авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина

СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ

КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ

Калининград

1997

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г.Н. Чупахина

СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ

КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ

Монография

Калининград

1997

Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений: Монография. - Кали-

нингр. ун-т. - Калининград, 1997. - 120 с. - ISBN 5-88874-063-2.

В монографии дана характеристика системы аскорбиновой кислоты растений, включающей аскорбиновую, дегидроаскорбиновую и дикетогулоновую кислоты, а также ферменты, окисляющие и восстанавливающие аскорбат. Приведены результаты исследования действия полихроматического и монохроматического света на компонен ты системы, обсуждается вопрос о фоторецепторе светозависимого синтеза аскорбино вой кислоты. Рассматриваются пути биосинтеза аскорбата, компартментация данного процесса и субклеточная локализация кислот системы аскорбиновой кислоты. Иссле дована зависимость биосинтеза указанных кислот от фотосинтеза и дыхания. Впервые исследовалась дикетогулоновая кислота как компонент системы аскорбиновой кисло ты. Приводится метод получения альбиносных проростков, их физиолого биохимическая характеристика, рекомендация использования в качестве модели для изучения светозависимых процессов не связанных с фотосинтезом.

Для физиологов, биохимиков, преподавателей вузов, аспирантов и студентов.

Иллюстр. 30. Библиогр.: 461 назв.

Рецензент - зав. отделом химии фотосинтеза Института биоорганической химии и нефтехимии АН Украины, чл.-кор. АН Украины А.А. Ясников.

Печатается по решению редакционно-издательского Совета Калининградского го сударственного университета.

ISBN 5-88874-063-2 © Калининградский государственный университет, Галина Николаевна Чупахина СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ Монография Лицензия № 020345 от 27.12.1991 г.

Редактор Л.Г. Ванцева.

Оригинал-макет подготовлен Д.В. Голубиным.

Подписано в печать 25.12.1996 г. Формат 6090 1/16.

Бумага для множительных аппаратов. Усл. печ. л. 7,5.

Уч.-изд. л. 8,0. Тираж 200 экз. Заказ 92.

Калининградский государственный университет, 236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14.

ВВЕДЕНИЕ Аскорбиновая кислота - уникальное полифункциональное соединение. Об ладая способностью обратимо окисляться и восстанавливаться, она принимает участие в важнейших энергетических процессах растительной клетки - фотосин тезе [341, 378] и дыхании [451, 362];





является признанным антиоксидантом [8].

Несомненно ее участие в процессах роста, цветения, вегетативной и репро дуктивной дифференциации [230], в водном обмене [151], регуляции фермента тивной активности [46], стимуляции реакций метаболизма, связанных с обменом нуклеиновых кислот и синтезом белка [207, 365], в защитных реакциях растений [200, 2].

Особый интерес для биотехнологии представляет факт накопления аскорби новой кислоты в культуре растительных тканей и активации их роста аскорба том [288, 295]. В связи с этим знание условий, формирующих пул аскорбиновой кислоты зеленых растений, необходимо не только для программированного по лучения высоковитаминных растительных продуктов, что само по себе является важным для решения проблемы качества пищи, но и для понимания механизмов, определяющих продуктивность растений.

Возросший интерес к аскорбиновой кислоте как к лекарственному препарату [257] обусловлен противовирусным [395] и противоопухолевым действием ас корбиновой кислоты и ее дериватов [450], а также авторитетной рекламой дваж ды лауреата Нобелевской премии Л.Полинга [116]. При определении витамин ной ценности растительного сырья витамин С определяется как сумма взаимо превращающихся восстановленной и окисленной форм аскорбиновой кислоты [152]. Однако дегидроаскорбиновая кислота не всегда переходит в аскорбино вую, так как разрыв ее лактонового кольца ведет к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты, не обладающей витаминной активностью и практиче ски не исследованной у растений. Поэтому для всесторонней оценки роли ас корбиновой кислоты в метаболизме растений необходимо одновременное иссле дование всей системы аскорбата, включающей вышеназванные органические кислоты, а также ферментные системы, способствующие окислению и восста новлению аскорбиновой кислоты. Именно такие подходы к исследованию вита мина С [258, 430] являются наиболее перспективными.

Со времени открытия аскорбиновой кислоты интерес к этому соединению не проходит, хотя в последние годы он значительно снизился. Но это не говорит о том, что решены все проблемы, связанные с аскорбатом. Они есть. В частности, до сих пор не выяснены пути синтеза аскорбиновой кислоты, не до конца ясна ее роль в жизни автотрофных организмов, являющихся продуцентами и поставщи ками витамина С для человека. Решение этих вопросов требует нового уровня исследований, чему, несомненно, может служить изучение аскорбиновой кисло ты как компонента системы органических кислот: аскорбиновая дегидроа скорбиновая дикетогулоновая кислота.

В предлагаемой работе обобщены литературные данные и результаты собст венных исследований автора, касающиеся путей биосинтеза аскорбиновой ки слоты и субклеточной локализации аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дике тогулоновой кислот. Рассматривается действие полихроматического и монохро матического света на компоненты системы, зависимость биосинтеза анализи руемых кислот от фотосинтеза и дыхания. Для решения этих вопросов исполь зовались данные по биосинтезу кислот в проростках ячменя с измененным пиг ментным составом, в экспериментально полученных альбиносных проростках, а также при ингибировании и стимуляции дыхания интермедиатами цикла Кребса.



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АК - аскорбиновая кислота АО - аскорбатоксидаза ГН - глютатион восстановленный ГS-SГ - глютатион окисленный ДАК - дегидроаскорбиновая кислота ДКГК - дикетогулоновая кислота ДКС - дальний красный свет 2,4 - ДНФ - 2,4 - динитрофенол ИУК - индолилуксусная кислота КС - красный свет МДАК - монодегидроаскорбиновая кислота НАД - никотинамидадениндинуклеотид НАДФН+Н+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный ОПФЦ - окислительный пентозофосфатный цикл ПААГ - полиакриламидный гель СМ - стрептомицин УФ - ультрафиолет ФАР - физиологически активная радиация Фдк - фитохром с максимумом поглощения в области дальнего красного све та около 730 нм ФС I - фотосистема I ФС II - фотосистема II Хл - хлорофилл ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ЭТЦ - электрон-транспортная цепь Глава 1. КИСЛОТЫ И ФЕРМЕНТЫ СИСТЕМЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В 1927 году A.Сцент-Гиорги впервые выделил из некоторых растений и ко ры надпочечников неустойчивое вещество с сильно выраженными восстанови тельными свойствами, которое сначала назвал гексуроновой кислотой, затем аскорбиновой, учитывая ее антискорбутное (скорбут - цинга) действие. Химиче ская формула АК была предложена в 1933 году Хирстом и независимо от него Эйлером, а в конце 1933 г. ее правильность окончательно доказана Михеелем.

Химический синтез АК осуществлен Рейхштейном в 1932 г., когда структура ее еще не была известна. В 1933 г. Рейхштейн и Хаворс с Хирстом опубликовали методы синтетического получения АК. История открытия и изучения АК под робно описана Б.А. Кудряшовым [69].

В химическом отношении АК является лактоном 2,3-диэнол-l-гулоновой ки слоты с эмпирической формулой С6Н8О6. Она обладает сильно выраженными восстанавливающими свойствами благодаря наличию в молекуле диэнольной группы:

С ОН С ОН Окисляясь, АК легко переходит в дегидроформу:

O O C C НО-С О=С НО-С О - 2H О=С О H-C + 2H H-C HO-C-H HO-C-H СH2-OH СH2-OH L-аскорбиновая Дегидроаскорбиновая кислота кислота (восстановленная форма) (окисленная форма) Этот процесс обратимый, и ДАК может вновь восстановиться до l-AK.

Окисление АК до ДАК происходит в результате отдачи двух протонов и двух электронов. При окислении АК в особых условиях (УФ свет, температура жидкого воздуха) за счет отдачи только одного протона возникает свободный радикал - монодегидроаскорбиновая кислота. Это нестабильная, реакционноспо собная форма АК.

O O O O C C C C НО-С HO-С O-С O=С -H+ -H+ НО-С О О-С О О-С О -2e О=С О H-C H-C H-C H-C HO-C-H HO-C-H HO-C-H HO-C-H СH2-OH СH2-OH СH2-OH СH2-OH L-аскорбиновая Монодегидро- Анион дегидро- Дегидроаскор новая кислота аскорбиновая аскорбиновой биновая кис кислота кислоты лота Переход l-АК в ДАК двухэтапный. На первом этапе две молекулы l-AK дают начало двум молекулам монодегидроаскорбиновой кислоты. Далее они дисму тируют: одна молекула превращается в ДАК, другая - в l-АК [60].

Лактоновое кольцо в молекуле l-AK стабильно, а в ДАК легко гидролизует с образованием кислоты с открытой цепью - 2,3-дикетогулоновой кислоты [84].

Последняя может подвергаться окислительному распаду под действием гипоио дида натрия с образованием щавелевой и треоновой кислот:

O O C C - OH COOH О=С С=O COOH О=С О +H2O С=О Щавелевая кислота H-C H - C - OH HO - C - H HO - C - H COOH СH2 - OH СH2 - OH H - C - OH HO - C - H CH2OH Дегидроас- 2,3-дикето корбиновая l-гулоновая L-треоновая кислота кислота кислота Введенная экзогенно дикетогулоновая кислота при освещении хлоропластов фотоокисляется [453]. Под влиянием окисляющих АК ферментов происходит декарбоксилирование ДАК и ДКГК с образованием l-ксилоновой и l-ликсоновой кислот.

У растений, аккумулирующих щавелевую кислоту (шпинат, бегония, кисли ца), окисление введенной 1-14С-АК или 1-14С-ДАК происходит с образованием щавелевой и винной кислот. В проростках ячменя, которые не накапливают ща велевую кислоту, включение метки в последнюю происходит слабо. Отмечено, что метка из 1-14C-ДАК легко включалась в щавелевую кислоту шпината и кис лицы, а 1-14С-ДКГК очень медленно метаболизировалась в щавелевую кислоту.

