авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 | 4 |

«КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Г.Н. Чупахина СИСТЕМА АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ Калининград ...»

-- [ Страница 2 ] --

Таким образом, сторонники темнового образования АК указывали на факт накопления АК в этиолированных проростках и в неосвещенных частях расте ний: в корнях, клубнях. Говоря о накоплении АК в этиолированных проростках, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70] полагала, что в этих условиях происходит не ново образование АК, а переход ее из неактивной формы в активную. Это предполо жение автор сделал на основании того, что накопление витамина С в семенах достигает максимума в момент налива семени, а затем снижается в процессе со зревания. При прорастании в темноте накопление витамина С в проростке огра ничено тем максимумом, которого оно достигало в стадии налива семени. К то му же наблюдаемое в темноте образование АК, возможно, происходит за счет предшественников, которые синтезируются на свету. Такого мнения придержи валась М.Рэйд [374]. Б.Оберг [192] отмечал бльшее накопление АК в листьях гороха в темноте, чем на свету, но количество синтезированной АК зависело от интенсивности света предыдущих дней.

Несмотря на отрицание рядом исследователей прямого участия света в обра зовании АК, в литературе накапливались данные, указывающие на увеличение ее содержания под действием света. Еще М.Рэйд [374] отмечала большое влия ние света на накопление АК при прорастании и на ранних стадиях роста коровь его горошка. Семидневные растения, растущие на свету, содержали в четыре раза, а одиннадцатидневные - в 8 раз больше АК, чем проростки соответствую щего возраста, растущие в темноте. В листьях тюльпана, находящихся на свету, по данным Ф.Ажена [266], количество АК было в 4-5 раз больше, чем в темноте.

Со временем появляются наблюдения, указывающие на то, что преимущест венное накопление АК происходит у растений, растущих на открытых участках, по сравнению с затененными;

в солнечные дни - по сравнению с пасмурными.

Такие данные для томатов были получены Н.Восом [444], а также Мао Ляном [322], исследовавшим содержание АК у 48 видов дикорастущих овощных куль тур, 8 видов древесных и у некоторых других растений. У деревьев и кустарни ков было найдено повышенное содержание АК в наиболее освещенных частях кроны [446], а у хлопчатника в наиболее освещенных ярусах листьев [140].

Высокое содержание АК в солнечную погоду наблюдалось в листьях люцер ны [36], кукурузы [37]. Д.И.Шматок [186] на основе определения АК в 242 видах растений из 31 семейства, растущих в полярно-альпийском ботаническом саду (Мурманская область), также отмечает большее накопление АК в солнечную погоду, чем в пасмурную. Аналогичный вывод сделан для плодово-ягодных культур Алтая [188].

Биосинтез АК из меченой 1-14С-,6-14C-,1-4Н- и 6-3Н-Д-глюкозы идет значи тельно быстрее на свету, чем в темноте [274].

Стимулирующее действие света на биосинтез АК зависит от его интенсивно сти. Это показано в опытах с этиолированными проростками ряда растений, вы полненных Т.Сугаварой [413]. Пятидневные проростки кукурузы, редиса, китай ской капусты освещались 6-42 часов светом различной интенсивности (10- люкс). Установлено, что увеличение содержания АК при освещении шло про порционально увеличению интенсивности света, по крайней мере в пределах эксперимента автора. В этиолированных проростках, находящихся в ходе экспе римента в темноте, количество АК оставалось почти без изменения.

Зависимость биосинтеза АК от интенсивности действующего света показана для целого ряда растений: огурцов, кукурузы, проса, конопли, мака, которые выращивались в парниках при интенсивности света, составляющей 1-1/20 от полного летнего освещения. Оказалось, что уменьшение интенсивности освеще ния в 10 раз у всех растений привело к уменьшению количества АК в 3-5 раз [67]. С увеличением интенсивности света (0, 3000, 10000, 20000 люкс, 43 часа) возрастало содержание АК в проростках капусты [346] и семядолях японской редьки (О, 500, 2500, 10000 люкс, 24 часа) [284]. При выращивании растений в фитотроне уровень АК также повышался с увеличением мощности ФАР [183].

Работы такого плана продолжаются в связи с решением вопросов выращивания овощей в закрытом грунте и получения витаминной пищи [260, 421].

В литературе имеется лишь несколько указаний на то, что содержание АК в растениях снижается в солнечные дни, но при этом или отмечалась очень жаркая погода, или опытные растения находились на прямом солнечном свету [317].

Для гороха показано увеличение содержания АК в ночное время [70].

Первые данные о накоплении АК на свету в нефотосинтезирующих органах приведены М.Рэйд [375]. При искусственном культивировании на питательной смеси отрезанных верхушечных долей корешков Calonyction aculeatum на свету и в темноте спустя 4-8 недель было обнаружено, что содержание АК в темноте не изменилось, а на свету возросло в 4-10 раз. Аналогичные данные приведены А.М.Смирновым и К.Е.Овчаровым [148]. Однако авторы указывали на замедле ние роста корней на свету, что могло привести к концентрированию АК на еди ницу веса корня.

Позднее стали появляться работы, указывающие на возможное прямое уча стие света в образовании АК. Так, А.А.Ничипорович [92] отмечал, что наряду с углеводами прямыми продуктами фотосинтетической деятельности растений могут быть аминокислоты, а также вещества высокой физиологической актив ности типа витаминов и фитогормонов;

что состав и количественное соотноше ние первичных продуктов фотосинтеза сильно меняются в зависимости от типа и физиологического состояния растений, от минерального питания, от условий водного режима, от интенсивности и спектрального состава света.

А.Мицуи, Я.Ои [344], изучая природу восстанавливающего вещества, обра зующегося при освещении реакционной смеси, состоящей из суспензии хлоро пластов и цитоплазматической фракции листьев шпината, нашли, что весь неиз вестный фотопродукт или большая его часть является АК. Гомогенаты из зеле ных и этиолированных проростков ячменя в анаэробных условиях на свету так же накапливали восстанавливающие вещества [343]. Данный факт авторы объ яснили тем, что на свету происходит фотовосстановление предшественника АК.

Если вытяжки содержали не целые хлоропласты, а их фрагменты, то фотовос становительного образования АК не происходило.

Е.Ассолбергс [209] уточняет, что только некоторые ступени синтеза АК яв ляются светозависимыми. Данное заключение он делает на основании того, что отрезанные листья яблони, выдержанные в атмосфере 14СО2, продолжали вклю чать радиоактивный углерод в молекулу АК, находясь в нормальной атмосфере и в темноте, и на свету. Однако с увеличением интенсивности света включение С в АК возрастало.

Увеличение содержания АК при освещении связывается многими исследо вателями с процессом фотосинтеза. Так, Т.Н.Кузнецова-Зарудная [70] показала, что при световом голодании взрослого растения происходит прогрессивная по теря АК. При перенесении растения в нормальные условия содержание АК вновь возрастает, но во время активной ассимиляции сильно снижается. Отсюда автор делает вывод об участии АК в процессе фотосинтеза и новообразовании ее в том же самом процессе. Предположение о существовании прямой связи между содержанием АК и фотосинтезом высказал Т.Сугавара [413]. Соответст вие между количеством АК и площадью поверхности изолированных листьев яблони, по мнению Е.Ассолбергса [209], указывает на прямую зависимость со держания АК от интенсивности фотосинтеза.

Большинство авторов [77,138, 152] стимулирующее действие света объяс няют тем, что в процессе фотосинтеза создаются особые активные сахара, из которых легко может синтезироваться АК. С.Д.Львов, Г.К.Гуцевич, А.Пантелеев [77] писали, что связь процесса образования АК с фотосинтезом не прямая, а косвенная, что в условиях оживленного фотосинтеза действительно наблюдается накопление витамина С, поскольку в процессе фотосинтеза созда ются особые активные сахара, из которых легче может синтезироваться молеку ла АК. При отсутствии фотосинтеза для образования АК из наличных сахаров требуются более сложные условия для переработки их в соответствующую форму, поэтому накопление АК идет здесь, если оно вообще имеет место в та ких условиях, гораздо более замедленным темпом и не достигает того высокого уровня, как на свету. Подтверждением положения, высказанного С.Д.Львовым с соавторами, может служить наблюдение того, что суточные кривые накопления АК не совпадают с кривыми фотосинтеза, но всегда максимальное накопление АК в растениях отмечается после наибольшего подъема фотосинтеза. В корнях, где отсутствует фотосинтез и сахара вновь не образуются, влияние света, по мнению К.Е.Овчарова [96], осуществляется через активирование ферментов.

Связь АК с фотосинтезом В.Франке [244, 246] также считает косвенной, так как синтез АК может идти в бесхлорофильных органах при наличии ассимиля тов. У 4-недельных альбиносных проростков конских бобов он наблюдал значи тельное содержание АК - не меньшее, чем у одновозрастных зеленых. По мне нию Г.Менера и В.Франке [339], АК не относится к числу прямых продуктов фотосинтеза, так как при усиленном фотосинтезе в атмосфере, богатой углекис лым газом, образование ее ослабевает.

Таким образом, имеющиеся в литературе данные не дают возможности од нозначно оценить роль света в биосинтезе АК. С одной стороны, известны фак ты темнового образования АК в этиолированных проростках, корнях и клубнях, с другой стороны, множество наблюдений говорит об увеличении ее содержа ния на свету. В связи с этим возникает вопрос: ограничивается ли действие све та в процессе образования АК только тем, что на свету увеличивается количест во продуктов фотосинтеза - углеводов, необходимых для биосинтеза АК в каче стве субстрата, или свет непосредственно участвует в процессе новообразования аскорбата?

Важную роль в процессе образования АК играет качественный состав света.

К 1939 году накопилось немало данных о действии света различного спектраль ного состава на фотосинтез. Согласно этим данным, продуктивность фотосинте за в зеленых растениях в большинстве случаев уменьшалась с уменьшением длины волны действующего света.

