авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Министерство промышленности и торговли Российской Федерации Правительство Новосибирской области ...»

-- [ Страница 6 ] --

ELECTRON-BEAM TREATMENT OF ELECTROSPUN PRODUSED VACULAR GRAFTS A.O. Lebedeva, O.B. Vayner1, T.S. Godovikova1, U.V. Afonin1, A.U. Demianova1, M.V. Korobeinikov2, A.S. Yunoshev3, A.A. Karpenko4, I.V. Popova4, E.A. Pokushalov4, A.E. Akulov5, A.V. Romashenko5, S.M. Fomenko6, A.M. Zaydman6, P.P. Laktionov 1Institute of chemical biology and fundamental medicine SB RAS, Novosibirsk, Russia Budker Institute of Nuclear Physics SB RAS, Novosibirsk, Russia Lavrentyev Institute of Hydrodynamics SB RAS, Novosibirsk, Russia Meshalkin Institute of Circulation Pathology, Novosibirsk, Russia Institute of cytology and genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia Department of Histology, Novosibirsk Institute of Traumatology, Novosibirsk, Russia Abstract. Novel approaches for construction of articial implants – analogs of hyalinic cartilage and blood vessels were designed. Photopolymerized derivatives of gelatin and chondroitin-4-sulfate were chemically synthesized, solid 3D matrixes for cultivation of chondroblasts were prodused by electrospinning of nylon 6 or polylactid-co-glycolide solutions. All stages of production of photopolymerized gel non-toxic for chondroblasts were elaborated. In vivo experiments demonstrates that multi-layers implant consisting of sheets of nylon 6 populated with chondroblasts and xed with photopolymerized composition is tightly bound in the damaged area of hyalinic cartilage and cells stay alive for a long time. Vascular grafts were prodused by electrospinning of synthetic polymers solutions (polycaprolactone, polylactide co-glycolide, nylon 6) and their mixtures with gelatin and growth factors. Mechanic strength of the materials as long as the inuence of electron-beam treatment of the materials onto their stiffness and stability was investigated. The polymers composition supporting adhesion and proliferation of endotheliocytes were selected.

In vivo experiments demonstrate permeability of the grafts for blood stream and capacity for long term functioning in rats.

Получение имплантов, идентичных заменяемым тканям или ор ганам, является насущной потребностью современной медицины в связи с увеличении доли возрастных пациентов, действием неблаго приятных условий внешней среды и, в результате ростом количества заболеваний, требующих восстановления утративших функциональ ное состояние тканей и органов. Современное развитие химических технологий и физических методов позволяет получать трехмерные матриксы с механическими свойствами, близкими к заменяемым ор ганам, а современные молекулярно-биологические методы и методы клеточной инженерии позволяют получать клеточно-наполненные импланты близкие по свойствам к заменяемым органам.

Одним из примеров медленно регенерирующих тканей, особен но у пациентов пожилого возраста является гиалиновый хрящ. Для формирования аналога хрящевой ткани нами был предложен ком бинированный материал, состоящий из слоев волокнистой подлож ки, изготовленной методом электроспиннинга из биосовместимых и биодеградируемых полимеров, таких как полилактид-ко-гликолиды скрепленных и зафиксированных в месте повреждения при помо щи фотополимеризуемых биосовместимых материалов. В качестве исходных фотополимеризуемых блоков были использованы синте зированные хондроитин-4-сульфата метакрилат (ХСМА), желатина метикрилат (ЖМА), а в качестве связывающего полимера – полиэти ленгликольдиакрилат (ПЭГДА). ХСМА и ЖМА были синтезированы в ИХБФМ СО РАН по модифицированному протоколу [1] и охарак теризованы при помощи 1Н-ЯМР. В качестве фотоинициатора был использован 2-гидрокси-4’-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропеофенон (Darocur 2959 (D2959)), который по литературным данным не токси чен для клеток в концентрации от 0,01 %-0,1 % и оптимален для фо тополимеризации биосовместимых гелей [2]. Фотополимеризацию инициировали, облучая гель при помощи ультрафиолетового фонаря MTE U301 со светодиодным элементом излучающим свет с длиной волны 366±7 нм по данным измерения на спектрометре AVANTES, AvaSpec-3648. Поскольку в качестве излучающего элемента в фонаре используется 16 точечная решетка, для того, чтобы получить равно мерный световой поток, было изготовлено конденсорное устройство из двояковыпуклой линзы с фокусным расстоянием 3,6 см, которое позволяло получать пятно света равномерной интенсивности диа метром 6-8 мм на расстоянии 15-50 мм от конденсора. Мощность светового потока, измеренная на приборе COHERENT 3sigma с UV измерительной головкой диаметром 6 мм составляла 28 мВт/см2 на расстоянии 2 см от конденсора. С использованием тепловизора ТКВр ИФП/СВИТ было показано, что облучение клеток в течение 20 минут (28 мВт/см2) не приводит к нагреванию клеток более чем на 0,03°С (минимальный уровень детекции сигнала тепловизором), и не может индуцировать в клетках тепловой шок. Для того, чтобы исследовать влияние используемого источника света и фотоинициатора D2959 на жизнеспособность клеток, хондробласты, полученные из операци онного материала и культивированные в среде DMEM/F12 по ранее описанному протоколу [3], облучали в течение 3-х минут при мощно сти 28 мВт/см2 и оценивали количество живых и мертвых клеток спу стя 48 часов при помощи окрашивания клеток кальцеином (Calcein AM, Sigma) и пропидиум иодидом (Fluka). Было показано, что сам по себе (без освещения) D 2959 не токсичен для хондробластов, и после освещения токсичен только в концентрации более 0,09 % (0,15 %).

Следует отметить, что в присутствие фотополимеризуемых полиме ров ХСМА, ЖМА и ПЭГДА D 2959 менее токсичен. Для того чтобы исследовать токсичность ХСМА и ЖМА хондробласты культивиро вали в присутствие ХСМА (25 мг/мл) и ЖМА (12,5 мг/мл), после 48 часов культивирования окрашивали клетки пропидиум иодидом/ кальцеином и оценивали жизнеспособность клеток. Было показано, что культивирование клеток в присутствие ХСМА и ЖМА не приво дит к появлению клеток окрашенных пропидиумиодидом, и, таким образом, синтезированные фотополимеризуемые биополимеры не влияют на жизнеспособность хондробластов.

Прочность гелей из ХСМА, ЖМА и ПЭГДА на сжатие опреде ляли с помощью универсальной машины для испытания материалов Zwick/Roell Z100 (Германия). Было показано, что гель, содержащий 25 мг/мл ХСМА, 12,5 мг/мл ЖМА и 2,5 % ПЭГДА, имеет прочность 0,17 МПа, что близко к прочности гиалинового хряща, составляющей 0,2-0,58 МПа [4]. Однако такие гели не поддерживают нормального функционирования хондробластов, которые сохраняют жизнеспособ ность только в гелях, содержащих 25 мг/мл ХСМА, 12,5 мг/мл ЖМА и 0-1,25 % ПЭГДА, которые имеют в 5 раз меньшую прочность.

Нами было показано, что хондробласты хорошо пролиферируют на поверхности листов, полученных методом электроспиннинга из полилактид-ко-гликолида и нейлона 6. Листы из нейлона 6 с культи вируемыми хондробластами были использованы для формирования комбинированного аналога гиалинового хряща в эксперименте in vivo. Для этого в гиалиновом хряще коленного сустава кролика было сформировано отверстие диаметром 4 мм, в которое была уложена стопка листов из нейлона 6 (5 шт), пропитанных и зафиксированных в месте повреждения фотополимеризуемым гелем (25 мг/мл ХСМА, 12,5 мг/мл ЖМА, 2,5 % ПЭГДА, 0,09 % D2959). Было показано, что спустя 3 мес. имплант сохранился в месте установки, следователь но, он надежно «зафиксирован» при помощи фотополимеризуемого геля, а при помощи гистологического окрашивания было показа но, что клетки в составе такого импланта сохранили жизнеспособ ность.

Таким образом, комбинированный материал, состоящий из ли стов, изготовленных методом электроспиннинга и фотополимеризуе мого геля, может быть успешно использован для замещения дефек тов гиалинового хряща. В процессе электроспининга в получаемый 3Д матрикс можно вводить дополнительные компоненты, такие как стимуляторы клеточной пролиферации, антибиотики, индукторы клеточной дифференцировки, что позволяет получать материалы с широким набором свойств, стимулирующие рост хондробластов и эффективно интегрирующие в неповрежденный хрящ.

Известные недостатки существующих протезов сосудов, такие как недостаточная эндотелизация, склонность к формированию очагов воспаления, стенозов, стимулируют поиск новых вариантов сосуди стых протезов. Одним из перспективных методов создания волокни стых материалов из природных и синтетических полимеров является метод электроспиннинга. Метод электроспиннинга заключается в вытягивании нити диаметром от нескольких десятков нанометров до нескольких микрон из раствора полимера (или получении частиц в зависимости от условий – вязкости, скорости истечения, силы поля), вносимого в электрическое поле [5]. Этот процесс позволяет, моде лировать структуру поверхности внеклеточного матрикса многих ор ганов и тканей, состоящих из коллагеновых и эластиновых волокон.

Показано, что такие матриксы эффективно заселяются клетками, и обладают необходимыми механическими характеристиками [6].

При помощи электроспиннинга из растворов синтетических по лимеров (нейлон 6, поликапролактон, полилактид-ко-гликолид) и их смесей с желатином и факторами, стимулирующими рост клеток сосудов, нами были получены листовые и трубчатые 3Д матриксы.