Вероятно, для образования щавелевой кислоты существенно наличие лактоново го кольца в предшественнике [453].

У герани также два первые атома углерода АК включаются в молекулу ща велевой кислоты, а С4-фрагмент - в винную кислоту [445, 448]. Однако судьба двух первых атомов углерода АК может быть иной. Например, у винограда от резок цепи с первого по четвертый атом углерода включается в l-винную кисло ту, а оставшийся С2-фрагмент повторно вовлекается в цикл гексоз и продуктов их метаболизма. [445, 383]. При этом углерод первого атома АК может выс вобождаться в форме CO2 [272].

Изолированные листья Parthenocissus quinquefolia L метаболизируют АК с образованием l-треоновой и винной кислот. Показано, что треоновая кислота не является промежуточным метаболитом обмена аскорбата, превращающегося в винную кислоту [271]. Такими метаболитами могут быть l-идониновая, 2-кето-l идониновая и 5-кето-l-идониновая кислоты. В молодых тканях винограда вве денная АК превращается в 5-кето-l-идониновую кислоту через 2-кето-l идониновую и l-идониновую кислоты. Из С4-фрагмента 5-кето-l-идониновой ки слоты далее синтезируется l-(+)винная кислота. Считается [318], что именно l АК. является физиологическим интермедиатом на пути биосинтеза винной ки слоты в листьях винограда. Радиоактивность от 5-кето-l(6-14С)идониновой ки слоты обнаруживалась в сахарах и нерастворимом осадке [381, 382]. Следова тельно, обмен АК в растениях связан с органическими кислотами и углеводами, которые в одних условиях являются субстратом в биосинтезе АК, а в других для их образования используются фрагменты молекулы АК, полученные после ее деградации.

Таким образом, АК в растительных тканях может присутствовать в восста новленной форме, окисленной и в виде нестабильной монодегидроаскорбиновой кислоты. Восстановленная и окисленная АК находятся в свободном состоянии.

Известны три связанные формы АК: аскорбиген - соединение АК с полипепти дом;

комплекс АК с витамином Р и, вероятно, еще с каким-то неизвестным ве ществом;

третья связанная форма АК - это соединение АК с нуклеиновой кисло той через посредство минерального железа [158].

Обычно в растениях преобладает восстановленная форма АК. Накоплению ДАК препятствует ее нестабильность (особенно при рН выше 5), поэтому при измельчении тканей наблюдается быстрая потеря ДАК. Тем не менее измеримые количества ДАК присутствуют во многих тканях. Содержание окисленной фор мы АК в разных условиях неодинаково и иногда достигает высоких значений.

Так, в яблоках в начале созревания ДАК составляла 55% от общего количества АК и ДАК, а в конце - только 5-6% [35]. Соотношение двух форм АК может служить показателем физиологического состояния растений: высокая интенсив ность процессов жизнедеятельности - больше восстановленной АК, низкая ин тенсивность - растет содержание дегидроформы [68,34].

Для красных водорослей показано сезонное изменение соотношения АК/ДАК. В апикальной части таллома птерокладии оно достигало максимума в декабре, а к лету значительно снижалось. В базальной части соотношение АК/ДАК в течение года было низким и мало менялось [303].

АК в чистых растворах с сильно кислой реакцией среды и в растительных соках с нормальной кислотностью при рН ниже 7 не способна к самоокислению.

Однако в других растворах на воздухе АК быстро окисляется. Катализирующее действие на процесс неферментативного окисления АК оказывают гидроксиль ные ионы, двух- и трехвалентные металлы, особенно медь.

Известны четыре ферментные системы, принимающие участие в окислении АК. Это специфическая оксидаза АК - аскорбатоксидаза (1.10.3.3), цитохромная система, полифенолоксидаза (1.14.18.1) в присутствии полифенолов и перокси даза (1.11.1.7) в присутствии перекиси водорода [35].

Аскорбатоксидаза - медьсодержащий фермент, окисляет АК кислородом воздуха, но имеет ограниченное сродство к кислороду [26]. Механизм окисления АК пероксидазой и полифенолоксидазой - с помощью хинонов. Коферментами пероксидаз являются различные фенольные соединения, они окисляются до хи нонов, последние окисляют АК до ДАК:

кислород + фенол хинон;

хинон + АК ДАК + фенол.

Окислительно-восстановительные превращения АК ДАК тесно связаны с системой глютатиона: 2ГSН ГS - SГ + 2Н+, в которой восстановление окис ленного глютатиона катализируется ферментом глютатионредуктазой (1.6.4.2), а окисление идет при участии глютатиондегидрогеназы (аскорбата) (1.8.5.1) [409].

Есть мнение, что превращение ДАК в АК - неферментативный процесс [59].

Окислительно-восстановительная система АК у эвглены, по данным Шигео ки и др. [402, 403], включает следующие компоненты:

H2O2 (1) H2O (3) l-АК (3) Монодегидро-l-АК Дегидро-l-АК (2) НАДФ+ НАДФН+Н+ (4) ГS - SГ Г - SH где:

(1) - l-аскорбатпероксидаза, (2) - монодегидро-l-аскорбатредуктаза, (3) - неферментативная реакция, (4) - дегидро-l-аскорбатредуктаза.

Таким образом, система АК растений включает АК, монодегидро-АК, ДАК [239], которые обладают витаминной активностью. ДКГК, образующаяся из ДАК, уже лишена биологической активности. Количественный анализ ДКГК может служить показателем направленности процессов в системе АК ДАК, которая зависит от активности ферментов, окисляющих AК: аскорбатоксидазы, полифенолоксидазы, цитохромоксидазы и пероксидазы, а также ферментов, вос станавливающих кислоты системы АК: монодегидро-l-аскорбатредуктазы и де гидро-l-аскорбатредуктазы. В качестве восстановителя выступает система глю татиона ГS - SГ Г - SН и НАДФН+Н+. Высокий уровень АК стимулирует биосинтез аскорбатоксидазы [240,3] и подавляет аскорбатредуктазу [3].

ДКГК растений, рассматриваемая нами в системе АК, практически не иссле дована, исключая единичные работы [85,405,279,334,205] и работы автора [181, 174, 178], хотя следует подчеркнуть, что ее уровень дает информацию для пони мания функционирования системы АК ДАК.

Глава II. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЖИЗНИ АВТОТРОФНЫХ ОРГАНИЗМОВ 2.1. Участие аскорбиновой кислоты в энергетических процессах растений В хлоропластах содержится значительное количество АК, по весу не усту пающее содержанию хлорофилла, а выраженное в молях даже превосходящее его [123]. Этот факт, а также способность АК обратимо окисляться и восстанав ливаться могут определять ее участие в важнейшем энергетическом процессе зеленых растений - в фотосинтезе. Действительно, многие экспериментальные исследования подтверждают такую возможность. В частности, показано, что ас корбат способствует биосинтезу хлорофилла [237, 218] и восстановлению его в темноте при участии активной МДАК [38]. В семенах японской редьки при 48 часовом освещении возрастало содержание АК и пропорционально - содержание хлорофилла. Между количеством хлорофилла и АК отмечалась линейная зави симость при коэффициенте корреляции 0,96 [437].

Основываясь на опытах по обратимому фотохимическому восстановлению хлорофилла АК в растворах пиридина, А.А.Красновский [62, 66] полагал, что этот процесс может представлять одну из стадий фотосинтеза. Подтверждая на личие реакции А.А. Красновского, в результате которой образовывалась красная восстановленная форма хлорофилла при освещении его растворов в пиридине в присутствии АК, Т.Баннистер [213] уточнил, что донором электрона при фото восстановлении хлорофилла может быть анион АК, возникающий при ее диссо циации в среде воды и пиридина.

На роль АК как донора электронов в фотосинтетических реакциях или в ре акциях, тесно связанных с ними, указывал и Л.Мапсон [325]. Он считал, что АК может участвовать в переносе электрона от пластохиона к цитохрому f. Другие авторы также рассматривали АК как переносчика электронов при фотосинтезе [250, 335, 343]. По мнению Л.Мапсона, действительным переносчиком электро нов является нестабильная МДАК, способная участвовать в цепи реакций не циклического фосфорилирования в растениях [324].

При изучении фотоокисления аскорбата изолированными хлоропластами шпината было показано [221], что АК может замещать воду как донор электро нов для ФС II и что обе световые реакции и электрон-транспортная система ме жду ними принимают участие в фотоокислении АК.

В ныне признанных схемах циклического и нециклического переноса элек тронов в процессе фотосинтеза среди переносчиков электронов нет АК, но в мо дельных системах АК часто используется как экзогенный донор электрона для ЭТЦ фотосинтеза [298, 376, 384]. При блокировании переноса электронов между ФС I и ФС II дихлорфенилдиметилмочевиной электроны от АК могут поступать в ФС I [85].

АК необходима для фотофосфорилирования [51]. В ее присутствии лучше сохраняется без инактивации фотосинтетический аппарат клетки, увеличивается фосфорилирование изолированных хлоропластов [227, 203, 204, 249, 333], ста билизируется фотофосфорилирование фрагментов фотосинтетических мембран [341].

Таким образом, участие АК в процессе фотосинтеза может проявляться или в биосинтезе фотосинтетического аппарата растительной клетки, или в его ста билизации, что будет способствовать повышению его фотохимической активно сти, а в конечном итоге - фотофосфорилированию.

Предположение о том, что, обладая окислительно-восстановительными свой ствами, АК может участвовать в процессе дыхания, впервые было выдвинуто А.Сцент-Дьерди в 1927 г. Позднее ряд исследователей рассматривал АК как су щественный фактор дыхания [77, 328, 323]. К.Е.Овчаров [95] отмечал, что не случайно при прорастании семян имеет место энергичное образование АК, ведь энергия дыхания прорастающих семян очень высока.

Усиление дыхания под действием АК наблюдали многие авторы [313, 43, 46]. Так, в присутствии аскорбата увеличивалось поглощение кислорода изоли рованными проростками ячменя [278], суспензией хлоропластов шпината [199] и хлореллы, находящейся в темноте [59], срезанными стеблями томатов [377].