Т.Сугавара [414], признавая наличие прямой связи между фотосинтезом и содержанием АК, попытался установить влияние качества света на биосинтез АК. Им исследовалось действие красного (670 нм), оранжево-красного (645 нм), зеленого (560-455 нм), синего (505-380 нм) и белого света на образование АК в этиолированных проростках кукурузы, гороха, сои, китайской капусты, редиса, ячменя и др. растений. Фильтры, необходимые для получения света различной длины волны, изготавливали, покрывая стеклянные пластинки окрашенной пленкой желатина. Используемый свет выравнивался не по общей энергии, а по величине максимума пропускания. Учитывая эффективность действия на обра зование АК, свет различных участков спектра можно было расположить в сле дующем порядке: белый свет красный оранжево-красный зеленый синий.

В опыте с редисом результаты не совпадали с основными наблюдениями: про цент АК был относительно высок в зеленой и синей частях спектра. Данный факт автор объяснил тем, что на синем и зеленом свету проростки редиса росли энергичнее.

Б.И.Щербаков [187], исследуя проростки пшеницы, нашел, что среди от дельных лучей солнечного спектра наиболее активная роль в стимуляции обра зования АК принадлежит красному свету (680-620 нм и на линии 344,061 нм).

Действие сине-фиолетовых лучей в комплексе с голубыми и зелеными было слабее. Наиболее активным для синтеза АК автор считает свет тех участков спектра, которые активны в отношении фотосинтеза. Однако в опытах с листья ми традесканции И.Руге [379] отметил, что содержание АК в листьях при осве щении светом с длиной волны 650 нм и выше было больше, чем в неосвещенных листьях, а свет с длиной волны меньше 480 нм тормозил синтез АК, так что наи более активные для фотосинтеза области спектра - 440 и 630 нм - не совпадали с точками наибольшей стимуляции синтеза АК.

Имеются примеры положительного влияния зеленого света на биосинтез АК в растениях [95, 98, 187], что также нельзя связать с процессом фотосинтеза.

Результаты исследования действия синего света на биосинтез АК крайне противоречивы. К.Е.Овчаров [95], выращивая проростки хлопчатника под лю минесцентными лампами различного спектрального состава, нашел, это синий свет задерживал образование в них АК. По данным И.А.Чернавиной [167], синий свет, напротив, повышал в листьях яровой и озимой пшеницы содержание вос становленной и окисленной форм АК. Только на синем свету (380-440 нм) отме чено увеличение общего количества АК у эвглены, тогда как зеленый и красный свет не проявили активности [404]. К.Богдански, Н.Богданска [220] исследовали накопление АК в плодах яблонь, завязи которых прикрывали цветными пленка ми из полиэтилена. Определение содержания АК через 6 недель показало, что количество ее в плодах, затененных синей пленкой, было выше, чем в плодах под желтой и особенно под красной пленкой. Эффективность сине-зеленого све та для образования АК в проростках фасоли отмечали Нива и Катаяма [351].

В большинстве работ, анализирующих влияние качества света на биосинтез АК, отмечается бльшая эффективность белого (полихроматического) света по сравнению с монохроматическим [98,108, 187, 194, 220, 414]. Обзор литератур ных данных о действии света различного спектрального состава на биосинтез АК показывает, что имеется незначительное число работ, освещающих эту тему.

К тому же представленные данные, особенно по действию синего света, неодно значны. Это может быть следствием того, что в работах использовались различ ные источники света, различные виды растений. Исследованиями же Т.А.Пари бок [111] показано, что реакция растений на освещение светом различного спек трального состава имеет видовую специфичность. Так, для томатов и сельдерея наиболее активным в образовании АК был свет розовых люминесцентных ламп, а для гороха - синих ламп.

Кроме этого специфичность действия лучей различных областей ФАР на биосинтез АК зависит от мощности лучистого потока. У пшеницы и редиса при низкой интенсивности света (50 Вт/м2) максимальное количество АК накаплива лось на красном свету, а с повышением интенсивности света до 100 Вт/м2 и вы ше - на синем свету [48]. В большинстве работ для освещения растений исполь зовался свет широких участков спектра, данные по действию на биосинтез АК света спектральных линий практически отсутствуют.

При изучении действия света на биосинтез АК в растениях нами было пока зано, что свет является одним из важнейших факторов в этом процессе [173].

Стимуляция светом накопления АК в зеленых проростках ячменя проявлялась уже при интенсивности света, равной около 100 эргсм-2с-1 [98], и во многом за висела от первоначального содержания АК в проростках. Поэтому предвари тельное выдерживание растений в темноте, снижающее общее количество АК, способствовало большему накоплению ее на свету (табл. 8). На основании этого в наших исследованиях проростки перед опытами около 40 часов выдержива лись в темноте для снижения в них уровня АК, что в дальнейшем способствова ло повышению отзывчивости проростков на освещение.

По имеющимся представлениям, биосинтез АК в растениях усиливается при дополнительном снабжении их гексозами, однако роль света в этом процессе не выяснена. Как показали наши исследования, положительное действие углеводов на биосинтез АК в зеленых листьях ячменя проявлялось только на свету (рис.8).

В освещенных проростках, находившихся в течение 10 часов на растворе глюко зы, значительно увеличилось содержание АК. За это же время в листьях ячменя, плавающих на растворе глюкозы в темноте, количество АК не повысилось, хотя следовало бы ожидать увеличения содержания АК от дополнительно поступив шей в лист глюкозы, если бы биосинтез АК был только темновым процессом. За 6-7 часов пребывания листьев на растворе глюкозы-1,6-14С в темноте в них вхо дит глюкоза: по нашим данным, активность 0,1 мл сока, выделенного из осве щенных листьев, составила 2504 имп/мин, а из темновых листьев - 778 имп/мин.

К тому же за это время в листьях, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы, происходит увеличение редуцирующих углеводов на 20% [100]. Следовательно, хотя в лист в темноте входит значительное количество глюкозы, увеличения со держания АК не наблюдается. Только при очень длительном выдерживании рас тений, дополнительно снабженных углеводами, в темноте (от 64 часов до 4 су ток) на сильно концентрированных растворах (10-20%-ная сахароза) отмечается некоторое увеличение содержания АК [193, 374], что подтверждается и нашими данными [98]. Однако необходимо иметь в виду, что при столь длительном пре бывании зеленых растений в темноте в них могли произойти глубокие измене ния в обмене веществ.

- темнота;

- свет Рис. 8. Влияние света на биосинтез АК в растущих проростках ячменя (а) и проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы (б).

Интенсивность света 25 тыс. эргсм-2с-1, экспозиция 10 часов Таблица Влияние предварительного затемнения на содержание АК в 8-дневных проростках овса, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы в темноте и на белом свету (интенсивность света 25 эргсм-2с-1;

экспозиция 8 часов) Условия выращивания Условия Содержание АК проростков до опыта опыта мкг/г % Нормальная смена дня и ночи Исходное содержание 537,6±4, В темноте 541,6±8, На свету 621,2±13, 40 часов в темноте Исходное содержание 468,4±3, В темноте 474,4±1, На свету 600,8±3, 69 часов в темноте Исходное содержание 386,8±0, В темноте 431,6±2, На свету 516,2±9, Приведенные данные позволяют заключить, что свет имеет значение не только для фотосинтетического процесса, дающего исходный материал для био синтеза АК, но и играет определенную роль в преобразовании углеводов в мо лекулу АК. Можно предположить, что в зеленых листьях ячменя в процессе биосинтеза АК наряду с темновыми реакциями имеют место фотохимические.

Одним из доказательств наличия фотохимической реакции является посто янство продукта реакции в том случае, если не изменяется произведение интен сивности действующего света на время его действия [156]. Из приведенных данных (табл.9) видно, что количество синтезированной АК всегда оставалось постоянным, если произведение интенсивности света на время действия не ме нялось и равнялось 90 (10 тыс. эргсм-2с-1 9 часов;

15 тыс. эргсм-2с-1 6 ча сов;

30 тыс. эргсм-2с-1 3 часа). Следовательно, результаты этого опыта под тверждают выдвинутое нами предположение о возможности существования в биосинтезе АК фотохимических реакций. При биосинтезе АК в растениях фото химическая реакция или реакции, вероятно, чередуются с биохимическими, так как при понижении температуры до минус 1°С наблюдалось замедление образо вания АК в проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы на свету.

Увеличение содержания АК в растениях на свету многие исследователи свя зывают с процессом фотосинтеза [42, 70, 209], в результате которого образуют ся углеводы, необходимые для темнового синтеза АК. В этом случае спектры действия биосинтеза АК и фотосинтеза должны совпадать. Нами исследовалось действие света различного спектрального состава на биосинтез АК в зеленых и этиолированных проростках ячменя. Монохроматический свет получали с по мощью цветных стеклянных светофильтров с известными характеристиками. В качестве источника света использовались лампы накаливания и люминесцент ные лампы БС-30. В табл. 10 приведены результаты действия света той макси мальной интенсивности, которую удалось получить от указанных источников света.

Экспериментальные данные показывают, что содержание АК значительно увеличилось только на свету красного участка спектра 620-740 нм, активного для фотосинтеза. Некоторое накопление АК отмечено на зеленом свету 480- нм, тогда как активные для фотосинтеза синий 430-520 нм и фиолетовый 370 460 нм участки спектра [11, 128] не оказали положительного действия на био синтез АК.