В экспериментах in vitro была исследована способность 8 типов ма триксов разного состава (поликапролактон, нейлон 6, полилактид-ко гликолид и их смесей с желатином и факторами роста), стимулировать клеточную адгезию и пролиферацию. Показано, что фибробласты и эндотелиоциты могут закрепляться и пролиферировать на поверхно сти 3Д матриксов;

в отличие от фибробластов, которые хорошо при крепляются и не теряют жизнеспособности на всех типах матриксов, эндотелиоциты намного более чувствительны к материалу, из кото рого изготовлены 3Д матриксы, а оптимальными материалами для их культивирования является 3Д матрикс из полилактид-ко-гликолида с желатином и EGF, или такой же матрикс, содержащий в качестве основного компонента нейлон 6.

Проведены испытания прочности материалов, полученных мето дом электроспиннинга. Пределы упругой и остаточной деформации, представляющие наибольший интерес, определены исходя из диа грамм растяжения, полученных на универсальной машине для ис пытания материалов Zwick/Roell Z100 (Германия) и при воздействии статической нагрузки на исследуемые материалы. Модуль упругой деформации полученных материалов составляет от 360 до 530 Н/см2, удлинение при разрыве 45-50 %. Наряду с требованиями к механи ческой прочности, устойчивости к длительным циклическим нагруз кам протез сосуда должен быть устойчив к формированию стенозов и аневризм, т.е. содержать элементы предотвращающие передавлива ние или необратимое радиальное растяжение сосуда. Одним из под ходов к введению жестких элементов может быть высокоэнергетиче ская обработка отдельных областей протеза.

Для модификации механических свойств листовые материалы и трубки, изготовленные при помощи электроспиннинга из нейлона 6, облучали тормозным излучением электронного пучка, генерируемым ускорителем электронов ИЛУ-6 с энергией 2 МэВ и дозой, варьирую щей в диапазоне от 0 до 250 кГр с шагом 25 кГр. Показано, что об лучение приводит к повышению упругих свойств протезов сосудов, и таким образом, может быть использовано не только для стерилиза ции изделий, но и для модификации механической прочности про тезов, однако требуется дополнительное исследование устойчивости таких материалов к длительной циклической нагрузке и исследова ние их биологических свойств.

Протез сосуда из нейлона 6 имплантирован в брюшную аорту кры сы линии Wistar весом от 400 г. На базе SPF-вивария ИЦИГ СО РАН выполнено постоперационное прижизненное исследование кровото ка в брюшной аорте крысы методом магнитно-резонансной ангио графии с использованием томографа «BioSpec 117/16USR» (Bruker, Germany). Показано, что оперированная артерия проницаема для тока крови. Таким образом, отработаны основные этапы исследова ния процесса изготовления протезов сосудов и создана методологи ческая база для получения протезов нового поколения.

Список литературы:

1. Wang D-A., Varghese S., Sharma B., StrehinJ., Fermanian S., Gorham J., Fairbrother D.H., Cascio B., and Elisseeff J.H. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue–biomaterial integration. // Nature Materials. – 2007. – V.6. – P. 385-392.

2. Patel P.N., Gobin A.S., West J.L., Patrick, Jr. C.W. Poly(ethylene glycol) Hydrogel System Supports Preadipocyte Viability, Adhesion, and Proliferation. // Tissue Engineering. – 2005. – V.11. – P. 1498-1505.

3. Ikenoue T., Trindade M.C.D., Lee M.S., Lin E.Y., Schurman D.J., Goodman S.B., Smith R.L. Mechanoregulation of human articular chondrocyte aggrecan and type II collagen expression by intermittent hydrostatic pressure in vitro. // Journal of Orthopaedic Research. – 2003. – V. 21. – P. 110–116.

4. Jurvelin J.S., Buschmann M.D., Hunziker E.B. Mechanical anisotropy of the human knee articular cartilage in compression. // Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. – 2003. V. 217. – P. 215-219.

5. Garg K., Bowlin G.L. Electrospinning jets and nanobrous structures. // Biomicrouidics. – 2011. – V. 5. – P. 013403.

6. Li M., Mondrinos M.J., Chen X., Gandhi M.R., Ko F.K., Lelkes P.I. Co electrospun poly(lactide-co-glycolide), gelatin, and elastin blends for tissue engineering scaffolds. // Journal of Biomedical Materials Research Part A. – 2006. – V. 79A. – P. 963–973.

НОВЫЕ АТРАВМАТИЧЕСКИЕ ШОВНЫЕ И ДРЕНАЖНЫЕ УСТРОЙСТВА В ХИРУРГИИ В.П. Самсонов, П.П. Тюриков, Е.В. Заварзина, А.К. Самсонов ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН, г. Благовещенск Аннотация. Проведена приоритетная разработка и изучены возможности при менения новых атравматических шовных и дренажных устройств в хирургии. По лученные экспериментальные (60 кроликов) и клинические (46 больных) данные позволяют рекомендовать широкое применение атравматических устройств в хирургии.

NEW ATRAUMATIC SUTURE AND DRENAGE DEVICES IN SURGERY V.P. Samsonov, P.P. Turikov, E.V. Zavarzina, A.K. Samsonov FSBF Centre of Physiology and Patology of Respiration SB RAMS, Blagovechensk Abstrakt. New atraumatic suture and drenage devices were developed and tested in surgery. Experimental (60 rabbits) and clinical (46 patients) data obtained allow to recommend using new atraumatic suture and drenage devices in surgery.

По данным американских авторов, в США затраты на один случай «инфекции, в области хирургического вмешательства» составляет 3152 доллара, в целом по стране материальный ущерб от всей хирур гической внутрибольничной инфекции достигает 10 млрд. долларов в год, включая непрямые затраты [5].

Учитывая высокую медицинскую и экономическую значимость проблемы, многие специалисты признают «инфекцию в области хи рургического вмешательства» ведущей госпитальной инфекцией [2].

За последние десятилетия, несмотря на усовершенствование тех ники соединения тканей, применение многочисленных антибиоти ков, в решении проблемы несостоятельности швов радикальных из менений не наблюдается.

Для профилактики данных осложнений используют различные ме тоды и средства, такие, как укрепление швов фибрин-коллагеновой суб станцией ТахоКомб [8], применение аутофибринового клея [3], биоклея ЛАБ [6], укрепление зон анастомозов различными способами, лазеро магнитотерапия зоны анастомоза [1], санация области анастомоза [4].

C целью профилактики послеоперационных осложнений, связан ных с применением шовного материала, нами разработаны: устрой ство для наложения съемного атравматического шва (патент России №2054890);

устройство для наложения кассетных съемных швов (па тент России №2061416);

устройство для пережатия полых органов (па тент России №1531262);

инфузионно-дренажное устройство (патент России №2146538);

дренажное Т-образное устройство (патент России №2211053). Все устройства готовятся заранее для одноразового приме нения и предварительно стерилизуются любым холодным способом.

Предложенные устройства позволяют атравматично удалять из внутренних органов и тканей ранее установленные дренажи, нало женные хирургические швы и лигатуры в необходимое, расчетное время после срастания ушитых тканей.

Новизна применяемых устройств состоит в том, что к хирургиче скому шовному гидрофильному или гидрофобному, но фитильному, не рассасывающемуся материалу добавляется интимно связанный с ним (ноу-хау) гибкий электрод, выполненный, например, из посере бренного многожильного медного провода, выводимый из внутрен них тканей или органов на поверхность кожи.

Ввиду того, что любой биообъект насыщен водой с растворенны ми в ней солями, а шовный материал гидрофилен или фитилен и, сле довательно, внутри биообъекта он пропитан водным раствором элек тролита, создается идеальный контакт металлического электрода с пропитанной электролитом шовной нитью, при завязывании нити на тканях или сосудах она своим натяжением дополнительно механиче ски сдавливает металлическую часть электрода. Шовная нить имеет жесткое соединение с изоляционной оболочкой электрода. В расчет ное время к больному присоединяется пассивный электрод от аппа рата для высокочастотной хирургии (электронож), а через наружный конец электрода, выведенный на поверхность кожи от шовной нити, пропускают высокочастотный ток. В результате электрического раз ряда на внутреннем конце электрода, в месте контакта шовной нити с ним, нить мгновенно перегорает. И благодаря ее жесткому крепле нию к изоляции электрода, путем тяги за наружный конец электрода, шов или лигатуры свободно и атравматично удаляется из внутренних ушитых тканей. По такому же принципу сконструированы съемные атравматические дренажные устройства.

Проведены исследования, определяющие повреждающее дей ствие высокочастотного электрического тока на живые ткани. Была создана аппаратно-инструментальная база по поиску наиболее под ходящих материалов для изготовления гибких многоактивных элек тродов и их оболочек. Техническим обеспечением опытных работ были: источник переменного высокочастотного тока с возможностью дозированной его подачи на электрод, измерительные приборы для регистрации и контроля температуры, силы тока и времени воздей ствия, исследовалась теплопроводность материалов, используемых для оболочек электродов.

Полученные результаты измерений выявили зависимость между диаметром поперечного сечения электрода и временем воздействия тока на него, было подобрано напряжение высокочастотного тока, не обходимого для пережигания шовных нитей.

Устройства состоят из шовного материала, изоляционных обо лочек для электродов (поливинилхлоридный медицинский пла стикат), утвержденных МЗ России для применения в клинических условиях.

Экспериментальная апробация разработанных устройств проведена на 60 взрослых кроликах обоих полов породы шиншилла. Всего было осуществлено 250 острых и 50 критических опытов. В острых опытах устройства снимали сразу после наложения или через 1 час. В хрониче ских опытах устройства снимали через 3-7 суток. Все съемные устрой ства в острых опытах были извлечены полностью из тканей живот ных, перегорание шовного материала внутри устройства происходило во всех наблюдениях, что подтверждалось наличием пепла в каналах устройств и свободным извлечением устройств из ран и полостей.

