авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |

«Министерство здравоохранения Российской Федерации Министерство промышленности и торговли Российской Федерации Правительство Новосибирской области ...»

-- [ Страница 7 ] --

and Guegler K.J. 2005. Real-time quantication of microRNAs by stem–loop RT–PCR./ Nucleic Acids Research. 33( 20): 1-9.

5. Hanahan D, Weinberg R.A. 2011. Hallmarks of cancer: the next generation.

Cell. 144(5):646-674.

6. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. 2006. Oncomirs--microRNAs with a role in cancer. Nature Rev. Cancer 6: 259-269.

7. Ciof J.A, Yue W.Y, Mendolia-Loffredo S, Hansen K.R, Wackym P.A, Hansen M.R. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwanno ma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 2010 Dec;

31(9):1455-62. doi:

10.1097/MAO.0b013e3181f20655.

8. Zhang Y, Dutta A, Abounader R. The role of microRNA in glioma initiation and progression. Front Biosciences 2012, 17, 700-712.

9. Louis D.N., Ohgaki H., Wiestler O.D., Cavenee W.K., Burger P.C., Jouvet A., Scheithauer B.W., Kleihues P. // The 2007 WHO Classication of Tumours of the Central Nervous System МЕТОД ДИЭЛЕКТРОФОРЕЗА ЭРИТРОЦИТОВ В ДИАГНОСТИКЕ ДИФФУЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ М.В. Кручинина, С.А. Курилович, В.М. Генералов, М.И. Воевода, А.А. Громов, В.А. Баум, Е.Г. Немцова, Е.В. Логвиненко, А.В. Белковец, С.В. Чересиз, Д.И. Кудина, Е.Ю. Кранц Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт терапии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск, Россия Аннотация. Продемонстрированы возможности метода диэлектрофореза эри троцитов с помощью системы электрооптической детекции клеток в диагностике диффузных заболеваний печени. Показано, что комплекс электрических и вяз коупругих параметров эритроцитов позволяет решить целый ряд вопросов, в том числе, по дифференциальной диагностике, оценить степень фиброза печени (при чувствительности 71,4 %;

специфичности 60 %;

прогностической ценности «+»

результата 83,3 %), биохимическую, вирусологическую активность, контролиро вать эффективность проводимой терапии. Ценность данного метода существенно возрастает в связи с его неинвазивностью, малой трудоемкостью, высокой про пускной способность, информативностью, наглядностью, возможностью работы в реальном режиме времени в целях скрининга, в том числе, для выявления ранних стадий заболевания.

THE METHOD OF DIELECTROPHORESIS OF ERYTHROCYTES FOR DIAGNOSIS OF DIFFUSE LIVER DISEASES M.V. Kruchinina, S.A. Kurilovich, V.M. Generalov, M.I. Voevoda, A.A. Gromov, V.

A. Baum, E.G. Nemtsova, E.V. Logvinenko, A.V. Belkovets, S.V. Cheresiz, D.I. Kudina, E.Yu. Krantz Institute of Internal Medicine Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk, Russia Abstract. We demonstrated the possibilities of the method of dielectrophoresis of erythrocytes by the system of electrooptical cell detection in the diagnosis of diffuse liver diseases. We found, that the complex of the electrical and viscoelastic parameters of erythrocytes can solve a number of issues, including in the differential diagnosis, to assess the degree of liver brosis (with a sensitivity of 71,4%, specicity 60%, predictive value of the “+” result 83,3%), biochemical, virological activity and monitor the effectiveness of the therapy. The value of this method increases substantially due to its non-invasive, low-complexity, high-bandwidth, information content, clarity, ability to work in real time for screening, including those to detect the early stages of the diseases.

Хроническая диффузная патология печени (ДПП) является широ ко распространенной с тенденцией к дальнейшему росту [1,9]. Рост числа больных с данной патологией требует надежной получаемой диагностической информации. В настоящее время эта задача реша ется путем использования совокупности биохимических, инстру ментальных методик, среди которых «золотым стандартом» явля ется биопсия печени – морфологический (гистологический) метод.

Однако его инвазивность, сложность интерпретации результатов при небольшом размере биоптата, неудовлетворительная воспроизводи мость заключений, данных разными морфологами, и т.д. стимулиру ют разработку неинвазивных или малоинвазивных способов оценки степени фиброза печени, стадии заболевания.

Поэтому поиск и внедрение в клиническую практику новых ме тодов диагностики ДПП остается актуальной задачей гепатологии.

Одним из новых перспективных подходов в данном направлении следует считать метод диэлектрофореза эритроцитов, что показали результаты наших предшествующих исследований [2,4,5,6,7,8,10].

Цель работы – продемонстрировать возможности метода диэлек трофореза эритроцитов в диагностике ДПП.

Материалы и методы. Обследованы 62 мужчины в возрасте от 38 до 69 лет с диффузной патологией печени, подписавших инфор мированное согласие на участие в исследованиях. Группу сравнения составили 21 человек в возрасте от 35 до 60 лет, у которых по данным биохимических и инструментальных методов исследования не было выявлено клинически манифестирующих хронических заболеваний внутренних органов.

Степень выраженности фиброза печени устанавливалась на осно вании данных биопсии печени, которая была проведена 21 пациенту с диффузными заболеваниями печени. У 41 пациента степень фи броза печени определялась макроморфологическими методами ви зуализации (УЗИ, КГ, ЯМРТ). В группе сравнения биопсия печени не проводилась по этическим соображениям. Всем обследованным выполнены биохимические и инструментальные исследования, УЗИ печени, селезенки, а также портальных сосудов. Вирусная этиоло гия заболевания устанавливалась на основании обнаружения серо логических маркеров методом иммуноферментного анализа (ИФА) и (или) ДНК и РНК вирусов методом полимеразноцепной реакции (ПЦР), а алкогольная – при отрицательных результатах ИФА сыворо точных маркеров вирусных гепатитов и достоверно подтвержденном систематическом потреблении алкоголя.

При анализе данных биопсии печени оценивались отдельно гисто логический индекс активности хронического вирусного гепатита и степень выраженности фиброза печени. Большинство больных (14 че ловек) имело умеренную степень гистологической активности (от 9 до 12 баллов);

у 5 мужчин гистологическая активность оказалась легкой (от 4 до 8 баллов) и у 2 – была выраженной (от 13 до 18 баллов).

По результатам совокупного анализа сформированы три группы по степени выраженности фиброза печени. Первую группу состави ли обследуемые группы сравнения (21 человек) без признаков фи броза печени (F0). Вторая группа включала 39 пациентов с первой или второй степенью фиброза (легкий невыраженный фиброз – F1 F2). В третью группу входили 23 пациента с третьей или четвертой степенью фиброза (выраженный фиброз – F3-F4).

В группе пациентов со степенью фиброза F1-F2 выявлено наличие хронических вирусных гепатитов (у 9-ти – С, у 15-ти – В, у 4-х – В+С генеза) с минимальной (у 16 пациентов) и умеренной (у 12 больных) биохимической активностью. 12 пациентов этой группы систематиче ски потребляли алкоголь, т.е. имели смешанную (вирусно-алкогольную этиологию процесса). У 11 больных генез патологии печени был рас ценен как алкогольный, маркеры вирусной инфекции у них не были выявлены. Гистологическая активность процесса в этой группе соот ветствовала степени фиброза, т. к. была от 4 до 8 баллов (А1).

В группе пациентов со степенью фиброза F3-F4 у 9-ти человек верифицирован хронический вирусный гепатит С;

у 14-ти – хрони ческий вирусный гепатит B. При этом у 10-ти из 23-х мужчин хро ническая вирусная инфекция протекала на фоне длительного злоу потребления алкоголем. Биохимическая активность гепатитов была умеренной. У большей части пациентов с циррозами печени (т.е., гепатитом IV стадии) степень компенсации по Чайлд-Пью соответ ствовала 8-10 баллам (класс В), у 3-х человек – 12-14 баллам (класс С). По данным биопсии, большинство больных (11 человек) имели умеренную степень гистологической активности (от 9 до 12 баллов – А2);

у 3 она была выраженной (от 13 до 18 баллов – А3).

Пациенты с вирусными гепатитами различались по уровню ви русологической нагрузки: у 21 больного он был минимальным (не определялся с помощью использованных методов);

в 17 случаях был низким – менее 2 000 МЕ/мл для ХГВ, менее 105 копий/мл для ХВС;

у 9 пациентов – высоким – более 100 000 копий/мл или 20 000 МЕ/мл для ХГВ, более 2х106 копий/мл для ХГС, а у 4 обследуемых – очень высоким – 108-109 копий/мл.

Обследование выполнено с одобрения Этического Комитета ФГБУ «НИИ терапии» СО РАМН от 18 сентября 2012, протокол N 36.

У больных с верифицированным диагнозом, а также у мужчин группы сравнения исследовали электрические, вязкоупругие параме тры эритроцитов методом диэлектрофореза (ДЭФ) в неоднородном переменном электрическом поле (НПЭП) с помощью автоматизиро ванной специализированной установки, использующей электроопти ческую систему детекции клеток [2]. Оценивали электропроводность мембран, индексы агрегации и деструкции эритроцитов, емкость мембран клеток, скорость движения эритроцитов к электродам, по ложение равновесной частоты, амплитуду деформации эритроцитов, поляризуемость клеток, обобщенные показатели вязкости и жестко сти, величины индуцированного дипольного момента и заряда.

Результаты. Разработка метода диэлектрофореза эритроцитов и морфометрия клеток позволяли предполагать наличие корреляций между некоторыми параметрами эритроцитов и степенью фиброза печени.

При изучении электрических и вязкоупругих характеристик эри троцитов оказалось, что в подгруппе больных со степенью фиброза F3-F4 преобладали деформированные, предгемолитические формы эритроцитов (р0,05). У этих пациентов была выше доля клеток с положительным диэлектрофорезом и поляризуемость на высоких ча стотах 0,5 и 1МГц (p0,001-0,05) и оказалась ниже поляризуемость клеток на низких частотах (0,05 и 0,1МГц) (p0,01-0,001). При степе ни фиброза F3-F4 оказались более высокими значения обобщенных показателей жесткости, вязкости, среднего радиуса, индекса агре гации, деструкции, а также электрической проводимости мембра ны эритроцитов и низкие – амплитуды деформации под действием НПЭП по сравнению с F1-F2 и F0 (p0,001-0,05).

