авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 |

«RU 2 411 290 C2 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Получение антитела Антитела, либо моноклональные, либо поликлональные, можно получить к очищенному или частично очищенному белку или фрагменту пептида вируса ToTV множеством способов, известных специалистам в данной области, включая инъекцию белка в качестве антигена животным, слияние гибридомы и рекомбинантные способы, включающие бактериальные или фаговые системы (см. Marks et al, 1992a;

Marks et al., 45 1992b;

Lowman et al., 1991;

Lerner et al., 1992, где в каждой из этих ссылок описаны подходящие способы).

Антитела против вирусных частиц, белков или пептидов вируса можно получить иммунизацией подходящего хозяина-позвоночного, предпочтительно млекопитающего, например кроликов, коз, крыс, кур и мышей, частицами, белками или пептидами самостоятельно или в объединении с адъювантом. Обычно предусматривают две или более иммунизации, и кровь или селезенку собирают через несколько дней после последней инъекции. В случае поликлональной антисыворотки,.: RU 2 411 290 C иммуноглобулины можно осадить, выделить и (аффинно) очистить. В случае моноклональных антител, спленоциты обычно сливают с иммортализованным лимфоцитом, например миелоидной линией, в условиях для селекции гибридом. Затем гибридомы можно клонировать в условиях лимитирующих разведений и проводить скрининг их супернатантов по антителам, обладающим желаемой специфичностью.

Способы продукции (моноклональных) антител и способы их получения и применения в различных способах хорошо известны в литературе (см., например патенты США №№ 4381292, 4451570 и 4618577;

Harlow and Lane, 1988;

Ausubel et al., 1998;

Rose et al., 1997;

Coligan et al., 1997). Обычно антитело, направленное против связанного с вирусом белка, будет обладать аффинностью связывания по меньшей мере 110 5 1107 M 1.

Рекомбинантный белок, полученный из вируса ToTV, такой как может быть получен путем экспрессии кодирующей белок геномной последовательности вируса в подходящей экспрессирующей системе, является предпочтительным в качестве антигена. Однако можно использовать также очищенные белки. Антигены, подходящие для детекции антителами, включают в себя любой белок ToTV, который соединяется с любым специфическим к ToTV антителом млекопитающего, подвергавшегося воздействию вируса ToTV или инфицированного им.

Предпочтительные антигены по изобретению включают в себя антигены, вызывающие иммунный ответ у млекопитающих, подвергавшихся воздействию ToTV, которые, таким образом, как правило, наиболее легко узнают антитела млекопитающих. В частности, предпочтительные антигены включают в себя белки капсида ToTV. Наиболее предпочтительными являются структурные белки из очищенного вируса.

Способы клонирования геномных последовательностей в экспрессирующие векторы и из них для манипуляции с геномными последовательностями и для экспрессии белка, кодируемого геномной последовательностью в гетерологичном хозяине, хорошо известны, и эти способы можно использовать для получения экспрессирующих векторов, клеток-хозяев и клонированных геномных последовательностей, кодирующих антигены, где последовательности экспрессированы в хозяине для получения антител для применения в диагностических анализах (см., например, Sambrook et al., 2001 и Ausubel, et al., 1998).

Для получения антигенов ToTV можно использовать множество экспрессирующих систем. Например, описано множество экспрессирующих векторов, пригодных для получения белков в E.coli, B.subtilis, дрожжах, клетках насекомых, клетках растений и клетках млекопитающих, каждый из которых можно использовать для получения антигена ToTV, подходящего для получения анти-ToTV антитела или его фрагмента.

Разумеется, собственно ToTV также можно использовать в качестве экспрессирующего вектора для данной цели.

Одним из применений антител по изобретению является скрининг экспрессирующих библиотек кДНК для идентификации клонов, содержащих вставки кДНК, кодирующие представляющие интерес белки или структурно родственные, перекрестно иммунореактивные белки. Такие скрининги экспрессирующих библиотек кДНК хорошо известны в данной области (см., например, Young and Davis, 1983), ссылка на который приведена в данном контексте, так же как другие опубликованные источники. Другим применением этих антител является использование в аффинной хроматографии для очистки белков ToTV. Эти антитела также применимы для анализа инфекции ToTV.