После снятия устройств животные выдерживались различные сроки в виварии. Сроки составляли от 2 часов до 25 дней. В эти сроки животные забивались, у них из областей меток производился забор тканей, на которые накладывались устройства, и тканей, где проходил электрод. Затем производилось их гистологическое исследование.

Гистологическими исследованиями тканей, где находились атрав матические съемные устройства, не обнаружен шовный материал в тканях.

В окружающих тканях отмечалось незначительное воспаление, как результат механического раздражения инородным телом. Через семь суток после снятия атравматических шовных и дренажных устройств гистологическая картина окружающих тканей демонстри ровала заживление раны первичным натяжением, следов ожога окру жающих тканей, остатков инородных тел и грубых воспалительных реакций нами не отмечено. Экспериментальные исследования позво лили рекомендовать применение предложенных новых атравматиче ских устройств в клинике.

В клинических условиях были выполнены операции на легких больных с гнойно-некротическими заболеваниями легких, им были выполнены различные по объему операции.

При этом с целью профилактики осложнений, для наложения швов на грудную стенку и для дренирования плевральных полостей нами были применены съемные атравматические шовные и дренаж ные устройства [7].

Устройство для наложения съемного атравматического шва при менялось нами для сближения ребер при ушивании торакотомного оперативного доступа, с помощью устройства для наложения атрав матических кассетных съемных швов соединялись мягкие ткани, для дренирования плевральных полостей применяли атравматические дренажные устройства. Атравматические дренажные устройства атравматическими швами прикреплялись к куполу плевральной по лости, дренаж выводился наружу через отдельный разрез в грудной стенке. Спустя 24-48 часов после операции дренажи свободно удаля лись с помощью воздействия электроножа на электрод, проходящий внутри дренажа.

У всех 46 оперированных больных после применения съем ных атравматических шовных и дренажных устройств не возникло осложнений. Ушитые ткани зажили первичным натяжением, а шов ный материал был своевременно удален из организма.

Таким образом, разработанные приоритетные инновационные технологии позволили осуществить современные способы лечения больных с хирургической патологией легких и добиться эффектив ного излечения больных без осложнений.

Список литературы:

1. Агаев Э.К. Оптимальная хирургическая тактика при резекции терми нального отдела подвздошной кишки // Клин хир. 2009. Т.2. С. 19-21.

2. Агаев Э.К. Несостоятельность швов кишечных анастомозов у боль ных после экстренной и неотложной резекции кишки // Хирургия. 2012. №1.

С.34-37.

3. Антонов О.Н. Фибриновый клей в профилактике несостоятельности анастомозов «высокого риска» в плановой торакоабдоминальной хирургии:

Автореф. дис.... канд. мед. Наук. М. 2006. 32с.

4. Наумов Н.В. Межкишечный анастомоз: патогенез и профилактика не состоятельности: Автореф. дис.... д-ра мед. наук. Красноярск, 2002. 34с.

5. Петрухина М.И. Особенности проявления внутрибольничных инфек ций в хирургических стационарах // Внутрибольничные инфекции: эпиде миология и профилактика. М., 2008. С.117-148.

6. Применение хирургического клея «Биоклей-Лаб» для профилактики несостоятельности анастомозов на органах желудочно-кишечного тракта / М.Д.Дибиров [и др.] Анналы хир. 2008. Т.2. С.31-34.

7. Самсонов В.П., Тюриков П.П. Применение приоритетных разработок в лечении хирургических заболеваний легких // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 1999. Вып.3. С.18-29.

8. Шуркалин Б.К., Горский В.А., Воленко В.А. и др. Возможности, ре зультаты и перспективы укрепления кишечных швов фибринколлагеновой субстанцией ТахоКомб. Хирургия, 2004.Т. 2. С. 53-55.

РЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕЧЕНИЯ ТРАВМЫ ШЕЙНОГО ОТДЕЛА ПОЗВОНОЧНИКА И СПИННОГО МОЗГА В.Ю. Ульянов, С.П. Бажанов, И.А. Норкин Федеральное государственное бюджетное учреждение «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Министерства здравоохранения Российской Федерации Аннотация. Приводятся сведения о результатах лечения больных с осложнен ной травмой шейного отдела позвоночника на основе применения комплекса методов лечебного воздействия, направленных на увеличение регенераторного потенциала спинного мозга. Объектом исследования явились 12 больных с ослож ненной травмой шейного отдела позвоночника. В работе использовались клинико неврологические, лабораторные, интраскопические методы диагностики, а также комплекс патогенетически и хронометрически обоснованных методов лечебного воздействия, включая хирургические и нехирургические. Применение регенера тивных технологий в лечении этой группы больных позволило сократить сроки по слеоперационной реабилитации и увеличить функциональный результат лечения.

REGENERATIVE TECHNOLOGIES TREATMENT OF CERVICAL SPINE AND SPINAI CORD INJURY V.Yu. Ulyanov, S.P. Bazhanov, I.A. Norkin Federal State Institution “Saratov Scientic Research Institute of Traumatology and Orthopedics” of the Ministry of Health of the Russian Federation Abstract. Provides information about the results of treatment of patients with complicated injury of cervical spine through the use of complex methods of therapeutic effects to increase the regenerative potential spinal cord. The object of the study were 12 patients with cervical spine and spinal cord injury. We used clinical, neurological, laboratory, intraskopy methods of diagnosis, and a complex pathogenesis and chronometrically based methods of therapeutic effects, including surgical and non surgical. The use of regenerative technologies in the treatment of this group of patients has reduced the post-operative recovery time and increase the functional outcome.

Создание и внедрение в клиническую практику ряда социально направленных программ по охране здоровья населения Российской Федерации тесно связано с началом реализации приоритетного наци онального проекта «Здоровье», в рамках которого значительное вни мание уделяется оказанию высокотехнологичной медицинской помо щи, что, безусловно, позволяет улучшить результаты хирургического лечения и последующей медицинской реабилитации больных. Од нако до настоящего времени продолжают регистрироваться высокие показатели нетрудоспособности, инвалидности и смертности среди лиц молодого и трудоспособного возраста, что наносит серьезный ущерб экономике государства. Значительный негативный вклад в эту ситуацию привносят случаи травматизма, как промышленного, так и бытового. В структуре полученных травм отдельное место занимают повреждения позвоночника, в том числе закрытые травмы его шей ного отдела, представляющие собой не только актуальную медицин скую, но и социальную проблему [1,4].

Степень нетрудоспособности после травмы шейного отдела по звоночника зависит от степени и уровня повреждения спинного моз га. Согласно клиническим данным и проведенным морфологическим сопоставлениям, только в 30 % случаев имеется полное повреждение спинного мозга, еще в 30 % отмечается неполное анатомическое повреж дение без выраженного неврологического дефицита, что достигается со хранностью функций спинного мозга ниже уровня поражения. Еще в 30 % случаев аксональные пути, проходящие через область поврежде ния, сохраняют способность выполнять некоторые функции [3,7,8].

С точки зрения патогенеза травма спинного мозга может рассма триваться как итог двух процессов: изначального механического по вреждения вещества спинного мозга и последовательности прогресси рующих вторичных патофизиологических событий (некроз и апоптоз, нейровоспаление, метаболические расстройства, ингибирование ро ста аксонов, несовершенный нейрогенез, эксайтотоксичность) [2] Существенные отличия состояния пациентов с различными уров нями повреждения спинного мозга требуют разработки комплекса мероприятий, направленных на ограничение механизмов вторичной альтерации и активацию процессов ремоделирования нервной ткани, а именно неотложной нейропротекции, направленной на предупре ждение смерти нейронов, активации процессов регенерации волокон нервных путей, т.е. инициации роста после повреждения. На послед ствия повреждения вещества спинного мозга воздействуют путем клеточного замещения и лечения процессов демиелинизации нерв ной ткани. Разрабатываются также методы стимуляции аксональной регенерации [5,6,9,10].

Цель: улучшить результаты лечения больных с осложненной трав мой шейного отдела позвоночника путем применения комплекса не медикаментозных и медикаментозных мероприятий, направленных на повышение регенераторного потенциала спинного мозга.

Объект исследования составили 42 больных, находившихся на ле чении в ФГБУ «СарНИИТО» Минздрава России с 2010 по 2013 гг.

В структуру исследования входили пациенты с повреждениями верх нешейного (n = 15) и нижнешейного (n=20) отделов позвоночника, а также больные с многоуровневыми (супра-субаксиальными) по вреждениями (n=7). Кроме неврологического обследования, всем больным выполняли спондилограммы, компьютерные томограммы, магнитно-резонансную томографию и электронейромиографию. Во всех случаях при определении нестабильного характера поврежде ния для предотвращения вторичного смещения костных фрагментов в просвет позвоночного канала выполняли эндоскопически ассисти рованную интубацию трахеи в нейтральном положении головы в условиях продолжающейся фиксации шейного отдела позвоночника жестким ортезом. Для профилактики ятрогенных осложнений в ходе манипуляций на структурах верхнешейного отдела позвоночника и краниовертебрального перехода в ряде случаев применяли систему интраоперационного нейрофизиологичекого мониторинга, основан ного на регистрации вызванных сенсо-моторных потенциалов.

Основными целями хирургического лечения являлись декомпрес сия, репозиция и полноценная стабилизация поврежденного сегмен та с использованием принципов микронейрохирургии и учета кон цепции единого нейроортопедического подхода. При повреждениях С1 позвонка, а также при нестабильных переломах зуба С2 позвон ка I типа (со сдвиговым смещением в сагиттальной плоскости) во всех случаях применяли фиксацию в Halo-аппарате, что позволяло выполнить наряду с закрытой аппаратной декомпрессией дурально го мешка, адекватную репозицию и надежную фиксацию перелома.