Таблица Влияние света различной интенсивности и времени освещения (при постоянстве их произведения) на биосинтез АК в 6-дневных зелёных проростках ячменя Условия Интенсивность Время Произведение времени Содержание АК опыта света в тыс. освещения освещения на интен- мкг/г % эргсм-2с-1 в часах сивность света В темноте - - - 65,9±1, На свету 10 9 90 126,8±8, На свету 15 6 90 134,0±1, На свету 30 3 90 138,0±8, Таблица Влияние света различного спектрального состава на биосинтез АК в зеленых и этиолированных проростках ячменя (экспозицая 10 ч) № Условия Интенсивность Содержание АК в проростках опы- опыта света, тыс. зеленых этиолированных эргсм-2с- та мкг/г % мкг/г % 1 В темноте - 71,8±1,1 100 89,8±2,7 На УФ свету 320-400 нм 1,6 72,6±1,6 101 114,2±2,6 На белом свету 16,0 156,2±3,8 218 178,0±1,5 2 В темноте - 155,7±12,7 100 151,6±1,8 На фиолетовом свету 370-460 нм 1,3 164,4±0,9 106 183,2±9, 3 В темноте - 188,8±10,2 100 236,6±3, На синем свету 430-520 нм 6,5 193,4±2,4 102 280,3±4, 4 В темноте - 86,0±0,1 100 184,8±2, На зеленом свету 480-560 нм 4,4 98,8±0,8 115 230,2±4, 5 В темноте - 143,6±3,2 100 - На красном свету 620-740 нм 5,0 187,2±7,8 130 - - // - 50,0 208,4±1,2 145 - 6 В темноте - 210,4±17,9 100 334,2±1, На красном свету 600-1100 нм 26,0 217,2±9,0 103 362,8±5, 7 В темноте - 81,0±1,0 100 - На красном свету 690-1100 нм 32,0 100,3±0,1 124 - На красном свету 720-1100 нм 32,0 114,4±5,6 141 - 8 В темноте - 210,4±17,9 100 128,4±0, На инфракрасном свету 880-3000 нм 75,0 93 195,2±12,0 160,0±0, Красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм, включающий актив ную для фотосинтеза область спектра, также оказался неэффективным для био синтеза АК, что, возможно, объясняется добавлением к красному свету инфра красной радиации. В то же время положительно действовал на биосинтез АК длинноволновый красный свет с ближним инфракрасным 690-1100 и 720 1100 нм, который малоактивен для фотосинтеза. Таким образом, спектры дейст вия фотосинтеза и биосинтеза АК в отдельных областях не совпадают. Это дает основание предположить, что биосинтез АК в зеленых проростках ячменя прямо не связан с фотосинтезом.

Этиолированные проростки ячменя, несмотря на не полностью синтезиро ванный за 10 часов опыта пигментный аппарат, отличались большей чувстви тельностью к освещению, чем зеленые. Так, содержание АК в них увеличилось на синем 430-520 нм, фиолетовом 370-460 нм, ультрафиолетовом 320-400 нм и инфракрасном 880-3000 нм свету, т.е. в тех участках спектра, которые не стиму лировали биосинтез АК в зеленых проростках.

На зеленом свету 480-560 нм АК накапливалась как в зеленых, так и в этио лированных проростках, однако в последних более интенсивно, что тоже гово рит о большой чувствительности к освещению этиолянтов.

Для этиолированных проростков ячменя, так же, как и для зеленых, неактив ным оказался красный свет с ближним инфракрасным 600-1100 нм интенсивно стью 26 тыс. эргсм-2с-1. Увеличение содержания АК в этиолированных проро стках на УФ и инфракрасном свету - неактивных для фотосинтеза участках спек тра - подтверждает высказанное ранее предположение о том, что биосинтез АК в растениях прямо не связан о фотосинтезом, а протекает при участии специфиче ских фотобиохимических реакций. Об этом же говорят и данные опытов с использованием экзогенной глюкозы-14С [171].

Вывод об отсутствии прямой связи между фотосинтезом и биосинтезом АК находит подтверждение в исследовании роли зеленых пигментов в накоплении АК. При решении этого вопроса мы исходили из следующего положения: если существует прямая зависимость между биосинтезом аскорбиновой кислоты и наличием хлорофилла, то освещение проростков светом с длиной волны, соот ветствующей пикам поглощения хлорофилла А и В в листе [123] как в красной, так и в сине-фиолетовой области, способствовало бы накоплению аскорбиновой кислоты. Этим самым была сделана попытка выяснить спектр действия биосин теза аскорбиновой кислоты.

В результате исследований [104,109] было выяснено, что свет с длиной вол ны 370-460 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в фиолетовой области, и 440-520 нм, включающей пик поглощения хлорофилла В в синей об ласти, не оказал влияния на биосинтез аскорбиновой кислоты в проростках яч меня при интенсивности 6 тыс. эргсм-2с-1. Красный свет 670-740 нм, соответст вующий пику поглощения хлорофилла А, оказывал положительное действие на биосинтез АК лишь при высокой интенсивности, равной 12 тыс. эргсм-2с-1.

При добавлении к свету данного участка спектра более коротковолнового крас ного света, включающего пик поглощения хлорофилла В в красной области, на капливалось значительное количество АК уже при интенсивности света 500 эргсм-2с-1.

Одновременное освещение проростков светом, соответствующим пикам по глощения хлорофилла А в фиолетовой и красной областях, практически не из менило содержания АК (табл. 11), хотя, как известно, хлорофилл А является ос новным пигментом фотосинтеза. Следовательно, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза АК в области поглощения хлорофилла А не совпадают.

Таблица Влияние света с длиной волны, включающей пики поглощения хлорофилла А и В в красной и сине-фиолетовой областях, на биосинтез аскорбиновой кислоты в проростках ячмени (экспозиция 10 ч) Интенсивность Содержание Условия опыта света в тыс. восстановленной АК -2 - эргсм с - в мкг/г в% В темноте - 147,8 На свету с длиной волны:

370-460 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в фиолетовой области;

0, 670-740 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла А в красной области 5,0 159,6 На свету с длиной волны:

440-520 нм, соответствующей пику поглощения хлорофилла В в синей области;

0, 635-780 нм, соответствующем пикам поглоще ния хлорофилла А и В в красной области 5,0 184,4 На свету лампы накаливания 5,7 180,6 К сожалению, с помощью стеклянных светофильтров точно выделить свет, включающий пик поглощения хлорофилла В в красной области, нам не удалось, поэтому исследовали свет, включающий пики поглощения хлорофилла В в си ней в хлорофиллов А и В в красной областях. Этот свет оказался активным для биосинтеза АК и по своему действию был идентичен действию света лампы на каливания равной интенсивности. Физиологическая роль хлорофилла В в расте ниях еще не достаточно ясна. Возможно, что он, поглощая свет соответствую щей части красной области спектра, участвует и в фотобиохимическом синтезе АК. В то же время не исключено, что активность света 635-780 нм объясняется добавлением к неактивному участку спектра 670-740 нм, соответствующему пику поглощения хлорофилла А в красной области, более коротко- и длинно волновой радиации, т.е. расширением спектра действующего света.

Во всех наших опытах белый свет (полихроматический) был эффективнее в биосинтезе АК, чем монохроматический. При сочетании света нескольких уча стков видимой области спектра также синтезировалось больше АК, чем при дей ствии света одного участка спектра;

в иных случаях активным оказался свет, полученный при смешении неактивных для биосинтеза АК областей спектра.

Так, под действием синего света 430-520 нм интенсивностью 25 тыс. эргсм-2с- содержание АК в зеленых проростках не изменилось (рис. 9). Неэффективным оказался и фиолетовый свет 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эргсм-2с-1, тогда как сине-фиолетовый свет 370-500 нм уже при интенсивности, равной 3 тыс.

эргсм-2с-1, положительно влиял на накопление АК. Данный эффект, вероятно, не является точной копией эффекта Эмерсона, наблюдаемого в фотосинтезе и заключающегося в усилении активности действующего света при дополнитель ном освещении светом другой длины волны. В наших опытах активным для биосинтеза АК оказался свет, полученный при сочетании двух неактивных уча стков спектра. В связи с этим и активность белого света в биосинтезе АК, по видимому, нельзя рассматривать только как простое складывание активных для биосинтеза АК участков спектра.

Рис. 9. Процент увеличения биосинтеза АК на синем свету 430-520 нм интенсивностью 25 тыс. эргсм-2с-1 (1), фиолетовом 370-460 нм интенсивностью 6 тыс. эргсм-2с-1 (2) и сине-феолетовом 370-500 нм интенсивностью 3 тыс. эргсм-2с-1 (3) по отношению к контролю (темнота). Экспозиция 10 часов Обзор литературных данных по действию света различного качественного состава на биосинтез АК показывает, что изучается в основном действие света широких участков спектра и остается невыясненной роль света чистых спек тральных линий. Нами [107] исследовался свет синей спектральной линии 436 нм, выделенной из излучения ртутно-кварцевой лампы ПРК-7, при исполь зовании светофильтров СС5, С3С18, ЖС11, а также свет зеленой линии 546 нм (светофильтры ЖС17, С3С10, ПС7) и желтой - 577 нм (светофильтры С3С10;

ОС13;

3С7). Инфракрасная радиация устранялась водным экраном. Действие света спектральных линий сравнивалось с действием света соответствующих участков спектра равной интенсивности (6,5 тыс. эргсм-2с-1, рис. 10). Неэффек тивным для биосинтеза АК оказался свет синей спектральной линии и синего участка спектра (430-520 нм). Свет зеленой спектральной линии не изменил со держания аскорбиновой кислоты ни при интенсивности света, равной 6,5 тыс.

эргсм-2с-1, ни при 13 тыс. эргсм-2с-1, тогда как свет зеленого участка спектра (480-600 нм), как всегда, проявил большую активность. Из трех исследованных спектральных линий только свет желтой линии оказал положительное действие на образование аскорбиновой кислоты. Однако свет желто-оранжевого участка спектра оказался более благоприятным для биосинтеза АК, чем свет желтой спектральной линии. Следовательно, в биосинтезе АК свет широких участков спектра используется лучше, чем свет соответствующих спектральных линий при равных интенсивностях.

Рис. 10. Биосинтез АК проростками ячменя:

А - в темноте;

Б - на синем свету 430-520 нм;

В - на свету синей спектральной линии 436 нм;

Г - на белом свету;

Д - на зеленом свету 480-600 нм, с резким уменьшением интенсивности в желтой части спектра;

Е - на свету зеленой спектральной линии 436 нм;

Ж - на желто-оранжевом свету 550-780 нм со значительным уменьшением интенсивности в красной части спектра;

З - на свету желтой линии 577 нм.

Экспозиция 6 часов. Интенсивность света 6,5 тыс. эргсм-2с- Известно, что энергия кванта света коротковолновой области спектра пре восходит таковую в более длинноволновой области. Поэтому при сравнении действия света различных участков спектра друг с другом необходимо вырав нивать их по квантам. Это было учтено в следующей серии опытов, где иссле довалось действие красного 652 и 645 нм, желтого 587 нм и зеленого света нм интенсивностью 1,441015 квантовсм-2с-1 на биосинтез АК в 9-10-дневных проростках озимого ячменя сорта Паллидум 330/2. Монохроматический свет был выделен с помощью интерференционных светофильтров от кинопроекци онной лампы, мощностью 400 Вт, являющейся точечным источником света. С помощью специальной установки на интерференционный светофильтр проекти ровали параллельный пучок света, что давало возможность выделить монохро матический свет с шириной в максимуме пропускания 9-12 нм.