Диагностическая точность метода диэлектрофореза эритроцитов в определении степени фиброза печени по сравнению с методом би опсии печени оказалась удовлетворительной: 68,4 %, при чувстви тельности 71,4 %;

специфичности 60 %;

прогностической ценности «+» результата – 83,3 %;

прогностической ценности «-» результата – 42,9 %.

Исследование параметров эритроцитов данным методом позволи ло выявить особенности, связанные с генезом заболевания, биохими ческой активности процесса.

У пациентов с различной этиологией процесса наблюдалось изме нение положения равновесной частоты в НПЭП: при вирусной этио логии процесса достоверно чаще (p0,05) наблюдалось смещение равновесной частоты в область более низких частот (0,1 МГц), в то время как при алкогольном и смешанном генезе заболевания, напро тив, отмечалось смещение таковой в область более высоких частот (более 0,5МГц) при условии одинакового представительства разных стадий заболевания в группах.

Наиболее жесткими, вязкими и плохо деформируемыми оказа лись эритроциты больных с патологией печени алкогольного и сме шанного генеза, достоверно отличаясь от величин при HBV и HCV поражениях печени (p0,0001-0,05) (таблица 1). Получены высоко достоверные сильные обратные корреляции жесткости эритроцитов и амплитуды деформации (r=-0,78, p0,002). Соответственно, индекс агрегации эритроцитов в растворе диэлектрика был самым высоким при алкогольном и смешанном генезе заболевания.

Выявлены различия в параметрах эритроцитов в зависимости от уровня вирусной нагрузки – ее увеличение сопровождалось крайне Таблица 1.

Вязкоупругие и электрические характеристики эритроцитов (Er) при диффузной патологии печени различного генеза (M±m).

Обобщен- Обобщен- Амплитуда Индекс Поляризуе- Электро- Емкость ный показа- ный показа- деформа- Индекс де Группы агрегации мость при провод- клеточной тель тель ции Er струкции больных Er 106МГц ность, мембраны жесткости вязкости при 106 Er [%] [усл.ед.] [м3] [см/м] [Ф] [Н/м] [Пас] МГц [м] 1 группа 4,74·10-6 5,5·10-1 7,0·10-1 1,49·10-6 1,37·10-15 6,07·10-5 6,74·10-14 1, HBV ± 8,4·10-7 ± 3,4·10-2 ± 1,8·10-1 ± 3,8·10-7 ± 2,2·10-16 ± 2,1·10-6 ± 2,4·10-15 + 0, (n=31) 2 группа 4,04·10-6 5,4·10-1 7,14·10-1 1,30·10-6 1,14·10-15 5,78·10-5 5,93·10-14 2, HCV ± 7,1·10-7 ± 2,3·10-2 ± 1,3·10-1 ± 1,4·10-7 ± 1,7·10-16 ± 1,4·10-5 ± 2,8·10-15 + 0, (n=28) 3 группа 9,73· 10-6 6,9·10-1 9,7·10-1 8,44·10-7 0,46·10-15 9,84·10-5 11,42·10-14 8, Смешан- ± 1,5·10-6 ± 4,4·10-2 ± 1,8·10-1 ± 1,6·10-7 ±2,0·10-16 ± 1,5·10-5 ± 3,9·10-15 + 0,67*** ный генез *^ *^ ***^^ **^^ ***^^^ ^^^ (n=34) **** 4 группа 1,81·10-5 7,37·10-1 10,48·10-1 6,97·10-7 0,79·10-15 4,93·10-5 7,36·10-14 7, Алкоголь- ± 6,9·10-6 ± 3,2·10-2 ± 1,7·10-1 ± 1,0·10-7 ±2,8·10-16 ±2,5·10-6 ± 3,6·10-15 + 0, ное по- **^^ *^ *^^^ *^# ## ## ***^^^ ражение (n=53) Примечания:

* – достоверность (p) отличия от 1-й группы (* – p0,05, ** – p0,005, *** – p0,0001);

^ – достоверность (p) отличия от 2-й группы (^ – p0,05, ^^ – p0,002, ^^^ – p0,0001).

# – достоверность (p) отличия от 3-й группы (#- p0,05, ##- p0,001, ### – p0,0001) резким сдвигом равновесной частоты в высокочастотный диапазон, резким снижением электрической емкости мембран эритроцитов (т.е. оболочки клеток становились толще ~ в 10 раз), дипольного мо мента и скорости движения клеток к электродам (p0,001-0,02). При очень высокой вирусной нагрузке клетки практически не двигались к электродам, деформировались под действием электрического поля в минимальной степени, наблюдался выраженный гемолиз на всех частотах. При сходных уровнях вирусологической нагрузки более выраженные изменения в амплитуде деформации, обобщенных пока зателях вязкости и жесткости выявлены при хроническом вирусном гепатите С, что, вероятно, связано с нарушениями липидного обмена, развитием инсулинорезистентности [1,9].

Высокая электропроводность мембран и относительная поляризу емость прямо коррелировали с показателями, характерными для син дрома цитолиза (АСТ, АЛТ;

концентрация в сыворотке крови желе за), воспалительного синдрома (изменение белково-осадочных проб, повышение уровней IgG, IgM, IgA) и синдрома печеночно-клеточной недостаточности (снижение содержания в сыворотке крови общего белка, особенно альбуминов, протромбина, холестерина – r=+0,786, p0,035 и r=+0,77, p0,03, соответственно) и обратно – с биохими ческими проявлениями синдрома холестаза (повышение активности экскреторных ферементов ЩФ, ГГТП). Гипербилирубинемия с по вышением как прямой, так и непрямой фракций оказалось обратно связанной с величиной среднего радиуса эритроцитов (для общего билирубина r=-0,916, p0,004;

для прямого билирубина r=-0,859, p0,013;

для непрямого билирубина r=-0,847, p0,016). Повышение уровня общего холестерина было прямо связано с жесткостью клеток (H/м), а ХС ЛПВП оказался прямо связанным с уровнем электропро водности мембран (r=+0,259, p0,05) и относительной поляризуемо стью (r=+0,272, p0,042);

гипербилирубинемия была обратно связана с величиной среднего радиуса эритроцитов.

В последующем детальное изучение фракционного состава фос фолипидной фракции мембран эритроцитов и динамики электриче ских и вязкоупругих характеристик эритроцитов при ДПП на фоне фосфолипидзамещающей терапии послужило патогенетическим основанием назначения эссенциальных фосфолипидов при этой па тологии. У 38 пациентов (возраст от 36 до 57 лет) с хроническим гепа титом вирусного, алкогольного и смешанного генеза были исследо ваны фосфолипидный состав мембран эритроцитов и электрические и вязкоупругие параметры эритроцитов в динамике лечения эссен циальными фосфолипидами (ЭФЛ). На фоне курсовой терапии ЭФЛ отмечено достоверное увеличение показателей пластичности, поля ризуемости, емкости, скорости движения эритроцитов к электродам и снижение уровней обобщенных показателей вязкости, жесткости, электропроводности, индексов агрегации и деструкции (p0,001 0,05), что может отражать улучшение функционального состояния мембран гепатоцитов и служить патогенетическим обоснованием применения ЭФЛ. Особенно выраженным оказалось изменение элек трической емкости мембран эритроцитов (р0,001), отражающей степень диспротеинемии при ДПП. Получены прямые корреляции этого показателя с уровнем альбуминов (r=0,511, p0,044) и обратные с уровнем гамма-глобулинов (r=-0,476, p0,05). В динамике лечения отмечено снижение уровня трансаминаз, которые оказались связан ными с уровнем электроповодности (r = 0,927, p0,003 для АЛТ и r=0,520, p0,048 для АСТ) и поляризуемости (r= – 0,908, p0,005 для АЛТ и r = – 0,63, p0,004 для АСТ)[7].

Таким образом, методика диэлектрофореза эритроцитов может быть использована не только для диагностики ДПП, но и для контро ля эффективности проводимой терапии.

Изучение особенностей электрических и вязкоупругих параме тров эритроцитов у пациентов с непрямыми гипербилирубинемия ми позволило использовать полученные данные в целях дифферен циальной диагностики [5]. В исследование включено 28 пациентов (мужчины в возрасте от 17 до 67 лет) с непрямыми гипербилируби немиями (НГБ), 20 из которых (71,4 %) наблюдались с диагнозом – «синдром Жильбера», оставшиеся – с диагнозом «непрямая гипер билирубинемия неясного генеза». Группа больных с непрямыми гипербилирубинемиями неоднородна по поведению эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле. Для пациентов с синдромом Жильбера характерны умеренно сниженная пластичность эритроцитов на фоне слегка повышенных обобщенных показателей вязкости, жесткости, емкости и электропроводности мембран клеток, единичный лизис эритроцитов на низких частотах с последующей умеренно повышенной агрегацией клеток по сравнению с группой контроля и эритроцитарными НГБ (р0,0001-0,05). Для пациентов, непрямая гипербилирубинемия которых определяется состоянием эритроцитов, типична значительно сниженная поляризуемость на всех частотах, резко повышенная склонность клеток к гемолизу и об разованию агрегатов при сохраненной или слегка сниженной дефор мабельности эритроцитов (р0,001-0,02). Высокие уровни индекса деструкции на всех частотах определяют высокие уровни индекса агрегации, поскольку высвобождающийся при разрушении эритро цитов АДФ является мощным индуктором образования агрегатов, в том числе и лейкоцитарно-тромбоцитарных [3].

Заключение. Таким образом, исследование параметров эритро цитов, их электрических, вязкоупругих характеристик методом диэ лектрофореза в НПЭП позволяет, наряду с клиническими данными, сделать заключение по целому комплексу вопросов при диффузной патологии печени, в частности, решить некоторые вопросы диффе ренциальной диагностики, оценить степень фиброза печени, биохи мическую, вирусологическую активность, контролировать эффектив ность проводимой терапии. Ценность данного метода существенно возрастает в связи с его малой трудоемкостью, высокой пропускной способностью и информативностью, возможностью работы в реаль ном режиме времени, наглядностью.