В процессе воздействия на дыхание важная роль принадлежит соотношению АК/ДАК, так как последняя, функционируя как переносчик водорода в дыха тельной цепи растений [323], отвлекает часть водорода окисляемого субстрата, что, вероятно, и приводит к торможению дыхания. Показано, что ДАК тормозит активность дегидрогеназ, интенсивность восстановительных синтезов, образова ние макроаргических связей. Поэтому повышение отношения АК/ДАК за счет уменьшения ДАК сопровождается усилением дыхания и роста растительных клеток [434].

При окислении субстрата за счет отнятия водорода последний при участии переносчиков передается в зависимости от вида растения, сорта или стадии ин дивидуального развития на цитохромную систему, флавиновую или аскорбаток сидазу. Этот фермент может отдать водород непосредственно на кислород и вы полнить функцию терминальной оксидазы [134]:

Глютатион Редуктаза Аскорбат редуктаза ДАК оксидаза SH2 НАДФ 2 глютатион-SH ДАК Н2О S НАДФН2 глютатион-S-S- АК 1/2 О глютатион Так как аскорбатоксидаза имеет ограниченное сродство к кислороду, можно полагать, что окисление через систему АК/ДАК имеет подчиненное значение.

Однако Мапсон и Мустафа [328] нашли, что у проростков гороха дыхание на 25% осуществляется за счет системы аскорбатоксидазы. При прорастании семян гороха примерно через пять дней в них появлялась аскорбиноксидазная система, для функционирования которой требовалась АК, восстановленный глютатион, НАД+Н+ и в качестве окисляемого субстрата - яблочная кислота. Аскорбинокси дазная система проростков была связана с растворимой частью цитоплазмы и не обнаруживалась в митохондриях.

По мнению Б.А.Рубина и М.Е.Ладыгиной [134], аскорбатоксидаза участвует и в дыхании хлоропластов, дыхательная цепь которых схематически изобража ется следующим образом:

Система пероксидазы ДАК АК — Аскорбинатоксидаза НАДФ+Н2+ О Хинон фенол — о-Дифенолоксидаза Цитохром в В молодых плодах лимона система переноса электронов от дыхательного субстрата - яблочной кислоты на кислород также включает АК, оксидоредуктазу АК и глютатион [410]. Интересно отметить, что, как показано в данной работе, глютатион и АК стимулировали дыхание только в августе - декабре, а в январе июне угнетали.

Наряду с фактами активации дыхания в присутствии АК известны примеры прямо противоположного ее действия. Так, наблюдалось ингибирование аскор батом дыхания корней проростков пшеницы в условиях торможения окисли тельной активности эндоплазматического ретикулума, что, вероятно, связано с усилением аскорбатзависимого перикисного окисления липидов [25]. Возмож ность стимуляции окисления жирных кислот (особенно стеариновой) в присут ствии увеличивающихся доз АК (до 106,56 мМ) была показана ранее [255].

Исследуя взаимосвязь между биосинтезом АК и развитием нечувствительно го к цианиду дыхания в срезах клубней картофеля, авторы [206] предположили, что АК необходима для синтеза белков, участвующих в дыхании по нечувстви тельному к цианиду пути. В связи с чем АК рассматривается как фактор, кон тролирующий данный тип дыхания.

Таким образом, АК может участвовать в дыхательном процессе как непо средственный переносчик водорода и как ко-фактор, стимулирующий процесс, о чем говорят данные только что рассмотренного исследования. Причем доля ды хания через систему АК/ДАК может колебаться и в некоторых случаях стано виться доминирующей. Так, у растений табака, пораженных картофельным ви русом У основной вклад в интенсивность дыхания вносила система глютатион аскорбат [315].

2.2. Влияние аскорбата на экспрессию генома, ферментативную активность, водный режим, ростовые и другие процессы Рассматривая вопрос о физиологической роли АК в растениях, Чикай и Сингх [230] указывают, что АК активирует реакции метаболизма, связанные с обменом нуклеиновых кислот. Это возможно за счет того, что АК играет роль дерепрессора, снимающего репрессорное действие гистонов на ДНК. Таким пу тем АК освобождает большее число матриц для синтеза мРНК [230, 398].

Наиболее существенное физиологическое воздействие АК на растения обу словлено тем, что она оказывает влияние на ферментативную активность. В ее присутствии активируется тиоглюкозидаза [276], мирозиназа [361], фермента тивный гидролиз бензилглюкозинолата [269], протеазы, амилазы, усиливается синтез РНК [231] и активность РНК-азы [338], хотя другие исследования [231] последнее не подтверждают.

Характер действия окисленных форм АК на ферментативную активность может быть иным, чем у восстановленной АК. Так, если восстановленная АК активировала фосфоглюкомутазу семян гороха, то ДАК снижала, а ДКГК - не оказывала влияния [205]. Другой пример: АК и ДКГК в анаэробных условиях не меняли активность ферментных систем, окисляющих сукцинат и глюкоза-6-фос фат, а ДАК при этом оказывала тормозящее действие [334].

Известны случаи ингибирующего влияния на активность ферментов и вос становленной формы АК. Это показано для полифенолоксидазы [4] и протеоли тических ферментов, для которых АК является антагонистом [390]. АК вызыва ла лаг-фазу в активности пероксидазы, которая снималась аскорбатоксидазой [224].

Механизм действия АК на ферментативную активность различных энзимов, вероятно, не одинаков. Активацию претеолитических ферментов аскорбатом объясняют [45, 46] тем, что в присутствии АК восстанавливаются дисульфидные группировки. Стимуляция тиоглюкозидазы может происходить за счет того, что АК вызывает конформационное изменение молекулы фермента, сопровождаю щееся увеличением сродства к субстрату [276]. Есть мнение [231], что действие АК затрагивает геном растений: она контролирует кодирующий механизм, диф ференцированно влияя на синтез РНК и скорость реакций различных ферментов.

Полагают, что АК может играть роль гормона, мобилизующего ферменты.

Таким образом, действие АК на ферментативную активность может прояв ляться или в изменении активности уже имеющихся ферментов, или в измене нии скорости их синтеза.

АК оказывает существенное влияние на водный режим растений. Оно про является в торможении поступления воды [44, 431, 433], уменьшении оводнён ности [44], в изменении подвижности внутриклеточной воды [153], ускорении транспирации [431, 433, 151]. Хотя в отношении последнего имеются и прямо противоположные данные [44].

Под действием АК изменяется соотношение свободной и связанной воды за счет увеличения свободной. Механизм действия АК на поступление и потерю воды объясняют [44] изменением коллоидно-химических свойств протоплазмы, а также деполяризацией протоплазменных мембран.

Важную роль АК играет в процессах роста и развития растений. Она обеспе чивает дружное и более быстрое прорастание семян у пшеницы, овса, кукурузы, кунжута и других растений [241, 230, 408];

активирует рост гипокотиля и корней [432, 400, 236], проростков люпина, растений ячменя [176] и помидоров, семя доли которых были удалены после прорастания [300], пазушных побегов [58].

Имеются данные о стимуляции роста стеблей тростника окисленной формой АК [443]. Определяя содержание АК в 5-7-дневных проростках гороха и кукурузы, Г.Ф.Проценко [122] показала, что растения, отличающиеся быстрым ростом, со держали меньше АК, чем медленно растущие. На основании чего автор полага ет, что АК принимает участие в биохимических превращениях, лежащих в осно ве роста. Действительно, АК меньше используется карликовыми сортами сорго [291], хотя ее содержание, как показано в данной работе, почти одинаково у вы соко-, средне- и низкорослого сортов.

Определенную роль АК играет в процессах цветения, вегетативной и репро дуктивной дифференциации. Она стимулирует растяжение и морфогенез клетки [385], цветение некоторых растений [166]. Уровень АК резко повышается в на чале дифференциации цветков [424]. Обработка растений АК увеличивает коли чество мужских и женских цветков, но уменьшает их соотношение по сравне нию с контролем [396]. Отмечено стимулирующее действие АК на клубнеобра зование картофеля и его прорастание [270, 393]. Введение АК в питательную среду значительно усиливало прорастание пыльцы хлопчатника, а обработка ра стений АК ускоряла образование и уменьшала опадение завязей [96]. Плоды аб рикоса и сливы быстрее созревали в присутствии АК [417]. Общее воздействие АК на растение проявляется в задержке старения листьев, то есть распада хло рофилла, РНК, ДНК [252].

Стимулирующее действие АК на ростовые процессы для каждого вида и сорта растений проявляется в определенных пределах концентраций. Обработка семян яровой пшеницы АК в концентрации 0,01% стимулировала ростовые про цессы, а в концентрации 0,1% - подавляла их [43]. Для корней кукурузы стиму лирующим рост оказался раствор АК в концентрации 0,05-0,005%, а в концен трации 0,05-2,5% - ингибирующим [88]. В ряде опытов [372] стимуляция роста отрезков колеоптилей овса под действием АК наблюдалась в узких пределах концентраций (0,3·10-3 - 4,5·10-3 М).

Наряду со стимуляцией роста при обработке растений АК происходит уве личение содержания последней [245, 184, 168, 264, 248, 253, 407], тем самым увеличивается суммарное воздействие АК на ростовые процессы.

Отмеченное в ряде работ отсутствие стимуляции или даже угнетение роста под действием АК [334, 352, 369, 428, 435] можно объяснить тем, что АК при окислении быстро превращается в ДАК, которая замедляет рост [47, 436]. Так, ингибирование роста, наблюдаемое у карликовых мутантов кукурузы, имело место при более высоком отношении ДАК/АК по сравнению с нормально рас тущими растениями и, как заключает автор, рост связан с более восстановлен ным состоянием клетки [340]. Хотя поддерживать его за счет восстановленной АК непросто, так как у карликовых и нормально растущих растений кукурузы наибольшая активность свободного и связанного с клеточными стенками фер мента, окисляющего АК, - АО - обнаружена в тканях мезокотиля с активным растяжением клеток. Таким образом, для активного роста растений необходимо высокое содержание восстановленной формы АК при активной АО.