Приведенные данные (табл. 12) подтвердили сделанный ранее вывод о вы сокой активности в биосинтезе АК красного света, соответствующего пику по глощения хлорофилла В в красной области спектра (645 нм), а также зеленого света с длиной волны в максимуме пропускания светофильтра 553 нм. Однако наибольшую активность в биосинтезе АК проявил желтый свет - 587 нм, на ко тором уровень АК увеличился на 160% по сравнению с темновым контролем.

Сказанное дает основание заключить, что акцепторами света в процессе свето зависимого накопления АК могут быть соединения, поглощающие свет в корот коволновой красной области спектра и в желто-зеленой области.

Таблица Влияние зеленого, желтого и красного света интенсивностью 1,441015 квантовсм-2с-1 на биосинтез АК в 9-10-дневных проростках озимого ячменя (экспозиция 8 ч) № Вариант Содержание АК опыта опыта мкг/г % 1 В темноте 58±1, На зеленом свету 553 нм 110±4, 2 В темноте 30±2, На желтом свету 587 нм 78±2, 3 В темноте 36±0, На красном свету 645 нм 76±3, 4 В темноте 22±0, На красном свету 652 нм 33±1, Продукты фотосинтеза во многом определяются качеством действующего света: работами Н.П.Воскресенской [18, 19] и других [280, 215] показано слабое образование углеводов на синем свету, поэтому можно предположить, что не эффективность синего света (430-520 нм) в процессе образования АК объясня ется недостаточной обеспеченностью данного процесса углеводами. Однако в серии опытов, проведенных с зелеными проростками ячменя, плавающими на 0,5%-ном растворе глюкозы, где не было недостатка в исходном материале, также наблюдалась слабая активность синего света по сравнению с красным (620-740 нм) и зеленым (480-600 нм) светом (рис. 11) [102].

На синем свету в проростках, получивших экзогенную глюкозу, накопление АК отмечалось лишь при высокой интенсивности синего света, равной 20 тыс.

эргсм-2с-1, тогда как на белом свету в проростках даже без дополнительного снабжения углеводами биосинтез АК шел уже при интенсивности света, равной около 100 эргсм-2с-1, на зеленом свету - при интенсивности света, равной 4, тыс. эргсм-2с-1, а на коротковолновом красном - при 2,3 тыс. эргсм-2с-1. Следо вательно, активный для фотосинтеза синий участок спектра (430-520 нм) прояв ляет некоторую активность в биосинтезе аскорбиновой кислоты лишь при вы соких интенсивностях света и при дополнительном снабжении углеводами. Ве роятно, спектры действия фотосинтеза и биосинтеза аскорбиновой кислоты в отдельных областях не совпадают, а свет оказывает специфическое действие на биосинтез АК помимо фотосинтетического процесса. Аналогичный вывод дела ет И.Руге [379]. Однако в литературе имеется ряд указаний о положительном действий синего света на биосинтез АК: Нива, Катаяма [351], И.А. Чернавина [167], К. Богдански, Н. Богданска [220]. Но так как большинство авторов для выделения синего света использовало цветные пленки, то, скорее всего, они имели дело не с чисто выделенным синим участком спектра, а с комплексным светом, который используется в биосинтезе АК лучше, чем свет монохромати ческий [186].

- ДАК - АК Рис. 11. Биосинтез АК и ДАК листьями ячменя, находящимися на 0,5%-ном растворе глюкозы в темноте (а), на синем 430-520 нм (б), зеленом 480-600 нм (в), крас ном 620-740 нм (г) и белом свету (д) интенсивностью 20 тыс. эргсм-2с-1 8 часов Обобщая вышеизложенное, можно заключить, что свет играет важную роль в биосинтезе АК, причем большое значение в этом процессе имеет качественный состав света. Действие света на биосинтез АК не только осуществляется через фотосинтез, дающий субстрат для аскорбата, но и носит специфический харак тер, что дает основание рассматривать в целом образование АК как фотохимиче ский процесс;

хотя, скорее всего, лишь некоторые реакции (или реакция) на пути от углеводов к АК являются фотохимическими. Таким может быть последний этап в образовании АК из предшественника [343].

4.2. Биосинтез аскорбиновой кислоты проростками с измененным соотношением зеленых и желтых пигментов При прорастании семян даже в темноте в проростках образуется АК. Со держание ее в первые дни увеличивается до определенного предела, затем по нижается, что связывается с исчезновением субстратных ресурсов семени [374,379]. Для новообразования же АК необходим свет. При перенесении на свет этиолированных проростков наряду с накоплением АК происходит их зе ленение, поэтому естественным было связывать новообразование АК с накоп лением пигментов.

Работами многих авторов показано, что хлорофиллоносные ткани растений наиболее богаты АК [39, 52, 142]. Подтверждением этого положения могут слу жить исследования Т.Сугавары [414], в которых 5-дневные этиолированные проростки редиса, кукурузы и китайской капусты при прозеленениии на свету высокой интенсивности внешне были тёмно-зелёными и содержали больше АК, чем желто-зеленые проростки, находящиеся на свету низкой интенсивности. В других опытах освещение 5-дневных проростков кукурузы, содержащих хлоро филл, приводило к накоплению в них АК, в то время как альбиносные пророст ки при освещении не меняли уровня АК. Увеличивающийся синтез АК на свету, по мнению автора, был, несомненно, прямо или косвенно обусловлен влиянием света на деятельность хлоропластов.

Как считает Ф.Я.Механик [83], прямая зависимость между содержанием АК и хлорофилла имеет место лишь в определенных пределах уровней этих показа телей. Количество АК растет параллельно с увеличением содержания хлоро филла лишь до 85% от его содержания в нормальных листьях. У зеленых ово щей, по данным А.Акао [197], отношение содержания хлорофилла к АК состав ляет 0,81, а в семядолях японской редьки при 48-часовом освещении между со держанием хлорофилла и АК отмечалась линейная зависимость при коэффици енте корреляции 0,96 [284].

Детальные исследования динамики зеленения этиолированных проростков подсолнечника, кукурузы, репы, конских бобов и овса [415] показали, что через 30-60 минут после начала освещения в проростках появляется хлорофилл А и начинается фотосинтез. Только после этого отмечается новообразование АК.

Хлорофилл В появляется через 2-3 часа после хлорофилла А, отсюда следует, что присутствие хлорофилла В не обязательно для начала образования АК. В то же время И.Руге [379] считал, что природа листовых пигментов, обусловли вающих синтез АК, еще не ясна и что они не идентичны ни хлорофиллу, ни ка ротину. М.Мириманов [342] предполагал наличие в клеточном соке связи АК с флавонолами.

Однако, хотя большее количество АК обычно находится в хлорофиллонос ных тканях, ряд авторов [233 363, 374, 415] указывает на отсутствие паралле лизма в образовании АК и хлорофилла. М.Рэйд [374] отмечала, что листья могут иметь очень мало хлорофилла, но содержать много АК или иметь очень много хлорофилла, но сравнительно мало АК. В работе К.Г.Врублевской [22] показано, что в отдельные фазы онтогенеза конских бобов значительное количество АК находится в корнях, куда она может транспортироваться из листьев [169]. Неза висимость образования АК от содержания хлорофилла А.М.Смирнов и К.Е.Овчаров [148] подтверждают опытами с изолированными корнями ряда рас тений, в которых на свету отмечалось увеличение содержания АК. Корни более 25 месяцев росли без надземных органов, поэтому, как считают авторы, нет ос нований считать, что в синтезе АК принимал участие хлорофилл.

Вопрос о взаимоотношении АК и желтых пигментов изучен крайне недоста точно. В.А.Бунаков и др. [10, 363], исследуя плоды томата, моркови, шиповника, отмечают отсутствие определенного соотношения между содержанием АК и ка ротина. Некоторые авторы считают, что существует антогонизм между процес сами образования каротина и АК. В.С.Фёдорова [160], напротив, наблюдала од новременное накопление АК и каротина у лиственницы, кедра и кипрея с подня тием их в горы до верхних границ массового распространения видов.

Такие противоречивые сведения дают основание сказать, что функциональ ные связи между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них АК остаются пока неясными [247]. То же самое с еще большим правом, можно сказать о взаимосвязи биосинтеза АК и желтых пигментов.

В работе М.М.Окунцова и др. [109] было показано, что, создавая различные условия освещения для этиолированных проростков, можно получить растения с определенным соотношением зеленых и желтых пигментов и что особенно большим различием в содержании зеленых пигментов отличаются проростки, выращенные на синем и зеленом свету. В своих исследованиях мы использовали это свойство проростков для получения растений, отличающихся по содержа нию пигментов, с тем чтобы на этих объектах выяснить зависимость образова ния АК от количественного содержания пигментов (хлорофилла А, хлорофилла В, каротина, лютеина, виолаксантина). В результате проведенных опытов не об наружено количественной зависимости в содержании АК и пигментов, а в неко торых случаях растения, содержащие больше зеленых и желтых пигментов, от личались даже более низким уровнем АК (табл.13). Возможно, здесь имеет ме сто такое же явление, как в случае фотосинтеза и хлорофилла, где также не на блюдается количественной зависимости интенсивности фотосинтеза от содер жания зеленых пигментов, хотя роль хлорофилла в фотосинтезе общеизвестна.

4.3. Исследование способности альбиносных проростков накапливать аскорбиновую кислоту на свету Освещенные части растений обычно содержат больше АК, однако при ис следовании действия света на ее биосинтез рядом исследователей высказывалось предположение, что этот процесс прямо не связан с фотосинтезом [244, 246, 339]. Подтверждением такого мнения могут служить данные о несовпадении в некоторых областях спектров действия биосинтеза АК и фотосинтеза [101, 103].

Неясными пока остаются функциональные связи между хлорофиллоносностью клеток и синтезом в них АК [24, 109].

