авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |

«Modern NMR Techniques for Chemistry Research Andrew E. Derome The Dyson Perrins Laboratory, University of Oxford, UK Pergamon ...»

-- [ Страница 8 ] --

Причина, по которой выбранный нами эксперимент выглядит не достаточно впечатляюще, заключается в том, что намагниченность претерпевает одинаковую модуляцию как в течение времени tt, так и в течение времени t2 (прецессия на собственной ларморовой частоте).

Более интересны такие эксперименты, в которых в обоих временных интервалах происходят различные процессы. В общем мы стараемся проводить двумерные эксперименты таким образом, чтобы намагни ченность, которая совершала эволюцию с какой-то частотой за время /х (т.е. была «помечена» этой частотой), прецессировала с другой (отлич ной от первой) частотой в течение времени t2. Последняя частота в экспериментах всех типов будет описывать и химические сдвиги, и константы спин-спинового взаимодействия. Это приводит к сигналам при (v x, v 2 ) с различающимися Vj и v 2, т.е. к недиагональным или фосс-пикам. Для того чтобы понять, как интерпретировать экспери мент, нам нужно знать, что представляют собой частотные оси (в нашем примере они обе являются протонными химическими сдвигами, но могут быть и сдвигами разных ядер или константами спин-спинового взаимодействия и химическими сдвигами и т. д.). Важно также знать, как связаны намагниченности в период t1 и t2, или, другими словами, что приводит к появлению кросс-пиков.

Когда мы проводим двумерный эксперимент, нам необходимо за дать диапазон изменения 11 и величину приращения между отдельными значениями (инкремент) tl. Более подробно этот вопрос мы обсудим ниже, но сейчас я хотел бы отметить, что оцифровка интервалов tt полностью аналогична оцифровке обычных ССИ. Таким образом мы используем понятие ширины спектральной полосы (которая определяет ся диапазоном ожидаемых частотных модуляций в течение времени 1Х) для того, чтобы определить инкремент /х в соответствии с критерием Найквиста. Мы также используем понятие цифрового разрешения для определения общего объема выборки данных по этой временной коор динате. При этом мы сразу сталкиваемся с серьезными практическими проблемами. Вспомним пример из гл. 2, в котором мы оцифровывали протонный спектр с рабочей частотой 500 МГц, занимающий область химических сдвигов Юм.д. Для того чтобы получить цифровое раз решение 0,2 Гц на точку, необходимо использовать время выборки 266 Глава данных 5 с и объем памяти, достаточный для хранения 50000 действи тельных чисел (или 25 000 комплексных чисел при использовании квад ратурного детектирования).

Все эти параметры являются практически достижимыми для спектрометров, оснащенных современными систе мами обработки данных. Если мы попытаемся провести описанный выше двумерный эксперимент с использованием такой же полосы частот и такого же цифрового разрешения в обоих измерениях, то для этого потребуется 50000 слов для представления переменной t2 и дважды по 25000 слов для tt, что в целом составит 2500000000 слов! Общее время такого эксперимента можно оценить следующим образом: это 7,5 с (средняя величина tx плюс время выборки данных по t2), повторенное 25 000 раз, и все это помножено на 8 (из-за технических ограничений это, по-видимому, минимальное число прохождений для каждого значения tx, как мы увидим в дальнейшем). Это составит 17 суток! Очевидно, нам необходимо уточнить наши представления об оцифровке спектров, когда мы приступаем к двумерным ЯМР-экспериментам.

Чтобы не показалось, что двумерная спектроскопия несет с собой только одни бесконечные технические проблемы, мы сейчас перейдем к рассмотрению таких ситуаций, когда эти эксперименты оказываются в высшей степени информативными. Действительно, определенные труд ности возникают при обработке двумерных массивов данных. Накопив определенный запас энергии и энтузиазма, мы вернемся к рассмотрению этих проблем.

8.3. Эксперимент Джинера 8.3.1. Введение Та последовательность, которую мы сейчас изучали, фактически являющаяся первым двумерным ЯМР-экспериментом, предложена Джи нером в 1971 г. Ее полезность станет очевидной, когда мы рассмотрим, что произойдет при действии второго импульса на систему, которая имеет гомоядерную спин-спиновую связь. Однако перед тем, как перейти к этому вопросу, я хочу обратиться к эксперименту, который, хотя и является в высшей степени непрактичным, очевидно, мог бы оказаться полезным, если бы его можно было бы реализовать. В дальнейшем станет ясно, что основные недостатки этого вымышленного экспери мента не характерны для эксперимента Джинера, в то время как информационная емкость каждого из них сравнима.

8.3.2. Двумерный эксперимент.

Непрерывная развертка-преобразование Фурье Гомоядерная развязка является старым и очень информативным экспериментом. Как известно, она позволяет определить, какие группы ядер в молекуле связаны спин-спиновым взаимодействием, что в свою Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР очередь часто подтверждает или опровергает гипотезы о ее строении.

Подтверждение спин-спинового взаимодействия с помощью этого экспе римента принято считать более «солидным» доказательством типа структуры, чем простое рассмотрение данных по химическим сдвигам и константам спин-спинового взаимодействия, причем мнение это до статочно распространено. Оно основано на нашей уверенности в том, что, например, в протонных спектрах большие константы будут редко наблюдаться между ядрами, разделенными более чем тремя связями.

В сравнении с этим информация, полученная из величин химических сдвигов, может оказаться в существенной степени неоднозначной, по скольку сдвиги подвержены влиянию большого числа факторов, и мы не знаем точно их действие. Поэтому опасно опираться только на данные по химическим сдвигам при определении структуры. Назначение этой книги состоит в том, чтобы в ряде случаев нам избавиться от необ ходимости так поступать.

При определении характера спин-спиновой связи с помощью гомо ядерной развязки возникают некоторые проблемы. Если мы имеем дело со сложным спектром, то может оказаться неочевидным, облучение каких сигналов будет наиболее информативным. При этом мы можем потратить массу времени на проведение тех экспериментов, которые окажутся совершенно неинформативными. Даже если мы знаем, какие сигналы следует облучить, не всегда в спектре, имеющем сильное перекрывание сигналов, можно провести облучение с необходимой селективностью. Из-за сложного характера мультиплетности результат развязки может быть замаскированным и не замеченным. Для решения последней проблемы предложен метод разностной развязки, но сам этот метод имеет ряд недостатков, в особенности из-за эффектов, возни кающих при сдвигах Блоха-Зигерта.

Тот эксперимент со спиновой развязкой, который мы хотели бы провести, выглядит следующим образом. Пусть спектрометр в авто матическом режиме делает дискретную развертку частоты развязки при прохождении через интересующую нас область частот. Пусть для каж дого значения частоты развязка осуществляется абсолютно селективно, а результат ее однозначно проявляется в какой-то области спектра. 4$се эти эксперименты соберем в одном месте, для того чтобы могла быть непосредственно отображена полная структура спиновой связи. Пусть эксперимент проходит быстро и с высокой чувствительностью.

На практике к этому эксперименту наиболее близко можно было бы подойти, по-видимому, реализовав серию экспериментов с разностной развязкой (это был бы эксперимент INDOR с фурье-преобразованием) при очень низком уровне мощности декаплера, что и обеспечит высокую селективность. Не вдаваясь в детали, положим, что отклики проявляют ся для связанных спин-спиновым взаимодействием протонов, причем в тех случаях, когда облучению подвергаются их партнеры по спиновой связи. Было бы непросто изобразить такую серию спектров достаточно информативным путем, но, не заостряя на этом внимания, перейдем 268 Глава к более фундаментальной проблеме. Этот эксперимент привел бы к двумерному спектру, но реально он является спектром непрерывной развертки по одной координате. Частота развязки варьируется в спектре тем же самым способом, что и частота передатчика в спектрометрах старого типа. Ценой этого будет низкая скорость сбора информации.

Время, которое потребуется для перевода частоты развязки из одного края спектра в другой, будет зависеть от того, насколько грубо или тонко нам нужно делать приращения к частоте, другими словами, от разрешения по этой координате. Это аналогично требованию малой скорости прохождения для получения высокого разрешения на спектро метре с непрерывной разверткой. Даже без учета других его практи ческих недостатков это был бы по сути малоэффективный эксперимент, поскольку измерения проводятся в частотной области. Вот если бы использовать преимущества метода фурье-преобразования по второй координате!

8.3.3. Перенос намагниченности Несомненно, вы не удивитесь, когда узнаете, что последовательность Джинера обладает именно этими преимуществами перед вымышленным двумерным спектром, полученным с помощью сочетания непрерывной развертки и преобразования Фурье. Причина этого заключается в том, что в системе, содержащей связанные спин-спиновым взаимодействием ядра, второй импульс такого эксперимента приводит к перераспреде лению намагниченности, причем намагниченность, соответствующая какому-то одному переходу в течение времени t u перераспределяется между всеми другими, с которыми этот переход связан. Как сказано во введении, я хотел бы обсудить механизм этого явления позднее, и на деюсь, что вы пока примете на веру то, что это действительно так.

В гл. 6 мы уже рассматривали эксперименты по переносу намагни ченности (SPI, DEPT, INEPT), которые, однако, значительно проще для понимания, потому что эти системы являются гетероядерными (что позволяет независимо рассматривать действие импульсов на ядра раз норо типа), а также из-за того, что мы выбрали специальное распо ложение компонент мультиплета, для которых осуществляется перенос намагниченности. В общем виде гомоядерный эксперимент, к рассмотре нию которого мы сейчас приступаем, несколько труднее визуализиро вать. Тем не менее нам необходимо выяснить, что стоит за словами «всеми другими, с которыми этот переход связан». Итак, я напомню вам диаграмму энергетических уровней системы АХ, к которой мы уже не раз обращались в других главах (рис. 8.6).