Ингибирующее действие АК на ростовые процессы находит и другое объяс нение с учетом результатов следующего опыта: 30-дневные растения пшеницы опрыскивали в течение 11 дней 0,001 и 0,005 М растворами АК [412]. Это при вело к снижению высоты растений, количества побегов, массы надземной части, содержания общего количества свободных аминокислот. В связи с чем угне тающее действие АК на рост автор связывает с влиянием ее на синтез аминокис лот. Конкретнее, это может проявляться в ингибировании переаминирования глутаминовой кислоты и аланина [398].

Таким образом, в литературе имеются данные о стимуляции и ингибирова нии ростовых процессов у растений под действием АК. Естественно, это можно объяснить и видовой специфичностью объектов исследования, и конкретными условиями опытов. Но в любом случае для окончательного решения вопроса не обходим одновременный анализ всех кислот системы АК: АК ДАК ДКГК, так как свойства АК и ДАК как доноров электронов, источников водорода - пря мо противоположные, что, несомненно, сказывается на их воздействии на росто вые процессы. При этом легкость перехода АК в ДАК и наоборот усложняет си туацию определения действующего начала. Тем не менее большинство авторов разделяет точку зрения о том, что в присутствии АК отмечается стимуляция ростовых процессов.

Механизм действия АК на рост может быть двояким. С одной стороны, АК может выполнять функцию дерепрессора, снимающего репрессию синтеза ДНК гистонами, что определяет ее участие в работе кодирующего механизма клетки [230, 398]. С другой стороны, действие АК на рост может быть опосредовано через ауксины. Показано, что АК может тормозить окисление индолилуксусной кислоты, катализируемое пероксидазой, возможно, прямо связываясь с ИУК. В этом случае АК выступает как конкурентный ингибитор пероксидазы, защищая ИУК от разрушения [357]. Стоит отметить, что существовало мнение, согласно которому специфическая активность ауксинов сама является результатом их первичного воздействия на обмен АК [332].

Особый интерес для биотехнологии, и в частности для отработки методов культивирования растительных тканей, представляют данные о накоплении АК этими тканями и о стимуляции их роста АК [288, 295].

АК оказывает влияние на азотистый обмен растений. Обработка пшеницы раствором АК приводила к уменьшению в листьях количества свободных ами нокислот и некоторому повышению содержания нерастворимого азота [412].

Присутствие АК в функционирующих клубеньках вигны говорит о возможном ее участии в процессе азотфиксации [253].

Под действием АК активируются некоторые биосинтетические процессы.

Показана необходимость АК для биосинтеза оксипролинсодержащих белков в растениях [207, 365] и синтеза алкалоидов в недифференцированной каллюсной ткани мака снотворного [295]. АК вызывала снижение окислительно-восстано вительного потенциала березы, что ускоряло переход к вегетации, связанной с синтезом биополимеров [144].

Экзогенный аскорбат оказывает действие на разность поверхностных биопо тенциалов, сдвигая ее в область положительных значений у набухающих семян кукурузы и пшеницы [139]. АК снимала индуцируемое феррицианидом увели чение рО2 у элодеи и валлиснерии [93].

Таким образом, даже конспективное перечисление тех процессов, в которых принимает участие АК: фотосинтез, дыхание, рост, развитие, устойчивость, экс прессия генома, ферментативная активность, биосинтетические и биофизические процессы, азотфиксация, восстановление нитритов [214] - говорит о том, что АК затрагивает практически все стороны жизнедеятельности растений и относится к числу важнейших полифункциональных соединений автотрофных организмов.

2.3. Защитная функция аскорбиновой кислоты АК выполняет важную защитную функцию, что прежде всего проявляется в отношении растений к пониженным температурам. В ряде работ показана роль АК в формировании зимостойкости [1, 117, 147, 170, 202]. Это касается интро дуцируемых растений [72], плодово-ягодных культур [118, 188] и злаков [122, 126], зимостойкие сорта которых накапливали больше АК, чем менее зимостой кие.

Большое количество работ посвящено исследованию действия АК на им мунные свойства растений, так как считается, что одним из проявлений активно го иммунитета растений является нормальное или повышенное образование в них АК [27, 112, 119]. Например, содержание АК в плодах манго, превышающее 40 мг %, увеличивает их устойчивость к поражению бактериями, вызывающими черную пятнистость плодов [439].

Ответной реакцией на многие поражения растений является усиленный био синтез АК. Так, в листьях виноградной лозы, восприимчивых к антракнозу, об наружено повышенное содержание АК при высокой активности АО [44]. Высо ким был уровень АК в листьях баклажана, подверженных вертициллезному увя данию [389]. Обработка восприимчивых к нематоде сортов томатов раствором АК (45 мМ) на 96-99% снижала их поражаемость. Полагают, что АК использу ется для синтеза митохондриальных оксипролин-содержащих белков, которые определяют устойчивость томатов к нематоде [208].

Известно мнение, что защитную функцию выполняет не восстановленная АК, а ее окисленная форма [112], так как у устойчивого к пероноспорозу сорта гороха в клетках, расположенных у очага поражения, часть АК была представ лена окисленной формой. Она-то, как считают авторы, и служит барьером на пути возбудителя. У восприимчивых сортов гороха в местах проникновения па тогена обнаружена только восстановленная форма АК.

Защитное действие АК проявляется и при радиационном поражении расте ний. Предпосевное облучение сухих семян кукурузы различными дозами рент геновских лучей (до 22 тыс. рентген) и гамма-лучей (до 33 тыс. рентген) вызы вало при больших дозах радиации увеличение у растений содержания АК [145].

В связи с этим предпринимаются попытки выяснить защитное действие пре- и постобработки экзогенной АК на семена, подвергнутые воздействию гамма-из лучения [426]. Уже имеются данные о том, что замачивание семян ячменя в 0,5 М растворе АК за час до облучения снижало количество поврежденных об лучением проростков и стимулировало их рост [449]. При облучении в леталь ных дозах количество АК может уменьшаться, возможно, за счет того, что воз растает ее расход на окисление липидов [94, 406].

Столь же актуальным, как исследование защитной роли АК при радиацион ном облучении, является изучение защитных свойств соединений системы АК в отношении растений, обрабатываемых гербицидами [397]. Для практики сель ского хозяйства определенный интерес может представлять тот факт, что коэф фициент восстановления - окисления ДАК и АК соответственно был значитель но выше у сортов, устойчивых к полеганию [82].

Повышенным уровнем АК отличаются пораженные раком органы картофеля [76]. По данным Р.Маковер [316], АК ослабляет его побурение. Некоторые про изводные АК - аскорбат калия, аскорбат кальция - способны защищать листья фасоли от повреждений, вызываемых озоном [248]. Каким образом растения мо гут защищать себя от губительного действия озона, используя АК ? Предполага ется, что диффундирующий в листья озон прежде всего реагирует с АК, скон центрированной в клеточных стенках, и это ограничивает его проникновение в наиболее уязвимые ткани. Другие механизмы инактивации озона в клеточной стенке, такие, как разрушение его в результате образования перекисей и реакций с этиленом, вероятно, не столь эффективны [225].

Экзогенный аскорбат может снимать ингибирование нитратредуктазы в ли стьях овса в темноте вызванное перекисью [293]. Возможная функция АК и компонентов ее системы в растениях, находящихся в условиях стресса, рассмат ривается в ряде работ [455, 457-461].

Таким образом, при участии АК формируется устойчивость растений по от ношению ко многим неблагоприятным воздействиям: к пониженной температу ре, радиации, вирусной и бактериальной инфекции и т.д. Учитывая результаты цитированных выше работ, можно рекомендовать использование обработки АК для борьбы с возбудителями некоторых заболеваний растений. Кроме этого, уровень эндогенной АК может служить тестом, характеризующим устойчивость растений. В перспективе растения, обладающие высоким показателем тести рования по данному признаку, можно использовать при получении растений с заданными свойствами методами соматической гибридизации и генной инжене рии.

Глава 3. БИОСИНТЕЗ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ДЕРИВАТОВ 3.1. Субстраты для новообразования аскорбата Способностью синтезировать АК обладают растения различных уровней ор ганизации: грибы, водоросли, мхи, лишайники, хвощи, плауны, голосеменные и покрытосеменные растения. Присутствует она и в бактериях [152]. Содержание АК в растениях колеблется в значительных пределах, достигая рекордной вели чины в плодах австралийского растения терминалии фернандианы и мальпигии около 4000 мг % [162]. Виды растений, листья которых отличаются повышен ным содержанием АК, могут иметь самое различное таксономическое поло жение [198]. Растения легко синтезируют АК, но каким образом они это делают, до сих пор полностью не ясно [28].

Изучение путей синтеза АК началось с установления природы веществ, яв ляющихся исходными при ее новообразовании. Первые убедительные доказа тельства того, что АК образуется из гексоз, были получены в экспериментах С.Рай [371], которая показала, что у отрезанных зародышей гороха, растущих на стерильной синтетической среде, гексозосахара увеличивали содержание вита мина С. Со времени первых экспериментов прошло немало лет, однако до сих пор не ясно, какие именно сахара являются исходными для синтеза АК.

К.Л.Поволоцкая [115], испытав различные моно- и дисахара: глюкозу, фрук тозу, галактозу, лактозу, маннозу и сахарозу - показала, что все они, за исключе нием лактозы, используются в синтезе АК. Необходимость глюкозы для синтеза АК отмечала и К.З.Тульчинская [159].

Инфильтрируя в проростки овса различные соединения, В.Н.Девятнин [32] установил, что синтез АК усиливается при введении веществ, содержащих 6 уг леродных атомов и сходных по расположению отдельных атомов в положении С5-С6 с l-АК. Соединения, не отвечающие этим требованиям, как полагает автор, в биосинтезе АК непосредственного участия не принимают. Основным материа лом для синтеза АК, по его мнению, являются углеводы, и в первую очередь та кие углеводы и их производные, как инозит, сорбит, 2-кето-l-гулоновая кислота, левулоза и сорбоза.