При переломах зуба С2 позвонка II типа производили остеосинтез канюлированным винтом фирмы Medtronic после осуществления предварительной закрытой репозиции в Halo-аппарате (в случае сме щения костных фрагментов в сагиттальной плоскости), что наряду с минимальной инвазивностью вмешательства позволяло добиться хо роших функциональных результатов. При переломах зуба С2 позвон ка III типа нами применялся трансартикулярный атланто-аксиальный артродез по Magerl. При переломах дуг С2 позвонка («переломах па лача») с наличием сегментарной нестабильности предпочтение отда вали вентральному С2-С3 спондилодезу с мононосегментарной эн дофиксацией шейной пластиной, выполняемых из правостороннего субмандибулярного доступа в условиях умеренной тракции шейного отдела позвоночника по оси.

При повреждениях нижнешейного отдела позвоночника во всех случаях хирургическое вмешательство выполняли из вентрального до ступа, которое являлось обоснованным с учетом биомеханики повреж дений и соответствовало направлению силы, вызывавшей дислокацию костных фрагментов в просвет позвоночного канала и формирование кифотической деформации на уровне повреждения. Кроме того, перед ний доступ позволял осуществить манипуляции как на деформиро ванных костных, так и на компремированных невральных структурах.

В связи с этим, всем больным выполняли хирургическое вмешательство в объеме вентральной декомпрессии дурального мешка, коррекции и фиксации поврежденных позвоночно-двигательных сегментов. Меж теловой спондилодез выполнили всем пациентам: моносегментарный (n=7) и полисегментарный (n=13). Во всех случаях, при оценке отда ленных результатов, достигнуто формирование полноценного костного блока на уровне спондилодеза, что подтверждалось при выполнении функциональных рентгенограмм и по данным мультиспиральной КТ.

При многоуровневых повреждениях шейного отдела позвоночни ка хирургическое вмешательство во всех случаях производилось из Г-образного разреза, который сочетал в себе как подчелюстной, так и стандартный передне-боковой парафарингеальный доступы. При этом удавалось получить широкий подход к телам практически всех шейных позвонков (С2-Th1) с оптимальным углом операционного действия, а также выполнить адекватную многоуровневую деком прессию дурального мешка, нервно-сосудистых образований позво ночного канала, осуществить надежную фиксацию поврежденных позвоночно-двигательных сегментов с использованием полисегмен тарных металлоимплантов.

В раннем послеоперационном периоде лечение больных осущест вляли в отделении реанимации и интенсивной терапии, где прово дили комплексное медикаментозное лечение, включающее в себя мембраностабилизирующую, антигипоксантную, вазотропную, ме таболическую, антибактериальную терапию. Локальную гипотермию спинного мозга осуществляли в первые часы после выполнения хи рургического вмешательства путем перфузии спинного мозга охлаж денным до 5-8 0С 0,9 % раствором хлорида натрия 1 раз в сутки под непрерывным контролем витальных функций. Критериями прекра щения сеансов локальной гипотермии служили регресс клинических проявлений восходящего отека спинного мозга, а также тенденция к снижению концентраций лактата/пирувата, лактатдегидрогеназы в периферической крови, которые тестировались в динамике.

При наличии у больных ясного сознания, самостоятельного, кли нически эффективного дыхания через естественные дыхательные пути, стабильных гемодинамических показателей, отсутствии при знаков психомоторного возбуждения ежедневно проводили сеансы гипербарической оксигенации в одноместной барокамере Ока МТ в режиме 1,4-1,6 ата, продолжительностью 40 мин. Режим компрессии и декомпрессии составлял 0,15 ата/мин при длительности 8-10 мин.

Продолжительность курса ГБО-терапии составила 10-12 сеансов.

Критерием эффективности гипербарической оксигенации как метода нейропротекции являлась тенденция к снижению на 21-е сутки по казателей перекисно-антиоксидантного дисбаланса и иммунологиче ских маркеров повреждения нервной ткани по сравнению с базаль ным уровнем, определяемым при поступлении.

После регресса явлений острого периода травматической болезни спинного мозга, подтверждаемого клинико-лабораторными данными, приступали к следующему этапу осуществления инструментальной нейропротекции, которая была направлена на повышение регенера торного потенциала нервной ткани. Для этого применяли сочетанное электромагнитное воздействие на центральную нервную систему.

Нейромодуляцию спинного мозга осуществляли путем эпидуральной имплантации электродов выше и ниже уровня повреждения. В слу чаях повреждения верхнешейного отдела позвоночника устанавли вали только один эпидуральный электрод ниже уровня повреждения в связи с наличием анатомической близости ствола головного мозга, стимуляция которого может вызывать витальные нарушения. Воздей ствие магнитным полем на головной мозг обеспечивали через внеш ние излучатели, установленные на кожные покровы головы в про екции темпоральных и субокципитального окон, месторасположение которых предварительно определяли по данным транскраниальной допплерографии. Сеансы сочетанного электромагнитного воздей ствия производили 3 раза в сутки по 10-15 мин со стандартными па раметрами в течение 15-20 дней. Критериями эффективности прово димого метода лечения являлись данные клинико-неврологического обследования, электрофизиологического исследования (Н-рефлекс, М-ответ), а также динамика маркеров регенерации нервной ткани.

Наряду с применением комплекса методов немедикаментоз ной нейропротекции всем больным проводили реабилитационно восстановительные мероприятия, направленные на раннюю двига тельную активизацию, улучшение нейротрофических процессов и профилактику инфекционно-воспалительных процессов.

По завершению стационарного лечения больные выписывались с рекомендациями о продолжении физио-функциональных мероприя тий в условиях лечебных учреждений по месту проживания.

Таким образом, предлагаемый нами комплекс регенеративных технологий, включающий применение патогенетически и хрономе трически обоснованных хирургических и нехирургических методов воздействия в лечении больных с осложненной травмой шейного от дела позвоночника позволил сократить сроки послеоперационной реабилитации и улучшить функциональный результат лечения.

Список литературы:

1. Борода Ю.И., Драгун В.М. Дифференцированный подход к хирурги ческому лечению осложненных дислокаций шейных позвонков / Поврежде ния и заболевания шейного отдела позвоночника: Материалы симпозиума ГУН ЦИТО им. Н.Н. Приорова. М., 2004. С. 85-86.

2. Крыжановский Г.Н. Основы общей патофизиологии. М.: ООО Меди цинское информационное агентство, 2011. 256 с.

3. Нейропротекция: модели, механизмы, терапия / под ред. М. Бэра;

пер.

с англ. В.П. Зыкова, П.М. Камчатнова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. 429 с.

4. Перльмуттер О.А. Травма позвоночника и спинного мозга. Н.

Нoвгород:: Медицина, 2000. 144 с.

5. Румянцева С.А., Ступин В.А., Афанасьев В.В. [и др.]. Второй шанс (современные представления об энергокоррекции). М.: МИГ Медицинская книга, 2011. 176 с.

6. Pointillart V. Pharmacological therapy of spinal cord injury during the acute phase / Spinal Cord. 2000. n. 38. P. 71-76.

7. Bunge M.B. Bridging areas of injury in the spinal cord / Neuroscientist.

2001. n.7. P. 325-339.

8. Dietz V., Young R.R. The syndrome of spinal cord dysfunction. In: Neuro logical Disorders: Course and Treatment. Brandt T., Caplan R.L., Dichgans J. [et al.] San Diego: Academic Press, 2003. P. 925-937.

9. Ditunno J.F. Walking index for spinal cord injury: An International multi center validity and reliability study / Spinal Cord. 2000. n. 38. P. 234-243.

10. Geller H.M., Fawcett J.W. Building a bridge: engineering spinal cord re pair / Exp. Neurol. 2002. n.174. P. 125-136.

Раздел V. ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ, СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ, СИНТЕЗ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ, РАЗРАБОТКА И СОЗДАНИЕ НОВЫХ МОДЕЛЕЙ ЛАБОРАТОРНОГО ОБОРУДОВАНИЯ ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОМАТЕРИАЛОВ И ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ДНК В.Ф. Зарытова, А.С. Левина, З.Р. Исмагилов, Н.В. Шикина, Н.А. Мазуркова, М.Н. Репкова Институт химической биологии и фундаментальной медицины, СО РАН, Новосибирск, Россия Институт катализа СО РАН, Новосибирск, Россия ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, р.п. Кольцово, Россия Аннотация. Разработана технология получения нанокомпозитов TiO2•PL DNA, содержащих наночастицы диоксида титана и фрагменты ДНК. Показано, что созданные нанокомпозиты проникают в клетки без использования трнсфекционных агентов и физических методов воздействия и проявляют слабую токсичность (ТС50 1800 мкг/мл). На примере подавления репродукции вируса гриппа А продемонстрирована высокая противовирусная активность созданных нанокомпозитов (99.98%). Оценена также ингибиторная активность (IC50 = 1.5 мкг/ мл, что соответствует 0.03 мкМ по ДНК-фрагменту) и индекс селективности (селек тивность SI = ТС50/IC50 1200). Полученные результаты позволяют рассматривать созданные нанокомпозиты как перспективные лекарственные препараты для лечения и профилактики не только вирусных, но и других заболеваний, связанных с функциями нуклеиновых кислот.

ANTIVIRAL ACTIVITY OF PREPARATIONS BASED ON NANOMATERIALS AND IMMOBILIZED DNA Zarytova V.F., Levina A.S., Ismagilov Z.R., Shikina N.V., Mazurkova N.A., Repkova M.N.

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS, Novosibirsk, Russia.

Institute of Catalysis, SB RAS, Novosibirsk, Russia.

FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia.

Abstract. A method of designing nanocomposites TiO2•PL-DNA containing titanium dioxide nanoparticles and DNA fragments has been developed. The prepared nanocomposites were shown to penetrate through cell membranes without any transfection agents and physical impact. These nanocomposites have a low toxicity (ТС50 1800 мкг/мл). A high antiviral activity (99.98%) of the proposed nanocomposites was demonstrated against inuenza A virus.