Таблица Влияние белого света на образование аскорбиновой кислоты и пигментов в проростках ячменя, выращенных на синем (430-520 нм) и красном свету (620-1100 нм) интенсивностью 9 тыс. эргсм-2с- Содержание пигментов в на 1 г Содержание АК Условия выращивания проростков хлорофилл каро- люте- виолак- в мг % в% А В тин ин сантин 1, 2 день - в темноте 0,00 0,00 6,70 23,91 17,84 13,42 3, 4, 5 день:

в темноте по 8 часов на синем свету ежедневно по 8 часов на красном свету ежедневно 192,83 47,85 14,97 31,44 23,11 107,2±1, 6 день:

в темноте 8 часов на белом свету интенсивностью 5 тыс. эргсм-2с-1 725,58 245,01 36,86 48,26 35,75 184,0±2, 179,2±4, 846,26 285,41 43,60 50,03 36, После освещения 15 часов в темноте При исследовании этих вопросов наиболее перспективными могут быть ра боты с беспигментными мутантами или с растениями, имеющими измененный пигментный состав, которые можно получить при обработке растений некото рыми антибиотиками: хлорамфениколом или СМ. Исследование механизма дей ствия СМ на прокариотные организмы показало его ингибирующее влияние на функцию рибосом. СМ связывается с 70S-рибосомами [31, 261], в результате чего появляются ошибки при считывании информации с природной матрицы [420]. Наличие 70S-рибосом и у высших растений объясняет факт подавления в присутствии СМ синтеза хлорофилла, РНК, развития структуры хлоропластов [222], уменьшение скорости включения аминокислот в белки пластид [228].

Угнетение биосинтеза хлорофилла и развития хлоропластов под действием СМ отмечено у этиолированных проростков томатов, турнепса, капусты, горчи цы [319, 320, 321]. Другим исследователям, используя обработку растений СМ, удалось получить альбиносные особи эвглены [366] и альбиносные растения пшеницы [6]. По данным Р.С.Бабаяна и др. [6], СМ в концентрации 150 200 мкг/мл вызывает появление альбиносных проростков у пшеницы, однако эффективные для пшеницы дозы СМ не оказывали существенного действия на семена ячменя, поэтому в начале своей работы мы определили концентрации СМ, вызывающие альбинизм у ячменя. Эти концентрации примерно в десять раз превосходили активные для пшеницы дозы и равнялись 1-2,5 мг/мл. Такое большое колебание величины концентрации действия, вероятно, объясняется тем, что 30S-субъединицы рибосом в зависимости от температуры могут при соединять одну или две молекулы СМ [31].

Проростки ячменя, выросшие из семян, обработанных стрептомицином (справа - контроль). Фото Я.Д. Кесельман Для получения альбиносных проростков семена ячменя, помещенные в чаш ки Петри или плоские кюветы, смачивались раствором СМ [181]. Чаще всего использовалась концентрация 2,5 мг/мл. Через сутки обработка семян раствором повторялась;

через двое-трое суток проклюнувшиеся семена высаживались в почву. Первый лист проростков, полученных из обработанных СМ семян, на две трети был альбиносным, верхушка оставалась пигментированной (см. фото на с. 57). Зона раздела имела желто-зеленую окраску. В опытах использовались вы резки из альбиносных участков мутантных листьев. В них определено содержа ние пигментов по Нибому [75]. Действие света (люминесцентные лампы ЛЦЦ 40) на содержание хлорофилла и каротиноидов представлено в таблице 14. Кро ме альбиносного материала исследовались зеленые и этиолированные пророст ки.

В зеленых листьях ячменя, плавающих на растворе СМ, при освещении про исходит уменьшение количества хлорофиллов и суммы каротиноидов по срав нению с контрольным вариантом - листьями, плавающими на воде.

Таблица Биосинтез пигментов (мкг/г) листьями ячменя в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эргсм-2с-1;

экспозиция 24 ч) Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды 3еленые листья Исходное содержание 360,2±3,0 295,4±13,0 156,3±9, На воде 442,7±20,8 305,9±7,9 212,4±7, На воде + СМ 314,2±10,9 233,8±7,1 158,5±5, Этиолированные Исходное содержание 0 0 16,0±0, На воде 147,8±2,9 113,2±7,6 94,3±6, На воде + СМ 42,0±1,8 41,2±10,4 37,4±1, Световые альбиносы Исходное содержание 0 0 4,1±0, На воде 0 0 4,8±0, На воде + СМ 0 0 3,2±0, Темновые альбиносы Исходное содержание 0,2±0,3 0,3±0,66 5,0±0, На воде 0,9±0,03 1,7±0,1 8,4±0, На воде + СМ 0 0 5,5±0, В этиолированных проростках в присутствии СМ за 24 часа освещения син тезируется некоторое количество хлорофилла А, В и каротиноидов, однако в контроле синтез указанных пигментов был в три раза выше. Можно предполо жить, что ингибирование биосинтеза зеленых пигментов СМ не затрагивает процесс перехода протохлорофиллида в хлорофилл и синтезированные в этио лированных проростках предшественники хлорофилла на свету переходят в хлорофилл даже в присутствии СМ;

новообразование предшественников хлоро филла, вероятно, ингибируется антибиотиком, что и ведет к меньшему накопле нию зеленых пигментов в варианте с СМ.

Вырезки из альбиносных частей листьев ячменя, выращенных на свету (в таблице - световые альбиносы) и в темноте (темновые альбиносы), или не имели зеленых пигментов, или содержали их в небольшом количестве, которое убира лось дальнейшим освещением в присутствии СМ.

Таким образом, используя обработку семян СМ, удалось получить расти тельный материал, практически лишенный зеленых пигментов и содержащий незначительное количество каротиноидов. Распределение АК, ДАК и ДКГК по зонам в зеленых и мутантных листьях демонстрирует рис. 12, из которого видно, что по содержанию восстановленной формы АК опытные и контрольные зеле ные растения отличались незначительно, в то время как окисленная форма АК и ДКГК преобладали в верхней зеленой и нижней альбиносной части мутантных растений.

- листья с альбиносным основанием - зеленые листья Рис. 12. Содержание АК, ДАК и ДКГК в верхней части (1) и основаниях (2) зеленых и частично альбиносных листьев ячменя В дальнейшем исследовалась способность альбиносных листьев синтезиро вать АК, ДАК и ДКГК. Поскольку используемый материал не содержал зеленых пигментов и фотосинтез в нем был блокирован, субстрат для биосинтеза АК вводился экзогенно: вырезки из листьев помещались на 1%-ный раствор глюко зы. В связи с этим была проверена способность синтезировать хлорофилл А, В и каротиноиды вырезками из листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы (табл. 15). Ингибирующий эффект СМ сохранялся и в этих условиях, а вырезки из листьев темновых и световых альбиносов содержали следовые коли чества зеленых пигментов и через 24 часа освещения, если они находились на растворе глюкозы с СМ.

Таблица Биосинтез пигментов (мкг/г) вырезками из листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эргсм-2с-1;

экспозиция 24 ч) Вариант опыта Хлорофилл А Хлорофилл В Каротиноиды Зеленые листья 429,1 ± 7,6 336,1 ± 24,1 184,2 ± 17, Исходное содержание 496,0 ± 20,0 364,0 ± 9,5 211,7 ± 8, На глюкозе 432,7 ± 10,8 356,5 ± 4,5 191,7 ± 6, На глюкозе + СМ Этиолированные 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,5 ± 0, Исходное содержание 135,7 ± 13,0 141,6 ± 3,0 70,3 ± 3, На глюкозе 25,6 ± 3,6 12,7 ± 2,3 24,7 ± 1, На глюкозе + СМ Световые альбиносы 5,8 ± 0, Исходное содержание 0 1,2 ± 0,5 1,0 ± 0,02 6,2 ± 0, На глюкозе 0,6 ± 0,02 0,4 ± 0,01 3,8 ± 0, На глюкозе + СМ Темновые альбиносы 2,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 4,5 ± 0, Исходное содержание 3,4 ± 0,2 2,3 ± 0,4 8,6 ± 1, На глюкозе 2,1 ± 0,1 1,7 ± 0,1 5,6 ± 1, На глюкозе + СМ При исследовании зависимости биосинтеза антоцианов от зеленых пигмен тов Манцинелли, Янг и др. [320] использовали этиолированные проростки, об рабатывая их СМ. Как видно из представленных данных, такие проростки и в присутствии СМ продолжают синтезировать некоторое количество хлорофил лов, вырезки же из альбиносов в этом плане представляют собой лучший мате риал. Поэтому нами для исследования биосинтеза АК, ДАК и ДКГК в зависимо сти от содержания зеленых пигментов были взяты альбиносные участки первых листьев проростков ячменя, выращенных на свету, а в качестве контроля - соот ветствующие участки зеленых листьев.

В вырезках из зеленых и альбиносных листьев ячменя было определено ис ходное содержание всех исследуемых кислот и, как видно из таблицы 16, альби носы по количественному содержанию в них АК, ДАК и ДКГК мало отличались от зеленых проростков.

Таблица Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками листьев ячменя, плавающими на 1% растворе глюкозы в присутствии СМ на свету (интенсивность света 15,2 тыс. эргсм-2с-1;

экспозиция 24 ч) Вариант опыта АК ДАК ДКГК Зеленые участки 178,3 ± 10,6 57,3 ± 13,4 39,1 ± 10, Исходное содержание 85,7 ± 13,1 40,8 ± 7,7 21,0 ± 4, В темноте 220,2 ± 15,3 22,7 ± 9,1 69,7 ± 15, На свету Альбиносные участки 166,4 ± 8,5 44,5 ± 2,2 37,2 ± 6, Исходное содержание 91,4 ± 2,0 35,6 ± 7,8 19,1 ± 5, В темноте 217,5 ± 19,7 13,9 ± 3,3 71,1 ± 17, На свету Выдерживание в темноте зеленых проростков в течение 24 часов привело к уменьшению содержания всех кислот: в большей степени АК и ДКГК, в мень шей - ДАК. 24-часовое освещение способствовало накоплению АК и особенно ДКГК, но в три раза уменьшило количество ДАК.