Эта система описывает четыре перехода, и соответственно в спектре ЯМР проявляются четыре линии. Каждый из переходов, например А 1 ;

соответствует определенной линии в спектре, например линии на частоте vA + (1/2) J A X, что следует из основных свойств систем первого порядка.

Если второй импульс в эксперименте Джинера соответствует я/2, то та Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР Рис. 8.6. Энергетические уровни для системы АХ.

часть намагниченности, которая соответствует переходу A t, преобра зуется в намагниченность всех других переходов, т.е. А 2, Х1 и Х 2.

Некоторая доля намагниченности сохранится также и за переходом А1.

Таким же образом перераспределятся компоненты для всех других переходов. Это означает, что линия, регистрируемая в течение времени t2, может содержать компоненты своей амплитудной модуляции с час тотами, соответствующими положению всех остальных линий по коор динате t1. Это приведет к появлению кросс-пиков с этими линиями в двумерном спектре. Не очень просто понять, как все одновременно смешивается со всем, однако легко себе представить получающийся спектр (рис. 8.7).

6, 6,8 6,6 6, 6,7 6, м.а.

Рис. 8.7. Эксперимент Джинера, проведенный на системе АХ (Р-хлоракриловая. кислота).

270 Глава Сигналы, находящиеся на диагонали спектра, соответствуют тем компонентам намагниченности, которые имеют ту же частоту как в течение tl, так и в течение t2. Это та часть намагниченности, которая совсем не перенесена действием второго импульса. Итак, глядя на сигналы, находящиеся на диагонали, мы обнаружим, что это нор мальный спектр системы. В нашем случае-только два дублета. Вне диагонали мы видим сигналы кросс-пиков между всеми линиями, которые могут принадлежать как одному и тому же мультиплету (сигналы, расположенные по квадрату около диагонали), так и разным мультиплетам, связанным спин-спиновым взаимодействием (группы из четырех линий вдали от диагонали). Следует отметить, что, поскольку намагниченность переносится между переходами в обоих направлениях, кросс-пик при (v 1 ;

v 2 ) имеет симметрично расположенного партнера при (v 2, v t ). Корреляции между переходами, принадлежащими одному муль типлету, могут вызвать определенные неудобства, и ниже мы увидим, что их можно устранить. Важными корреляциями являются те, которые принадлежат переходам из разных мультиплетов. Они необходимы для выявления характера спин-спиновых связей. В нашем простом примере имеется только одна спиновая система, поэтому «все коррелирует со всем». В более сложных системах мы можем непосредственно про следить путь передачи спин-спинового взаимодействия через недиаго нальные пики. Это происходит благодаря тому, что спин-спиновое взаимодействие между протонами открывает тот путь, по которому может переноситься намагниченность при действии второго импульса.

8.3.4. Два реальных примера Сейчас мы приступим к рассмотрению содержащего массу инте ресных деталей вопроса о том, как мы проводим этот эксперимент и в чем собственно состоят его достоинства и недостатки. Однако, для того чтобы возбудить ваш аппетит, перед тем, как, перейти к разделам, содержащим больше технических вопросов (они будут следовать ниже), мне представляется целесообразным обратиться к двум реальным задачам для того, чтобы вы могли убедиться, насколько легко можно сделать спектральное отнесение на основе эксперимента Джинера. Пер вая из них относительно проста и могла бы быть решена более традиционными средствами, в то время как вторая лет десять назад представляла бы серьезную проблему. Сейчас она может быть решена за вечер. Перед тем как обращаться к спектрам, следует прояснить еще два вопроса. Первый касается названия метода, который я до сих пор называл экспериментом Джинера. В литературе иногда используют это обозначение, но значительно чаще встречается термин COSY (от англ.

Correlation Spectroscop Y-корреляционная спектроскопия). Практически все методы используют какого-либо типа корреляцию, поэтому термин COSY (часто в сочетании с модифицирующими дополнительными терминами), к сожалению, используют также и для обозначения разно Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР образных родственных методов, что может приводить к недоразу мениям. Итак, термином COSY я буду пользоваться для обозначения гомоядерной корреляции через спин-спиновое взаимодействие, осущест вляемой с помощью эксперимента Джинера.

Второй важный вопрос заключается в том, как правильно пред ставлять результаты эксперимента COSY. Двумерный спектр можно представить как совокупность одномерных спектров (строк), смещенных относительно друг друга. Такое представление используется до сих пор для того, чтобы подчеркнуть природу данных. Но по мере того как растет сложность спектра, оно оказывается излишне громоздким, и ин терпретация спектра может приводить к недоразумениям. Значительно более ясное представление о соотношении между диагональными и не диагональными сигналами мы получим, если будем использовать кон турную форму записи, точно таким же образом, как изображается на картах форма горного массива. В качестве иллюстрации на рис. 8. показаны в форме контурного представления те же самые данные, что и на рис. 8.7. Достаточно реальное представление о спектре можно получить, прописав только один нижний контур (что, кстати, и быстрее), а не несколько уровней, как изображено на рисунке. При этом пред ставление об относительной высоте пика в той или иной степени можно составить по его величине (площади контура). Для работы со спектром COSY полезно иметь под рукой график обычного спектра, что позволит легче идентифицировать сигналы на диагонали. Для того -6, 6, 6.7 6, Рис. 8.8. Это альтернативное контурное представление двумерного спектра, в общем, более удобно.

272 Глава чтобы связать контуры диагональной части двумерного спектра с сиг налами в обычном спектре, требуется некий навык, который, однако, легко приобретается в практической работе.

Теперь о примерах. В обоих случаях у нас были предварительные соображения о структуре соединений, и цель детального отнесения сигналов в спектре состояла в проверке того, насколько спектр со гласуется с этой структурой. Это, действительно, достаточно распро страненный случай, потому что, даже если проводить полный струк турный анализ «с нуля», т.е. не располагая предварительной инфор мацией, многие заключения о структуре фрагментов молекулы могут быть получены на основании простых спектров ЯМР (или, конечно, с помощью других спектральных методов). Гипотезы о взаимном расположении фрагментов молекулы могут быть затем проверены с помощью более детальной интерпретации спектров. Возможности отнесения с помощью двумерных ЯМР-экспериментов делают стадию такой проверки значительно более строгой.

Первое вещество (1) является природным соединением. Оно вы делено из бобов [1] и представляет интерес, поскольку его структура похожа на структуру других соединений-ингибиторов гликозидазы.

Обычный протонный спектр приведен на рис. 8.9, а контурное представ ление спектра COSY-на рис. 8.10. Сначала следует уделить некоторое н 6 'н Hi' 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 - 3,4 3,2 3,0 2, м. о.

А н 5 н1а Н 2а Н 2е 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1, Рис. 8.9. Протонный спектр соединения 1 (500 МГц, D 2 O).

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР е я • ft } В li H 2Q • S К 0 «I Н 2« Z »н,...

S В В я В II « Hie •."i a • л• яв з я 1 »

а н н6,н6' # • а » •• •.

4,2 4,0 3,8 3,6 3, 3,2 3,0 2,В 2,8 2,1 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1, Рис. 8.10. Полный спектр COSY соединения 1.

время сопоставлению групп сигналов в одномерном спектре с диагональ ной частью спектра COSY для того, чтобы сориентироваться в послед нем. Отметим, что двумерные эксперименты обычно проводятся со значительно худшим, чем в одномерных спектрах, цифровым разреше нием, и поэтому не все элементы тонкой структуры, проявляющейся в обычных спектрах, могут быть идентифицированы в контурном представлении COSY. Однако, изучив вопрос более детально, мы уви дим, что лишь в редких случаях это может вызвать неудобства.

При интерпретации спектров наиболее важный вопрос состоит в том, чтобы идентифицировать сигналы, отнесение которых однозначно. При мером этого может быть аномерный протон Щ в кольце глюкозы, 18- Глава ),• 5, 4,« 4,2 «,0 2, 2,» 2, Рис. 8.11. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Показана схема отнесения взаимодействующих протонов в кольце глюкозы.

которому, несомненно, принадлежит дублет в слабом поле. Таким образом, мы имеем опорную точку для определения партнеров по спин-спиновому взаимодействию, что в данном примере позволит нам полностью отнести сигналы этого кольца. Рис. 8.11 иллюстрирует схему отслеживания спин-спиновых взаимодействий, стартующую от аномер ного протона к его единственному кросс-пику, а затем снова на диаго наль для определения сигнала, соответствующего протону Н' 2, после чего к другому кросс-пику и т. д. Необходимо отметить, что кросс-пики хорошо разрешены, несмотря на то что в обычном спектре даже на частоте 500 МГц наблюдается сильное перекрывание сигналов в области Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР а 3 * t;

H 2o HI 3 "H2e И OB в II & s в & #« 8, 3,1 5,« 5,2 5,0 2,8 1,6 2,4 2,2 2,0 1,1 1,1 1,« М.В.

Рис. 8.12. Сильнопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Попытайтесь сделать отнесение сигналов другого кольца, не обращаясь к рис. 8.9-8.11.

Стартовой точкой может быть любой из помеченных на рисунке протонов Н 2.

резонанса протонов глюкозного кольца. Это происходит из-за того, что положение кросс-пика определяется двумя химическими сдвигами, и вероятность их полного совпадения соответственно падает. Случайно оказалось так, что в данном спектре мы можем идентифицировать мультиплеты, соответствующие каждому протону, путем тщательного изучения растяжек одномерного спектра. Если бы спектр был настолько сложен, что этого уже нельзя было сделать, то вместо идентификации сигналов по одномерному спектру нам часто приходилось бы ставить перед собой лишь задачу идентификации кросс-пиков. Для этого по требуется совершенно новый взгляд на расшифровку спектра, но этот 18»

276 Глава подход к установлению структуры является абсолютно правильным.