Большое влияние на биосинтез аскорбиновой кислоты из экзогенных суб стратов оказывают условия освещенности. Так, в опытах Аберга [193] выдержи вание в темноте в течение 1-5 суток листьев овса и петрушки на 2,5-5%-ных рас творах сахарозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, ксилозы снижало в них содержание аскорбиновой кислоты и только при длительном выдерживании листьев (2-4 суток) на 10-20%-ных растворах сахарозы и 5%-ных растворах глю козы и ксилозы в темноте наблюдалось некоторое увеличение содержания ас корбиновой кислоты по сравнению с исходным. В наших исследованиях [98, 103] также подчеркивается необходимость света в образовании аскорбиновой кислоты из глюкозы.

Иного характера данные приводит Е.Ассольбергс [209]. Из большого набора исследованных им соединений (d-глюкоза, d-фруктоза, l-сорбоза, d-глюкуроно вая кислота, 2-кета-l-гулоновая кислота, глюкозоциклоацетоуксусная кислота и др.) только -лактон глюкуроновой кислоты вызывал значительное увеличение содержания аскорбиновой кислоты в листьях молодых побегов яблони, находя щихся на свету (18 тыс.люкс, 24,48 часов). Автор не нашел положительного дей ствия глюкозоциклоацетоацетата на биосинтез АК, в то время как ряд исследо вателей [350, 427] рассматривал это соединение как промежуточное при биосин тезе АК. Семена фасоли при проращивании в присутствии радиоактивной глю козы или радиоактивного глюкозоциклоацетоацетата использовали последний в пять раз лучше, чем глюкозу [427]. М.Натх и М.Белкходе [350] также отмечали преимущественное использование глюкозоциклоацетоацетата в биосинтезе АК по сравнению с глюкозой и ацетоацетатом.

В опытах М.Накатани [З48] ферментный препарат, выделенный из зароды шей 6-дневных зеленых проростков гороха, способных интенсивно синтезиро вать АК, катализировал образование АК из d-глюкуроновой, d-галактуроновой и особенно из диацетон-2-кето-l-гулоновой кислот. В присутствии d-глюкозы и d-галактозы синтез АК не шел.

Использование углеводов в биосинтезе АК в настоящее время не вызывает сомнения [368, 402]. Что касается исследования органических кислот как суб страта для образования АК, то здесь следует снова обратиться к работе В.А.Девятнина [32], в которой помимо уже названных соединений изучалось действие щавелевой, винной, фумаровой, янтарной, лимонной, альгиновой, АК и 2-кета-l-гулоновой кислот. При инфильтрации в проростки овса из них лишь по следняя увеличила содержание АК на 20% по сравнению с исходным. Введение АК поднимало собственный уровень лишь на 6%, фумаровой и лимонной - на 2,6. Винная и альгиновая кислоты не меняли содержание АК, щавелевая - сни жала его на 15%. В опыте использовались растения, выращенные на свету.

В своей работе по изучению действия органических кислот на биосинтез АК мы строго контролировали условия освещения во время опыта. В качестве суб страта использовали -кетоглутаровую, янтарную, винную, щавелевую, яблоч ную и лимонную кислоты в концентрации 0,005 М. Опытные 7-9-дневные про ростки ячменя, предварительно выдержанные в темноте в течение 48 часов, по мещали на растворы кислот в темноте и на свету люминесцентных ламп ЛЦД- (17 тыс. эргсм-2с-1) на 6 часов. В связи с тем, что использование глюкозы в про цессе биосинтеза АК является доказанным, в параллельных вариантах листья помещались на 0,005 М раствор глюкозы и на воду. Контролем служили расте ния, растущие во время опыта в темноте.

В таблице 1 представлены данные о действии винной кислоты на биосинтез АК в проростках ячменя. На растворе винной кислоты на свету содержание АК в листьях увеличилось в 2,5 раза по сравнению с контролем, тогда как на растворе глюкозы - общепризнанном субстрате для биосинтеза АК - в 2 раза, на воде лишь на 38%. Положительное действие на биосинтез АК винная кислота, так же как и глюкоза, оказывала только на свету.

Таблица Влияние винной кислоты на биосинтез АК в 8-9-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час;

интенсивность света 17 тыс. эргсм-2с-1) Вариант опыта АК t мкг/г % Контроль (а) 49,3 На воде:

свет (б) 67,8 138 а = 0, темн. (в) 50,9 103 в На 0,005 М растворе винной кислоты: б = 9, свет (г) 126,5 256 г темн. (д) 44,4 90 г = 12, е а = 0, д На 0,005 М растворе глюкозы: б = 6, свет (е) 99,0 201 е темн. (ж) 49,1 100 а = 0, ж n = 6, tтабл. = 2,57 для Р 0, Достаточно хорошо используется в биосинтезе АК и -кетоглутаровая ки слота (табл.2): содержание АК в листьях, плавающих на 0,005 М растворе -ке тоглутаровой кислоты, на свету увеличилось на 47%, на растворе глюкозы - на 44. В этой серии опытов использовались проростки с более высоким исходным содержанием АК, поэтому прибавка АК в абсолютных величинах не столь высо ка, как в предыдущих опытах, однако и здесь достоверно показано, что кетоглутаровая кислота используется в биосинтезе АК так же хорошо, как и глюкоза. Использование -кетоглутаровой кислоты в этом процессе идет только на свету.

Положительное действие на биосинтез АК оказала и янтарная кислота (табл.3). Содержание АК в листьях, находившихся на растворах янтарной кисло ты и глюкозы, увеличилось соответственно на 51 и 58%, на воде - на 39. В дан ных опытах выявлено достоверное накопление АК в листьях, находившихся в темноте на растворе янтарной кислоты и на воде. Вероятно, в определенных ус ловиях проростки содержат достаточное количество предшественника АК, что позволяет им осуществлять синтез АК и в темноте, независимо от наличия экзо генных субстратов.

В проростках ячменя, помещенных на 0,005 М раствор щавелевой кислоты на свету (табл.4), за 6 часов освещения содержание АК увеличилось на 55% по сравнения с контролем. В листьях на растворе глюкозы прибавка в содержании АК составила 56%, на воде - 32. Следовательно, щавелевая кислота наряду с винной, янтарной и -кетоглутаровой может использоваться как субстрат в био синтезе АК.

Таблица Влияние -кетоглутаровой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час;

интенсивность света 17 тыс. эргсм-2с-1) Вариант опыта АК t мкг/г % Контроль (а) 104,2 На воде: а = 5, свет (б) 142,7 137 в темн. (в) 115,0 На 0,005 М растворе -кетоглутаровой кислоты: б = 3, 152,8 свет (г) г 98,3 темн. (д) г = 0, е а = 1, д На 0,005 М растворе глюкозы: б = 8, свет (е) 150,1 144 е темн. (ж) 111,0 106 а = 1, ж n = 6, tтабл. = 2,57 для Р 0, Таблица Влияние янтарной кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час;

интенсивность света 17 тыс. эргсм-2с-1) Вариант опыта АК t мкг/г % Контроль (а) 126,6 На воде:

а свет (б) 175,7 139 = 4, в темн. (в) 140,9 На 0,005 М растворе янтарной кислоты: б = 3, свет (г) 191,7 151 г темн. (д) 137,8 109 г = 1, е а = 9, д На 0,005 М растворе глюкозы: б = 4, свет (е) 199,6 158 е темн. (ж) 135,8 107 а = 1, ж n = 6, tтабл. = 2,57 для Р 0, Таблица Влияние щавелевой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час;

интенсивность света 17 тыс. эргсм-2с-1) Вариант опыта АК t мкг/г % Контроль (а) 113,8 На воде:

а свет (б) 150,0 132 = 2, в темн. (в) 125,6 На 0,005 М растворе щавелевой кислоты: б = 7, свет (г) 176,4 155 г темн. (д) 144,4 127 г = 0, е а = 3, д На 0,005 М растворе глюкозы: б = 3, свет (е) 178,2 156 е темн. (ж) 130,5 115 а = 1, ж n = 8, tтабл. = 2,36 для Р 0, Наиболее активно биосинтез АК идет в проростках, помещенных на раствор щавелевой кислоты на свету, однако щавелевая кислота может использоваться и в темноте.

Содержание АК в проростках, используемых в опытах по изучению дейст вия яблочной кислоты на биосинтез АК, было низким (табл. 5), поэтому отмеча лось резкое возрастание содержания АК в освещенных листьях, находящихся на воде и на глюкозе (на 113 и 140%). В варианте же с яблочной кислотой увеличе ние АК составило всего лишь 48%, т.е. меньше, чем на воде.

Таблица Влияние яблочной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 7-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час;

интенсивность света 17 тыс. эргсм-2с-1) Вариант опыта АК t мкг/г % Контроль (а) 50,4 На воде:

а свет (б) 107,5 213 = 1, в темн. (в) 47,6 На 0,005 М растворе яблочной кислоты: б = 6, свет (г) 74,4 148 г темн. (д) 58,2 115 г = 7, е а = 0, д На 0,005 М растворе глюкозы: б = 3, свет (е) 121,2 240 е темн. (ж) 43,5 86 а = 3, ж n = 8, tтабл. = 2,36 для Р 0, В следующей серии опытов исследовалось действие лимонной кислоты на накопление АК (табл. 6). Здесь также отмечено резкое возрастание содержания АК в освещенных проростках, причем прибавка АК была почти одинаковой во всех вариантах: на воде - 89%, на растворе лимонной кислоты - 94%, несколько большее увеличение на растворе глюкозы - 104%. Во всех темновых вариантах прибавка АК составила 19-26%. Следовательно, в присутствии экзогенной ли монной кислоты скорость новообразования АК на свету не увеличивается по сравнению с контролем на воде, а в случае с яблочной кислотой даже уменьша ется.

Таким образом, наряду с углеводами в процессе биосинтеза АК могут ис пользоваться соединения, содержащие более короткую углеродную цепочку, в частности некоторые органические кислоты, такие, как щавелевая, янтарная, винная и -кетоглутарозая. Причем использование их идет преимущественно на свету, а в случае с винной и -кетоглутаровой кислотами - только на свету [110].