Изменение содержания АК, ДАК и ДКГК в зависимости от освещения у аль биносов имело такой же характер, как и у зеленых проростков, т.е. не зависело от наличия зеленых пигментов.


Накопление АК и ДКГК в зеленых и альбиносных проростках, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы, наблюдалось только на свету. Необходимо отме тить, что поступление в лист экзогенной глюкозы зависит от условий освеще ния: так, в опытах М.М.Окунцова, Р.А.Карначук, Н.М.Фроловой [106] на свету в листья овса входило почти в два раза больше 14С-глюкозы, чем в темноте. Сле довательно, в нашем опыте проростки, находящиеся на свету, лучше снабжены субстратом, чем темновые, но это, вероятно, не является единственной причи ной, обусловливающей световой биосинтез АК и ДКГК, так как если бы он был темновым, мы наблюдали бы накопление кислот и в темноте, но в меньших масштабах, чем на свету. На самом же деле в темноте количество указанных ки слот резко снижается. По-видимому, помимо субстрата решающее значение в процессе накопления АК и ДКГК имеет свет.

Исследована реакция на свет зеленых и альбиносных проростков, предвари тельно выдержанных в темноте в течение 45 часов (табл. 17). Такое длительное пребывание в темноте способствовало снижению в зеленых проростках содер жания окисленной формы АК и в два раза уменьшило количество восстановлен ной АК и ДКГК. Последующее 20-минутное освещение почти полностью вос становило исходное содержание АК и ДКГК и резко снизило (в 2,5 раза) количе ство окисленной формы АК, тогда как в темноте за это время существенных из менений не произошло.

Таблица Биосинтез АК, ДАК и ДКГК (мкг/г) зелеными и альбиносными участками листьев ячменя, плавающими на 1%-ном растворе глюкозы в присутствии СМ (экспозиция 20 мин;

предварительное выдерживание проростков в темноте 45 ч;

интенсивность света 15,2 тыс. эргсм-2с-1) Вариант опыта АК ДАК ДКГК Зеленые участки 299,6 ± 2,3 57,8 ± 2,2 86,5 ± 4, Исходное содержание 99,0 ± 5,3 50,8 ± 2,8 42,2 ± 4, 45 ч темноты 95,2 ± 1,3 47,5 ± 1,8 40,5 ± 1, 45 ч темноты + 20 мин темноты 200,8 ± 9,1 19,3 ± 1,2 79,3 ± 5, 45 ч темноты + 20 мин света Альбиносные участки 177,2 ± 10,1 42,2 ± 2,7 67,9 ± 4, Исходное содержание 87,6 ± 6,6 31,1 ± 2,5 13,0 ± 0, 45 ч темноты 90,0 ± 13,8 31,7 ± 2,0 12,8 ± 3, 45 ч темноты + 20 мин темноты 169,7 ± 6,4 8,0 ± 0,0 25,0 ± 1, 45 ч темноты + 20 мин света 45-часовое пребывание в темноте альбиносов особенно сильно сказалось на содержании ДКГК, количество которой уменьшилось с 67,9 до 13,0 мкг/г. По следующее 20-минутное освещение увеличило ее содержание почти в 2 раза, но оказалось недостаточным для восстановления исходного уровня. Характер из менений восстановленной и окисленной форм АК у альбиносов был таким же, как и у зеленых проростков.

Таким образом, альбиносные участки листьев ячменя на свету при наличии экзогенного субстрата интенсивно синтезируют АК и ДКГК, следовательно, их образование не связано с наличием зеленых пигментов и представляет собой не зависимый от фотосинтеза светозависимый процесс.

Следует отметить, что под действием СМ количество желтых пигментов в листьях ячменя уменьшается в десятки раз, но это тоже не оказывает существен ного влияния на накопление АК и ДКГК, хотя нужно учитывать, что регулятор ные функции пигменты могут выполнять и в небольших концентрациях, когда поглощенная ими световая энергия используется лишь для переключения мета болических путей [20, 64].

Механизм светоактивации образования АК и ДКГК пока неясен. Однако, учитывая то, что некоторые органические кислоты (щавелевая, янтарная, винная, -кетоглутаровая) способствуют накоплению АК на свету [110], можно предпо ложить, что зависящее от света накопление АК (возможно, и ДКГК) в зеленых, и особенно в альбиносных, проростках связано с функционированием цикла Креб са, деятельность которого, как теперь известно, продолжается и на свету [12, 16, 97]. В связи с чем на свету усиливается поступление радиоактивного углерода из 1,6-14С-глюкозы в ди- и трикарбоновые кислоты [97]. О возможности биосинтеза С4-кислот непигментированными клетками уже сообщалось [18].

Светозависимое накопление АК альбиносными проростками говорит об от сутствии прямой связи данного процесса с фотосинтезом. Реальнее выглядит зависимость биосинтеза АК от дыхательного процесса, для которого работами последних лет показана возможность функционирования на свету не только ЦТК, но и гликолиза, а также ОПФЦ [5, 13, 16, 80];

тем более, что на свету в анализируемых альбиносных проростках стимулируется дыхание в целом и от дельные его этапы: гликолиз, ОПФЦ, ЦТК [49].

Исследование действия света различного спектрального состава на биосин тез АК в альбиносных проростках ячменя показало (рис. 13), что наибольшую активность в этом процессе проявил зеленый свет (480-600 нм) и далее по мере уменьшения активности - синий (430-520 нм) и красный (620-740 нм).

Рис. 13. Содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных проростках ячменя на свету различного спектрального состава в % к количеству кислот в темновом варианте - 100% (интенсивность света - 2,5 тыс. эргсм-2с-1;

экспозиция - 1 ч) Таким образом, и в опытах с альбиносными проростками ячменя подтвер дился факт стимулирующего действия зеленого света на накопление АК. Зеле ный свет длительное время рассматривался как малоактивный для растений, и его обычно использовали для выполнения препаративной работы перед свето вым экспериментом и во время фотоморфогенетических исследований. Работа ми, выполненными в 60-70-е годы, нам удалось показать, что на зеленом свету, а также на желто-зеленом активно синтезируется АК в этиолированных и зеленых проростках [98, 103, 104]. Далее было установлено, что зеленый свет оказывает влияние на ростовые процессы [53, 297, 302, 394], на фотосинтетический аппа рат [24, 40, 55, 91, 314] и содержание органического углерода у растений [79].

Активация некоторых реакций метаболизма зеленым светом рассматривается рядом авторов как опосредованная фитохромом, возбуждаемым зеленым светом [54, 120, 146]. Следовательно, зеленый свет нельзя рассматривать как физиоло гически инертный, а уточнение механизма его действия на растения - дело бу дущих исследований.

4.4. Субклеточная локализация аскорбиновой кислоты и ее окисленных форм в связи с освещением Гистохимическое исследование распределения АК в листьях чистяка весен него (Ficaria verna Huds.) показало, что она сосредоточена в хлоропластах, около ядер и во внешнем слое цитоплазмы. В стебле этого растения центральный ци линдр и кора богаты АК, которая содержится главным образом в хлоропластах [195]. Более 30 - 40% АК листьев шпината также находится в хлоропластах [243]. В клетках корня конских бобов (Vicia faba L.) и лука репчатого (Allium сера L.) повышенное содержание АК обнаружено в области, близкой к клеточ ной стенке, а в клетках меристемы она распределена по всей цитоплазме равно мерно [289]. Много АК и в самой клеточной стенке [225]. В клетках корня хрена весь аскорбат сосредоточен в больших центральных вакуолях [262].

Субклеточная локализация АК в большой степени определяется физиологи ческим состоянием клетки и ее структур. В зависимости от функционального состояния хлоропластов содержание АК в протоплазме может быть выше, чем в хлоропластах [195]. Делящиеся клетки культивируемых верхушек корней куку рузы накапливали АК в цитоплазме, но картина распределения АК менялась по сле начала элонгации клеток. В полностью вытянувшихся клетках основная часть АК была связана с клеточной стенкой [236].

Имеющиеся в литературе фрагментарные данные не дают цельной картины количественной локализации АК в клетке. Исследование же этого вопроса, не сомненно, имеет большое значение для всесторонней оценки физиологической роли АК в обмене веществ растений.

Для клеточных структур свойственен постоянный обмен метаболитами, по этому, решая вопрос о субклеточной локализации АК, мы провели одновремен ный анализ ее содержания в хлоропластах и митохондриях, клеточном соке и структурных элементах - фракции целых листьев, оставшейся после извлечения сока [177, 178]. При этом учитывались условия освещенности, которые оказы вают существенное влияние на содержание АК [181, 275]. Наряду с анализом восстановленной АК исследовалась ее окисленная форма - дегидроаскорбиновая кислота и продукт необратимого окисления АК - дикетогулоновая кислота, практически не исследованная в растениях [172]. В опытах использовались 7-9 дневные проростки ячменя сорта Надя. Источник света - люминесцентные лам пы ЛДЦ-40 интенсивностью 33 тыс. эргсм-2с-1.

Хлоропласты выделяли по методике, описанной в работе Г.А. Могилевой и др. [87]. Супернатант, полученный при осаждении фракции хлоропластов, под вергали центрифугированию при 9 тыс. об/мин (ЦЛР-1) в течение 15 минут для отделения митохондрий. Целостность структур в выделенных фракциях контро лировали микроскопированием соответствующих образцов. Клеточный сок из влекали центрифугированием (1 мин при 2 тыс. об/мин, ЦЛС-3) обработанных хлороформом листьев в специальных стеклянных контейнерах [105].

Расчет количества исследуемых кислот проводился на сухой и сырой вес хлоропластов, митохондрий и целых листьев. Закономерности изменения со держания кислот в условиях опытов сохранялись при обеих формах расчета, по этому приводим только данные, полученные при пересчете на сырое вещество с тем, чтобы была возможность сопоставить содержание кислот в структурах и клеточном соке.

Одновременный анализ АК, ДАК и ДКГК в клеточном соке и структурных элементах листьев ячменя (рис. 14) показал, что все исследованные кислоты ко личественно преобладают в клеточном соке, превосходя содержание АК в струк турных элементах почти в 4 раза, а ДАК - более чем в 2 раза.