Хорошей стартовой точкой для отнесения сигналов другого кольца может служить любой из двух сильнопольных мультиплетов, которые должны принадлежать протонам Н 2 а или Н 2 е (а-аксиальный, е-эква ториальный). Только эти два протона не находятся по соседству с гете роатомами. Отметим, что, хотя мы по-прежнему используем химические сдвиги для облегчения отнесения, реально мы пользуемся только боль шими эффектами, как в данном случае, а не какими-то малозначащими несущественными деталями. Например, нам не потребуется использо вать предположение о том, находится ли слабопольный протон вблизи азота или кислорода. Отнесение сигналов этого кольца я оставляю «,» «,3 «,2 4,1 4,0 5,9 S,8 5,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3, м.а.

РИС. 8.13. Спектр COSY соединения 1, оптимизированный для регистрации даль них констант.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР в качестве упражнения;

растяжка соответствующей части спектра при ведена на рис. 8.12.

Убедившись в том, что оба кольца предполагаемой структуры согласуются со спектром, нам остается определить лишь место со членения колец. Одномерный спектр не содержит каких-либо конкрет ных указаний на это, но замечательное свойство эксперимента COSY состоит в том, что он позволяет нам непосредственно определить место сочленения. Это связано с возможностью регистрировать кросс-пики, вызываемые малыми константами, которые меньше наблюдаемой ши рины линии и вследствие этого не проявляются в одномерном спектре.

В протонном спектре константы через четыре и пять связей часто попадают в диапазон от 0,1 до 0,5 Гц. Хорошо известно, что геометри ческие факторы могут сделать эти константы значительно большими по величине, как, например, при расположении протонов по правилу W.

Для того чтобы зарегистрировать кросс-пики, сопряженные с малыми константами, необходимо выполнить некоторые условия. Это будет обсуждаться ниже в разд. 8.4.2, однако существенным является то, что времена регистрации данных в обоих измерениях должны быть доста точно большими (обычный фактор контроля разрешения). На рис. 8. для того же диапазона, что и на рис. 8.11, приведен спектр COSY, оптимизированный для регистрации дальних констант. Теперь ано мерный протон H'i имеет большое число кросс-пиков с другими прото нами глюкозного кольца. Но весьма важно то, что он также имеет кросс-пик с протоном Н 4 другого кольца (отмечен стрелкой на рис. 8.13).

Он появляется благодаря существованию неразрешенной в спектре константы через четыре связи между этими протонами и однозначно указывает на место сочленения колец.

Во втором примере уровень сложности на порядок выше. Соединение 2 имеет молекулярную массу около 1000. Но для современных воз можностей двумерной спектроскопии даже такая задача остается доста CONH точно простой. Использование спектра COSY (рис. 8.14а и 8.146) в деталях подобно тому, как это делалось в предыдущем примере, и я предоставляю читателю возможность убедиться самому в сог 278 Глава./ сн : • *\ •о о '' ' I' '' 'I' •' •I ' ••' I ' •' •I )I IfIIIII 5,S 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1, М.Э.

V Рис. 8.14a. Полный спектр COSY соединения 2.

ласованности отнесения, приведенного в подписи к рисунку (рис. 8.15).

В связи с этим примером я хотел бы обратить внимание на то, что важно не забывать традиционные методы, которые по-прежнему могут ока заться весьма эффективными. Настолько легко поддаться очарованию открывающимися возможностями двумерной спектроскопии ЯМР, что о простых путях решения проблемы можно забыть.

Изучение всего протонного спектра соединения 2 (рис. 8.15) хорошо иллюстрирует это положение. В этом примере сигналы занимают более обширную область, чем в предыдущем случае, и некоторые из стоящих в стороне сигналов выглядят весьма привлекательно в качестве воз можной опорной точки для отнесения. Например, таковы дублеты А, Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР -в о О •S э # О о- в SN к• ( Ш •* в 'J.K « в.11, i •о Ов iff о 1 »*• ООН S @h a •®~ я SS 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3, М.8.

Рис. 8.146. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.14а.

В и С в слабом поле, которые могут быть отнесены к амидным NH-протонам. В принципе, можно было бы провести эксперимент COSY так, чтобы включить все сигналы спектра, но при этом возникнут определенные проблемы. При этом либо придется выполнять экспе римент с очень низким цифровым разрешением, что в этом случае никак нельзя считать приемлемым, либо он займет много времени и в ходе него возникнет громоздкий массив данных. От мощности имеющегося в распоряжении компьютера зависит, составит или не составит пробле му размер массива данных;

однако большое время регистрации спект ра-это фундаментальное препятствие. Эксперимент COSY может быть быстрее и проще проведен, если предварительно выполнить несколько Глава простых экспериментов двойного резонанса для того, чтобы иденти фицировать ближайшее окружение слабопольных протонов (рис. 8.16).

Имея в виду эту возможность, я мог бы проделать то же самое с двумя дублетами метильных групп в сильном поле, сделав диапазон частот для двумерного эксперимента еще уже. Однако в определенный момент у меня были некоторые соображения для того, чтобы оставить эти сигналы в двумерном спектре, а исключение области NH-протонов уже уменьшило размер эксперимента до такого уровня, который, по моему л роспЛ. растб pocmO.

1. I -*-л_А_ h•..i и»

с А В D Е 9,* 9,2 9,0 8,8 В, Б 8,4 8,2 8,0 7,8,6 7,4 7,2 7,0 6, м.8.

PhCH,— PhCH F G H 1 J,K LM NО P Q R.S T U —i—i—i—•—i—i—i—'—i—i—r~~—i—'—i—'—i—•—i—'—i—•—i—•—i ' i 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4, м.е.

Л —r~ —i— —I— — I — —I 1 1 1, 1, 3,4 3,2 3, з,е 3,6 2, Рис. 8.15. Протонный спектр соединения 2 (500 МГц, пиридин-^)- Отнесение сигналов (обозначения атомов и групп см. на схеме соединения 2): А, кольцо A NH;

В, кольцо В NH;

С, Ala (фрагмент D) NH;

F, A3;

G, А4;

Н, В^ /, В 4 ;

J, Glu (фрагмент Е) а-протон;

К, A,;

L, Ala (фрагмент D) а-протон;

М, В 2 ;

N, А2;

О, Ae;

P, Ala (фрагмент С) а-протон;

Q, А6;

R, В 5 ;

S, В 6 ;

Т, В 3 ;

U, А5;

V, В 6 ;

W и X Glu (фрагмент Е) СН 2 ;

CHj 1, Ala (фрагмент С) Me;

CHf, Ala (фрагмент D) Me.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР Йпучение С облучение В облучение А PhCHj PhCH S.30 5,20 5,10 5,00 4,90 4,80 4,70 4,60 4, ' М.8.

РИС. 8.16. Спектры двойного резонанса соединения 2.

опыту, мог бы быть проведен достаточно легко. Поэтому я не провел этих развязок.

8.3.5. Детали эксперимента COSY Введение. Сейчас у нас есть некоторое представление о том, на сколько полезным инструментом при отнесении сигналов может слу жить эксперимент COSY, и я намерен приступить к более углубленному изучению вопросов о том, как проводится эксперимент COSY, как возникают разнообразные артефакты и как они могут быть устранены, какие есть методы представления данных и как на практике подобрать подходящие экспериментальные параметры. Этот раздел посвящен в основном техническим вопросам и будет более интересен тем, кто самостоятельно выполняет на спектрометре эксперимент COSY или аналогичные эксперименты. Если у вас нет технических наклонностей или вас вовсе не интересуют вопросы о том, как работать на спектро метре, я рекомендую опустить большую часть этого раздела, за исклю чением параграфов «Фазовые соотношения в фазочувствительном COSY» и «Цифровое разрешение и времена выборки данных». Многие из обсуждаемых здесь вопросов полностью или частично касаются не только COSY, но и всех двумерных экспериментов, и в оставшихся 322 Глава Me-, Р, Me Me РМе-i ].^Меь Рб и 7 1 е з L которой вы можете, по-видимому, столкнуться при использовании этой техники для произвольных ядер со спином 1/2, представляют широкие спектральные диапазоны, которые могут потребоваться. Как следствие этого, в некоторых случаях возникают большие массивы данных. Для квадрупольных ядер времена релаксации не должны быть настолько короткими, чтобы совсем исчезло спин-спиновое взаимодействие.

Однако константы, хотя бы частично разрешенные в одномерном спектре, могут все-таки приводить к появлению кросс-пиков.

Этот эксперимент нашел свои наиболее интересные приложения при исследовании спектров ядер таких элементов, которые образуют много ядерные кластерные соединения. COSY зарекомендовал себя идеальным методом для установления сложных структур в этой области. Например, COSY использован в спектроскопии П В [26] и 1 8 3 W [27]. Некоторые другие методы корреляционной спектроскопии (см. разд. 8.5) также использовались для 1 8 3 W [28].

8.4. Эксперименты, родственные COSY 8.4.1. COSY- Варьирование длительности второго импульса эксперимента COSY, т. е. использование последовательности с переменной а, приводит к изменению относительных интенсивностей кросс-пиков и близких к диагонали пиков. В частности, можно показать с использованием подхода, основанного на каскадах импульсов, или с помощью формального квантовомеханического описания, что соот ношение интенсивностей при переносе когерентности между прямо и косвенно связанными переходами определяется как ctg2(a/2). Прямо связанные переходы в системе АХ-это пара переходов, таких, как А и Xj, имеющих общий уровень энергии. Косвенно связанные переходы могут возникать в более сложных спиновых системах и являются непараллельными переходами, не имеющими общего энергетического Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР уровня. Задавая а равной я/4, мы получим соотношение порядка 6.