Стимуляцию накопления АК в присутствии экзогенной щавелевой и винной ки слот можно объяснить исходя на того факта, что деградация АК в растениях идет с образованием данных кислот. Следовательно, при их избытке, когда воз можно ингибирование процесса деструкции молекулы АК конечными про дуктами реакции, снижаются ее потери.

Таблица Влияние лимонной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час;

интенсивность света 17 тыс. эргсм-2с-1) Вариант опыта АК t мкг/г % Контроль (а) 73,8 На воде:


а свет (б) 139,6 189 = 19, в темн. (в) 92,3 На 0,005 М растворе лимонной кислоты: б = 0, свет (г) 143,6 194 г темн. (д) 87,6 119 г = 1, е а = 5, д На 0,005 М растворе глюкозы: 150,6 204 б = 1, свет (е) 92,9 126 е темн. (ж) а = 2, ж n = 6, tтабл. = 2,57 для Р 0, Стимуляцию синтеза АК экзогенными субстратам вообще, и органическими кислотами в частности, нельзя интерпретировать однозначно, как непосредст венное использование этих соединений при новообразовании АК. Возможно опосредованное ускорение биосинтеза АК через стимуляцию других процессов, например, ЦТК в случае с органическими кислотами - интермедиатами цикла [15]. Это предположение проверялось в опытах по исследованию действия экзо генного пирувата, декарбоксилирование которого дает уксусную кислоту, ис пользуемую в ЦТК. Исследования показали стимуляцию синтеза АК в листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе пирувата, по сравнению с вариантом, где в качестве субстрата использовался 0,005 М раствор глюкозы (рис.1). Поло жительное действие пирувата наблюдалось только у освещенных растений (рис. 2). Следовательно, существует связь биосинтеза АК с функционированием ЦТК на свету.

Рис. 1. Накопление АК в освещенных (31,5 тыс. эргсм-2с-1) листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе глюкозы (1) и 0,005 М растворе пирувата (2) различное время Рис. 2. Действие экзогенного пирувата (0,005 М) на накопление АК в листьях ячменя в темноте (1) и на свету (31,5 тыс. эргсм-2с-1) (2) Более достоверные и информативные данные при исследовании возможно сти использования в биосинтезе АК тех или иных соединений, несомненно, дает метод меченых атомов. Показано, что изолированные листья девичьего виногра да пятилисточкового (Parthenocissus quinquefolia.) трансформируют меченую d-глюкозу (5-3H-1-14С-глюкозу и 3H-, 14С-глюкозу) в АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы [271, 272]. Таким образом, метод позволяет не только однозначно решить вопрос о возможности использования конкретного субстрата в биосинтезе АК, но и дает материал для решения вопроса о путях ее биосинтеза. Подробнее эти два взаимосвязанных вопроса будут рассматриваться в следующем разделе.

3.2. Химизм биосинтеза Установление веществ, необходимых для образования АК, является лишь первым этапом в изучении путей ее синтеза, которые до сих пор полностью не исследованы [28, 306]. Наиболее значительные работы в этой области выполне ны двумя группами исследователей: Ф.Ишервуд, Л.Мапсон, Г.Чжень и Ф.Ловус, Р.Джанг, а в последние годы - Ф.Ловус в сотрудничестве с Я.Хелспером, К.Саито и др. уже больше внимания обращали не на биосинтез, а на метаболизм АК.

Большинство авторов наиболее вероятными предшественниками АК счита ют d-глюкозу и d-галактозу [150]. Это значит, что при превращении их в l-АК гидроксильные группы у пятого углеродного атома должны быть перемещены из d, положения в l. Это может осуществиться прямой инверсией групп у С5 или инверсией всей цепи так, что С-1 d-глюкозы станет С-6 углеродной цепи АК.

Имеется несколько возможных механизмов для реализации этих изменений.

Ф.Ишервуд, Г.Чжень, Л.Мапсон [282, 283] считают, что превращение d-глю козы и d-галактозы в l-АК включает инверсию всей молекулы и идет без предва рительного расщепления углеродной цепи:

CHO CHO СH2OH CO Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H СH2OH СOOH СOOH СH2-OH D-глюкоза D-глюкуро- L-гулоно- L-АК новая кислота вая кислота * инверсия Биосинтез АК, по их мнению, более вероятно протекает из d-галактозы пу тем окисления ее в d-галактуроновую кислоту, восстановления d галактуроновой кислоты в l-галактоновую и окисления -лактона последней в l АК:

CHO CHO СH2OH CO Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О HO-C-H HO-C-H HO-C-H H-C H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H СH2OH СOOH СOOH СH2-OH D-галактоза D-галактуро- L-галактоно- L-АК новая кислота вая кислота Приведенная схема не включает всех промежуточных соединений на пути синтеза АК. Л.Мапсон и Ф.Ишервуд [327] более подробно анализируют превра щение d-галактуроновой кислоты в l-АК растительными экстрактами. Под влия нием экстракта из проростков гороха происходит превращение производных d галактуроновой кислоты в производные l-галактоновой кислоты и дальше в l АК. Этот процесс in vitro осуществляется в две стадии:

1) восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно--лактон под влияни ем фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы;

процесс идет за счет восстановленного НАДН;

2) окисление лактона в АК, требующее присутствия ферментного ком понента, заключенного в митохондриях.

Эффективность использования l-галактоно--лактона в биосинтезе АК пока зана и другими авторами [287], наблюдавшими при его введении в листовые пластинки Petroselinum crispum резкое возрастание АК, содержание которой че рез 190 часов достигало 12% от сухого веса.

Правильность предлагаемой схемы синтеза проверяется следующим обра зом: в качестве субстрата растениям дается предполагаемое промежуточное ве щество и регистрируется, насколько быстро из него синтезируется АК. В том случае, когда образование АК идет из d-глюкозы, непосредственным предшест венником l-АК будет l-гулоно--лактон [74, 283, 388]. Возможность использова ния в синтезе АК d-галактуроновой кислоты и гулонолактона отрицалась Е.Ассольбергсом [209], который показал, что в отрезанных листьях яблони они вызывали меньший синтез АК, чем водный контроль. Автор предполагал, что промежуточное вещество между глюкуроновой и АК может быть иным, чем -лактон.

Схема биосинтеза АК, предложенная Ф.Ишервудом с сотрудниками, нахо дит подтверждение в экспериментах с использованием экзогенных субстратов (in vivo) и ферментных препаратов (in vitro). Подкормка проростков салата, бо бов и гороха l-галактоно--лактоном легко дает l-АК. Д-глюкуроно--лактон и l гулоно--лактон также дают l-АК, но в намного меньшем количестве, чем соот ветствующие производные галактозы.

Ф.Ишервуд с сотрудниками первыми демонстрировали образование l-АК in vitro в экстрактах из проростков гороха, используя l-галактоно--лактон как суб страт. Ответственные ферменты были всецело локализованы внутри митохонд рий. L-галактоно--лактон быстро превращался в l-АК. Скорость превращения l гулоно--лактона в l-АК составляла лишь 1/20 от скорости предыдущей реакции [282].

Таким образом, группой Ф.Ишервуда получены экспериментальные данные в подтверждение того, что в биосинтезе АК могут быть использованы производ ные d-глюкозы и d-галактозы, причем последние: d-галактуроновая кислота, l галактоно--лактон - являются лучшими субстратами, чем соответствующие производные d-глюкозы. Этот путь образования АК, по мнению авторов, вклю чает инверсию углеродного скелета исходной молекулы и образование проме жуточных фосфорилированных продуктов.

Схема путей биосинтеза l-АК у Euglena gracilis, предложенная С.Шигеока [402], предусматривает возможность обмена метаболитами, образующимися из d-глюкозы и d-галактозы при перестройке их в молекулу АК:

Д-глюкоза Д-галактоза UДР-глюкоза UДР-галактоза (А) UДР-глюкуроновая кислота UДР-галактуроновая кислота Д-глюкуроновая кислота Д-галактуроновая кислота (В) Д-глюкуроно--лактон L-галактоновая кислота (В) L-гулоно--лактон L-галактоно--лактон (С) (С) L-аскорбиновая кислота Жирные линии на схеме показывают главный путь синтеза АК, в ней приве дены некоторые ключевые ферменты, катализирующие данный процесс:

(А) - UДР-глюкозо дегидрогеназа;

(В) - NАДР: l-гексонат дегидрогеназа;

(С) - l-гулоно--лактон дегидрогеназа.

Эффективным приемом в выяснении путей синтеза АК является ис пользование радиоактивных метчиков, что дает возможность проследить путь от исходного вещества до конечного продукта. Такие исследования с использова нием радиоактивных веществ проведены Ф.Ловусом с сотрудниками. В отде ленные созревающие плоды земляники вводились растворы гексоз, меченых по определенному атому углерода. Через 24-120 часов из плодов выделялась АК, в ней определялось место меченого углерода и величина его активности. Кроме земляники анализировались листья винограда, петрушки, проростки кресс-сала та, молодые побеги фасоли, Изолированные листья винограда трансформировали d-глюкозу в l-АК с со хранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы [272]. В ягодах земляники и побегах фасоли [217] исследовался биосинтез l-АК из l-гулоно-1,4-лактона и l-галактоно-1,4-лактона. Радиоактивность в l-АК была локализована в том же атоме углерода, что и в предшественнике. Результаты некоторых исследований, выполненных Ф.Ловусом с сотрудниками [308, 309, 310, 311, 312], суммированы в таблице 7.

Из представленных данных видно, что в плодах земляники и проростках кресс-салата молекула глюкозы, меченая по 1,2 или 6-му углеродному атому, превращается в l-АК, меченую соответственно по 1, 2 или 6-му атому углерода.

Это дало возможность авторам предполагать, что образование l-АК из d глюкозы и d-галактозы идет без разрыва углеродной цепи и без специфического использования одной или другой триозы. Данный случай рассматривается как один из путей образования АК в растениях, включающий образование фосфори лированных гексоз.

Иная картина была получена, когда в зеленые плоды земляники ввели d-глю куронолактон, меченый по первому углеродному атому. После 66-часовой экс позиции 97% метки было сосредоточено в 6-м углеродном атоме l-АК, что воз можно только при перестройке углеродного скелета [311].