Исследование выполнено при поддержке Министерства образова ния и науки Российской Федерации, соглашение 8041 от 24.08.2012, номер заявки «2012-1.1-12-000-1001-004».

Список литературы:

1. Гастроэнтерология. Национальное руководство. Под ред Ивашкина В.Т., Лапиной Т.Л. М. – 2008. – 700C.

2. Генералов В.М., Кручинина М.В., Дурыманов А.Г., Медведев А.А., Са фатов А.С., Сергеев А.Н., Буряк Г.А., Курилович С.А., Громов А.А. Диэлек трофорез в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний. – Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». – 2011. – 172C.

3. Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Ко зинца Г.И., Макарова В.А. М. – 1997. – 480C.

4. Кручинина М.В., Курилович С.А., Паруликова М.В., Громов А.А., Ба киров Т.С., Генералов В.М., Пак А.В. Вязкоупругие и электрические харак теристики эритроцитов при различной степени фиброза печени // Вестник НГУ. – 2005. – V.3. – Вып.4. – С.43-52.

5. Кручинина М.В., Курилович С.А., Светлова И.О., Громов А.А., Гене ралов В.М., Бакиров Т.С. Диэлектрофорез эритроцитов: новые возможности в диагностике непрямых гипербилирубинемий // Бюллетень Сибирского от деления Российской академии медицинских наук. – 2009. – V.3. – C.29-35.

6. Курилович С.А., Кручинина М.В., Генералов В.М., Бакиров Т.С., Рихтер В.А., Семенов Д.В. Электрические параметры и структура мем бран эритроцитов при диффузных заболеваниях печени // Российский жур нал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2009. – V.XIX. – Вып. 2. – С.30-36.

7. Курилович С.А., Кручинина М.В., Громов А.А., Генералов В.М., Баки ров Т.С., Рихтер В.А., Семенов Д.В. Обоснование применения эссенциаль ных фосфолипидов при хронических заболеваниях печени: динамика элек трических и вязкоупругих параметров эритроцитов // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2010. – V.11. – C.46-52.

8. Патент 2296327 РФ. Способ дифференциальной диагностики забо леваний печени / Генералов В.М.;

Бакиров Т.С.;

Пак А.В.;

Звольский И.Л.;

Кручинина М.В.;

Курилович С.А.;

опубл. 27.03.2007.

9. Подымова С.Д. Болезни печени. М. – 1993. – 544C.

10. Kruchinina M.V., Generalov V.M., Kurilovich S.A., Bakirov T.S., Gro mov A.A., Parulikova M.V., Pak A.V. Viscoelastic and electric characteristics of erythrocytes at different degrees of hepatic brosis // J. Global Toxin Review. – 2007. – V.10. – P.25-36.

ПРИМЕНЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ SHIMADZU ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ С.Н. Лунева, А.Н. Накоскин, С.А. Мельников ФГБУ «РНЦ «ВТО» имени академика Г. А. Илизарова», г. Курган Аннотация. В данной работе представлена схема выделения неколлагено вых белков из костной ткани крупного рогатого скота. Рассмотрено применение хроматографической системы shimadzu с препаративными колонками для выде ления и очистки белков костной ткани. Показано, что разделение белков на ко лонке для гельпроникающей хроматографии эффективно в нейтральном буфере трисоксиметиламинометан-хлороводородная кислота (трис-НСl).

APPLICATION OF CHROMATOGRAPHY SYSTEM SHIMADZU FOR SEPARATION OF BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES FROM BONE TISSUE S.N. Luneva, A.N. Nakoskin, S.A. Melnikov Russian Ilizarov Scientic Center for Restorarive Traumatology and Orthopaedics, Kurgan Abstract. We present the algorithm of non-collagen protein separation from cattle bone tissue with the use of chromatographic system SHIMADZU that is supplied with preparative columns for isolation and purication of the bone tissue proteins.

It was demonstrated that separation of proteins on the column for gel-penetrating chromatography was effective in the neutral buffer of tris-HCl.

В костной ткани содержатся биологически активные вещества, большинство из которых являются веществами белковой природы.

Неколлагеновые белки костной ткани содержат в своем составе боль шое количество рострегулирующих пептидов, таких как костные морфогенетические белки, инсулинподобные факторы роста и др.

Выделенные из костной ткани рострегулирующие пептиды находят свое применение в травматологии и ортопедии как регуляторы про цессов остеогенеза. Поэтому применение гельпроникающей хрома тографии для выделения препаратов белка достаточной чистоты яв ляется актуальной задачей.

Целью данной работы является демонстрация опыта применения хроматографической системы Shimadzu для анализа, разделения и выделения белков из костной ткани крупного рогатого скота.

Материалы и методы исследования. Фракцию неколлагеновых белков выделяли из компактной костной ткани трубчатой части бе дренной кости крупного рогатого скота. Костная ткань подвергалась измельчению и деминерализации соляной кислотой. Полученную смесь после фильтрования фракционировали диализом через диализ ную пленку различной пористости. Устройство для диализа позволи ло выделить белки с молекулярной массой более 14 кDa и от 3,5 до 14 кDa. Состав выделенных таким образом фракций неколлагеновых белков костной ткани анализировали с помощью хроматографиче ской системы shimadzu. Хроматографическая система представлена насосом высокого давления серии LC-20 AP, блоками автоинжекто ра, УФ-детектора и коллектора фракций. В работе использовались препаративные колонки Shodex Protein KW-2002.5 для гельпрони кающей хроматографии. В качестве элюентов использовались дис тиллированная вода, буферный раствор Трис-HCl концентрацией 50 ммоль/л и рН=7,5 и фосфатный буфер той же концентрации и рН.

Элюенты и пробы были предварительно профильтрованы через мем бранный фильтр с диаметром пор 45 мкм. В качестве калибровочных растворов для гельпроникающей хроматографии использовали на бор маркеров различной молекулярной массы Sigma-Aldrich MWGF 200-1KT. Объем закалываемой пробы не превышал 3 %от рабочего объёма колонки. Концентрация белков, наносимых на колонку, со ставляла 6 мг/мл.

Результаты. Одной из задач исследования является подбор адек ватных условий разделения неколлагеновых белков костной ткани по молекулярному весу. В доступной нам литературе мы не нашли рекомендаций по условиям разделения. В качестве элюентов нами были опробованы дистиллированная вода и растворы, рекомендуе мые производителем колонок: фосфатный буфер и буфер Трис-HCl.

Независимо от состава элюента свободный объем колонки оставался постоянным. При использовании буфера Трис-HCl времена удержи вания маркеров были больше и, соответственно, разрешающая спо собность колонки была выше по сравнению с другими элюентами.

К тому же в области молекулярных масс более 100 кДа разрешаю щая способность колонки независимо от состава элюента снижается.

Поэтому в дальнейшей работе было принято решение использовать буфер Трис-HCl.

При проведении анализа неколлагеновых белков костной тка ни гельпроникающей хроматографией с использованием Трис-HCl буфера получены следующие данные. По виду профилей хрома тограмм можно заключить, что фракция неколлагеновых белков с молекулярной массой более 14 кДа состоит преимущественно из составляющих: первая – более 200 кДа, вторая – 150 кДа, третья – 60 кДа. Фракция неколлагеновых белков 3,5 – 14 кДа имела примеси высокомолекулярных белков, вероятно, оставшихся после диализа либо образовавшихся за счет агрегации более низкомолекулянных белков в процессе выделения и хранения, и представлена в основном тремя низкомолекулярными фракциями с молекулярной массой 10, и 3 кДа. Полученные нами профили хроматограмм имели высокую степень воспроизводимости в зависимости от партии полученных неколлагеновых белков. Однако при увеличении концентрации бел ка, наносимого на колонку, наблюдалось незначительное смещение хроматографических пиков в большую сторону времени удержания.

Используя коллектор фракций, нам удалось собрать необходимые це левые составляющие. В рамках научной работы Центра, выделенные хроматографические фракции, планируется изучить в рамках экспе римента на животных по регуляции процессов костеобразования.

Таким образом, применение хроматографической системы Shi madzu позволило получить в препаративном количестве однородные по молекулярному весу фракции неколлагеновых белков костной ткани.

Список литературы:

1. Влияние кальцийфосфатных соединений и неколлагеновых кост ных белков на костеобразование в дырчатых дефектах метафиза (экспери ментально-морфологическое исследование)/ С.Н. Лунева, И.А. Талашова и др.// Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. –2011. – № 3-2. – С. 196-199.

2. Справочник биохимика / Р. Досон [и др.]. М.: «Мир», 1991. -С. 359.

3. Ускорение костной регенерации экстракорпорально модифицирован ной аутоплазмой /А.В. Попков [и др.] Медицинская технология. Курган, 2006. – С. 6.

КОМПЛЕКСНАЯ ИММУНОДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ А.Г. Полтавченко, А.В. Ерш, С.А. Пьянков, Н.А. Кривенчук, Д.В. Буторин, П.В. Филатов Государственный Научный Центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Новосибирская обл., Россия) ЗАО «ИмДи» (Кольцово, Новосибирская обл., Россия) Аннотация. Описан вариант мультиплексной иммунодиагностики инфекцион ных заболеваний на основе микрочипов с низкой плотностью нанесения белков.

Метод представляет собой мультиплексный вариант дот-ИФА, чувствительность которого повышена за счет использования конъюгата на основе коллоидного зо лота и эффективной системы его проявления. Метод сочетает в себе мультиплекс ность и простоту изготовления и применения белковых микрочипов. При сходной чувствительности, он имеет по сравнению с традиционным ИФА очевидные пре имущества по простоте получения результатов, расходу реагентов, трудозатратам и удельной стоимости.