Интенсивности пиков, соответствующих переносу между параллель ными переходами, также понижаются на определенную величину.

Это и есть популярный эксперимент COSY-45, который имеет два преимущества перед основным COSY.

Понижение интенсивности пере носа между параллельными переходами упрощает вид спектра вблизи диагонали из-за уменьшения кросс-пиков внутри мультиплетов. В слож ном спектре это может сделать возможной идентификацию корреляций, которые в противном случае были бы скрыты в нагромождении пиков вблизи диагонали. Благодаря тому, что межмультиплетный перенос ограничивается в основном непосредственно связанными переходами, возникает возможность определения относительных знаков констант спин-спинового взаимодействия в системах из трех и более спинов по некоторой аналогии с одномерным экспериментом спин-тиклинг. Этот последний тип информации используется при определении структуры лишь в особых случаях. По этой причине, а также учитывая то, что данный вопрос подробно обсуждается в книге [5] (разд. 2.3.4), я не буду в дальнейшем развивать эту тему.

На рис. 8.34 показаны спектры COSY и COSY-45 2,3-дибромпро пионовой кислоты (оба в форме магнитуды). Видно, что в нижнем спектре исчезли некоторые компоненты кросс-пиков и корреляции внут ри мультиплетов. Однако эта иллюстрация, по-видимому, несколько обманчива. Важно помнить, что эти корреляции не устраняются пол ностью, а лишь уменьшаются в некоторое число раз. В более сложных случаях может оказаться невозможным так определить нижний контур ный уровень, чтобы исключить все ослабленные корреляции, поэтому не получается столь хорошее упрощение диагональной части спектра.

Сопоставление рис. 8.35 (COSY-45) и рис. 8.10 (COSY-90 того же соеди нения) отчетливо указывает на то, что при этом следует ожидать. Для рутинных спектров COSY-45 запись с фильтром типа эха при магни тудном представлении тем не менее в целом является предпочтительной.

Однако при этом происходит некоторая потеря чувствительности по сравнению с COSY-90. Этот метод нельзя использовать в фазочувстви тельном варианте из-за того, что сигналы возникают не только за счет амплитудной модуляции. Из новых экспериментов, в которых могут быть получены фазочувствительные данные, стоит посмотреть Е. COSY [9].

8.4.2. Определение малых констант Небольшие константы, значительно меньшие ширины линии, также дают кросс-пики в эксперименте COSY, хотя и с низкой интенсивностью.

Для протонных спектров это означает, что часто возможно иденти фицировать константы через 4 и 5 связей, лежащие обычно в диапазоне 0,1-0,5 Гц и, следовательно, неразрешимые в рядовых одномерных экспериментах. Спектроскописты считают эту возможность весьма при Щ : t: BIT COSY- LJL 4,5 И 4,3 4,2 4,1 4,0 3,9 3,8 57 3, м.Э.

4. Спектры COSY-90 и COSY-45 2,3-дибромпропионовой кислот ние спектра COSY-45.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР ч ft * & • ч» * ш т \ а ша ш.

•0 а а т •g • * -т 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1, М.О.

Рис. 8.35. Спектр COSY-45 соединения 1.

влекательной, так как кажется, что это позволяет расширить границы измерения. Но как химики мы должны быть более осторожны в сужде ниях. Несомненно, бывают случаи, когда полезно определить очень небольшие константы, как, например, для соединения 1 из разд. 8.3.4.

Тем не менее встречаются и такие ситуации, когда проявление в спектрах всех дальних корреляций становится очень нежелательным. В частности, в спектрах молекул с жестким или напряженным углеродным скелетом, а также в спектрах полиненасыщенных соединений иногда может пока заться, что все коррелируют со всем, и информация о структуре из подобных спектров извлекается с трудом. В настоящее время един 326 Глава ственным способом ослабить возникающие за счет малых констант корреляции является работа с низким цифровым разрешением и корот кими временами регистрации. Однако эти корреляции могут быть особо выделены в описанном ниже случае.

Мы уже обсуждали главные факторы, определяющие интенсивность кросс-пиков, обусловленных малыми константами. Кратко напомню, что эти факторы определяются как степень ослабления противофазных пиков, и соотношение между переносом когерентности и поперечной релаксацией представляется выражением (8.3). Это выражение действи тельно описывает спад огибающей ССИ для сигнала, соответствующего переносу когерентности по обеим координатам. Он достигает максимума для значения времени / т а х, определяемого соотношением 'max = — arctg(7uJT2) (8.4) nJ Для очень небольших значений J (JT2 « 1) оно хорошо аппроксими руется как r max = T2. Таким образом, чтобы предотвратить потерю сигнала, вызванного малыми константами, нам необходимо иметь времена выборки по каждой из координат, значительно превышающие Т2;

это условие не выполняется для рутинных экспериментов COSY.

В экспериментах с фильтром типа эха при магнитудном представ лении данных для получения формы линии, похожей на сигнал погло щения, нам требуется так подобрать функцию окна, чтобы она напо минала сигнал эха, т.е. была симметрична относительно центральной точки времени выборки. Для того чтобы максимум этой функции соответствовал максимуму сигнала переноса когерентности, нам по требуется время регистрации порядка 2Т2 по обеим координатам. Это временное ограничение неизбежно, однако можно избежать необходи мости хранения и обработки очень больших массивов данных, которые могут при этом возникнуть. Это достигается введением двух допол нительных задержек фиксированной длины в интервалы tt и t2, в таком случае последовательность приобретает вид При этом смягчается требование к временам выборки до Atvi2 ~ ~ 2Г2 — 2А, т. е., если для регистрации данных потребуется одно и то же общее время, для оцифровки нужно будет меньше точек. Как и в COSY-45, при необходимости а может принимать значение, меньшее чем л/2. Однако это может оказаться нецелесообразным, поскольку так или иначе могут возникать проблемы, связанные с чувствительностью.

Мы уже видели пример спектра, полученного таким образом (рис. 8.13).

В этом случае А было выбрано равным 0,25 с. Для типичного диапазона протонных Т2 от 0,2 до 0,6 с подходящие значения А лежат в интервале 0,05-0,45 с в предположении, что для времени регистрации исполь зовано значение 0,3 с. В экспериментах этого типа может уменьшаться Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР интенсивность корреляций, обусловленных большими по величине конс тантами, если выражение J(T2 — А) принимает значение, близкое к це лочисленному (т. е. J ш 7 или 14 Гц для приведенных выше параметров);

таким образом, для того чтобы избежать недоразумений, хорошо было бы иметь обычный спектр COSY.

8.4.3. Многоквантовая фильтрация Если мы добавим дополнительный rt/2-импульс непосредственно в конце последовательности COSY следующим образом:

то в таком случае многоквантовая когерентность, которая, как ока зывается, возникает перед третьим импульсом, может быть опять переведена в наблюдаемую намагниченность (см. параграф «Еще раз о переносе намагниченности» в разд. 8.3.5). При этом в идеале третий импульс должен следовать сразу за вторым, однако на практике может быть использована задержка до нескольких микросекунд для фазового сдвига. Как обсуждалось выше, задание подходящего фазового цикла может затем разделить сигналы, возникающие от многоквантовой когерентности различных порядков. Так, например, двухквантовая ко герентность в 2 раза более чувствительна к изменению фазы в возбуж дающей ее последовательности, чем одноквантовая. Поэтому, если мы смещаем фазу ср первых двух импульсов (в общем случае всех импульсов до того момента, как возникла когерентность) на 90°, фаза того регистрируемого сигнала, который прошел через состояние двухкван товой когерентности, инвертируется. Тогда инвертирование фазы при емника (т.е. вычитание 90°-эксперимента из О°-эксперимента) выде ляет компоненту, прошедшую через состояние двухквантовой когерент ности.

Правило для выделения ^-квантовой когерентности заключается в том, чтобы шагами изменять фазу возбуждающих импульсов в сле дующей последовательности: 0, ISO/p, 2 х 1$0/р...(2р — 1) х 180/р, аль тернируя фазу приемника по мере движения [10]. Эта процедура также позволяет детектировать когерентности порядка р (2т + 1), т = 0, 1, 2...

Однако в общем когерентности более высокого порядка возбуждаются с низкой интенсивностью. Многоквантовые когерентности модулируют ся как функция tt обычным образом, поэтому результирующий спектр оказывается похожим на нормальный COSY, но испытавшим воздей ствие многоквантовой фильтрации. Квадратурное детектирование по координате v t в этих экспериментах может осуществляться с помощью любого из обсуждавшихся выше методов, если вы не забыли, что для получения необходимого сдвига фазы на 90° в /^-квантовой когерент ности вам нужно сместить фазу возбуждающей последовательности на 90/р градусов. Отметим, что многоквантовая фильтрация может по 328 Глава требовать фазовых сдвигов, не кратных 90°;

спектрометры, созданные примерно после 1983-1984 гг., как правило,'обеспечивают это.