The inhibitory activity (IC50) was evaluated to be 1.5 мкг/мл, which corresponded to 0.03 мкМ for DNA fragment. The selectivity index was calculated as the ratio SI = ТС50/IC50 1200. The results allow one to consider the proposed nanocomposites as prospective drugs for the treatment and prophylaxis of not only viral but also the other diseases associated with nucleic acid functions.

Знание нуклеотидной последовательности геномов открыло ре альную возможность создания селективных лекарственных средств, специфически воздействующих на внутриклеточные нуклеиновые кислоты (НК) (например, на НК патогенов или на онкогены), кото рые при этом не затрагивают НК хозяина. Селективность действия обеспечивается соответствием нуклеотидных последовательностей НК-мишеней в клетке и направленного к ней нуклеотидного компо нента лекарственного препарата. Такие препараты перспективны для лечения практически всех заболеваний (инфекционных, онкологиче ских, сердечно-сосудистых и др.), в основе которых лежит функцио нирование соответствующих НК. Появление этих заболеваний чаще всего ассоциировано с появлением и накоплением определенных «вредоносных» РНК, имеющих в каждом отдельном случае свою нуклеотидную последовательность. Возможность блокирования РНК, ответственных за различные заболевания, путем создания ле карственных препаратов на основе синтетических комплементарных им нуклеиновых кислот (антисмысловых олигонуклеотидов, дезок сирибозимов, малых интерферирующих РНК и более стабильных в биологических средах пептидных аналогов нуклеиновых кислот), открывает колоссальные возможности для лечения. Это препараты нового поколения, адресно воздействующие на генетический матери ал патогенов, не затрагивая НК хозяина. Они направлены на опреде ленные мишени и должны обладать максимальной эффективностью и минимумом побочных эффектов.

Адресное воздействие на генетический материал клетки является одной из важнейших проблем современной биологии и медицины.

Первые работы в этой области были сделаны в России, в Новоси бирске, с участием автора статьи [1]. В настоящее время такие ис следования проводятся во всех развитых странах мира. Одной из наиболее значимых, но пока до конца не решенных проблем в об ласти антисенс-подхода, генотерапии является слабое проникнове ние фрагментов НК в клетки. Из-за низкой способности проникать в клетки они до сих пор не нашли широкого применения в медицине.

Несмотря на многолетние поиски систем доставки фрагментов НК в клетки [2], проблема до сих пор не решена. В мире проблема до ставки существует не только для ДНК и ее фрагментов, но и для мно гих лекарственных форм. Низкая степень проникновения лекарств в клетки приводит к необходимости использования больших доз для достижения терапевтического эффекта, что часто приводит к серьез ным осложнениям, вызванным токсичностью препаратов.

Недавно авторами данной статьи были инициированы работы по созданию искусственных наноконструкций на основе наночастиц, содержащих антисмысловые олигонуклеотиды, для направленного воздействия на вирусный геном. Эти исследования в рамках ФЦП были поддержаны государственными контрактами № 02.51.11. (2007-2008 гг) и 02.512.12.2038 (2009-2010 гг) и ГК № 16.512.11. (2011-2012 гг) (ТП «Медицина будущего»). В результате проведен ных работ разработана эффективная технология создания уникаль ных нанокомпозитов, состоящих из наноматериалов-транспортеров и синтетических ДНК. Показано, что созданные нанокомпозиты про никают в клетки без использования трнсфекционных агентов и фи зических методов воздействия, а доставленные фрагменты ДНК спо собны эффективно подавлять функции определенных генов в клетке [3-5]. В качестве наноматериалов-транспортеров использованы нано частицы, полученные на основе слабо токсичных биосовместимых материалов, разрешенных к применению в медицинской практике, а именно: диоксида титана (TiO2) и диоксида кремния (SiO2), которые способны проникать внутрь клеток [6].

Для получения нанокомпозитов разработаны методы достаточно прочного, но нековалентного связывания транспортируемых лекар ственных препаратов с наночастицами [3, 4]. Разработанные типы «привязки» ДНК фрагментов к наночастицам, обеспечивают, с одной стороны, возможность проникновения ДНК фрагментов в клетки в виде нанокомпозитов, а с другой стороны, после их проникновения в клетки – высвобождение ДНК из состава нанокомпозитов. Пока зано, что доставленные таким образом ДНК фрагменты эффективно воздействуют на внутриклеточные НК-мишени [4, 5], что свидетель ствует о способности созданных нанокомпозитов транспортировать лекарства на основе синтетических НК в клетки с сохранением их уникальных свойств – узнавать и воздействовать на комплементар ные участки НК-мишеней.

Полученные нанокомпозиты с использованием диоксида титана были испытаны в качестве противовирусных средств. Нанокомпозиты на основе фрагментов ДНК и наночастиц диоксида силикагеля, кото рый считается биодеградируемым, находятся на стадии разработки.

Высокий уровень смертности в России связан, в первую очередь, с сердечно-сосудистыми болезнями, онкологией и вирусными (грипп, СПИД, гепатит и др.) заболеваниям. Появление этих заболеваний, как правило, ассоциировано с появлением и накоплением определенных РНК, имеющих свою нуклеотидную последовательность. Мы проде монстрировали биологическую активность созданных нанокомпози тов на примере подавления репликации вируса гриппа А в клеточной системе. Геном вируса гриппа А содержит 8 одноцепочечных РНК сегментов отрицательной полярности. После заражения клеток виру сом гриппа вирусные (-)vРНК-сегменты транскрибируются в мРНК и реплицируются в комплементарные (+)сРНК [7]. Сегмент 5 кодирует нуклеопротеин (NP), который играет ключевую роль в инкорпорации вирусного генома в клеточные ядра инфицированного организма и, тем самым, способствует дальнейшей репликации и сборке вирус ных частиц [8]. Ряд авторов показали, что сегмент 5 является осо бенно успешной мишенью для блокирования репродукции вируса различными противовирусными реагентами на основе нуклеиновых кислот, например морфолино-олигонуклеотидами [9] или короткими интерферирующими РНК [10].

Мы использовали MDCK клетки, инфицированные широко рас пространенным подтипом вируса гриппа А человека (H3N2) и на нокомпозиты вида TiO2•PL-ДНК(1) и TiO2•PL-ДНК(2), первый со держал ДНК-фрагмент, комплементарный некодирующей области вирусной РНК 5 сегмента, а во втором случае ДНК-фрагмент был некомплементарен РНК-мишени, то есть был использован в качестве контроля.

Вначале было исследовано влияние наночастиц TiO2 и наноком позитов на выживаемость клеток. Концентрация образцов, вызыва ющая гибель 50 % клеток (ТС50) была оценена как 1800 мкг/мл в обоих случаях, т.е. показана низкая токсичность созданных наноком позитов, причем основной вклад вносят сами наночастицы.

В опытах по оценке противовирусной активности препаратов мы использовали нетоксическую концентрацию 5 мкг/мл, что соответ ствует концентрации ДНК-фрагмента в нанокомпозите 0.1 мкМ. На нокомпозиты и контрольные образцы инкубировали с клетками до заражения вирусом. Показано, что наночастицы, не несущие ДНК фрагмент не влияют на репликацию вируса. Несвязанные ДНК(1)- и ДНК(2)-фрагменты также показали очень слабую противовирусную активность. Это – ожидаемый результат, т.к. известно, что ДНК очень слабо проникает через клеточную мембрану. Значительную проти вовирусную активность проявил нанокомпозит TiO2•PL-ДНК(1), несущий ДНК-фрагмент, комплементарный РНК-мишени: вирус инактивировался в 8000 раз или на 99.98 %. Следует отметить, что нанокомпозит TiO2•PL-ДНК(1) продемонстрировал в 30 раз боль шую противовирусную активность, чем тот же ДНК-фрагмент в при сутствии широко используемого трансфекционного агента липофек тамина, который обеспечивает проникновение ДНК в клетки. Можно сделать вывод, что TiO2-наночастицы обеспечивают более высокий уровень проникновения ДНК-фрагментов в клетки.

При сравнении действия нанокомпозитов TiO2•PL-ДНК(1) и TiO2•PL-ДНК(2), оказалось, что первый в 3000 раз более эффекти вен, т.е. показано, что нанокомпозит, несущий ДНК-фрагмент, ком плементарный целевой мишени, действует сайт-специфично.

На следующем этапе мы исследовали влияние дозы нанокомпози та на ингибирование репликации вируса. В этом случае инкубацию с нанокомпозитом проводили как до, так и после заражения виру сом. Показано, что концентрация нанокомпозита, приводящая к 50 % подавлению вируса (IC50), в обоих случаях составляет 1.5 мкг/мл (0.03 мкМ по ДНК-фрагменту). Полученные величины ТС50 и IC позволили оценить индекс селективности нанокомпозита: SI = ТС50/ IC50 1200 [5].

Сравнение с литературными данными по противовирусной ак тивности препаратов на основе нуклеиновых кислот показало, что созданные нами нанокомпозиты примерно на 2 порядка более эффек тивны и превосходят даже счтитающиеся самыми перспективными препараты на основе коротких интерферирующих РНК [5 и 10].

Таким образом, впервые мы продемонстрировали высокоэффек тивное и селективное противовирусное действие ДНК-фрагментов, доставленных в клетки с помощью TiO2-наночастиц. Высокое инги бирующее действие созданных препаратов на вирус гриппа А пока зывает их потенциал в качестве противовирусных препаратов. Пред ложенные нанокомпозиты могут найти применение для лечения и профилактики не только вирусных, но и других заболеваний, связан ных с функциями нуклеиновых кислот, когда необходимо эффектив ное и селективное взаимодействие ДНК-фрагментов с внутриклеточ ными нуклеиновыми кислотами-мишенями.