Длительное выдерживание проростков в темноте (40 ч) привело к выравни ванию содержания кислот в анализируемых фракциях за счет повышения уровня АК в структурных элементах и одновременного снижения окисленной формы АК в обеих фракциях.

Последующее 24-часовое освещение, снизив уровень АК в структурных элементах и повысив его в клеточном соке, вновь вернуло к исходному соотно шение в них АК (1 : 4). Свет повысил содержание ДАК и ДКГК в структурных элементах и в клеточном соке, в последнем особенно резко.


Таким образом, основным местом сосредоточения АК, ДАК и ДКГК в листь ях ячменя является клеточный сок. Содержание АК и ДКГК в нем довольно ста бильно, не меняется даже при длительном пребывании растений в темноте и увеличивается только при продолжительном освещении [180].

Наиболее существенные изменения содержания кислот в связи с освещением происходят во фракции "структурные элементы": в темноте резко возрастает количество АК, что сопровождается снижением ее окисленной формы - ДАК, на свету характер изменений становится противоположным. Вероятно, повышение содержания АК в структурных элементах в темноте является результатом неис пользования ее в процессе фотосинтеза, где она может идти на поддержание в восстановленном состоянии хлорофилла [63], пластоцианина [425], возможно, и других соединений электрон-транспортной цепи [301].

Длительное освещение изменило содержание АК в клеточном соке, увеличив его на 49% по сравнению с исходным содержанием. Это увеличение коррелиро вало с нарастанием продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Можно предполо жить, что в данных условиях увеличивается и светозависимое использование АК, идущее с накоплением ее окисленной формы и ДКГК, образующейся при разрыве лактонового кольца ДАК.

Стимулируемое светом накопление АК в клеточном соке может идти или за счет ее новообразования, или за счет усиливающихся на свету притоков АК из клеточных структур. Скорее всего, решающим является второе событие, так как в обеих анализируемых фракциях на свету увеличивается содержание ДАК, ко торое, обладая повышенной по сравнению с АК способностью растворяться в липидах, довольно легко может проходить через клеточные мембраны и выпол нять роль транспортной формы АК [154].

- свет - темнота Рис. 14. Действие света (33 тыс. эргсм-2с-1) на содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в клеточном соке (а) и структурных элементах (б) листьев ячменя - АК - ДАК - ДКГК Рис. 15. Содержание АК, ДАК и ДКГК в целых листьях ячменя (1), хлоропластах (2) и митохондриях (3) после 40 часов пребывания в темноте (а) и последующего 24-часового освещения (б) (интенсивность света - 33 тыс. эргсм-2с-1) В следующей серии опытов проводился одновременный анализ АК, ДАК и ДКГК в целых листьях, хлоропластах и митохондриях, выделенных из растений, находящихся в различных условиях освещения (рис. 15), с тем, чтобы исследо вать способность к биосинтезу АК данных клеточных структур, входящих в со став анализируемой нами фракции "структурные элементы".

Из представленных данных видно, что в одном грамме хлоропластов, выде ленных из листьев проростков ячменя, находящихся 40 часов в темноте, содер жится больше восстановленной АК, чем в грамме целых листьев, а в митохонд риях - меньше.

Последующее освещение растений, длительное время находившихся в тем ноте, увеличило содержание аскорбата в целых листьях и существенным обра зом повлияло на распределение АК в структурах: в хлоропластах уровень кисло ты понизился, а в митохондриях увеличился в 3 раза. Таким образом, показано светозависимое накопление АК в беспигментных структурах - митохондриях.

Что касается окисленной формы АК, то в структурах, выделенных из темно вых листьев, она практически отсутствовала;

ДКГК, напротив, накапливалась в больших количествах. Эти данные дают возможность представить направлен ность обмена исследуемых кислот: в темноте в хлоропластах и митохондриях идет необратимое окисление ДАК до ДКГК.

При освещении в хлоропластах появляется ДАК, а в митохондриях ее коли чество увеличивается с 5,3 мкг/г до 33,3 мкг/г. Следовательно, на свету начина ется использование АК с образованием окисленной формы. Последняя в мито хондриях в больших размерах необратимо окисляется до ДКГК, а в хлоропла стах этот процесс идет не так активно, вероятно, за счет того, что часть ДАК подвергается фотовосстановлению до АК [286].

Способность хлоропластов синтезировать АК в зависимости от освещения исследовалась и в опытах с изолированными хлоропластами. Последние выделя лись из листьев 7-9-дневного ячменя, находившегося 40 часов без освещения. В хлоропластах определялся уровень АК, ДАК и ДКГК, затем часть их освещалась 2 часа в склянках Тищенко при постоянном продувании через среду выделения (0,4 М сахароза, 1/15 М фосфатный буфер, 0,01 N NaCl) воздуха со скоростью 1 л/мин;

другая часть находилась в аналогичных условиях в темноте (табл. 18).

За два часа освещения в изолированных хлоропластах уровень АК увеличился в 4 раза, и только в этом варианте была обнаружена ДАК. Количество ДКГК, на против, в освещенных хлоропластах было ниже, чем у неосвещенных. Из анали зируемых кислот в среде выделения накапливалась только ДКГК, причем в зна чительном количестве, не уступающем ее содержанию в изолированных хлоро пластах и хлоропластах целого листа.

По всей видимости, при инкубации изолированных хлоропластов АК, актив но синтезируемая в них, выделяется в среду. В темноте она разрушается до ДКГК, на свету этот процесс тормозится, поэтому в среде выделения обнаружи вается ДАК - промежуточный продукт окисления АК до ДКГК.

Таблица Влияние света на накопление АК, ДАК и ДКГК изолированными хлоропластами листьев ячменя (интенсивность света 15,7 тыс. эргсм-2с-1;

экспозиция 2 ч) Вариант опыта АК ДАК ДКГК мкг/г t мкг/г мкг/г t Хлоропласты листьев ячменя, нахо дящегося 40 часов в темноте - (а) 210,2 0 233, a a + 2 часа темноты:

= 1,61 = 0, изолированные хлоропласты (б) 278,2 0 266, б б a среда выделения (в) 0 0 225,4 =, в + 2 часа света: a a = 19,2 = 0, изолированные хлоропласты (г) 840,4 55,6 228, г г среда выделения (д) 0 0 221, б б = 10,3 = 3, г г a = 0, д n =8, tтабл. = 2,37 для Р 0, Таким образом, субклеточная локализация АК, ДАК и ДКГК в листьях яч меня в значительной степени определяется условиями освещения. Светозависи мое накопление АК при длительной экспозиции связано с увеличением ее со держания в клеточном соке и митохондриях. В хлоропластах на свету также идет новообразование АК за счет или фотовосстановления предшественника [344], или фотовосстановления окисленной формы [286], однако наряду с этим имеет место активное использование восстановленной формы АК в светозави симых процессах, масштаб которого превышает биосинтез. Поэтому при дли тельном освещении растений содержание АК в хлоропластах начинает снижать ся. Можно допустить и другое: синтезированная на свету в хлоропластах АК быстро поступает в клеточный сок, тем самым определяя высокое содержание в нем аскорбата. Обмен восстановителем может идти не только с клеточным со ком, но и с митохондриями, и такая возможность уже обсуждается [56].

Представляется интересным подробнее обсудить возможный механизм вы явленного нами стимулируемого светом накопления АК в митохондриях. В ли тературе известны факты светозависимых изменений некоторых процессов в альбиносных растениях [456], в беспигментных структурах: в клеточных ядрах [71], в митохондриях, где при включении света резко возрастает НАД Н2 [267].

Что касается биосинтеза АК, то известно, что ферменты, ответственные за пре вращение l-галактоно--лактона в АК, содержатся в митохондриях [282]. Можно предположить, что эта заключительная реакция в биосинтезе АК является свето зависимой. Возможными акцепторами света в митохондриях могут быть цито хромы, в частности, цитохром С, для которого показано небольшое ускорение окислительно-восстановительных превращений при действии “белого” света [63, 65]. К тому же цитохромы имеют поглощение в зеленой области спектра - до вольно активной в биосинтезе АК [104].

Последняя ступень биосинтеза АК у эвглены катализируется l-гулоно-лактон дегидрогеназой, сосредоточенной преимущественно в цитозоле (86,7%);

11,6% ее находится в митохондриях [402]. На свету активность данного фермента уве личивается [404], что может обусловливать светозависимое накопление АК не только в цитозоле, но и в митохондриях.

Если же стимуляция светом биосинтеза АК осуществляется на уровне обра зования предшественника, то этот процесс должен идти в цитоплазме, содержа щей ферменты, ответственные за восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно--лактон [307, 327]. Следовательно, помимо субстрата лимитировать биосинтез АК может и восстановитель -НАДФН+Н+. Источником его в растени ях являются фотосинтез и ОПФЦ, функционирующий в цитоплазме и в хлоро пластах. Поскольку на свету в хлоропластах ОПФЦ полностью ингибирован, а в цитоплазме ограничен [80], то в светозависимом биосинтезе АК, скорее всего, используется восстановитель фотосинтетического происхождения. Тогда возни кает вопрос: почему на свету в хлоропластах, где идет фотосинтез, дающий вос становитель, количество АК уменьшается, а в митохондриях - увеличивается?

Этот факт можно объяснить лишь рассматривая масштаб использования АК в данных компартментах.

В хлоропластах АК используется в фотосинтезе и в дыхании. На свету пер вый источник затрат резко возрастает, а использование в дыхании, наоборот, уменьшается, следствием чего является снижение общего уровня АК в хлоро пластах и повышение в митохондриях. Кроме того, увеличение содержания АК в митохондриях может быть и результатом того, что здесь идет заключительный этап биосинтеза АК - превращение l-галактоно--лактона в АК.

Способность этиолированных и альбиносных проростков синтезировать АК говорит о возможном использовании в этом процессе и НАДФН+Н+ ОПФЦ. На блюдаемая у них стимуляция биосинтеза АК светом также идет за счет исполь зования восстановителя ОПФЦ, так как для альбиносов, например, показано, что на свету гликолиз и ОПФЦ не ингибируются, а напротив, отмечается стимуля ция выделения 14СО2 из равномерно меченой глюкозы [80]. Таким образом, на примере альбиносов видно, что не только субстрат, необходимый для биосинте за АК, но и восстановитель может лимитировать ее новообразование;

так, у аль биносов при отсутствии фотосинтеза, дающего субстрат, биосинтез АК стиму лируется светом.