Существуют две совершенно ясные причины, побуждающие к про ведению многоквантовой фильтрации: упрощение спектра й усовершен ствование фазочувствительного эксперимента COSY. Упрощение спект ра, возникающее за счет многоквантовой когерентности, может до стигаться только в связанных многоспиновых системах;

/^-квантовая когерентность может возникать только между по крайней мере /ьядрами со спином 1/2. Следовательно, в двухквантовом эксперименте устраняют ся синглеты (например, сигналы растворителя), в то время как обычные корреляции сохраняются. Трехквантовый эксперимент устраняет до полнительно системы АХ и АВ и так далее для более высоких порядков (однако чувствительность быстро падает при переходе к более высоким порядкам). Устранение пиков осуществляется только за счет вычитания сигналов, поэтому на практике в лучшем случае, вероятно, можно ожидать ослабления их интенсивностей в несколько сот раз. При этом также не возникает облегчения по отношению к динамическому диапа зону-АЦП по-прежнему должен быть в состоянии оцифровать весь диапазон амплитуд имеющихся сигналов. На рис. 8.36 сопоставлены спектры трипептида Gly-Tyr-Gly с двух- и трехквантовой фильтра цией. Трехквантовые эксперименты и эксперименты более высокого порядка, очевидно, не имеют столь общего характера, как основной COSY. Необходимо заранее знать типы имеющихся спиновых систем и в соответствии с этим выбирать тип эксперимента.

Второе важное свойство эксперимента с двухквантовой фильтрацией в его фазочувствительном варианте заключается в том, что в отличие от фазочувствительного COSY фаза как диагональных, так и кросс-пиков Рис. 8.36. Спектры COSY с двух- и трехквантовой фильтрацией для трипептида Gly-Tyr-Gly.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР "5" ИГ"" т[ 3,6 2, 2,4 3, Рис. 8.37. Сравнение нормального фазочувствительного COSY (слева, те же самые данные, что и на рис. 8.27) с DQF-COSY (справа). Сильное упрощение вида диагональной части последнего с лихвой компенсирует потерю чувстви тельности в этом эксперименте (см. текст).

может быть настроена на чистое поглощение. Фактически для систем, содержащих более двух спинов, диагональные пики все же будут иметь вклад дисперсионной компоненты;

тем не менее на практике улучшение весьма значительно. Это устраняет единственный недостаток фазочув ствительного COSY. За это приходится расплачиваться двукратным понижением чувствительности, которая определяется как отношение сигнала к тепловому шуму. В разд. 8.3.5 мы уже видели, что, по крайней мере при наблюдении протонов, помехи при детектировании чаще определяются уровнем шума по t1, а не теплового шума. Поскольку синглеты, вызывающие самый значительный шум по * 1 5 устраняются в эксперименте с двухквантовой фильтрацией, можно добиться эффек тивного улучшения по сравнению с таким же нефильтрованным спект ром. В настоящее время фазочувствительный COSY с двухквантовым фильтром (DQF-COSY), по-видимому, является лучшим методом для отнесения констант. Сравните два спектра на рис. 8.37 и вы уви дите, насколько понятнее становится диагональная часть в спектре DQF-COSY.

8.4.4. Эстафетный перенос когерентности Достаточно общая проблема при отнесении протонных спектров состоит в идентификации линейных цепей спинов, т. е. таких последо вательностей С Н — С Н — С Н — С И..., которые могут возникать в поли замещенных соединениях или олефинах. Отнесение с использованием COSY должно быть простым, однако иногда может возникнуть неопре 330 Глава деленность. Рассмотрим, например, только три спина, расположенные в ряд. Они образовали бы систему АМХ, в которой J A M и J M X были бы вицинальными константами, a J A X -нулевой (для насыщенных соеди нений). Соответствующий спектр COSY имел бы кросс-пики между А и М и между М и X, но не между А и X. Такая картина не содержит прямых указаний на то, что А и X являются составными частями одной и той же спиновой системы, поскольку тот же результат был бы получен для двух двухспиновых систем AM и М'А, если бы М и М' имели одинаковый сдвиг. В сложном случае (особенно в спектрах белков, где эта проблема возникает часто) из исследования одномерного спектра иногда нельзя определить, имеется ли перекрывание сигналов в неко торой заданной области спектра.

В эксперименте по эстафетному переносу когерентности (RCT, от англ. Relayed Coherence Transfer) эта проблема решается путем передачи намагниченности, перенесенной от А к М в нормальном эксперименте COSY, к следующим ядрам, связанным с М. Это достигается простым добавлением третьего тс/2-импульса для того, чтобы вызвать другое распределение когерентности, поэтому основная последовательность будет иметь вид При этом возникает проблема, что делать с интервалом ь. В идеале можно было бы представить проведение трехмерного эксперимента, в котором этот интервал изменялся бы с определенным шагом не зависимо от tl. После трехмерного преобразования мы получили бы массив данных, в котором амплитуда представляется как функция трех частот. Эта идея не имеет практической ценности, потому что вы полнение такого эксперимента потребовало бы много времени. Кроме того, трудно найти достаточно информативный способ представления данных такого типа. Обычно применяется другой способ. Значение Ь принимается равным такому вычисленному значению, которое обеспе чивает максимальный перенос когерентности от А к X через М.

Существует и третий метод, получивший название «аккордеон-спектро скопия», в котором, по существу, трехмерный эксперимент сводится к двум измерениям за счет того, что ь представляется как функция / :

(см. работу [11]), но мы не будем его здесь рассматривать. Для того чтобы сделать результат эстафетного переноса не зависящим от раз ностей химических сдвигов, необходимо поместить тс-импульс в середине интервала /?. Тогда последовательность будет выглядеть следующим образом:

^ т т с т,, Для системы АМХ, в которой JAX = 0, количество намагниченности, Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР перенесенное от А к X при использовании этой последовательности, пропорционально sin (27с/АМт) sin (27гУмхх) (8.5) поэтому оптимальное значение т можно выбрать, если удается оценить величину константы спин-спинового взаимодействия. В системах со свободным вращением вицинальные константы обычно близки к 7 Гц.

Тогда оптимальное значение х составляет примерно 35 мс. Для других систем т сложным образом зависит от типа констант и их значений;

обширные таблицы оптимальных значений т для разнообразных фраг ментов приводятся в работе [29].

Очевидно, дто этот эксперимент не имеет общего характера, по скольку требует некоторых предварительных знаний о спиновой системе и возможных значениях констант спин-спинового взаимодействия. Од нако в сочетании с COSY он может часто использоваться для устранения неоднозначностей. На рис. 8.38а и 8.386 сравниваются спектры COSY и RCT для соединения 6. Одномерный протонный спектр и спектр COSY в м н.

" "ч " LL • ?

1 я" * к ::

i j i | i | i | i | i | i | i | i j I a 4,0 3,6 ЗД $ Zfi 3 2,8 2,6 2, У," рисн,п г н* • н, н, I ' I ' I ' I 'I I 'I 5,5 5,0 45 ^ в 4,0 33 3/3 2, Рис. 8.38а. Протонный и COSY-спектры соединения 6.

332 Глава • « • 1 • 1 1 • л«. • отраженные / • Hg * II •• * • :. а;

Н3-Н5' • О н« ••н4-н Нб "н?..

е % ц ^-н« • Ан " О • »г нз 0 • •Hi 4, 5,5 5,0 S,0 2, Рис. 8.386. Спектр RCT соединения 6. В некоторых случаях помечены дополни тельные эстафетные пики.

представлены на рис. 8.38а, а спектр RCT, на котором помечены допол нительные корреляции,-на рис. 8.386. Хотя т подобрано для регистра ции небольших констант углеводного цикла, эстафетный перенос когерентности можно все-таки видеть и для других резонансных сигналов. Этот подход широко используется в спектроскопии ЯМР белков. Составляющие их спектры спиновые системы аминокислотных остатков известны, но часто сложность спектра такова, что даже кросс-пики могут недостаточно разрешаться. Использование экспери мента RCT позволяет определить связи между сигналами Р-протонов аминокислотных остатков и соответствующих протонов NH-групп даже тогда, когда не разрешаются сигналы а-протонов [12]. При работе с малыми молекулами более полезным, по-видимому, является гетеро ядерный вариант эксперимента RCT (см. гл. 9).

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР 8.5. Другие эксперименты по гомоядерной корреляции 8.5.1. INADEQUATE Введение. Это, пожалуй, одна из наиболее ужасных аббревиатур (от англ. Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Expe riment-эксперимент с невероятным двухквантовым переносом намагни ченности на природном содержании) в этой книге. Один из видов этого эксперимента до сих пор служит наиболее совершенным средством для установления строения скелета органических молекул. К сожалению, он также одновременно является и одним из наименее чувствительных из имеющихся экспериментов. По этой причине мы рассмотрим его лишь очень кратко. Исторически данный метод возник из идеи, связанной с измерением углерод-углеродных констант спин-спиновогоувзаимодей ствия на природном содержании, однако сформировавшие его концеп ции имеют значительно более общий смысл. Я намерен подойти к эксперименту INADEQUATE с другой стороны, на базе того, что мы уже знаем о COSY, а затем вернуться к первоначальному эксперименту.

При этом станет ясно, что мы уже изучили его принципы.

Самое большее, для чего мы до сих пор использовали двухквантовую когерентность, которая может быть получена в конце основной после довательности COSY,-так это преобразование ее опять в однокван товую когерентность. Это приводит к эксперименту DQF-COSY, в ко тором единственная роль, отводимая двухквантовой когерентности, состоит в том, чтобы отличать ядра, не имеющие констант, от тех, которые их имеют. Все интересное, что происходит в DQF-COSY в период эволюции tt, совершается с одноквантовой намагниченностью;

следовательно, в этом смысле можно лишь подразумевать, что это двухквантовый эксперимент. Используя ту же последовательность им пульсов, мы могли бы провести реальный двухквантовый эксперимент, фиксируя интервалы между первыми двумя импульсами и помещая интервал tx между двумя следующими импульсами таким образом:

К К К --2x---tl---t С использованием подходящего фазового цикла, выделяющего сигналы, которые возникли благодаря двухквантовой когерентности, мы полу чим, что именно частоты двухквантовых переходов будут совершать эволюцию в течение периода t v Для оптимального эксперимента нам нужно выбрать такое значение т, чтобы создать максимальную двух квантовую когерентность. Мы также поместим я-импульс в центре интервала 2т для того, чтобы возбуждение не зависело от химических сдвигов:

334 Глава Это основная двумерная последовательность INADEQUATE. Как и в случае COSY, я сначала собираюсь обсудить получаемые при этом результаты и лишь затем сравнительно кратко обратиться к техни ческим деталям проведения эксперимента.