Конкурентные преимущества предлагаемого продукта: возмож ность использования нанокомпозитов для доставки синтетических НК в клетки без применения трансфецирующих реагентов или фи зических воздействий;

низкая токсичность;

возможность высвобож дения фрагментов синтетических НК из состава нанокомпозитов внутри клетки благодаря нековалентному связыванию с наночасти цами, возможность использования предложенных нанокомпозитов в качестве препаратов, воздействующих на внутриклеточные НК.


Предлагаемые нанокомпозиты, несущие лекарственные препараты на основе синтетических НК, будут создаваться по одной технологии независимо от заболевания. При переходе от лечения одного заболе вания к другому в нанокомпозите будет изменяться только нуклео тидная последовательность синтетических НК.

В дальнейшем предложенный подход может быть распространен на создание аналогичных нанокомпозитов для лечения различных заболеваний, в основе которых лежат поврежденные НК и НК пато генов. Нанокомпозиты могут быть использованы для «выключения»

поврежденных генов, например, онкогенов или генов, ответственных за генетические или сердечно-сосудистые заболевания и др.

Список литературы:

1.Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonukleosides and diribonukleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. // Tetrahedron Letters. – 1967. – № 37. – P. 3557-3562.

2. Jafari M., Soltani, M., Naahidi S., Karunaratne D.N, Chen, P. Nonviral approach for targeted nucleic acid delivery. // Curr. Med. Chem. –2012. – V. 19. – P. 197–208.

3. Levina A., Ismagilov Z., Repkova M., Shatskaya N., Shikina N., Tuzikov F., Zarytova V. Nanocomposites consisting of titanium dioxide nanoparticles and oligonucleotides. // J. Nanosci. Nanotech. – 2012.– V.12.– P. 1812–1820.

4. Левина А.С., Исмагилов З.Р., Репкова М.Н., Шикина Н.В., Байборо дин С.И., Шацкая Н.В., Загребельный С.Н., Зарытова В.Ф. Создание TiO2 DNA нанокомпозитов, способных проникать в клетки // Биоорган. химия. – 2013. – T. 39. – С. 87–98.

5. Levina A.S., Repkova M.N., Ismagilov Z.R., Shikina N.V., Malygin E.G., Mazurkova N.A., Zinov’ev V.V., Evdokimov A.A., Baiborodin S.I., Zarytova V.F. High-performance method for specic effect on nucleic acids in cells using TiO2~DNA nanocomposites. // Scientic Report. – 2012.– V. 2.– P. 756;

DOI:10.1037/srep00756..

6. Han W., Wang Y., Zheng Y. In vivo biocompatibility studies of nano TiO materials. Advanced Materials Research. – 2009. – V. 79–82. – P. 389–392.

7. Lamb R.A. and Krug R.M. in Fundamental Virology, eds. Knipe D.M.

and Howely P.M., Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. – 2001. – P.

725–770.

8. Portela A. and Digard P. The inuenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication. – J. Gen. Virol. 2002. – V. 83. – P. 723–734.

9. Ge Q., Pastey M., Kobasa D., Puthavathana P., Lupfer C., Bestwick R.K., Iversen P.L., Chen J., Stein D.A. Inhibition of multiple subtypes of inuenza A virus in cell cultures with morpholino oligomers. // Antimicrob. Agents Chemoth er. – 2006. – V. 50.– P. 3724–3733.

10. Ge Q., McManus M.T., Nguyen T., Shen C.H., Sharp P.A., Eisen H.N., Chen J. RNA interference of inuenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003.– V. 100. – P. 2718–2723.

УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ БАКТЕРИЙ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Л.Б. Козлов, С.П. Сахаров, Е.В. Диц, В.В. Ефимов ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Минздрава России Аннотация. Разработано устройство и способ для выделения и накопления некультурабельных бактерий позволяющие проводить изучение биологических свойств некультурабельных бактерий. Перевод некультурабельных бактерий в культурабельное состояние позволяет при стандартных затратах на проведение микробиологических исследований повысить эффективность выделения возбуди телей инфекционных заболеваний, уменьшить количество ложноотрицательных ре зультатов, разработать наиболее эффективное этиотропное лечение заболеваний, вызванных некультурабельными бактериями, обеспечить в более полном объеме проведение эпидемического расследования вспышек инфекционных заболеваний, а также осуществлять в более полном объеме противоэпидемические мероприятия, направленные на выявление и изоляцию источника инфекционного заболевания.

ARRANGEMENT FOR ALLOCATION OF NOT CULTIVATED BACTERIA AND THE WAY OF ITS APPLICATION L.B. Kozlov, S.P. Saharov, E.V. Dits, V.V. Emov GBОUVPО the Tyumen state medical academy of Ministry of Health of Russia Abstraсt. The arrangement and way is developed for allocation and accumulation not cultivated bacteria allowing to spend studying biological properties некультура бельных bacteria. Translation not cultivatedbacteria in сultivated a condition allows at standard expenses for carrying out of microbiological researches to raise efciency of allocation of activators of infectious diseases, to reduce quantity false negative results, to develop the most effective этиотропное treatment of the diseases caused not cultivatedby bacteria, to provide in fuller volume carrying out of epidemic in vestigation of ashes of infectious diseases, as well as to carry out in fuller volume againstepidemicthe actions which have been directed on revealing and isolation of a source infectious been ill Известно значительное количество факторов, влияющих на ге нетическую и фенотипическую изменчивость микроорганизмов.

В ряде случаев под влиянием стресса бактерии теряют способность размножаться на питательных средах. Иногда даже значительное ко личество бактерий может переходить в жизнеспособное, но некуль турабельное состояние [1,2,6]. Установлено Staley J., Konopka A. [9], Kogure K. [8], что значительное количество бактерий, обладающих жизнеспособными патогенными свойствами, не размножаются в ла бораторных условиях. Так, в пробах морской воды стандартными лабораторными микробиологическими методами определяется толь ко 0,01-0,1 % бактерий, а остальные бактерии обладают некультура бельными свойствами.

Свойство бактерий обладать культурабельными и некультурабель ными свойствами связывают с образованием биопленок на поверхно сти микробных клеток. Считают, что биопленки представляют собой эволюционно наиболее древнюю форму существования бактерий и в процессе развития биопленок происходит чередование отдельных циклов. В настоящее время роль бактериальных биопленок в инфек ционной патологии до конца еще не изучена, однако высказывается предположение, что до 80-90 % всех инфекционных болезней связа ны с образованием биопленок. Среди клинически значимых бактерий способность образовывать биопленки показана для представителей семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcusspp., Streptococcusspp., Enterococcusspp., Actinomycesspp., Pseudomonasspp. и Haemophil usspp. Биопленки защищают бактерии от многих неблагоприятных факторов внешней среды, а при локализации в организме человека обеспечивают защиту от факторов резистентности хозяина. Благо даря физико-химическим свойствам биопленок бактерии становят ся нечувствительными к действию антибактериальных препаратов, фагоцитов, антител и белков системы комплемента. В биопленках находятся сообщества бактерий, в которых отдельные особи выпол няют самостоятельные функции, обмениваются информацией и ко ординированно реагируют на меняющиеся условия внешней среды [3,4,5,7].

Для выделения некультивируемых бактерий разработана полез ная модель: «Хладотермостат для выделения некультивируемых бактерий» (заявка №2012104891 от 13.02.2012 г.), на которую вы несено решение Роспатента о выдаче патента. Хладотермостатсо стоит из рабочей камеры, нагревательного элемента, охлаждающего змеевика, фильтра, испарителя, компрессора, приводного двигателя, пускового защитного реле двигателя, цифрового программирующе го устройства и датчика температуры. Цифровое программирующее устройство обеспечивает работу хладотермостата при температуре 37 С и при 4 С в течение заданного периода времени.

На базе ООО Научно-производственного инновационного пред приятия «Тюменский институт микробиологических технологий»

(НПИП «ТИМТ» разработана экспериментальная модель хладотер мостата, позволяющая переводить бактерии из некультурабельного в культурабельное состояние. Экспериментальная модель создана на основе выпускаемого промышленностью термостата воздушного лабораторного (ТВЛ-К, г. Санкт-Петербург) снабженного програм мирующим устройством, обеспечивающим работу хладотермостата в заданном режиме, позволяющем переводить бактерии из некульти вируемого состояния в культивируемое. При работе с предложенным устройством разработана инструкция по работе с программируемым термостатом, включающая: сборку установки и подготовку ее к ра боте, включение хладотермостата, работу с программой управления термостатом ТВЛ-К и составление алгоритма выполнения цикло программы перевода некультивируемых бактерий в культивируемое состояние. Управление работой хладотермостата осуществляют с помощью ноутбука, позволяющего сохранять полученную информа цию и проводить ее математическую обработку.

Использование данного устройства позволило разработать способ выделения некультивируемых бактерий стафилококка (Патент RU№ 2470074 от 20.12.2012 г.). Исследования проводились с госпитальны ми и спорадическими штаммами Staphylococcusaureus, Pseudomona saeruginosa и Escherichiacoli, выделенных от больных находящихся на лечении в 3-м роддоме г. Тюмени. Предложенный способ апроби рован на базе бактериологической лаборатории Тюменского филиа ла ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по железнодорожному транспорту». Всего проведено 30 анализов. В выделенных популяци ях определялась смесь культурабельных и некультурабельных бакте рий. Причем, в микробных популяциях концентрация некультивируе мых бактерий в лабораторных условиях была выше культивируемых на 2 и более десятичного логарифма.

Методика выделения некультурабельных бактерий стафилокок ка заключалась в следующем: выделенный от больных возбудитель инфекции идентифицировали по общепринятым методикам. Для на копления чистой культуры бактерий использовали скошенный мясо пептонный агар (МПА) и культивировали бактерии при температуре 37 С в течение 24 часов. Для определения концентрации бактерий, накопленных на скошенном МПА проводили посев из серийных раз ведений бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром и опре деляли количество выросших колоний, т.е. определяли титр бактерий, обладающих культурабельными свойствами. Пробирки с последую щими разведениями, в которых не удавалось выделить микробные клетки стафилококка,выдерживали 48 часов при температуре 4 С.