Подобная инверсия цепи углерода имела место при введении в плоды земля ники d-галактуроновой кислоты [304]. Данные эксперименты подтверждают мнение Ф.Ишервуда и его коллег о том, что образование l-АК предусматривает инверсию молекул исходных гексоз. Однако необходимо иметь в виду, что в данном случае образование АК зависело от введения специфического углерод ного источника, такого, как d-глюкуронолактон. В нормальном процессе био синтеза АК этот путь, очевидно, не будет главным.


Таблица Включение субстратов - 14С в l-АК Распределение меченого С в молеку Объект Субстрат ле АК, в % от общей активности С1 С2 С3 С4 С5 С d-глюкоза-1-14С Проростки кресс- - - - - салата d-глюкоза-1-14С 65-70 7-8 2-8 14- d-глюкоза-2-14С Созревающие плоды 69-73 0-6 22-23 2- d-глюкоза-6-14С земляники 24 1 1 2 - - - d-глюкуронолактон-1 С d-галактоза-1-14С 45 - 8 6 - Следовательно, в растениях существует и другой путь синтеза l-АК из d глюкуронолактона и d-галактуроновой кислоты, который не включает образова ние промежуточных фосфорилированных продуктов и предусматривает образо вание l-АК с инвертным порядком углерода С-цепочки по сравнению с исходной уроновой кислотой или лактоном.

Предположение о существовании в растениях двух путей синтеза l-АК, вы двинутое Ф.Ловусом и др., встретило возражение со стороны Ф.Ишервуда и Л.Мапсона [282]. Так как экспериментальные доказательства в пользу отсутст вия инверсии углеродной цепи глюкозы при образовании АК зависят от чистоты ее изолирования, то можно предположить, что существует радиоактивное за грязнение АК, которое трудно удалить. Таким загрязняющим веществом авторы считают d-арабоаскорбиновую кислоту, которая может быть образована сле дующим образом: d-глюкоза 6-фосфо-d-глюконовая кислота 3-окси-6-фос фо-d-глюконовая кислота 3-окси-d-глюконовая кислота d-арабоаскорбино вая кислота. Важно отметить, что глюкоза, меченая по первому углеродному атому, даст d-арабоаскорбиновую кислоту, меченую также по первому углерод ному атому, так что действительная картина превращения d-глюкозы в l-АК бу дет завуалирована.

В связи с тем, что в синтезе АК галактоза используется лучше, чем глюкоза, а радиохимические доказательства отсутствия инверсии в отношении галактозы менее определенны, чем в отношении глюкозы, то необходимы дальнейшие ра боты, чтобы решить вопрос, существуют ли два пути синтеза l-АК в растениях, как предполагает Ф.Ловус [305], или один путь, включающий инверсию угле родной цепочки d-глюкозы или d-галактозы при образовании l-АК, как считает Ф.Ишервуд и др.

3.3. Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот Внутри растительной клетки АК распределена неравномерно. Содержание ее в субклеточных структурах во многом зависит от их функционального состоя ния [195, 289] и от внешних условий [181, 273]. Обнаружение АК в тех или иных органоидах еще не дает основания связывать ее биосинтез с данными компар тментами, так как между клеточными структурами постоянно идет обмен мета болитами. Поэтому при решении вопроса о внутриклеточной локализации био синтеза АК в листьях ячменя нами не только учитывались данные по количест венному распределению аскорбата [178], но и исследовалось накопление АК и ее дериватов - ДАК и ДКГК - при ингибировании хлоропластных, митохондриаль ных и цитоплазматических рибосом в зеленых, этиолированных и альбиносных листьях ячменя.

Содержание АК, ДАК и ДКГК определяли по методу В.В.Соколовского, Л.В.Лебедевой, Т.Б.Лиелуп, приспособленному нами для анализа растительного материала [172]. В качестве ингибитора хлоропластных рибосом использовали стрептомицин, связывающийся с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Цитоплазма тические рибосомы блокировали циклогексимидом в концентрации 15 мкг/мл [155], митохондриальные - хлорамфениколом (100 мкг/мл) [185], учитывая, что к нему чувствительны и рибосомы хлоропластов [7].

Растения, полученные из обработанных СМ семян (альбиносы), имели аль биносное основание, зеленую верхушку и желто-зеленую переходную зону.

Анализ содержания АК, ДАК и ДКГК в участках листа с различной пигментаци ей (рис.3) показал присутствие анализируемых кислот и в альбиносной ткани, где уровень АК и ДАК был несколько ниже, чем в верхней и средней зоне листа, но в большем количестве обнаруживалась окисленная форма АК. Таким обра зом, альбиносная ткань обладает способностью синтезировать АК и ее произ водные, несмотря на значительные нарушения структуры некоторых клеточных органоидов.

Рис. 3. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней (1), средней (2) и нижней альбиносной (3) частях мутантных листьев ячменя Правомерно возникает вопрос о возможности транспорта АК из зеленой тка ни листа в альбиносную, так как в растениях АК может из листьев передвигаться по проводящим пучкам флоэмы, по центральной полости стебля и по межклет никам паренхимы даже в корни [169]. Исследования, выполненные на листьях хлорофитума с различным содержанием белой ткани, показали, что в срезанных листьях не происходит переброса меченых ассимилятов из зеленой ткани в бе лую ни на свету, ни в темноте [14], хотя стоит учесть, что характер расположе ния белых зон у хлорофитума и у частично альбиносных листьев ячменя раз личный.

С целью изучения компартментации процесса биосинтеза АК исследовалось накопление ее в одновозрастных зеленых, этиолированных и альбиносных про ростках ячменя. В опытах использовались не целые листья, а лишь нижние их участки, по размеру соответствующие альбиносной зоне мутантных листьев.

Длительное выдерживание зеленых проростков ячменя в темноте снижало в них уровень АК, а последующее освещение стимулировало ее накопление [181].

Этюд определялась постановка наших опытов, в которых масштаб светозависи мого накопления АК определялся в проростках, отличающихся по степени сформированности фотосинтетического аппарата после длительного выдержи вання их в темноте (рис.4). После 48-часовой темновой экспозиции проростки значительно отличались по содержанию восстановленной формы АК: макси мальное количество аскорбата обнаружено в этиолированных проростках, ми нимальное - у альбиносных, зеленые проростки содержали лишь 62% АК от уровня ее в этиолянтах.

Рис. 4. Действие света (33 тыс. эргсм-2с-1) на содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в 7-дневных зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в) проростках ячменя, выдержанных 48 часов в темноте Последующее освещение в течение 24 часов увеличило количество АК во всех типах проростков, но масштаб светозависимого накопления аскорбата был неодинаков;

если у зеленых проростков произошло удвоение содержания АК, то у альбиносов и этиолированных проростков прирост АК составил лишь 36 и 19% соответственно.

Следовательно, проростки, отличающиеся по пигментному составу и по сте пени сформированности фотосинтетического аппатара, обладают разной спо собностью накапливать АК. Пул АК на свету определяется новообразованием и одновременно идущими процессами ее использования, в которых восстановлен ная форма АК обратимо окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты, а разрыв лактонового кольца в последней приводит к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты.

Одновременный анализ указанных кислот показывает направленность про цессов в системе АК ДАК ДКГК. Так, в зеленых проростках на свету уменьшается уровень ДАК при одновременном возрастании количества ДКГК, тогда как у этиолированных проростков сумма дериватов не меняется и остается на более низком уровне, чем в пигментированных листьях. В связи с этим можно полагать, что у зеленых проростков на свету восстановленная форма АК исполь зуется активнее, чем у этиолированных и, следовательно, действительный уро вень светозависимого биосинтеза АК в зеленых проростках выше определяемо го. Следует отметить, что если у этиолированных проростков на свету количест во ДАК увеличивается, то у зеленых уменьшается, что, вероятно, происходит за счет фотовосстановления ДАК до АК, которое имеет место в хлоропластах [286].

Таким образом, учитывая структурные и физиологические различия зеле ных, этиолированных и альбиносных проростков и их способность синтезиро вать АК на свету, можно было бы связывать биосинтез аскорбата с хлоропла стами и, вероятно, с процессом фотосинтеза. Но, как показали проведенные опыты, АК накапливается в больших количествах в этиолированных проростках в темноте, а светозависимый биосинтез ее идет и у альбиносных проростков при увеличивающемся использовании АК на свету, так как в этих условиях нараста ло количество продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Альбиносные проростки были получены из семян, обработанных стрептомицином, который взаимодейст вует с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Следовательно, светозависимое на копление АК может идти при ингибировании хлоропластных рибосом, и можно предположить, что ферменты, участвующие в метаболизации углеводов до АК, синтезируются без участия данных структур.

В последующих опытах выяснялось влияние ингибирования митохондри альных рибосом на биосинтез АК, так как ранее при исследовании количествен ной локализации АК в листьях ячменя было показано светозависимое накопле ние АК во фракции, включающей митохондрии [178]. Ингибирование митохон дриальных рибосом осуществлялось хлорамфениколом (100 мкг/мл), к которому чувствительны и рибосомы хлоропластов. В опытах использовались зеленые и альбиносные проростки, выдержанные 48 часов в темноте. Нижние участки ли стьев данных проростков, а также этиолированных вырезались и помещались основанием в воду (контроль) или раствор хлорамфеникола на свет (рис. 5).

У контрольных зеленых проростков на свету количество АК увеличилось на 134%, ДКГК - почти вдвое. В присутствии хлорамфеникола уровень светозави симого накопления АК и ДКГК понизился с одновременным возрастанием со держания окисленной формы. В этиолированных проростках, также как и у зе леных, в присутствии хлорамфеникола на свету синтез АК тормозился, и только у альбиносов светозависимое наколение АК не ингибировалось хлорамфенико лом. Таким образом, в присутствии хлорамфеникола светозависимое накопление восстановленной формы АК снижалось у этиолированных и зеленых проростков и не менялось у альбиносных.

Рис.