При исследовании участия АК в обмене веществ растений, как правило, ана лизируется система кислот АКДАК. Однако присутствующее количество ДАК не всегда говорит о масштабе использования АК, так как уровень ДАК оп ределяется и одновременно идущим процессом восстановления окисленной формы, и необратимым ее окислением до ДКГК. Поэтому привлечение в подоб ных исследованиях данных по содержанию ДКГК дает дополнительную инфор мацию к решению вопроса о направленности окислительно-восстановительных процессов в системе АКДАКДКГК.

4.5. Возможные фоторецепторы светозависимого синтеза аскорбиновой кислоты Вопрос об акцепторе света, регулирующего накопление АК, пока решается однозначно. Это может быть фитохром [219, 391, 392] или родственное соеди нение [329]. Фоторецепторную функцию он может выполнять в растениях с раз личной пигментацией. Так, фитохром обнаружен в проростках овса, биосинтез хлорофилла которых ингибировался гербицидом норфлуразоном, и уровень фи тохрома в них мало отличался от такового этиолированных растений [285].

Г.Мор [89], относя увеличение скорости синтеза АК к фотореакциям проростков горчицы, также в качестве пигмента, поглощающего эффективный свет, рас сматривает фитохром. По его данным, ФДК способен быстро индуцировать и терминальную оксидазу АК - аскорбатоксидазу.

В проростках горчицы лаг-фаза изменения скорости накопления АК при включении дальнего красного света равняется 1,5 часа у 36-часовых проростков и 3 часам у 72-часовых [219]. В связи с этим повышение содержания АК на све ту, по-видимому, нельзя объяснить только системой фитохрома, так как лаг-фаза вызванного фитохромом увеличения содержания АК составляет один час и бо лее [219, 391], а в наших и других [404] опытах светозависимое образование АК отмечено и через более короткое время.

Регуляторные возможности фитохрома, вероятно, не так безграничны, как сейчас принято считать. В частности, уже приводятся данные о том, что регуля торное действие фитохрома на биогенез хлоропластов в большей степени прояв ляется в этиолированных проростках и при их прозеленении до этапа образова ния мембран тилакоидов, а дальше фитохром уже не влияет на состав и функ ционирование тилакоидов [232]. В связи с этим, пытаясь объяснить механизм стимулирующего действия света на биосинтез АК, нам хотелось бы привлечь внимание исследователей и к другим фоторецепторам [370], в частности, погло щающим свет в зеленой области спектра. Даже в случае с фитохромом высказы вается предположение, что зеленый свет фитохром поглощает не самостоятель но, а через посредство “зеленого фоторецептора”, который может взаимодейст вовать с фитохромом и регулировать его содержание в мембранах [441].

Зеленый свет могут поглощать цитохромы. Основным местом их локализа ции являются хлоропласты и митохондрии. Каждый цитохром имеет три полосы поглощения, и [73] (см. табл. 19). Следовательно, и полосы поглощения ци тохромов ЭТЦ фотосинтеза приходятся на зеленую область спектра (490 - нм) [50, 131, 438]. Проявивший большую активность в биосинтезе АК зеленый свет с длиной волны 553 нм (табл. 12) как раз соответствует поглощению вос становленного цитохрома f [447].

Митохондриальные цитохромы b и с также имеют поглощение в зеленой об ласти спектра. Оно может несколько отличаться от вышеприведенного. Так, в листьях шпината -пик цитохрома с обнаружен при 552 нм, b цитохромов - при 560 нм, а цитохромов - при 604 нм. Несколько отличалось поглощение -пика цитохромов стеблей шпината: оно приходилось на 549 нм у цитохрома с, 599 нм у цитохрома а и 554, 557, 567 нм - у цитохромов b [251].

Таблица Поглощение света цитохромами (нм) Полоса поглощения Цитохромы b Митохондриальные 563 532 с1 554 524 с 550 521 f Хлоропластные 555 526 b6 563 - b3 559 529 422- B зеленой области спектра поглощают и микросомальные цитохромы в про ростках маша: 559, 560,5, 562,5 нм [277].

Цитохромы обнаружены в нефотосинтезирующих клетках [259, 331], поэто му они могут выступать в качестве акцепторов зеленого света и в этиолирован ных проростках ячменя, пластиды которых содержат цитохромы f, b (низко по тенциальный), цитохром b - 563 нм [349].

Помимо цитохромов в зеленой области спектра поглощают беталаиновые пигменты [149], пластоцианин хлоропластов [416] и этиохлоропластов [130], антоцианы и незаряженные флавиновые радикалы (максимум поглощения нм) [85], возможно, и другие соединения [294]. При исследовании спектра дей ствия фотоэлектрической реакции фасоли было показано, что он сходен с тако вым фотосинтеза, но имеет еще дополнительный максимум в зеленой области спектра, наличие которого авторы связывают с фикобилиновыми пигментами [358].

Каким образом энергия зеленого света, поглощенного данными соединения ми, может стимулировать биосинтез АК, пока не ясно. Заманчиво предположить, что энергия света, поглощаемого, например, цитохромом в-559, функция кото рого не ясна [234], непосредственно используется в фотовосстановлении ДАК до АК. Система ДАК/АК имеет более высокий отрицательный окислительно восстановительный потенциал (0,08 В, рН 7,0), чем цитохромы (0,12 - 0,29 В) [133], и энергия зеленого света может быть использована для осуществления пе реноса электрона от цитохромов в сторону компонентов с более высоким отри цательным окислительно-восстановительным потенциалом: ДАК/АК.

Механизм участия зеленого света в биосинтезе АК может быть связан и с ак тивацией ЭТЦ дыхания или фотосинтеза, так как некоторые из указанных фото рецепторов являются их компонентами. Возможно и другое - при облучении зе леным светом, когда меняется скорость ростовых [53, 302, 394, 297] и ряда об менных процессов [24, 40, 55, 91, 314], уменьшается использование АК, напри мер, на фотовосстановление пигментов [378] или других соединений, что также будет способствовать накоплению аскорбата.

Такая возможность проверялась в опытах с альбиносными проростками яч меня, в которых с помощью салицилальдоксима ингибировалась активность пластоцианина [175]. Медьсодержащий белок пластоцианин присутствует в ти лакоидных мембранах хлоропластов [216, 132] и функционирует в качестве пе реносчика электронов от цитохрома f на Р700 в ЭТЦ между фотосистемой II и I [265, 354, 355]. Образование пластоцианина зависит от интенсивности дейст вующего света, и скорость его биосинтеза в темноте составляла лишь 1/10 от светового варианта [386]. В спектре поглощения окисленного пластоцианина имеется три максимума - 460, 597 и 775 нм, то есть один из них приходится на зеленую область спектра (рис. 16). Голубая окраска пластоцианина полностью исчезает при его восстановлении АК [416]. АК используется в процессе восста новления пластоцианина, хотя эта реакция может играть лишь второстепенную роль, так как в хлоропластах пластоцианин в основном восстанавливается цито хромом f [422]. Р700 также восстанавливается АК [41, 263], и этот процесс усили вается в 20-25 раз при добавлении 2,6 моля пластоцианина на моль Р700 [301].

Рис. 16. Спектры поглощения цитохрома с в окисленной (1) и восстановленной (2) формах. Указаны характерные полосы поглощения восстановленной формы -, и (по А.Ленинджеру, 1985) Пластоцианин присутствует в пигментированных тканях. Наличие его у аль биносов было показано нами с использованием метода афинной хроматографии [182]. Для ингибирования пластоцианина использовались различные концентра ции салицилальдоксима (510-4 - 510-9 М), добавленные к 1%-ной глюкозе, и в их присутствии исследовалось светозависимое накопление АК альбиносными проростками ячменя (рис. 17). Характер действия салицилальдоксима зависел от его концентрации: при 510-4 - 510-5 М отмечено увеличение содержания АК при снижении ДАК;

в присутствии меньших концентраций (510-6 - 510-7 М) уровень АК и ДКГК снижался, что сопровождалось накоплением ДАК.

Рис. 17. Изменение содержание АК (1), ДАК (2) и ДКГК (3) в альбиносных листьях ячменя, плавающих на 1%-ном растворе глюкозы на свету (1 час, 33 тыс. эргсм-2с-1) в присутствии различных концентраций салицилальдоксима (СА) в % к контролю (100%) Стимулирующее действие салицилальдоксима на накопление АК можно объяснить тем, что ингибирование пластоцианина влечет за собой уменьшение использования АК на его восстановление и восстановление Р700. Салицилальдок сим в концентрации 510-6 - 510-7 М, вероятно, уже не оказывает активного ин гибирующего действия на пластоцианин, и уменьшение накопления АК на свету в этом случае может определяться использованием ее на восстановление пласто цианина, и как результат использования восстановленной формы АК возрастает ДАК.

Обнаруженный нами эффект стимуляции накопления АК салицилальдокси мом в альбиносных проростках ячменя на свету проявлялся, хотя и в меньшей степени, и в этиолированных проростках. Вероятно, прозеленение этиолянтов отвлекает часть восстановленной АК, что подтверждалось данными опытов с более длительной, двухчасовой экспозицией: процесс прозеленения проростков нарастал, и стимуляция накопления АК салицилальдоксимом уже отсутствовала.

Следовательно, пул АК в проростках ячменя на свету может зависеть от функ ционального состояния пластоцианина, способного самовосстанавливаться и восстанавливаться АК.

Обсуждая приведенный материал по исследованию накопления АК в проро стках ячменя в присутствии салицилальдоксима, вероятно, нужно иметь в виду и нижеследующее соображение. Механизм ингибирующего действия салицилаль доксима основан на его влиянии на ионы меди. Если это не специфическая реак ция, то салицилальдоксим может ингибировать не только медьсодержащий бе лок - пластоцианин, но и медьсодержащие ферменты, окисляющие АК, и тогда наблюдаемое увеличение уровня АК в присутствии салицилальдоксима будет опосредовано не функциональным состоянием пластоцианина, а оксидазами АК.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.