Эти условия оказались достаточными для перехода некультурабель ных бактерий в культурабельное состояние. Очевидно, для данной стадии формирования биопленки у S.aureus воздействие низкой тем пературы (4 С) в течение 48 часов вызывало нарушение структуры биопленки и бактерии переходили в культурабельное состояние. Для выявления перехода бактерий из некультурабельного в культурабель ное состояние проводили посев на чашки Петри с желточно-солевым агаром с целью получения изолированных колоний, а затем определя ли концентрацию некультивируемых бактерий стафилококка.

Аналогичные исследования были проведены с культурами P.aeru ginosa и E.coli. Результаты проведенных исследований представлены в таблице.

Таблица Результат выделения некультурабельных бактерий в разведениях, в которых не определялись культивируемые бактерии Вид S. aureus S. aureus P.aeruginosa E.coli микроорга- (госпитальные (спорадические (спорадические (спорадические низма штаммы) штаммы) штаммы) штаммы) Количество 39,0±4,3 53,0±2,5 218,0±16,0 323,0±49, микробных клеток Предложенный способ позволяет при одинаковых затратах на проведение микробиологических лабораторных исследований по сравнению со стандартными микробиологическими методами иден тификации госпитальных и спорадических штаммов повысить эф фективность выделения возбудителей инфекции, уменьшить коли чество ложноотрицательных результатов исследований, разработать наиболее эффективное этиотропное лечение инфекционных заболе ваний, обеспечить в более полном объеме проведение эпидемиче ского расследования при возникновении вспышек инфекционных заболеваний, а также осуществлять в более полном объеме противоэ пидемические мероприятия, направленные на выявление и изоляцию источника инфекционного заболевания.

Список литературы:

1. Волянський Ю. Л. Некультурабельний стан аспорогеннихбактерій:

теоретичніаспектипроблеми та її практична значущість // Інфекційніхвороби. – 2004. – № 1. – С. 5-9;

2. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Ми кробиология. – 1998. – № 6. – С. 725-735;

3. Лямин А.В., Боткин Е.А., Жестков А.В. Методы выявления биопленок в медицине: возможности и перспективы / Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2012. – Том. – № 1. – Р. 17-22;

4. Сидоренко С.В. Роль биопленок в патологии человека. / Инфекциив хирургии. – 2004. –Т. 2. – № 3. – С. 16-20;

5. Юдин И.П. Современные подходы к оценке жизнеспособности бак терий с акцентом на феномене некультурабельности./Annals of Mechnicov Institute, 2007. – N 3. – Р. 8 -16,] 6. Colwell R. R. Bacterial death revisited // Nonculturable microorganisms in the environment / – Ed. D. J. Grimes. – Washington, D.C..ASMPress, 2000. – Р. 325– 7. Costerton W, Veeh R, Shirtliff M, Pasmore M, Post C, Ehrlich G. Theappli cationofbiolmsciencetothestudyandcontrolofchronicbacterialinfections. JClin Invest 2003;

112:466-77;

8. Kogure K., Simidu U., Taga N. Atentative direct microscopic method for counting living marine bacteria // Can. J. Microbiol. – 1979. – V. 25. P.415-420.

9. Staley J., Konopka A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthet ic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats // Annu. Rev. Microbiol. – 1985. –Vol. 39 – P. 321- РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И ТИПИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА ОСНОВЕ МИКРОРНК Н.Н. Колесников1, С.Е. Титов1,2, В.В. Ступак.3, А.В. Лехнер 3, М.К. Иванов2, Ю.А. Веряскина1, Л.Г. Ахмерова1, М.А. Садовой3, И.Ф. Жимулев Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск, ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздрава России».

Аннотация. МикроРНК новый класс регуляторных молекул РНК играющих су щественную роль во многих биологических процессах в клетке. Их дисфункция ведет к разным патологическим процессам, в том числе и к опухолям централь ной нервной системы. Выявлены специфические профили экспрессии микроРНК для разных гистотипов опухолей головного мозга человека. Для анапластической астроцитомы характерно падение уровня микроРНК – miR-221, miR-222 в срав нении с нормальными тканями, тогда как в менингиомах изменение уровня этих микроРНК незначительно. Наибольшие значимые изменения уровня выявлены для микроРНК – miR-155 и miR-451 в зависимости от степени злокачественности, что может иметь прогностическое значение для дальнейшего развития заболе вания. Использование дифференциальных панелей микроРНК открывает новые диагностические возможности и перспективы в биологии опухолей головного мозга.

DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC VALUES OF MICRORNA IN MOLECULAR BIOLOGY OF BRAIN TUMORS IN HUMAN.

N.N. Kolesnikov1, S.E. Titov1,2, V.V. Stupak3, A.V. Lehner3, M.K. Ivanov2, Yu.A. Veryaskina1, L.G. Achmerova1, M.A. Sadovoy3 and I.F. Zhimulev Institute of Molecular and Cell Biology Siberian Branch of RAS, Novosibirsk, Russia, ZAO «Vector-Best», Novosibirsk, Russia, Novosibirsk Research Institute of Traumotology and Ortopaedics, Novosibirsk, Russia.

Abstract. MicroRNAs are recently discovered a new class of small noncoding regulatory RNAs, participating in all key processes in cell. They are implicated in many pathologies as well as in tumorigenesis in human. In this study, we examined the expression levels of seven mature human miRNAs in various types of malignant gliomas, benign meningiomas and neuronomas, in comparison with normal tissues, using qRT-PCR, to characterize specic microRNA proles of various tumor hystotypes and malignancy grade. Expression proles allow us to suggest that some of the studied microRNAs may be candidate markers associated with the malignant progression of gliomas or benign meningiomas as well. As a whole “miR signature” differentiating panels open new possibilities for early diagnosis, prognosis and for the development of novel strategies in brain tumor treatment.

В настоящее время во всем мире отмечается рост числа новообра зований. Онкологические заболевания по-прежнему являются второй причиной смертности населения. Ранняя диагностика злокачествен ного образования является чрезвычайно важным фактором в улучше нии клинических результатов лечения. К сожалению, существующие методы диагностики позволяют обнаружить опухоль лишь на позд них стадиях и в большинстве случаев не обеспечивают прогности ческой информацией. Поэтому поиск биомаркеров злокачественных опухолей мозга по-прежнему остается весьма актуальной проблемой молекулярной биологии и медицины. В настоящее время во всем мире ведутся исследования и поиск новых методов и методик ранней диагностики онкологических заболеваний на основе передовых тех нологий молекулярной биологии, методов диагностики опухолевых образований, содержащих объективные и надежные количественные методы оценки состояния клетки в норме и при патологии.

Прорыв в этом направлении наметился после недавнего открытия нового класса малых некодирующих молекул РНК с огромным регу ляторным потенциалом, микроРНК (миРНК). МикроРНК регулиру ют множество биологических функций и являются интегральными компонентами геномов животных, растений и вирусов. В геноме человека в настоящее время выявлено 1600 микроРНК генов, анно тированных в базе данных (Rel.19, http://mirbase.org/). МиРНК кон тролируют экспрессию белок кодирующих генов на посттранскрип ционном уровне.

Более 60 % генов в геноме человека находятся под контролем миРНК. Примечательной особенностью миРНК является способ ность одной миРНК контролировать экспрессию десятка генов мишеней, и вместе с тем один ген может быть под контролем нескольких разных миРНК, что обеспечивает пластичность и ко ординированность регуляции многих метаболических процессов в клетке, включая эмбриональное развитие, клеточную пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и старение. В свою очередь дерегуляция экспрессии отдельных миРНК или групп ведет к патологическим состояниям и онкологическим заболеваниям человека. В настоящее время многочисленными исследованиями показано, что миРНК не только ассоциированы с различными типами опухоли, а сами могут выступать в роли онкогенов или супрессоров опухолевого роста [1].

МиРНК дифференциально экспрессируются в разных типах раковых клеток по сравнению с клетками нормальных тканей, их уровень экс прессии может либо значительно повышаться, либо снижаться, что позволило высказать предположение об их причинной роли в воз никновении опухолей и их развитии. И соответственно миРНК могут быть использованы в качестве биомаркеров в диагностике, прогнозе и развитии раковых заболеваний [2,3]. Экспериментальные работы по этому направлению интенсивно развиваются в основном за рубе жом. В нашей стране, к сожалению, подобные работы единичны как в учреждениях РАН, так и РАМН. За рубежом, крупнейшими фир мами – Merck, Stratagene, Dharmacon, Applied Biosystems, Invitrogen, Rosetta Genomics, Qiagen и др., интенсивно ведутся поисковые рабо ты по этим направлениям для диагностики и терапии заболеваний человека.

Наше исследование было направлено на сравнительный анализ профиля экспрессии ряда микроРНК при новообразованиях голов ного мозга человека и выявление специфических количественных характеристик их экспрессии в разных типах опухолей. Полученные данные являются важной предпосылкой для создания диагностиче ской и прогностической панели онкологических заболеваний голов ного мозга.

Результаты и обсуждение. Опухоли головного мозга представ ляют собой гетерогенную группу новообразований различающихся между собой по клеточному составу, происхождению и подразделяю щихся в первую очередь на доброкачественные и злокачественные.