5. Действие хлорамфеникола на содержание АК, ДАК и ДКГК в зеленых (а), этиолированных (б) и альбиносных (в) листьях ячменя, находящихся на свету (33 тыс. эргсм-2с-1). Проростки предварительно 48 часов выдерживались в темноте Хлорамфеникол оказывает ингибирующее действие на 80S-рибосомы мито хондрий, но известно его влияние и на синтез белков хлоропластов, преимуще ственно высокомолекулярных [81]. Поэтому снижение уровня АК у зеленых и этиолированных проростков в присутстсвии хлорамфеникола может быть ре зультатом действия его на оба типа рибосом. У альбиносных проростков на све ту масштаб накопления АК в присутствии хлорамфеникола не менялся, и это дает основание считать, что синтез ферментов, участвующих в метаболизации углеводов до АК, может идти без участия не только хлоропластных рибосом, но и митохондриальных.

Светозависимое накопление АК, блокируемое хлорамфениколом,в зеленых проростках составило 35% от всей синтезированной на свету АК, в этиолиро ванных - 54. Следовательно, как минимум половина АК листьев ячменя синте зировалась в присутствии ингибитора хлоропластных и митохондриальных ри босом. Разницу в масштабе ингибирования светового синтеза АК в зеленых и этиолированных проростках хлорамфениколом можно объяснить, допустив, что фотовосстановление ДАК в хлоропластах - чисто фотохимический процесс, идущий без участия ферментов, хотя восстановление ДАК до АК возможно с помощью дегидроаскорбатредуктазы. Скорее всего, эти проростки отличаются разной скоростью использования АК на свету и неодинаковой обеспеченностью субстратом процесса биосинтеза АК.

Рибосомы митохондрий высших растений по седиментационным свойствам и плотностной характеристике не отличаются от 80S-рибосом [29], но отноше ние к ингибиторам белкового синтеза у них иное, чем у цитоплазматических, имеющих константу седиментации тоже 80S: если митохондриальные рибосомы ингибируются хлорамфениколом, то цитоплазматические - цикдогексимидом [7], угнетающим синтез белка. Действие циклогексимида на светозависимое на копление АК проверялось в следующих опытах (рис. 6).

Рис. 6. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в зеленых проростках ячменя после 48 часов темноты (а) и 24 часов освещения (33 тыс. эргсм-2с-1) на воде (б) и растворе циклогексимида (15 мкг/мл) (в) Уровень АК в проростках ячменя подвержен сезонным колебаниям: зимой он выше, летом ниже. В данных опытах использовались зеленые проростки с низким содержанием АК, чему способствовало и предварительное выдержива ние их в темноте в течение 24 часов. Такие проростки обычно активно накапли вают на свету аскорбат. В условиях опыта часть проростков после темноты ос вещалась на воде (контроль), другая - на растворе циклогексимида. В контроль ном варианте уровень АК повысился более чем в 3 раза, в присутствии же цик логексимида светозависимое накопление АК было полностью блокировано. Сле довательно, в процессе биосинтеза АК в растениях на свету принимают участие ферменты, биосинтез которых идет на 80S-рибосомах цитоплазмы.

Как говорилось выше, АК в растениях может синтезироваться из глюкозы и (с большей скоростью) из галактозы, но путь этого синтеза окончательно не изу чен. В общем виде он представляется следующим образом: d-галактоза d-галактуроновая кислота l-галактоновая кислота l-галактоно--лактон l-аскорбиновая кислота. По данным [327], восстановление метил-d-галактурона та в l-галактоно--лактон в системе in vitro идет при участии фермента, локали зованного в растворимой части цитоплазмы, а окисление лактона в l-АК требует ферментного комплекса или одного фермента, заключенного в митохондриях. В случае использования в качестве субстрата при биосинтезе АК глюкозы этими ферментами будут глюкуронатредуктаза и гулонолактоноксидаза [74] соответ ственно (рис. 7). Для второго фермента показано [402], что в митохондриях эвг лены его содержание составляет только 11,6% от общего количества, а больная часть (86,7%) обнаруживается в цитозоле.

Учитывая полученные данные по полному ингибированию биосинтеза ас корбиновой кислоты циклогексимидом, можно полагать, что биосинтез глюку ронатредуктазы идет на 80S-рибосомах. Возможно, и биосинтез гулонолакто ноксидазы связан с цитоплазматическими рибосомами, если же она синтезиру ется на митохондриальных рибосомах, то блокирование синтеза АК в этом слу чае обусловлено отсутствием субстрата для фермента-l-гулонолактона.

В работе [178] показано, что при длительном освещении проростков ячменя значительно увеличивается количество АК во фракции, содержащей митохонд рии, тогда как во фракции хлоропластов содержание аскорбата уменьшается (или не меняется) при 10-минутной экспозиции [243], а в темноте - наоборот.

Эти факты могут говорить об активном использовании АК в митохондриях в процессе дыхания и в хлоропластах в процессе фотосинтеза, поэтому при отсут ствии в темноте фотосинтеза АК накапливается в хлоропластах, а на свету, когда в зрелых тканях ячменя с хорошо сформированным фотосинтетическим аппара том понижается темновое дыхание [161], количество АК увеличивается в мито хондриях.

Накопление АК в митохондриях на свету может быть и результатом суб стратной стимуляции новообразования аскорбата. Однако показано, что экзо генный субстрат - глюкоза - в темноте не стимулирует синтез АК [103]. Если же предположить, что в биосинтезе АК лучше используются "молодые" продукты фотосинтеза [125] или восстановитель - НАДРН+Н+ фотосинтетического проис Рис. 7. Схема биосинтеза аскорбиновой кислоты (по А.Ленинжеру, 1985 г.) хождения, тогда становится понятным факт более активного накопления АК в зеленых проростках на свету по сравнению с этиолированными и альбиносными.

Таким образом, масштаб светозависимого накопления восстановленной формы АК в проростках ячменя определяется степенью сформированности хло ропластов и является максимальным у зеленых проростков по сравнению с этиолированными и альбиносными. Пополнение пула АК на свету тормозится в присутствии хлорамфеникола у всех типов проростков, кроме альбиносных. У зеленых растений светозависимое накопление АК полностью ингибировалось циклогексимидом, что говорит об участии цитоплазматических 80S-рибосом в биосинтезе ферментов, принимающих участие в метаболизации углеводов в l АК.

Глава 4. ДЕЙСТВИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО И МОНОХРОМАТИЧЕСКОГО СВЕТА НА БИОСИНТЕЗ КИСЛОТ СИСТЕМЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ 4.1. Светозависимый синтез аскорбиновой кислоты в зеленых и этиолированных проростках Биосинтез АК в растениях в основном рассматривается как темновой спе цифически направленный окислительный процесс, в котором происходит аэроб ное окисление молекулы сахара. К.Л.Поволоцкая [115], наблюдая образование АК в этиолированных проростках, сделала вывод о том, что свет не является безусловно необходимым для биосинтеза АК, но в случае зерновых обеспечива ет большее (в 1,5-2 раза) накопление АК.

При изучении природы предшественников АК в этиолированных растениях коровьего горошка М. Рейд [374] отмечала увеличение АК в темноте в пророст ках, находящихся 4 дня на 0,5%-ном растворе глюкозы. Эти данные подтвер ждают возможность темнового биосинтеза АК и стимуляцию его экзогенной глюкозой в то время, когда собственные запасы семядолей уже израсходованы.

Наблюдаемое рядом авторов [77] увеличение содержания АК в ломтиках лука на воздухе В.А.Девятнин [33] рассматривал как свидетельство наличия в луке ферментативной системы, осуществляющей биосинтез АК. Им была сде лана попытка экспериментально показать ферментативный характер образова ния АК. С этой целью свежеотжатый луковый сок помещался в колбу с раство ром глюкозы. Через колбу пропускалась сильная струя воздуха, содержимое колбы охлаждалось до 0°С и освещалось. При соотношении сока к раствору глюкозы 1:20 в присутствии сернокислого марганца синтезировалась АК. Пре кращение аэрации останавливало процесс. Если в опыте использовался сок, предварительно нагретый до 100°С, биосинтез АК не шел. Этот факт автор рас сматривал как подтверждение того, что биосинтез АК идет при участии фер мента, который ингибируется высокой температурой. Освещение и температу ра, как указывает автор, играют второстепенную роль в данном процессе.

Таким образом, биосинтез АК В.А.Девятнин [33] рассматривал как фермен тативный процесс, который протекает при достаточном снабжении раститель ных тканей кислородом и катализируется солями марганца. Природа фермента тивной системы осталась не выясненной им, но было показано, что в ней прини мают участие органические соединения марганца. Однако сама посылка, из ко торой исходил В.А.Девятнин,-наличие раневого синтеза АК в кусочках лука вскоре стала подвергаться сомнению. Так, И.П.Митев, Р.Белева-Стайкова [86] показали, что при поранении луковицы возрастает содержание сульфгидриль ных групп и невитаминных редуктонов, которые при титрационном способе оп ределения АК с 2,6-дихлорфенолиндофенолом дают завышенные результаты.

В.Франке [244] на основании анализа литературных данных сделал вывод о косвенном влиянии света на процесс образования АК. Это мнение разделял К.Е.Овчаров [95], отрицающий прямое участие света в биосинтезе АК. Он гово рил, что то обстоятельство, что содержание витаминов в растениях, произра стающих в темноте, как правило, снижается, позволило некоторым авторам прийти к выводу о прямом участии света в биосинтезе витаминов. Однако дос товерные факты, говорящие о непосредственном действии света, имеются лишь в отношении витамина Д, а что касается других витаминов, в том числе и вита мина С, то такое утверждение ошибочно. В подтверждение этого положения он приводит факт темнового образования витаминов в изолированных корнях горо ха, хлопчатника и других культур. К.Е.Овчаров считал, что нельзя говорить о прямом, непосредственном действии света в процессе образования витаминов, а наблюдаемое снижение биосинтеза некоторых витаминов в темноте правильнее объяснить глубокими нарушениями обмена веществ, вызванными длительным пребыванием зеленых растений без освещения. Это может задержать биосинтез не только витаминов, но и многих других жизненно необходимых веществ, иг рающих важную роль в образовании витаминов.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 



Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.