Двумерные спектры INADEQUATE. Частоты двухквантовых пере ходов, совершающие эволюцию в течение периода tt этого экспери мента, являются просто суммой химических сдвигов (относительно частоты передатчика) для тех пар ядер, которые участвуют в форми ровании двухквантовой когерентности. Пики в двумерном спектре, соответствующие двум ядрам со сдвигами vA и vB, имеют координаты ((vA + vB),. X), где Х-частота одноквантовой когерентности, в которую переводится намагниченность действием последнего импульса. Как мы вскоре увидЬм, для сильных ядер, например 1 Н, это может приводить к некоторому усложнению;

данный эксперимент изобретен и проде монстрирован для ядер 1 3 С [3]. Преимущество рассеянных ядер, таких, как углерод, состоит в том, что в конечном спектре заметную интен сивность имеют только сигналы от двухспиновых систем АВ или АХ.

Они возникают благодаря тому, что 0,01% молекул вещества содержит два атома 1 3 С. Значительно более интенсивные сигналы от одиночных атомов 1 3 С устраняются за счет двухквантовой фильтрации, а сигналы от молекул с тремя атомами 1 3 С (трехспиновые системы) имеют пренебрежимо малую интенсивность. Можно так подобрать значение т, Рис. 8.39. Схематический двумер ный спектр INADEQUATE для по следовательности систем АХ. Те ча сти спектра, которые расположены снаружи от заштрихованных линий, не могут содержать сигналов.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР что будут наблюдаться только сигналы от атомов, связанных большими по величине прямыми константами. Таким образом, для каждой часто ты по v t, по которой наблюдается сигнал, можно выделить прямую, параллельную v 2, на которой будут находиться компоненты систем АВ или АХ для пары связанных атомов С, т.е. в двумерном спектре возникнут дублеты при ((vA + v B ), v A ) и ((vA + vB), v B ). Центр между каждой парой сигналов попадает в точку ((vA + vB), (vA + vB)/2), поэтому эти точки лежат на линии, имеющей коэффициент наклона, равный 2 (рис. 8.39). Этот факт можно использовать для того, чтобы отличить истинные сигналы от артефактов.

Поясним это на примере соединения 7 (рис. 8.40). Поскольку каждый С с, ее, С..С, —I—'—I—'—r~ —I—'—I—'—I—'—I—'—г~ 100 40 30 го 150 МО 130 120 Рис. 8.40. Двумерный спектр INADEQUATE 1 3 C лимонена (7). Время регистра ции по tl составляло 30 мс (256 инкрементов при спектральной полосе 9 кГц;

прохождений на инкремент). Остаточные одноквантовые сигналы видны на линии у1 = 0. Поскольку т было подобрано для средней по величине константы С—С между алифатическими углеродами, два корреляционных пика за счет взаимо действия через двойную связь имели низкую интенсивность и не проявились на графике.

336 Глава неконцевой атом углерода связан с двумя или более партнерами, в принципе может быть восстановлен весь скелет молекулы (если только нет разрывов в углеродной цепи, как во фрагментах С—X—С). Начи ная, как обычно, с наиболее легко относимого сигнала, мы проходим по линии, соответствующей его химическому сдвигу на оси v 2 и параллель ной v 1 ;

до тех пор, пока не обнаружим сигнал. Двигаясь далее параллель но v 2, мы определим одного из его партнеров по спин-спиновому взаимодействию. Стартуя опять с этого сигнала и повторяя то же самое, мы, очевидно, определим очередного партнера по спин-спиновому вза имодействию. Этот метод открывает феноменальные возможности, но одновременно имеет исключительно низкую чувствительность. Его не достаток состоит в том, что мы пытаемся наблюдать сигналы, интен 13 сивность которых равна интенсивности С-сателлитов от сигналов С, т.е. возникающих лишь от одной из 10000 молекул. Это исключает возможность использования эксперимента для большинства реальных задач, однако он может найти применение в биохимических исследова ниях с соединениями, меченными по С.

Если мы проделаем то же самое для такого сильного ядра, как *Н, то проблема чувствительности исчезает, но вместо нее возникают другие сложности [14]. Выбор задержки х в случае С прост: для систем АХ ее оптимальное значение составляет 1/4J (для сильносвязанных систем нужны несколько различающиеся значения, см. книгу [5]). Диапазон значений J для прямых углерод-углеродных констант относительно невелик (примерно 35-55 Гц). Для протонов, напротив, зависимость т от J оказывается более сложной из-за того, что часто приходится иметь дело со сложными спиновыми системами, да и диапазон изменения констант спин-спинового взаимодействия оказывается шире (для срав нения, скажем, от 2 до 20 Гц). Другая проблема для систем, содержащих более двух спинов, состоит в том, что двухквантовая когерентность при действии последнего импульса может перераспределяться по всем пере ходам в спиновой системе;

это усложняет интерпретацию каждой строки по v t, соответствующей сигналам от пары связанных ядер. К счастью, этот недостаток может быть частично устранен в результате того, что последний импульс задается равным Зя/4, а не я/2, что по аналогии с COSY-45 ограничивает большую часть перераспределения теми пере ходами, в которых участвующие ядра непосредственно формируют двухквантовую когерентность [14] (здесь термин «непосредственно»

используется в прямом смысле, безотносительно связи между перехо дами). На рис. 8.41 представлен протонный двумерный спектр INADEQUATE 2,3-дибромпропионовой кислоты с завершающими им пульсами я/2 и Зя/4.

Преимущество этого эксперимента по сравнению с COSY заклю чается в том, что в нем отсутствуют диагональные пики. Поэтому для очень сложных задач можно с помощью двумерного спектра INADEQUATE определить те корреляции, которые трудно найти в спектре COSY, когда соответствующий кросс-пик расположен близко Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР считывающий импульс--|- считывающий импульс -МО MB ::: •н \ - --I... -,„ - т •I \ Гц •ч I I •" О -ТОО - Гц ГЦ РИС. 8.41. Двумерные спектры INADEQUATE 'Н 2,3-дибромпропионовой кисло ты с варьированием угла последнего (или «считывающего») импульса. Пики, возникающие в результате нежелательного переноса намагниченности к «пассив ным» спинам, помечены стрелками на левом спектре.

к диагонали. Неудобство заключается в меньшей общности. Для этого метода невозможно задать оптимальное значение т, подходящее для всех возможных величин констант и типов расположения ядер. В на стоящее время уже есть ряд примеров, демонстрирующих полезность этого метода для анализа спектров ЯМР белков [15], но пока еще рано делать вывод о том, что окажется важнее-преимущества или недо статки. Для спектроскопии ЯМР малых молекул этот эксперимент определенно не является экспериментом первой необходимости, однако его можно рассматривать как альтернативу в тех случаях, когда COSY или его модификации не дают ответа на поставленный вопрос.

Детали двумерной последовательности INADEQUATE. При задании параметров для этого эксперимента мы сталкиваемся с обычными проблемами двумерной спектроскопии: выбором ширины спектральной полосы, параметров оцифровки и фазового цикла. В литературе имеется целый ряд подходов к их решению. Метод активно использовался в нескольких исследовательских группах, а детали его выполнения сильно меняются в зависимости от возможностей и конструкции спект рометра, которые существенно изменялись. Я собираюсь рассматривать его так же, как это было сделано для DQF-COSY и COSY, но для полноты упомяну некоторые другие возможности, с которыми вы можете столкнуться.

Создавая фазовый цикл, мы должны иметь в виду двухквантовую фильтрацию, подавление артефактов и квадратурное детектирование по 22- 338 Глава v r Двухквантовая фильтрация может достигаться точно так же, как и для DQF-COSY. Мы используем тот факт, что сдвиг на 90° фазы возбуждающей части последовательности (первые три импульса) ин вертирует сигналы, возникающие за счет двухквантовой когерентности.

Однако в литературе чаще используется циклирование фазы последнего импульса, по-видимому, с целью достижения удобства при программи ровании. Сдвиг по фазе этого импульса на 90° смещает фазу сигнала, который прошел через двухквантовую когерентность, на 270°. Это можно понять, если представить себе, что мы имеем сдвиг на 90° относительно возбуждающей последовательности (что приводит к фазо вому смещению на 180°) плюс прямой 90°-сдвиг возникшей однокван товой когерентности. Если мы будем менять фазу последнего импульса по кругу в последовательности х, у, —х, —у, то фазу приемника следует менять в противоположном направлении (т.е. х, —у, —х, у) для того, чтобы следовать за двухквантовым сигналом. Для подавления арте фактов к этому четырехшаговому циклу можно добавить процедуру CYCLOPS. Полезным может оказаться и смена фазы л-импульса.

Имеются также дополнительные возможности, описанные в работе [16].

В общем, размер реально необходимого фазового цикла лучше опре делять экспериментально для данного спектрометра, потому что никто не хочет без реальной необходимости увеличивать число прохождений на каждом шаге по tt.