Тип опухоли также определяется клетками, из которых она образу ется. Наибольший удельный вес среди опухолей головного мозга занимают глиальные опухоли – 45,6 % (56,4 % – среди мужчин и 37,4 % – среди женщин) и менингиомы – 27,9 % (20 % – среди муж чин и 33,2 % – среди женщин). Невриномы слухового нерва состав ляют 4,9 % общего числа опухолей головного мозга (3 % – у мужчин и 6 % – у женщин). Они составляют примерно 8 % всех опухолей основания черепа и 80 %опухолей задней черепной ямки. Эти наи более распространенные типы опухолей – глиомы, менингиомы и невриномы и составили основной предмет нашего сравнительного анализа. Операционный материал – опухолевые и нормальные ткани, были получены от 70 пациентов с различными гистопатологически ми типами опухолей – нейроэпителиальные опухоли разной степени злокачественности, оболочечные опухоли, невриномы и опухоли вто ричного происхождения (табл.1).

Материал сопровождался официальным заключением врача гистолога и был получен в соответствии с законодательством РФ.

В работе использовали количественный метод ПЦР анализа [4]. Вы Таблица 1.

Распределение опухолей головного мозга проанализированных по 7 миРНК в зависимости от их гистотипа Степень Гистоструктура Число случаев % злокачественности (Grade)* Глиобластома 10 14.3 IV Астроцитомы 15 21. пилоцитарная (1) I диффузная (4) II анапластическая (10) III Эпендимома 1 1.4 I Медуллобластома 2 2.8 IV Менингиома 26 37.1 I Невринома 4 5.7 I Метастаз 7 10. карциномы Прочие 5 7. Всего 70 Примечание. * – Классификация ВОЗ [9].

деление миРНК из операционного материала проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новоси бирск) в соответствии с инструкцией производителя. Для определе ния уровня экспрессии миРНК-21, -221, -222, -155, -205, -126 и – проводили ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio Rad Laboratories, США). В качестве внутреннего контроля исполь зовали малую РНК U6. МиРНК для исследования были выбраны на основе биоинформационного анализа многочисленных баз данных и данных литературы. Критерием выбора являлось их участие и кри тическая роль в процессах, характеризующих отличительные чер ты раковых клеток, таких как избегание апоптоза, неограниченная пролиферация, инвазия и метастазирование, ангиогенез [5]. Прово дили анализ четырех микроРНК – миР-21, миР-221, миР-222, миР 155, по литературным данным относящихся к онкогенным миРНК, т.е. сверхэкспрессия которых в раковых клетках нарушает работу генов-супрессоров опухоли, и двух онкосупрессорных микроРНК – миР-205, миРНК-451, понижение уровня которых ведет к активации онкогенов, и миРНК-126, с важной ролью в ангиогенезе [6]. Стати стическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA 9.1.

Спектры изменений экспрессии миРНК в разных опухолях. Не вринома или шваннома (a vestibular schwannoma, an acoustic neuro ma) – доброкачественная внутричерепная опухоль, формируется из шванновских клеток, образующих миелиновую оболочку нервов. Со ставляет от 5 % до 10 % всех внутричерепных неоплазм у взрослых.

Наиболее частой локализацией является слуховой нерв. Мы проана лизировали 4 случая неврином. Спектр экспрессии микроРНК для исследованных неврином характеризуется существенным повыше нием уровня четырех микроРНК – миР-21, – 221, -222, -155 и низким уровнем изменений по сравнению с контролем (нормальные клетки вестибулярной нервной ткани) миР-205, -126, -451. Интригующим оказался факт, что повышение уровня четырех микроРНК, относя щихся к онкогенным, миРНК-21, – 221, -222, -155 в невриномах, по определению доброкачественных опухолях, сопоставимо с таковым, наблюдаемым в диффузной астроцитоме, 2 степени злокачественно сти, и отлично от спектра этих микроРНК в менингиоме 1 степени.

Возможно, эти различия определяются типом клеток, из которых воз никают опухоли.

Сверхэкспрессия миР-21 в клетках вестибулярной шванномы от мечена в работах [7], и это приводит к росту опухоли. В экспериментах с анти-миР-21, когда выключается экспрессия этой микроРНК, снижа ется и пролиферация клеток шванномы. Соответственно делается вы вод, что миР-21 может служить подходящей мишенью для терапевти ческого воздействия, специфически редуцирующего рост опухоли.

Менингиома (Grage 1). Доброкачественная, медленно растущая опухоль, образующаяся из клеток арахноидального эндотелия. Уста новлен профиль экспрессии миРНК для 26 случаев менингиом. Ха рактерной особенностью спектра является значительное повышение уровня миР-155 в опухоли в сравнении с контролем и незначительные изменения в сторону понижения по остальным микроРНК. В 16 слу чаях значения уровня экспрессии миР-155 значительно превышали уровень, в 10 случаях – значения были менее существенными. В нор ме ген миР-155 экспрессируется в клетках иммунной системы, фи бробластах, эпителиальных тканях. Увеличение экспрессии отмечено при иммунном ответе, аутоиммунных заболеваниях и также при раз личных типах рака. В случае менингиомы мы выявили достоверное повышение уровня миРНК-155 по сравнению с нормальными клет ками, вероятно, это связано с ответом иммунной системы на возник новение опухоли. При этом мы видим низкий уровень миР-221/ и миР-21, относящихся к онкогенным микроРНК, уровень которых обычно повышен при злокачественных новообразованиях. Таким об разом, менингиомы обладают своим характерным специфическим профилем, отличным от неврином и глиом.

Глиомы разной степени злокачественности.

Пилоцитарная астроцитома (Grade I). Относится к медленно ра стущим доброкачественным опухолям, образующимся из астроци тов, встретилась всего в одном случае, что, по-видимому, связано с трудностью выявления опухоли на ранней стадии развития. Профиль экспрессии всех семи микроРНК в пилоцитарной астроцитоме прак тически не отличается от нормальных клеток.

Диффузная астроцитома. (Grade II). Проанализировано 4 случая.

Уровень онкогенных миРНК – миР-21,-221, -222 существенно повы шен по сравнению с пилоцитарной астроцитомой. Наибольшее уве личение отмечено для миР-21. Онкогенный эффект миР-21 в клетках глиомы человека связан с воздействием на гены мишени и подавле нием экспрессии тумор-супрессорных генов, таких как RECK,TIMP3, TGFBR2/3, HNRPK, Tap63JMY, TOPORS, TP53BP2, DAXX, PDCD [8]. Повышение уровня усиливает пролиферацию, клеточный цикл, миграцию, инвазию, уменьшает апоптоз. Увеличивает хемоустой чивость к VM-26 и TMZ. Низкий уровень ассоциирован с незначи тельно лучшей выживаемостью по данным атласа ракового генома (ТСGA). Уровень миРНК-21 коррелирует со степенью злокачествен ности и может быть использован в качестве прогностического марке ра данного гистотипа.

Анапластическая астроцитома. (Grade III), быстрый рост. Про филь экспрессии анапластической астроцитомы (АА) по микроРНК отличен от такового как диффузной астроцитомы, так и глиобласто мы. Характеризуется низким уровнем миР-21, -221, -222 и миР-126.

Повышение уровня миР-221 обычно коррелирует с повышенной сте пенью злокачественности, однако есть и другие данные о значитель ном снижении миР-221/222 в глиобластомных опухолях сравнитель но с нормальным мозгом. Так ТСGA данные свидетельствуют, что снижение уровня этих миРНК ассоциировано с лучшим прогнозом для пациентов. Необходимо отметить, что из 8 проанализированных нами случаев, в одном образце уровень онкогенных микроРНК был повышен в десятки раз, по сравнению с нормой. Возможно, это свя зано с переходом в глиобластому.

Глиобластома. (Grade IV), очень быстрый рост с прорастанием в мозговую ткань. На клеточном уровне имеет отличительные осо бенности: гетерогенность состава, быструю пролиферацию, ангио генез, экстенсивную инвазию, гипоксию, и некроз. Характеризует ся своим специфическим профилем экспрессии по микроРНК. По уровню миР-21 и миР-155 распадается на два типа: со значительно повышенным уровнем по сравнению с нормой – 3 случая и вторая группа (7 случаев) с незначительными изменениями. Также отмече ны индивидуальные вариации по уровню миР-451, уровень измене ний по которой является прогностическим маркером выживаемости.

У пациентов с диагнозом глиобластома, повышенный уровень миР 451 связан с более коротким периодом выживаемости. По сведениям из базы данных атласа раковых геномов (http://cancergenome.nih.gov) медианные значения выживаемости составили 280 дней при высоком уровне миР-451, тогда как у пациентов с низким значением миР- медиана по выживаемости равнялась 480 дням. По нашим результа там, из 10 случаев три пациента имели уровень миР-451 значительно меньше нормы, остальные – очень незначительно.

Таким образом, в ходе проведенных исследований выявлены специ фические профили экспрессии микроРНК, характерные для разных ги стотипов опухолей, и в зависимости от степени их злокачественности.

Намечены подходы к созданию диагностической и прогностической панели на основе микроРНК, потребность в которой диктуется отсут ствием скрининговых методов исследования, которые можно было бы внедрить и проводить на амбулаторном этапе. Это позволило бы во время провести лечебные мероприятия, будь то хирургическое лечение или адъювантная терапия, продлить жизнь пациента и в значительной мере повысить качество его жизни. Возможно, такой подход к диагно стике стал бы эволюционным толчком в лечении опухолей ЦНС.

Список литературы:

1. Krutovskikh V.A., Herceg Z. 2010. Oncogenic microRNAs (OnkomiRs) as a new class of cancer biomarkers. Bioessays 32:894-904.

2. Lee Y.S., Dutta A. 2009. MicroRNA in cancer. Annu. Rev. Pathol. 4: 199 227.

3. Krichevsky A.M., Gabriele G.. 2009. miR-21: a small multi-faceted RNA.

J. Cell. Mol. Med. 13 (1): 39-53.

4. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J., Zhou Z., Lee D.H., Nguyen J.T., Barbisin M., Xu N.L., Mahuvakar V.R., Andersen M.R., Lao K.Q., Livak K.J.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.