MULTYPLEXED IMMUNODIAGNOSTIC OF INFECTIOUS DISEASES A.G. Poltavchenko, A.V. Ersh, S.A. Pyankov, N.A. Krivenchuk, D.V. Butorin, P.V. Filatov Federal Budgetary Research Institution – State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” (FBRI SRC VB “Vector”) (Koltzovo, Novosibirsk region, Russia) Joint Stock Company «ImDi» (Koltzovo, Novosibirsk region, Russia) Abstract. A variant of multiplexed immunodiagnostic of infectious diseases on the basis of a low density protein microarray has been described. The method presents a multiplex variant of dot ELISA with sensitivity increased due to the use of a conjugate based on colloid gold and an efcient system of its development.

The method combines multiplexed character and simplicity of preparation and use of protein microchips. Having a similar sensitivity, it has obvious advantages over the traditional ELISA as far as prompt obtaining of results;

reagent costs, labor expenditures and specic cost are concerned.

Комплексная (мультиплексная) иммунодиагностика – новое на правление, предполагающее использование устройств, так называе мых «белковых матриц» (protein arrays), позволяющих одновременно определять в исследуемом образце множество различных антител или антигенов. Часто такие матрицы называют «белковыми чипами»

или «иммуночипами». В развитых зарубежных странах разработка таких устройств направлена по пути размещения больших белковых библиотек на миниатюрных подложках, роботизации процесса из готовления и применения чипов [1]. Такой подход требует создания новых дорогостоящих технологий, материалов, оборудования и поэ тому в настоящее время далек от внедрения в широкую клиническую практику [2].

На основании имеющегося опыта работы с каталитически актив ными маркерами, мы пытаемся реализовать другой подход к ком плексной диагностике, сочетающий мультиплексность с простотой изготовления и применения иммуночипов. Материалы и методологи ческие подходы, использованные нами при разработке мультиплекс ных систем, описаны в нескольких более ранних публикациях [3-9].

В настоящем сообщении приведена сжатая информация о принципах создания, достигнутых успехах и предполагаемых перспективах раз вития комплексной иммунодиагностики.

Наши тест-системы рассчитаны на проведение 20 комплексных анализов и включают в себя набор иммуночипов и многоячеечные аналитические ванны, заполненные готовыми рабочими раствора ми и герметизированные фольгой. Иммуночипы представляют со бой небольшие пластмассовые подложки с дискретно нанесенными в определенном порядке иммунореагентами захвата – антигенами или моноклональными антителами к нескольким возбудителям ин фекционных заболеваний. В наших системах они выполнены в виде блоков (гребенок) по 5 белковых матриц в каждом. Число анализи руемых инфекций на каждом чипе ограничено 10, что позволяет лег ко контролировать нанесение реагентов на подложку, а также учиты вать результаты визуально или с помощью простых компьютерных устройств. С другой стороны, это число обычно охватывает список дифференцируемых заболеваний и потому может быть и достаточ ным, и удобным для практического использования [10]. Кроме реа гентов захвата рабочая область иммуночипа содержит контроль рабо тоспособности системы и зону, свободную от специфических белков, для оценки фоновых явлений.

Методология применения иммуночипов представляет собой дот иммуноанализ с использованием золотых или серебряных иммуно золей, усилением оптического сигнала серебряным проявлением, и стабилизации окраски путем перевода серебра в его сульфид. При наличии в пробе определяемых маркеров заболевания, зоны нанесе ния на чип соответствующих реагентов захвата приобретают темную окраску, интенсивность которой зависит от концентрации маркера в образце. Анализ выполняется при комнатной температуре в тече ние 1 часа и требует 5-10 мкл образца. По предварительным данным (ограниченное число экспериментов) для выявления антител пригод на и цельная капиллярная кровь, которую легко получить проколом пальца. Последнее обстоятельство особенно важно в педиатрической практике, поскольку у малолетних детей взятие даже 5 мл крови из вены считается значительной кровопотерей. Исследование про водится в аналитических ваннах, каждая из которых рассчитана на обработку 5 иммуночипов. Технически анализ прост и выполняется путем переноса иммуночипа по рядам ячеек ванны с определенными временными интервалами. После выемки из последней ячейки про водится учет результатов.

В большинстве случаев надежная и верная трактовка результатов анализа возможна при визуальном учете, однако в некоторых случа ях (до 10 % анализов) субъективная оценка слабо окрашенных пятен может вызывать затруднения. Обычно сложности возникают при ис следовании сывороток с низкими уровнями специфических антител, когда трудно принять решение, к положительному или отрицатель ному результату отнести едва видное пятно. Чувствительность де текции такова, что фоновые сигналы на менее чистых белках могут выглядеть сходно со специфичными сигналами низкотитражных об разцов на более качественных иммунореагентах. Такая проблема воз никает и при регистрации конечной положительной точки разведения образца в процессе оценки чувствительности теста. Наконец, в ряде случаев, (например, при определении протективных титров антител) необходима объективная количественная оценка порога оптической плотности, определяющего защитные свойства сыворотки. Помочь в решении таких задач может специально разработанная программа компьютерного анализа оцифрованного изображения белкового чипа.

Эта программа выполняет следующие функции:

импортирует изображение матрицы с любого устройства, по зволяющего получить оцифрованное изображение матрицы – сканер, цифровой фотоаппарат или WEB-камера;

автоматически распознает по контрастной рамке, очерчиваю щей рабочую область иммуночипа, зоны нанесения на матрице опре деленных иммунореагентов;

по каждой зоне нанесения определяет оптическую плотность (ОП), задает и вычитает отсекаемое значение фона и интерпретирует результаты как положительные или отрицательные;

выдает на экран или печать протокол исследования в опреде ленной форме;

формирует реестр матриц с определенными реквизитами и про извольными комментариями по каждому иммуночипу.

Для каждого типа иммуночипов в программу вводится шаблон, содержащий описание конфигурации матрицы и отсекаемые значе ния фона по каждому антигену. Отсекаемые значения фона предва рительно определяются разработчиками тест-системы. Оптическая плотность в каждой области нанесения антигена выражается в про центах диапазона от ОП контроля работоспособности системы – К+ = 100 % до контроля фоновых явлений – зоны свободной от реаген тов К – = 0 %. Такой подход позволяет устранить зависимость ото бражаемых результатов от условий выполнения анализа. Программа пригодна для компьютера любого уровня, работающего с системой «Windows». Ввод информации и команд, от сканирования до выдачи протокола, осуществляется в режиме диалога.

Производство комплексных тест-систем предполагается органи зовать в сотрудничестве с ЗАО «ИмДи». Для этого на промышлен ной базе фирмы создана высокотехнологичная линия, включающая как современную сложную аппаратуру для подготовки воды, ультра звуковой очистки поверхности подложек, лазерной выкройки им муночипов и вакуумной упаковки, так и специально разработанные нестандартные устройства для автоматического нанесения иммуно реагентов на подложки, а также заполнения и герметизации анали тических ванн. Технология получения и применения комплексных тестов защищена Патентами РФ.

К настоящему времени выпущены экспериментальные серии муль типлексных тестов для обследования беременных женщин и новорож денных на антитела к агентам TORH-комплекса (Toxoplasma gondii, Rubella virus, Herpes simplex virus, Cytomegalovirus и Chlamydia tra chomatis), для оценки поствакцинального иммунитета к возбудителям детских вирусных инфекций (Rubella virus, Mumps virus, Measles virus и Poliovirus), а также подтверждающий дот-блот тест на антитела к ви русу гепатита С с применением 5 рекомбинантных белков. На стадии разработки комплексные тест-системы для контроля донорской кро ви (6 маркеров), для диагностики инфекций урогенитальной системы (6-7 маркеров) и для выявления паразитарных инвазий (6 маркеров).

В перспективе планируется создание тестов для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний, переносимых клещами и комарами, а в более отдаленной перспективе – мультиплексные систе мы для выявления маркеров аллергических и соматических заболева ний (онко- и кардиомаркеры). Технология изготовления иммуночипов универсальна и позволяет создавать системы, как для выявления анти тел, так и для обнаружения антигенов с любым набором и сочетанием специфичностей. Основным фактором, сдерживающим разнообразие наборов, является недоступность качественных иммунореагентов.

Лабораторные испытания наших мультиплексных систем пока зали хорошее (95-100 %) совпадение результатов с данными моно специфических ИФА-тестов ведущих отечественных и зарубежных производителей. При оценке комплексных тестов с использованием отраслевых стандартных образцов панелей сывороток получены по казатели диагностической чувствительности и специфичности, пре вышающие 95 %.

По себестоимости комплексный тест незначительно превышает одно исследование в моноспецифическом ИФА. При этом он позво ляет быстрее получить результаты анализа, не требует оборудования, энергообеспечения и особой квалификации персонала, поэтому мо жет выполняться в медицинских учреждениях, не имеющих специ ализированных лабораторий, в том числе в сельских больницах, где количество подлежащих обследованию невелико, а транспортировка образцов в лабораторию длительна, связана с трудностями или про сто невозможна. Таким образом, создание и внедрение в практику не дорогих и простых в исполнении многопрофильных серологических тестов, позволяющих оперативно проводить комплексное серологи ческое обследование пациентов, в том числе и в условиях слабо осна щенных медицинских пунктов, позволит сделать такое обследование более доступным, массовым, своевременным и эффективным.

Список литературы:

1. Cretich M., Damin F., Pirri G., Chiari M. Protein and peptide arrays: Re cent trends and new directions // Biomolecular Engineering. – 2006. – Vol. 23. – P. 77–88.

2. Lueking A., Cahill D.J., Mllner S. Protein biochips: a new and versatile platform technology for molecular medicine. Rewiev // Drag discovery today:

Targets. – 2005. – V. 10, P. 789- 3. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А. Многопрофильная иммунохимии-ческая индикация возбудителей инфекционных заболеваний // Клиническая лабораторная диагностика. – 2006. – № 5. – С. 39-42.

4. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Зайцев Б.Н. Мно гопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 1. Выбор фор мата белковых чипов и материала для изготовления подложки // Биотехно логия. – 2006. – № 5. – С. 77-87.

5. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 2. Иммобилизация антигенов на подложке белкового чипа // Биотехнология. – 2007.- № 1. – С. 86-94.

6. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М., Кривенчук Н.А., Карпышев Н.Н.

Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 3. Визуа лизация результатов анализа // Биотехнология. – 2007. – № 2. – С. 63-71.