Квадратурное детектирование по vx требует, как обычно, сдвига на 90° фазы регистрируемого сигнала. Для сигналов, возникающих за счет двухквантовой когерентности, это требует сдвига на 45° фазы возбуж дающих импульсов. На современных спектрометрах это можно сделать непосредственно. Однако в то время, когда метод INADEQUATE только разрабатывался, спектрометры не были приспособлены для таких фазовых сдвигов, поэтому были разработаны два косвенных способа. Первый состоит в использовании так называемого составного z-импульса [17], т.е. последовательности где нет задержки между импульсами, а обозначает угол импульса*, р соответствующий желаемому фазовому сдвигу (т. е. я/4 в нашем случае).


Для намагниченности в плоскости х — у эта последовательность будет совершать поворот намагниченности по оси z на угол ср (рис. 8.42). То, что произойдет в реальном эксперименте, будет сильно зависеть от качества спектрометра. Для выявления мнимой части эксперимента с квадратурным детектированием мы расположим эту группу импуль сов непосредственно после третьего импульса последовательности * То есть вызываемый импульсом поворот вектора намагниченности. Прим. перев.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР • * Г У Рис. 8.42. Составной z-импульс.

INADEQUATE [18] и, опустив взаимно погашающую пару импульсов (/2) и (п/2)-х, получим -Т-Я-Т-1-.

ч4/_, Существует еще возможность использовать фильтр типа эха. Она основана на зависимости интенсивности сигналов типа эха и анти-эха от длительности последнего импульса. Здесь слишком сложно дать полное обоснование такого эксперимента. Упомянем только, что задание по следнего импульса равным 2тс/3, по существу, устраняет компоненту анти-эха, не требуя дополнительных экспериментов со сдвигом фазы [19].

Выбор цифрового разрешения может быть сделан обычным путем.

Для этого необходимо стремиться сохранить время регистрации данных по t2 по крайней мере равным Г |, чтобы избежать потери чувстви тельности. Время регистрации данных по tt может быть очень коротким.

На первый взгляд может показаться, что полоса спектра по vx должна быть в 2 раза больше, чем по v 2, из-за того, что двухквантовые частоты являются суммой химических сдвигов. Но в действительности, если мы будем считать обе спектральные полосы равными, то, хотя и произойдет отражение двухквантовых частот, это не приведет к неоднозначностям (рис. 8.43). Последовательность связей углеродных атомов скелета вы является так же, как уже описано выше, а при определенных обстоя тельствах чувствительность для одинакового времени эксперимента улучшается в ^fl раз [20].

Исходный эксперимент INADEQUATE. Наконец, мы подошли к тому, с чего началось измерение углерод-углеродных констант спин спинового взаимодействия. Строго говоря, этот предмет не совсем подходит для главы, посвященной гомоядерной корреляции. Но он столь тесно связан с описанными выше экспериментами, что было бы неразумно его от них отрывать. Углерод-углеродные взаимодействия проявляются в спектрах 1 3 С как 13 С-сателлиты линий. Сателлиты, обусловленные прямыми константами, находятся на расстоянии 15-25 Гц от линий и, конечно, имеют амплитуду, составляющую 0,55% 22* 340 Глава Рис. 8.43. Схематическое представление двумерного спектра INADEQUATE, та кое, как на рис. 8.39, но с заведомым отражением по v,. Это не вносит никакой неоднозначности.

от основного сигнала. Константы через две и три связи, имеющие значения 0-15 Гц, проявляются в виде сателлитов на расстоянии 0-7 Гц от основной линии. Для реальных форм линий, полученных на сверх проводящих магнитах, это означает, что сателлиты от прямых констант должны непосредственно легко наблюдаться, а сателлиты от дальних констант могут потеряться на крыльях линии. Трудности могут воз никать не только при плохой форме линии, но также из-за боковых полос от вращения, имеющих обычно интенсивность порядка 0,1-1%, и, конечно, из-за примесей. Чтобы надежно обнаруживать линии сателли тов, весьма полезно устранить из спектра основной сигнал вместе с боковыми полосами от вращения, а также вообще все сигналы, кроме сателлитов.

Как мы уже знаем сейчас, этого можно достигнуть с помощью двухквантовой фильтрации. Если мы не будем проводить изменений t в двумерном INADEQUATE (т. е. фиксируем tx = 0), то получим после довательность -GUI представляющую собой одномерный эксперимент с двухквантовой фильтрацией. Использование уже описанного циклирования фазы (ко нечно, без компоненты квадратурного детектирования по tx) приводит к спектру, в котором подавляются все сигналы, возникающие от не связанных ядер. В то же время сигналы спиновых систем АВ или АХ останутся в спектре, хотя и без какого-либо улучшения чувствитель ности, поскольку мы по-прежнему наблюдаем сигналы от 0,01% ядер.

Компоненты дублетов проявляются в виде характерных линий с проти воположными фазами (рис. 8.44). Для достижения успеха в этом экспе рименте требуются большое количество вещества и столь же высокая стабильность работы спектрометра, как в экспериментах с ЯЭО, а также правильный выбор частоты повторения и т. Последние два условия широко обсуждаются в книге Бакса [5] (гл. 5), поэтому я не буду здесь их рассматривать.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР Рис. 8.44. Часть 1 3 одномерного спектра INADEQUATE C для атома углерода, Ц связанного с двумя другими;

можно раз I личить две разные прямые константы. Хо I рошо виден небольшой остаточный сиг нал от JI »о(«ал».ып основной (нерасщепленной) линии;

аю«пр \ попадает точно на центр дублетов он не i' i' I' I'I' вследствие изотопного сдвига при замеще 40 20 20 нии12Сна13С.

А- " Вследствие ограничений по чувствительности и из-за специфичности информации, получаемой из спектра INADEQUATE, маловероятно, что этот эксперимент станет широко использоваться в его первоначальной форме. Однако идея использования двухквантового фильтра (или фильт ра более высокого порядка) в одномерном спектре для разделения сигналов, представляющих интерес, от основных интенсивных сигналов имеет много возможных приложений, в частности в биохимии. Одним из очевидных примеров было бы прослеживание дважды меченных по 1 3 С метаболитов непосредственно в биологической системе. Такой экспе римент следовало бы сравнить с методом обратного переноса поля ризации, уже рассмотренным в гл. 6, и с методиками разностного спинового эха в гл. 10.

8.5.2. NOESY или обменная спектроскопия Введение. Если вы вернетесь назад и снова посмотрите на рис. 8.1, то поймете, что существует еще одна получаемая при действии последо вательности COSY компонента намагниченности, которую мы до сих пор полностью игнорировали. Это часть поперечной намагниченности, возвращенная к направлению оси z при действии второго импульса.

Отметим, что та намагниченность также модулируется как функция tlt т.е. она представляет собой частоту, меченную точно так же, как и намагниченность в плоскости х — у. Конечно, в COSY эта компонента не генерирует сигналов, поэтому нам даже не следует беспокоиться о том, чтобы устранить ее при циклировании фазы. Однако, поскольку она была вовлечена в некий физический процесс, мы можем провести двумерный эксперимент, который позволит его зарегистрировать. Для этого нужно возвратить намагниченность в плоскость х — у и про детектировать возникающий сигнал. Можно представить себе по край ней мере два информативных взаимодействия, в которые может быть вовлечена z-компонента меченой частоты: химический обмен с другим ядром и ядерный эффект Оверхаузера.

342 Глава Результат химического обмена, возможно, легче представить. Если мы выжидаем время после второго импульса, используя последова тельность Я Я П называемую NOESY, в таком случае при наличии обмена то ядро, z-намагниченность которого модулируется при одном химическом сдви ге в течение tx, может мигрировать к другому положению за период хт, называемый временем смешивания. Следовательно, оно имеет другой химический сдвиг в течение периода t2, и результирующий спектр будет похож на спектр COSY, а кросс-пики будут наблюдаться между обме нивающимися положениями. Этот эксперимент, применяемый для об наружения химического обмена, представляет собой двумерный аналог обычного эксперимента по переносу намагниченности и для сложных систем должен обладать обычными преимуществами двумерных спект ров. Однако, как мы увидим дальше, он имеет целый ряд технических недостатков.

Ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) также приводит к тому, что изменения в z-намагниченности одного ядра приводят к изменению z-намагниченности другого. Поэтому пары ядер, которые показывали бы ЯЭО в одномерном спектре, могут иметь кросс-пики в данном двумерном эксперименте. В методе обычного равновесного ЯЭО, ко торый рассмотрен в гл. 5, изменение z-намагниченности, используе мое нами, представляет собой насыщение (т.е. устранение) ее, но при этом любое нарушение теплового равновесия также может воздейст вовать на заселенности соседних ядер. NOESY является двумер ным аналогом неравновесного ЯЭО, рассмотренного в гл. 5 (разд.

5.2.4).

Итак, эксперимент NOESY позволяет определять пути химического обмена и устанавливать пространственную структуру быстро и с хоро шим разрешением, что характерно для двумерного метода. Таким, образом, он кажется весьма привлекательным. Я не хотел бы показаться слишком пессимистичным, но все же должен указать вам на ряд основных трудностей, связанных с его применением. Очевидно, что обменные и ЯЭО-взаимодействия здесь невозможно различить. Но тот же недостаток свойствен и обычным одномерным методам, поэтому нет причины на этом основании избегать использования NOESY. Обычно из химии известно, могут ли протекать обменные процессы в данном соединении, что позволяет правильно интерпретировать спектр NOESY.