7. Полтавченко А.Г., Яковченко А.М. Многопрофильная серодиагности ка инфекционных заболеваний. 4. Лабораторные испытания многопрофиль ного теста // Биотехнология. – 2007. – № 3. – С. 88-94.

8. Ёрш А.В., Полтавченко А.Г., Агафонов А.П., Кривенчук Н.А. Муль типлексная оценка поствакцинального иммунитета к детским вирусным инфекциям. – В сб. мат. 2-ой междунар. конф. «Астана – БИОТЕХ 2011»

(Астана, 10-11 октября 2011 г). – Астана: НЦБ РК. – 2011. – С. 35.

9. Полтавченко А.Г., Ёрш А.В., Кривенчук Н.А. Многопрофильная имму нодиагностика перинатального периода. – В сб. мат. 2-ой междунар. конф.

«Астана – БИОТЕХ 2011» (Астана, 10-11 октября 2011 г). – Астана: НЦБ РК. – 2011. – С. 10. Ekins R. P. Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microar rays // Clin. Chem. – 1998. – Vol. 44. – P. 2015–2030.

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПОЛИЭПИТОПНЫХ Т-КЛЕТОЧНЫХ ВИЧ-1 ИММУНОГЕНОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В СОСТАВЕ ДНК-ВАКЦИНЫ А.Ю. Регузова, Д.В. Антонец, Р.А. Максютов, А.А. Ильичев, С.Ф. Орешкова, С.И. Бажан, Л.И. Карпенко Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Кольцово, Новосибирская обл., Россия Работа выполнена при финансовой поддержке проекта РФФИ № 12-04- Аннотация. С использованием оригинального программного обеспечения и стратегией рационального проектирования был проведен дизайн трех искус ственных полиэпитопных иммуногенов TСI-N, TСI-N2 и TСI-N3, на основе которых сконструировано три рекомбинантные плазмиды – кандидаты ДНК-вакцины про тив ВИЧ-1. Все полученные ДНК-вакцины обеспечивают экспрессию целевых ге нов в культуре эукариотических клеток линии 293-Т, которая была показана с по мощью проточной цитометрии с использованием антител к маркерному эпитопу р24. Результаты иммунизации лабораторных мышей показали, что исследуемые иммуногены индуцируют продукцию ключевых медиаторов клеточного иммуни тета TNF-, IL-2 и IFN- в ответ на стимуляцию пептидами из белков ВИЧ-1, т.е.

демонстрируют наличие ВИЧ-специфического Т-клеточного иммунного ответа.

ENGINEERING OF POLYEPITOPE T-CELL HIV-1 IMMUNOGENS AND STUDY OF THEIR BIOLOGICAL ACTIVITY IN CONTENTS OF DNA VACCINE A.Yu. Reguzova, D.V. Antonets, R.A. Maksyutov, A.A. Ilyichev, S.F. Oreshkova, S.I. Bazhan, L.I. Karpenko State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” Koltsovo, Novosibirsk region, Russia Abstract. Using original software and the rational design strategy we conducted engineering of three articial polyepitope immunogens TСI-N1, TСI-N2 and TСI-N and on this basis design of three recombinant plasmids – candidate DNA vaccine against HIV-1 was carried out. All acquired DNA-vaccines provide target genes ex pression in the culture of eukaryotic cell line 293-T, which has been evaluated with ow cytometry method and using antibodies to p24 marker epitope. Results of mice immunization showed that investigated immunogens induce production of key me diators of cellular immunity TNF-, IL-2 and IFN- in response to peptide stimulation from HIV-1 proteins, thereby demonstrating HIV-specic T-cell immune response.

Вакцинация остается одним из самых эффективных методов про филактики инфекционных заболеваний [1]. Однако для разработки вакцин против высоко вариабельных вирусов, к которым относится ВИЧ-1, невозможно опираться на традиционные подходы для созда ния вакцины, т.е. использовать целые или ослабленные вирусы, либо отдельные вирусные белки, традиционно применяемые в случае дру гих вирусных инфекций (корь, краснуха, ветряная оспа). В послед нее время появились работы, в которых предлагается использовать только иммунологически значимые антигенные детерминанты из разных вирусных белков, консервативных среди различных вирус ных субтипов, которые при этом лишены иммунопатогенных эпито пов для конструирования искусственных полиэпитопных вирусных белков в качестве элементов вакцин нового поколения [2]. Подобный подход имел успех при создании вакцин против бактериальных па тогенов [3]. В этой связи перспективным направлением в работе по предотвращению ВИЧ-инфекции является создание искусственных полиэпитопных иммуногенов, которые стимулируют клеточный им мунный ответ.

В данной работе рассматриваются вопросы, связанные с создани ем искусственных полиэпитопных Т-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов и изучением вызываемого ими вирус-специфического клеточного иммунного ответа.

Цель исследования – сконструировать рекомбинантные плазми ды – кандидаты ДНК-вакцины против ВИЧ-1 на основе нового ис кусственного полиэпитопного клеточного иммуногена, содержащего CD4+ и CD8+ эпитопы из белков ВИЧ-1, подтвердить экспрессию генов, кодирующих целевой иммуноген, в эукариотических клетках и провести исследование иммуногенности на модели лабораторных мышей.

Материал и методы. Ранее нами был проведен дизайн нового ис кусственного полиэпитопного ВИЧ-1 иммуногена, названного TСI-N [4]. Предсказание Т-клеточных эпитопов и дизайн коровой амино кислотной последовательности polyE полиэпитопного иммуногена TСI-N осуществляли с использованием программного обеспечения TEpredict и PolyCTLDesigner [5, 6]. Дополнительно были исполь зованы последовательности убиквитина (Ub), сигнального пептида (ER-signal) и мотива белка LAMP-1, которые по замыслу должны обеспечить различные пути процессинга и презентации полиэпитоп ного иммуногена в составе ДНК-вакцины. В результате были синте зированы три гена, кодирующих целевые иммуногены TСI-N (polyE), TСI-N2 (ER-signal_polyE_LAMP-1) и TСI-N3 (Ub_polyE).

Полученные гены были клонированы в составе векторной плаз миды pcDNA3.1 по сайтам рестрикции HindIII и XhoI. В результа те было получено три рекомбинантных плазмиды p1, р2 и p3 – три кандидата ДНК-вакцины против ВИЧ-1. Последовательность целе вых генов подтверждена секвенированием. Наращивание биомассы клеточной культуры E. coli Bl21 и препаративное выделения реком бинантных плазмидных ДНК проводили по стандартной схеме [7, 8].

Чистоту препарата ДНК определяли спектрофотометрически, путем измерения оптического поглощения при длинах волн 260-280 нм, а также с помощью электрофореза в 1 %агарозном геле и определения эндотоксина с использованием ЛАЛ-реагента, согласно инструкции производителя (Charles River Laboratories).

Для оценки экспрессии целевых генов проводили трансфекцию эукариотических клеток линии 293Т c использованием реагента ли пофектамин (Invitrogene) согласно инструкции производителя набо ра. Через 48 часов культивирования была изучена продукция целевых белков в 293Т клетках, трансфицированных плазмидами p1, р2 и p3, с использованием моноклональных антител (МКА) 29F2, меченых FITC, и проточной цитометрии. Gag-эпитоп из белка р24 ВИЧ-1, с которым связываются МКА 29F2, включен в состав всех трех им муногенов для оценки экспрессии и метаболической стабильности клонированных генов. Анализ образцов осуществляли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur™ (BD) с использованием предложен ного производителем программного обеспечения и МКА 29F2.

Исследования иммуногенности сконструированных ДНК-плазмид p1, р2 и p3 были проведены на модели лабораторных мышей линии BALB/c. Доза ДНК для иммунизации каждой плазмидой составляла 100 мкг/мышь, каждая группа состояла из 5 животных. В качестве контрольной группы были взяты мыши, которым вводили физра створ. Иммунизацию проводили внутримышечно.

Способность исследуемых ДНК-вакцинных конструкций индуци ровать клеточный ответ оценивали по продукции TNF-, IL-2 и IFN CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами в ответ на стимуляцию пептидами из белков ВИЧ-1 с помощью метода внутриклеточного окрашивания цитокинов. Для этого выделяли лимфоциты из селезенки исследуе мых животных через 14 суток после иммунизации и культивировали со смесью пептидов из белков ВИЧ-1. Затем проводили фиксацию и пермеабилизацию активированных лимфоцитов с использованием набора Cytox/Cytoperm™ Plus Fixation/Permeabilization Kit (BD) и последующим окрашиванием поверхностных маркеров клеток анти телами PE Hamster Anti-Mouse CD3e, PerCP Rat Anti-Mouse CD4, Per CP Rat Anti-Mouse CD8a, а также внутриклеточных цитокинов анти телами APC Rat Anti-Mouse TNF, APC Rat Anti-Mouse IL-2, APC Rat Anti-Mouse IFN- (BD). Анализ образцов осуществляли с помощью проточного цитофлуориметра BD FacsCalibur.

Результаты исследования и обсуждение. Известно, что Т-клеточные эпитопы формируются из внутриклеточно синтезированных белков, что делает ДНК-вакцины (плазмиды, содержащие ген иммуногена под контролем эукариотического промотора) наиболее эффективным вектором для их доставки. В настоящее время прогресс в определе нии ВИЧ-1 CD8 + Т-клеточных эпитопов и понимание процессинга эндогенно синтезирующихся антигенов по пути MHC I дает основу для рационального проектирования полиэпитопных вакцин, индуци рующих широко реактивные ответы CD8 + Т-клеток к ВИЧ-1. Раз работка и исследование различных стратегий проектирования полиэ питопных иммуногенов, обеспечивающих эффектный Т-клеточный ответ, имеет большое значение как для создания вакцин против высо ко вариабельных патогенов, так и для получения фундаментальных знаний о механизмах иммунного ответа на искусственные полиэпи топные иммуногены.

Структура полиэпитопного иммуногена polyE TCI-N проекти ровалась на основе новейших литературных данных с целью фор мирования высоких уровней ответов CD8+ и CD4+ лимфоцитов на разных стадиях представления иммуногена иммунной системе. Для этого в состав полиэпитопной конструкции включены дополнитель ные последовательности, в том числе N-концевой убиквитин (Ub), N-концевой сигнальный пептид (ER-signal) и С-концевой тирозино вый мотив белка LAMP-1. N-концевой убиквитин нацеливает полиэ питопную конструкцию на протеасому для ее деградации с целью освобождения детерминант и их последующего связывания с моле кулами MHC I-класса. N-концевой сигнальный пептид обеспечивает поступление иммуногена в эндоплазматический ретикулум и в се креторный путь, а LAMP-мотив направляет этот иммуноген по про хождении по секреторному пути на деградацию в лизосомы, где об разующиеся пептидные фрагменты связываются с молекулами МНС II-класса и затем презентируются на поверхности клеток. Таким об разом, предполагается достигнуть представления иммуногенов по пути MHC I- и МНС II-класса CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитам и форми рования полноценного клеточного иммунного ответа.


Структуры спроектированных целевых иммуногенов на основе гена polyE схематически можно представить в следующем виде:

1. TCI-N конструкция: polyE 2. TCI-N2 конструкция: ER-signal_polyE_LAMP- 3. TCI-N3 конструкция: Ub_polyE.

Гены, кодирующие полиэпитопные иммуногены, получены химико фериметативным синтезом и клонированы в составе векторной плаз миды pcDNA3.1, в результате чего получены рекомбинантные плазми ды p1, р2 и p3. Последовательность сконструированных ДНК-вакцин подтверждена секвенированием и рестрикционным анализом.

Способность исследуемых искусственных генов в составе ДНК вакцинных конструкций экспрессировать целевой антиген в эукарио тических клетках была оценена с применением метода внутрикле точного окрашивания продуцируемого белка специфическими МКА 29F2 к эпитопу p24, мечеными флуорохромом FITC и последующей детекцией сигнала на проточном цитофлуориметре. С этой целью предварительно проводили фиксацию и пермеабилизацию 293Т клеток с использованием набора Cytox/Cytoperm™ Plus Fixation/ Permeabilization Kit (BD), трансфицированных плазмидами р1, р2 и р3. Антитела специфически связывались с экспрессируемым в со ставе целевого иммуногена эпитопом белка р24, анализ образцов осуществляли на проточном цитофлюориметре BD FACSCalibur. Со гласно полученным данным, клетки, трансфицированные плазмида ми p1, р2 и p3, продуцировали целевой иммуноген в соотношении 68,28 %, 73,12 % и 69,49 % от всех трасфицированных клеток каждой плазмидой соответственно, что подтверждает факт синтеза белков иммуногенов в эукариотических клетках.

Следующим этапом работы стало изучение иммуногенности по лученных ДНК-вакцинных конструкций. Для иммунизации были использованы мыши линии BALB/c. Доза ДНК составляла 100 мкг/ мышь, иммунизацию проводили внутримышечно.

Для исследования эффективности сконструированных ВИЧ-1 им муногенов в плане индукции клеточного иммунитета против ВИЧ, в качестве ключевых маркеров были выбраны IL-2, IFN-g, и TNF-а.

Эти цитокины соответствуют Th1 типу Т-клеточного ответа. Th клетки в первую очередь секретируют IL-2, IFN-g, и TNF-а и хемо кины, и, как считается, обеспечивают защитные реакции против вну триклеточных возбудителей, к которым относится ВИЧ. Известно, что на ранних стадиях ВИЧ-инфекции Th1 тип доминирует над Th типом, поэтому для создания протективного ответа вакциной необ ходимо, чтобы формировалось именно это направление клеточного ответа. Продукция IL-2 и IFN-g активирует цитотоксические CD8+ Т-клетки и инициирует уничтожение инфицированных клеток, соот ветственно контролирует виремию. Эти цитокины обладают также ауторегуляторными функциями. TNF-а инициирует апоптоз инфици рованных клеток, обеспечивая элиминацию их из организма. Именно указанные параметры клеточного ответа – способность CD4+ и CD8+ Т-клеток продуцировать перечисленные цитокины была исследована на 14 сутки после иммунизации мышей с помощью метода внутри клеточного окрашивания и проточной цитометрии.

В контрольной группе мышей, которым вводили физраствор, уро вень выброса исследуемых цитокинов не превышал 0,05 % CD4+ и CD8+ цитокин-продуцирующих клеток из 105 стимулированных пеп тидами лимфоцитов мыши.

Наибольшие значения продукции TNFa СD4+ и СD8+ Т-клетками обеспечивала конструкция TCI-N, кодирующая иммуноген polyE без концевых фланкирующих последовательностей. Для СD4+ клеток это значение составило 0,81 % и для СD8+ Т-клеток – 0,58 % клеток из 105 стимулированных пептидами лимфоцитов мыши.

Максимальный уровень IL-2 обеспечивала конструкция TCI-N2, кодирующая иммуноген ER-signal_polyE_LAMP-1. Для СD4+ клеток это значение составило 1,3 % и 0,95 % для СD8+ Т-клеток из 105 сти мулированных пептидами лимфоцитов. Это соответствует теоретиче ским предположениям, так как добавочные концевые мотивы LAMP- и ER-signal направляют такой белок по лизосомальному пути и далее на презентацию в комплексе с MHC II класса CD4+ Т-лимфоцитам.

В результате CD4+ Т-лимфоциты активируются и синтезируют IL-2, который в свою очередь активируют CD8+ Т-лимфоциты и иниции руют у них продукцию этого цитокина. IL-2 крайне важен, особенно у CD4 T-хелперов, поскольку он запускает продукцию IFN-g и TNF-а.

Также IL-2 активирует клеточную пролиферацию, что является по казателем эффективности клеточного ответа. Результаты высокой продукции IL-2 можно считать весьма обнадеживающими в плане иммуногенности созданных нами полиэпитопных иммуногенов, по скольку IL-2 продуцирующие CD8+ Т-клетки коррелируют с высо ким уровнем защиты пациента в течение ВИЧ инфекции. Кроме того IL-2 индуцирует CD8+ клеточно-опосредованную супрессию репли кации ВИЧ, что также приводит к снижению виремии.

Наибольший уровень синтеза IFNg обеспечивала конструкция TCI-N3, кодирующая иммуноген Ub_polyE. 0,85 % CD4+ и 0,92 % CD8+ Т-клеток из 105 стимулированных пептидами лимфоцитов мыши обеспечивают его продукцию. Полученный результат также соответствует теоретически предсказанному, так как убиквитин на правляет такой белок на протеосому и далее на презентацию в ком плексе с MHC I класса CD8+ Т-лимфоцитам. Затем CD8+ Т-клетки активируются и синтезируют IFNg, который индуцирует противови русную защиту путем инициации Fas-опосредованного клеточного киллинга, увеличивая чувствительность инфицированных клеток к TNFa. В контексте ВИЧ-инфекции IFNg ингибирует репликацию ВИЧ. Необходимо отметить, что оценка продукции IFNg CD4+ и CD8+ Т-клетками является одним из устоявшихся методических стандартов при изучении эффективности кандидатных вакцин, скон струированных для формирования клеточного ответа на ВИЧ-1.

Выводы. С использованием оригинального программного обе спечения и стратегии рационального проектирования был проведен дизайн трех искусственных полиэпитопных иммуногенов TСI-N, TСI-N2 и TСI-N3, на основе которых сконструированы три рекомби нантные плазмиды – кандидаты ДНК-вакцины против ВИЧ-1.

Все полученные ДНК-вакцины обеспечивают экспрессию целе вых генов в культуре эукариотических клеток линии 293-Т, которая была показана с помощью проточной цитометрии с использованием антител к маркерному эпитопу р24.

Все исследуемые иммуногены: TCI-N, TCI-N2 и TCI-N3 индуциру ют продукцию TNF-, IL-2 и IFN- в ответ на стимуляцию пептидами из белков ВИЧ-1, т.е. демонстрируют наличие ВИЧ-специфического Т-клеточного иммунного ответа.

Список литературы:

1. Plotkin S. L., Plotkin, S. A. A short history of vaccination. In Vaccines, S.A. Plotkin, W.A. Orenstein, and P.A. Oft, eds. (Philadelphia, PA: Elsevier Inc), 2008. Р. 1–16.

2. Bazhan S. I., Karpenko L. I., Lebedev L. R., Uzhachenko R. V., Belavin P. A., Eroshkin A. M., Ilyichev A. A. A synergistic effect of a combined bivalent DNA protein anti-HIV-1 vaccine containing multiple T- and B-cell epitopes of HIV- proteins // Mol Immunol. 2008. Vol. 45, № 3. Р. 661-669.

3. Sette A., Rappuoli R. Reverse Vaccinology: Developing Vaccines in the Era of Genomics // Immunity. 2010. Vol. 33, № 4. Р. 530–541.

4. Регузова А. Ю., Антонец Д. В., Максютов Р. А., Волкова О. Ю., Кар пенко Л. И., Ильичев А. А., Бажан С. И. Дизайн, конструирование и оценка экспрессии генов, кодирующие полиэпитопные Т-клеточные иммуногены ВИЧ-1 в составе ДНК-вакцинных конструкций // Вестник НГУ, 2012, №2.

Принята в печать.

5. Антонец Д. В., Максютов А. З. TEpredict: программное обеспечение для предсказания Т-клеточных эпитопов // Мол. биол. 2010. Т. 44, № 1.

С. 130–139.

6. Bazhan S. I., Karpenko L. I., Ilyicheva T. N., Belavin P. A., Seregin S. V., Danilyuk N. K., Antonets D. V., Ilyichev A. A. Rational design based synthetic polyepitope DNA vaccine for eliciting HIV-specic CD8+ T cell responses // Mol. Immunol. 2010. Vol. 47, № 7–8. P. 1507–1515.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Пер с англ. М., 1984.

8. Saporito-Irwin S. M., Geist R. T., Gutmann D. H. Ammonium Acetate Pro tocol for the Preparation of Plasmid DNA Suitable for Mammalian Cell Transfec tions // Biotechniques. 1997. Vol. 23, № 3. Р. 424–442.