В стадии развития находятся различные эксперименты, в том числе так называемая zz-спектроскопия [21], которая позволит отличить обмен от ЯЭО. Но она пока не находит широкого применения. Две существенно более серьезные трудности возникают при выборе задержки т т и из-за возможного присутствия перекрывающихся кросс-пиков, обусловленных спин-спиновой связью.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР Выбор гт. Задержка хт должна выбираться таким образом, чтобы происходил максимальный обмен или сформировался максимальный ЯЭО перед тем, как конечный импульс прикладывается к z-намагни ченности. Это потребовало бы знания значений времен 7\ вовлеченных во взаимодействие ядер, а также скорости обмена или формирования ЯЭО. Если мы знаем только один из этих двух параметров, то нам трудно начать эксперимент без предварительных допущений. Здесь существует четкая разница между возможным диапазоном хт для опре деления обмена и для ЯЭО (в последующем изложении я подразумеваю, что вам известны динамические эффекты в спектрах ЯМР;

см., напри мер, гл. 8 в книге Гюнтера [22]).

Конечно, химический обмен может происходить фактически с лю быми скоростями. Очевидно, что с помощью NOESY можно изучать область медленного обмена. Основываясь на разности химических сдвигов обменивающихся ядер, мы можем оценить верхнюю границу его скорости. Для двухпозиционного обмена с равными заселенностями и разностью их химических сдвигов Av при коалесценции сигналов константа скорости процесса кс равна яДу/^/2. Поэтому при медленном обмене в нашем случае скорость обмена к должна быть заведомо меньше, чем кс. В то же время к не должна быть намного меньше 1/Tj.

В противном случае частотно-меченая z-намагниченность исчезнет до того, как произойдет миграция. Диапазон значений к, для которых имеет смысл эксперимент NOESY, лежит между этими двумя границами. Чаще всего полезно использовать одномерный вариант намагниченности или NOESY в области довольно медленного обмена, где к не слишком сильно отличается от 1/7^, поскольку именно в этой области не су ществует других методов получения сведений о химическом обмене.

В этом случае оптимальное значение хт для обнаружения обмена, протекающего со скоростью к между равнозаселенными положениями, зависит от kTt и медленно изменяется от значения 0,5/к при к = 1/Ti до 1,5/к при к = 10/7^. Обычно к точно не известна, поэтому вполне разумно для грубой оценки т т принять его равным 1//с.

На практике бывает необходимо выполнить несколько эксперимен тов, используя различные оценки для к. Даже такой требующий значи тельного времени эксперимент все же дает только качественную инфор мацию о путях обмена, поскольку пока нет простого метода коли чественного расчета констант скоростей из получаемых данных. Обе эти проблемы (определение хт и количественный расчет констант) могут быть решены при использовании метода «аккордеон-спектроскопии»

[11], в котором т т устанавливается пропорциональной времени t1. В нем трехмерный спектр можно эффективно представить в виде двумерного.

При этом по координате Vj расположены линии, формы которых зависят от величины к. Расчет констант скорости из такого спектра требует количественного анализа формы линии этих сигналов. Прог раммы такого анализа пока еще не очень широко доступны, поэтому я не буду дальше продолжать его обсуждение. Вполне возможно, что 344 Глава в будущем такие эксперименты найдут более широкое применение.

В противоположность химическому обмену формирование ЯЭО сдерживается скоростью продольной релаксации. Многие обстоятельст ва могут сделать формирование ЯЭО более медленным, чем 1/Ти но ничто не может заставить его возникать быстрее. Это означает, что, выбрав хт примерно равным 1/Т1? мы с большой вероятностью сможем наблюдать кросс-пики ЯЭО между соседними ядрами. Ядерные эффекты Оверхаузера между более удаленными ядрами формируются медленнее, поэтому для их регистрации нужны большие времена смешивания. Но конкурирующая продольная релаксация приводит к тому, что кросс пики в этом случае будут очень слабыми. Конечно, в одномерных экспериментах такие ЯЭО тоже очень слабые, но в эксперименте NOESY используется стационарная, а не равновесная намагниченность, поэтому трудности дополнительно возрастают. Кроме того, при спин-спиновом взаимодействии могут возникнуть артефакты, очень запутывающие картину двумерного спектра и затрудняющие идентификацию истинных кросс-пиков ЯЭО. И наконец, еще раз отмечу, что не существует простого способа получения количественных результатов в данном эксперименте. Мы имеем только указание на присутствие ЯЭО, но не надежное измерение его величины. Существование этих неблагоприят ных факторов объясняет, почему NOESY мало используется при изу чении небольших молекул. Однако при исследованиях белков этот метод приобрел большое значение. Причина в том, что большие молекулы белков совершают беспорядочные движения в растворе относительно медленно. В связи с этим в таких системах вклад в быструю диполь дипольную релаксацию дает процесс Wo (см. гл. 5). В них ЯЭО оказы ваются большими и отрицательными, и они быстро устанавливаются.

Примеры использования метода NOESY для отнесения сигналов в спектрах белков приведены в работах [23, 24].

Трудности, обусловленные спин-спиновым взаимодействием. Не уди вило ли вас то, что последовательность NOESY отличается от исполь зованной для метода DQF-COSY только введением интервала хт. Это означает, что в эксперименте могут присутствовать различные сигналы переноса когерентности, и, как обычно, нужная компонента выделяется при помощи фазового цикла. Легко видеть, что фаза сигналов, воз никающих от намагниченности, ориентированной вдоль оси z в течение времени хт, не зависит от фазы первых двух импульсов, но следует за фазой третьего. Поэтому большую часть нежелательных сигналов можно подавить либо совместным циклированием фазы первых двух импульсов в последовательности х, у, —х, —у при постоянной фазе приемника, либо совместным циклированием фаз последнего импульса и приемника. Квадратурное детектирование можно провести обычными способами -фазочувствительным или с фильтром типа эха. Однако, к сожалению, существует перенос когерентности, приводящей к сигналам с точно таким же фазовым поведением, как и желаемая z-компонента.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР Эта часть проходит через нуль-квантовую когерентность. Это значит, что в спектре NOESY для нашего соединения на кросс-пики, обуслов ленные ЯЭО или обменом, накладьшается спектр COSY с нуль-квантовой фильтрацией, причем циклирование фазы не может препятствовать этому. Очевидно, что для связанных систем эта проблема неразрешима.

Она сродни эффектам SPT, возникающим в одномерных экспериментах по ЯЭО, но в двумерном эксперименте трудно или невозможно различать реальные и нуль-квантовые кросс-пики.

Было предложено несколько решений этой проблемы, но ни одно из них нельзя считать полностью удовлетворительным. Простейший прием сводится к варьированию интервала т т случайным образом при переходе от одного прохождения к другому. Интенсивность кросс-пиков, обуслов ленных ЯЭО или обменом, медленно изменяется с изменением хт, тогда как пики переноса когерентности модулируются с нуль-квантовыми частотами, которые равны разностям химических сдвигов связанных ядер. Таким образом, по крайней мере некоторые из нуль-квантовых сигналов изменяются так же быстро, как и хт. Поэтому при благо приятном стечении обстоятельств они должны усредняться и исчезать после некоторого числа прохождений. Наилучший способ реализации этой идеи-введение я-импульса в хт:

я я я г 2 ~ h ~ 2 ~ Т ' ~ Ti ~ % ~ Т ' ~ 2 ~ ' Теперь хт равняется т, + 2т' (использованное здесь обозначение взято из работы [25]). Т;

и т;

можно изменять, в то время как хт сохраняется постоянным. Тогда обменные или ЯЭО-пики не изменяются от про хождения к прохождению, а нуль-квантовые пики модулируются как функция только т,, поскольку все эффекты в оставшейся части хт рефокусируются. Можно менять т,- случайным образом, но все же при использовании этого способа приходится полагаться на удачу, и на дежное подавление можно получить лишь при большом числе про хождений. Существует и другой метод, когда вычисляется оптимальный набор значений т,- для каждого числа прохождений, который также зависит от диапазона подавляемых нуль-квантовых частот, т.е. от разностей химических сдвигов между парами взаимодействующих ядер.

Оказывается, что самый лучший результат дает комбинация вычислен ных и случайных переменных при пошаговом изменении т, как функции / х. Тогда Т;

выражается следующим образом:

*.- = Т? + Xh + ^random (8-6) В работе [25] содержатся таблицы и формулы для определения наилуч ших значений т,? для разных сочетаний диапазонов химических сдвигов и числа прохождений на каждое значение tt.

Даже при использовании этого тщательно разработанного метода подавление нуль-квантовых компонент при малом числе прохождений на каждое значение t, оказывается весьма слабым, особенно в том Глава случае, если велик диапазон разностей химических сдвигов. Но по скольку эксперимент NOESY всегда имеет низкую чувствительность, как правило, при накоплении сигнала используется большое число про хождений. Если на каждом шаге по tx используется больше 10 про хождений, то подавление нуль-квантовых пиков становится вполне достаточным для типичных диапазонов химических сдвигов. Ко всему этому нужно добавить, что хт должно быть порядка T t. Поэтому очевидно, что эксперимент NOESY требует больших затрат времени.

1,-арен _л Ньь 6,0 4, Рис. 8.45. Отслеживание пути химического обмена во флуктуирующем металло органическом соединении.

Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР Рис. 8.46. Спектр NOESY производно го пенициллина (8). Метильная группа, обращенная под плоскость молекулы, показывает в спектре кросс-пик с од ним из р-протонов (Н 5 ) лактамного цикла. При облучении этого метила на лактамном протоне проявляется равно весный ЯЭО, составляющий 15%. На против, метильная группа, расположен ная над плоскостью молекулы, обнару живает корреляцию с протоном Н 3.

2,5 2,0 1, Примеры. Несмотря на все сказанное в двух предыдущих разделах, в действительности эксперименты NOESY все же можно проводить!

Я склонен думать, что обнаружение химического обмена с практической точки зрения представляет собой наиболее важное применение этого метода для небольших молекул. В качестве примера на рис. 8.45 при веден спектр NOESY для стереохимически нежесткого металлооргани ческого соединения, на котором можно проследить механизм обмена.



Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.