АБЕРРАНТНО-МЕТИЛИРОВАННЫЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ДНК КРОВИ – ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МАРКЕРЫ РАННЕЙ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА Е.Ю. Рыкова1, И.А. Запорожченко1, Е.С. Морозкин, А.А. Пономарева2, Н.В. Чердынцева2, В.В. Власов1, П.П. Лактионов Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт онкологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Томск, Россия Аннотация. Злокачественная трансформация клеток определяется изменени ем профиля метилирования ДНК. Аберрантно метилированные гены выявляются во внеклеточной ДНК, циркулирующей в крови (циркДНК), что можно использо вать для диагностики рака. Разработаны новые тест-системы диагностики рака легкого на основе количественной ПЦР и селективного обогащения метилирован ной циркДНК с использованием метил-связывающих MBD доменов. При помощи анализа на микрочипах проведен поиск новых маркеров рака предстательной железы (РПЖ) в циркДНК. Верификация профиля метилирования кандидатных участков методом пиросеквенирования с последующим анализом внутримолеку лярной вариабельности позволила выявить новый неинвазивный маркер РПЖ – деметилированный ген RNF219.


ABERRANTLY-METHYLATED CIRCULATING DNA FROM BLOOD AS PROMISING MARKERS FOR EARLY NONINVASIVE CANCER DETECTION E.Y. Rykova, I.A. Zaporozhchenko, E.S. Morozkin, A.A. Ponomaryova, N.V. Cherdyntseva, V.V. Vlassov, P.P. Laktionov Institute of Сhemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, Novosibirsk, Russia Abstract. Malignant cell transformation is driven by changes in DNA methylation prole. Aberrantly methylated genes are found in extracellular DNA, circulating in blood (cirDNA), and can be valuable for cancer diagnostics. Test systems for lung cancer detection based on quantitative PCR and selective enrichment of cirDNA in methylated sequences with methyl-binding domain (MBD) proteins were elaborated.

Search for the new markers of prostate cancer (PC) in cirDNA has been conducted through microarray hybridization techniques. Verication of methylation proles of candidate sequences with pyrosequencing followed by intramolecular variability analysis revealed demethylated gene RNF219 as a novel noninvasive PC marker.

Присутствие внеклеточных нуклеиновых кислот в крови человека было обнаружено более полувека назад, и толчком к пристальному изучению их биологии, диагностического потенциала послужили полученные в 1989 году данные о том, что в плазме крови онколо гических больных присутствуют ДНК, характерные для геномной ДНК опухолевых клеток [1]. С этого момента к поиску нуклеиновых кислот – надежных диагностических и/или прогностических марке ров клеток опухолей в составе ДНК, циркулирующих в плазме крови (циркДНК), подключились ученые ведущих исследовательских цен тров. Показано, что циркДНК могут находиться в составе комплек сов с белками, которые обеспечивают их устойчивость к гидролизу нуклеазами крови. Примерами таких белков служат гистоны, белки плазмы, такие как, альбумин, сывороточный амилоид Р, липопротеи ны [2]. Другой формой циркуляции внеклеточных нуклеиновых кис лот являются везикулы, покрытые мембраной. Самые мелкие среди мембранных частиц крови – экзосомы – характеризуются размером, не превышающим 100 нм, и содержат согласно общепринятому мне нию преимущественно мРНК и микроРНК. Однако недавно было по казано наличие ДНК в экзосомах, продуцируемых кардиомиоцитами [3]. В составе микрочастиц – более крупных по сравнению с экзосо мами везикулярных телец диаметром до 1000 нм – был обнаружен широкий набор биополимеров, включающий, помимо ДНК, также матричную РНК, микроРНК и специфический набор белков [2]. Та кой же или больший размер имеют апоптические тельца – частицы, формирующиеся на поздних стадиях программируемой клеточной смерти и содержащие как ДНК, так и РНК. Все эти комплексы были обнаружены как в плазме, так и сыворотке крови.

В исследованиях, выполненных в ИХБФМ СО РАН, показано, что значительные количества циркулирующих нуклеиновых кислот связаны с поверхностью клеток крови, как эритроцитов, так и лей коцитов [4]. В составе связанных с поверхностью клеток нуклеино вых кислот (скпНК) также обнаружены ДНК и РНК, характерные для клеток опухолей, что делает скпДНК еще одним источником диагно стического материала [2].

Следует отметить, что характерные для опухолевых клеток ДНК циркулируют в крови в присутствие избытка нормальной ДНК и со ставляют от 0,01 до 15 % общих циркДНК [5], что сильно осложня ет их выявление. По данным аналитического обзора оптимальным онкомаркером являются аберрантно метилированные ДНК, которые были обнаружены во всех типах опухолей и в силу особенностей ана литических процедур могут быть легко обнаружены в присутствии большого избытка нормальной ДНК [6].

Целью настоящей работы является исследование диагностическо го потенциала аберрантно метилированных ДНК, циркулирующих в составе циркДНК или скпДНК, поиск маркеров и критериев, по зволяющих достоверно детектировать опухоль, оценивать эффектив ность противоопухолевой терапии и текущее состояние опухолевого процесса. Для этого выполнен анализ эпигенетического статуса ге нов опухолевой супрессии в циркДНК крови в норме и при онко логических заболеваниях, а также разработаны подходы к поиску новых эпигенетических маркеров рака при помощи технологии ги бридизации на микрочипах и путем предварительной селекции ги перметилированных последовательностей при помощи ДНК-метил связывающего домена (MBD) белка MBD2 человека.

По данным различных исследований, концентрация циркДНК в плазме невысока и варьирует в диапазоне от 1 до 20 нг/мл [2]. Недав но показано, что концентрация циркДНК в плазме крови здоровых людей составляет менее 10 % от общего количества циркДНК крови, остальное приходится на долю скпДНК [2]. При этом концентрация циркДНК в плазме существенно повышается при раке желудка и мо лочной железы, и незначительно изменяется при раке легкого, тогда как концентрация циркДНК, связанной с поверхностью клеток кро ви снижается при раке легкого и молочной железы и не изменяется при раке желудка [2]. Таким образом, соотношение между свободной циркДНК плазмы и связанной с клеточной поверхностью зависит от состояния донора – у здоровых доноров большая часть ДНК связа на с поверхностью клеток крови, у больных раком распределение циркДНК по фракциям изменяется в зависимости от типа опухоли.

Помимо изменения концентрации циркДНК, при развитии опухо лей нарушается «здоровый» профиль метилирования. При помощи метил-специфичной ПЦР на гены опухолевой супрессии p15, hMLH и MGMT показано наличие в плазме крови больных раком желудка аберрантно метилированных генов опухолевой супрессии [7]. Часто та встречаемости таких фрагментов ДНК была ниже, чем теорети чески ожидаемая по данным о частоте выявления в тканях опухоли.

Количественный анализ с использованием метил-специфичной ПЦР выявил 7-ми и 3-х кратное увеличение уровня метилирования гена RARB2 по сравнению со здоровыми донорами в связанной с поверх ностью циркДНК и плазме больных раком легкого соответственно [2]. Для комбинации двух маркерных генов RASSF1A и RARB2 пока зано, что использование в анализе не только циркДНК плазмы, но и скпДНК позволило увеличить чувствительность выявления больных раком легкого с 72 % до 90 %, а специфичность – с 65 % до 85 %.

Одной из задач исследования была разработка технически простого метода выявления новых эпигенетических маркеров рака в циркДНК.

Для этого использовали метод предварительной селекции гиперме тилированных последовательностей циркДНК при помощи ДНК метил-связывающего домена (MBD) белка MBD2 человека (метод MIRA) [8]. Для получения белка, содержащего метил-связывающий домен, была создана рекомбинантная плазмида, кодирующая слитый белок глутатионтрансферазы (GST) и метил-связывающего домена белка MBD2 человека для экспрессии в клетках E.coli. Полученный GST-MBD белок инкубировали с препаратом очищенных фрагментов циркДНК и выделяли комплексы белка с метилированными фрагмен тами ДНК при помощи глутатион-содержащих магнитных шариков.

Степень обогащения смеси метилированными фрагментами ДНК определяли количественным ПЦР с праймерами, специфичными к фрагменту CpG островка исследуемого гена. Предварительные экс перименты в модельной системе показали эффективность исполь зования метода для обогащения образцов ДНК по метилированным последовательностям. Проведен анализ изменения уровня метилиро вания гена опухолевой супрессии RARВ2 в циркДНК больных ра ком легкого, выявлена тенденция увеличения индекса метилирова ния RARВ2 по сравнению с циркДНК здоровых доноров (критерий Манна-Уитни, p0,1). Таким образом, разработанный метод позволя ет просто и технологично определять индекс метилирования целевых генов и, в сочетании с секвенированием, пригоден для поиска новых эпигенетических маркеров.

Существенным недостатком используемой в настоящее время ме тодологии, направленной на создание диагностических систем явля ется использование маркеров, выявленных в опухолевой ткани, в то время как сам процесс генерации циркДНК влияет на представлен ность маркеров в крови. Например, фрагментация ДНК зависит от нуклеосомной укладки;

ДНК, попадающая во внеклеточную среду в результате апоптоза, также не эквивалентна геномной по представ ленности последовательностей. Очевидно, что поиск диагностически значимых маркеров должен осуществляться рациональным образом непосредственно в пуле ДНК, циркулирующих в крови онкологиче ских больных. Для выполнения такого поиска нами был использован подход, основанный на использовании микрочипов, позволяющих проанализировать метилирование CpG богатого участка человече ской геномной ДНК. Всего было проанализировано 60 препаратов циркДНК из плазмы крови здоровых доноров (n=20), больных добро качественной гиперплазией (ДГПЖ) (n=20) и РПЖ (n=20). На пер вой стадии анализа общий пул молекул циркДНК плазмы обогащали фрагментами, содержащими метилированные CpG динуклеотиды, по модифицированной методике описанной Schumacher с соавтора ми [9]. Полученные фрагменты ДНК обработали T4 ДНК полимера зой для получения фрагментов с тупыми концами, лигировали с уни версальными адаптерами и гидролизовали метил-чувствительными эндонуклеазами рестрикции HpaII, HpyCH4IV и HinP1. Использова ние этих трех эндонуклеаз позволяет в сумме проанализировать до 41 % всех CpG-содержащих сайтов генома человека. Оставшиеся не гидролизованными фрагменты циркДНК амплифицировали по уни версальным праймерам в присутствии флуресцентно-меченых три фосфатов. Для нормализации данных гибридизации использовали фрагменты геномной ДНК лейкоцитов.

Анализ образцов ДНК был выполнен на базе Центра психического здоровья (г. Торонто, Канада) при помощи микрочипов Human CpG island microarray (Corning Life Sciences, Acton, MA), и с использова нием олигонуклеотидов, созданных для выявления метилированных ДНК. Микрочипы с гибридизованными библиотеками исследовали на сканере ScanArrayExpess (Perkin Elmer, USA) с использованием программного обеспечения GenePix 6.0. Выявлены различия уровня метилирования 197 фрагментов ДНК в составе образцов циркДНК больных РПЖ по сравнению с образцами циркДНК здоровых доно ров. Из них были выбраны 7 кандидатных участков ДНК, степень метилирования которых значительно различается между группами здоровых доноров и онкологических больных. Отобранные фрагмен ты были проанализированы методом пиросеквенирования. Реакции пиросеквенирования наработанных биотинилированных фрагментов были проведены для каждого образца циркДНК.

Данные пиросеквенирования не позволили выявить достоверные различия между уровнями метилирования цитозинов во всех иссле дованных фрагментах образцов циркДНК от пациентов с ДГПЖ и РПЖ. Между выборками здоровых доноров и больных РПЖ были обнаружены достоверные различия (р0,05) уровней метилирования некоторых CpG-динуклеотидов для двух фрагментов промоторных областей генов ZC3H4 и RNF219. В случае промоторной области гена ZC3H4 различия обнаружены в уровнях метилирования первой и четвертой позиций исследованного CpG фрагмента, а в промотор ной области гена RNF219 уровень метилирования различался для CpG-динуклеотидов в позициях 1-9, 11 и 13. Следует отметить, что при РПЖ промоторная область гена ZC3H4 гиперметилирована, тог да как для гена RNF219 – гипометилирована [10] Нами была определена диагностическая значимость метилиро вания отдельных CpG динуклеотидов для дифференцирования здо ровых и больных РПЖ. Для этого по каждому CpG-динуклеотиду выбирали пороговые значения уровня метилирования так, чтобы чувствительность выявления раковых пациентов составляла не ме нее 78-80 %, а специфичность – не менее 50 %. Полученные значе ния чувствительности аналитической системы составили 83 % для первого и четвертого CpG-динуклеотидов гена ZC3H4 и 80-95 % для различных CpG гена RNF219. Такие значения говорят о высоком потенциале этих позиций для дискриминации здоровых и больных РПЖ. Также для большинства пациентов было выявлено сопряжен ное снижение уровня метилирования CpG гена RNF219 в 1-9, 11 и 13 позициях, что позволяет предполагать высокую диагностическую значимость такого комплексного эпигенетического маркера.

Однако данные, полученные при помощи пиросеквенирования, не обеспечивают информацией об индивидуальных профилях метили рования исследуемой области в отдельных молекулах ДНК, цирку лирующих в крови. Поскольку такое знание может послужить важ ным фактором в последующей разработке диагностических систем, было решено провести секвенирование отдельных фрагментов ДНК крови. Для этого фрагменты промоторной области гена RNF219, по лученные путем ПЦР-амплификации из обработанных бисульфитом натрия образцов циркДНК здоровых доноров (n=6) и больных РПЖ (n=6), клонировали в плазмиде pGEM. Последовательности клонов промоторной области определяли секвенированием.

У здоровых доноров во всех 100 % молекул подавляющая часть (с 4-й по 12-ю позицию) CpG-динуклеотидов исследуемого фрагмента гена RNF219 метилирована, но при этом некоторые позиции (2, 13, 14, 16, 17) неметилированы в определенном сочетании. У здоровых доноров было выявлено 4 варианта таких сочетаний, обладающих примерно равной представленностью в пуле циркДНК. Больные РПЖ характеризовались либо присутствием в пуле циркДНК полно стью неметилированных фрагментов, либо существенной недопред ставленностью в пуле ДНК метилированных фрагментов – наличи ем только одного или двух вариантов метилирования фрагментов из 4-х характерных для здоровых доноров. Т.е. у раковых больных наблюдается определенная моноклональность или вырожденность пула фрагментов циркДНК. Данные секвенирования говорят о том, что найденная область гена RNF219 является перспективной для раз работки диагностического метода для РПЖ с использованием ПЦР в реальном времени, специфичной к полностью деметилированным участкам промоторной области гена RNF219. Следует отметить, что локализация этого гена на 13 хромосоме человека рядом с геном POU4F1 (13q31.1), связанного с онкологическими заболеваниями предстательной железы, позволяет предполагать координированные изменения этих двух генов при РПЖ. Таким образом, выявлены но вые потенциальные эпигенетические маркеры, ассоциированные с онкологическими заболеваниями предстательной железы.

В настоящей работе показана значимость циркДНК и скпДНК крови для диагностики онкопатологий различной локализации. По лученные результаты являются обоснованием целесообразности ис пользования суммарных циркДНК крови для поиска и анализа эпиге нетических маркеров.

Работа поддержана грантом РФФИ (№ 11-04-12105-офи-м 2011), проектом Президиума СО РАН совместно со сторонними ор ганизациями № 65, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (Госконтракт №П256).

Список литературы:

1. Valentin V. Vlassov, Pavel P. Laktionov, Elena Y. Rykova Extracellular nucleic acids // Bioassays. – 2007. – V. 29. – P. 654-667.

2. Elena Y Rykova E.Yu., Morozkin E.S., Ponomaryova A.A., Loseva E.M., Zaporozhchenko I.A., Cherdyntseva N.V., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Cell-free and cell-bound circulating nucleic acid complexes: mechanisms of generation, concentration and content. // Expert Opinion on Biological Therapy. – 2012. – V. 12. – P. S141-S153.

3. Waldenstrom A., Genneback N., Hellman U., Ronquist G. Cardiomyocyte Microvesicles Contain DNA/RNA and Convey Biological Messages to Target Cells. // PLoS One. – 2012. – V. 7. – P. e34653.

4. Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Rykova E.Yu., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V. Cell-surface-bound nucleic acids: Free and cell-surface-bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients. // Annals of New York Academy of Sciences. – 2004. V. 1022. – P. 221 227.

5. Diehl F., Schmidt K., Choti M.A., Romans K., Goodman S., Li M., Thornton K., Agrawal N., Sokoll L., Szabo S.A., Kinzler K.W., Vogelstein B., Diaz L.A., Jr. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. // Nature Medicine. – 2008. – V. 14. – P. 985-990.

6. Peters D.L., Pretorius P.J. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA – A new paradigm in genetic behaviour. // Clinica Chimica Acta. – 2011. – V. 412. – P. 806-811.

7. Kolesnikova E.V., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Shelestyuk P.I., Permyakova V.I., Vlassov V.V., Tuzikov A.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y.

Circulating DNA in the blood of gastric cancer patients. // Annals of New York Academy of Sciences. – 2008. – V. 1137. – P. 226-231.

8. Serre D., Lee B.H., Ting A.H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. // Nucleic Acids Research. – 2010. – V. 38. – P. 391-399.

9. Schumacher A., Kapranov P., Kaminsky Z., Flanagan J., Assadzadeh A., Yau P., Virtanen C., Winegarden N., Cheng J., Gingeras T., Petronis A. Microarray based DNA methylation proling: technology and applications. // Nucleic Acids Research. – 2006. – V. 34. – P. 528-542.

10. Cortese R., Kwan A., Lalonde E., Bryzgunova O., Bondar A., Wu Y., Gordevicius J., Park M., Oh G., Kaminsky Z., Tverkuviene J., Laurinavicius A., Jankevicius F.,Sendorek D.H., Haider S., Wang S.C., Jarmalaite S., Laktionov P., Boutros P.C., Petronis A. Epigenetic markers of prostate cancer in plasma circulating DNA. // Human Molecular Genetics. – 2012. – V. 21. – P.3619-3631.

ТЕХНОЛОГИИ ПРОГНОСТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В СИСТЕМЕ ДОКАЗАТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ Ю.В. Туманов, А.Н. Болдырев Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская обл., п. Кольцово Аннотация. В работе обсуждены технологии прогностических маркеров ви русных и бактериальных инфекций, применяемых в современной диагностиче ской практике. Возможность использования инструментальных методов контроля качества проводимых исследований в клинической диагностике повышает чув ствительность и специфичность анализа (более 90 %), и сравнима с результатами молекулярно-биологических методов. Развитие биотехнологии является важным фактором введения инноваций в диагностике. Накопление информации о свой ствах и видовой специфичности антигенов микобактерий или антител позволяет создавать высокоспецифичные диагностические тест-системы для иммуноанализа и оценки иммунного статуса, повысить эффективность методов иммунологическо го мониторинга.

THE TECHNOLOGIES OF PROGNOSTIC MARKERS FOR DEFINING INFECTIOUS DISEASES IN THE SYSTEM OF EVIDENCE-BASED MEDICINE Yu.V. Tumanov, А.N. Boldyrev Federal Budgetary Institution of Science State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Novosibirsk region, Koltsovo Abstract. The technologies of prognostic markers for dening viral and bacterial infections used in modern diagnostic practice were discussed in our article. The possibility for using instrumental methods of a quality control of the performing studies in clinical diagnostics allows to increase the sensitivity and specicity of the analysis (more than 90 %) which may be compared with the results of molecular biological methods. The development of biotechnology is an important factor in the introduction of innovations in diagnostics. The accumulation of datas for species specicity of mycobacterial antigens or antibodies will allow to create the highly specic diagnostical test systems for immunological assay to assess the immune status and to increase the effectiveness of the methods of immunological monitoring.

Человечество поражает более 400 инфекций. По данным ВОЗ еже годно в мире от инфекционных болезней умирает 16 млн. человек. За последние десятилетия человечество столкнулось с десятком новых инфекционных заболеваний. В общей структуре заболеваний челове ка на инфекционные болезни приходится от 20 до 40 %.



Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.