.: RU 2 411 290 C Настоящее изобретение, таким образом, относится к ToTV-специфическому вирусному белку или его фрагменту, в дальнейшем в этом документе обозначенному белковой молекулой. Применимыми белковыми молекулами являются, например, производные от любой из геномных последовательностей или их фрагменты, которые можно получить из вируса по изобретению. Такие белковые молекулы или их антигенные фрагменты, как приведено в данном описании, применимы, например, в диагностических способах или наборах и в диагностических композициях. В частности, применимыми являются такие белковые молекулы, кодируемые фрагментами рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые идентифицированы как вызывающие образование специфических для вируса ToTV антител, либо in vivo (например, для получения диагностических антител), либо in vitro (например, с использованием технологии фагового дисплея или другого способа, применимого для получения синтетических антител или их частей).

Также в настоящем документе предусмотрены антитела, являются ли они природными поликлональными или моноклональными, или синтетическими антителами (например, полученными из (фаговой) библиотеки связывающимися молекулами), которые специфически реагируют с антигеном, содержащим белковую молекулу или ее специфический для вируса ToTV функциональный фрагмент, такой как белок капсида по изобретению.

Способы идентификации изолята вируса как вируса ToTV Помимо детекции вируса ToTV, которая включает в себя диагностические способы, настоящее изобретение также относится к способам идентификации, т.е.

подтверждения, что данный изолят является ToTV. Такие способы могут быть основаны на филогенетическом заключении, как описано выше, и определении уровня гомологии нуклеотидной или аминокислотной последовательности между неидентифицированным изолятом вируса и одним или несколькими контрольными штаммами подтвержденных вирусов ToTV и вирусов, не относящихся к ToTV. Такие способы могут, например, включать в себя секвенирование (части) генома изолята вируса или белка капсида и сравнение уровня гомологии данной последовательности с последовательностями, предоставленными здесь для ToTV. Изолят, обладающий более чем 50% гомологией последовательности с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, как представлено в данном описании, считают таксономически соответствующим ToTV или принадлежащим к таксону вируса ToTV. Такой вирус является частью настоящего изобретения.

Чтобы идентифицировать вирус как вирус томата торрадо (ToTV), можно также использовать таксономические признаки, как представлено в таблице 1 выше, и путем сравнения определить, что новый изолят принадлежит к предположительному новому роду, типичным видом которого можно принять штамм ToTV, идентифицируемый по предоставленным здесь последовательностям нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 и 2, и депонированный в немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур DSM 45 24 ноября 2004 под номером для ссылки депозитов ToTV-E01 (DSM 16999). Таким образом, не является необходимым проводить сравнение последовательности, чтобы определить то, что вирус является ToTV. Предпочтительнее, способ идентификации вируса как вируса томата торрадо (ToTV) может включать в себя стадии определения наличия сочетания таксономических признаков, выбранных из группы, состоящей из:

a) морфологических признаков, таких как сферические частицы вириона без внешней оболочки диаметром приблизительно 28 нм;

b) признаков свойств генома, таких как свойство вируса обладать одноцепочечной.: RU 2 411 290 C линейной положительной смысловой РНК на основе двух фрагментов РНК, содержащих поли(A)-хвосты, которые кодируют полибелки 5,5 и 8 кДа, соответственно, и содержат кодирующие области или мотивы для 3 белков капсида, геликазы, протеазы, RdRP и предположительного двигательного белка, где фрагменты РНК, и/или полибелки, и/или мотивы обладают гомологией, на основании сравнения последовательности, в основном, как описано в данном документе, и c) признаков биологических свойств, таких как продуцирование некротических повреждений и ожогоподобных симптомов у томата, обладание кругом хозяев, связью с переносчиком и/или географическим распределением в основном, как описано в данном документе, и наличие связи с заболеваниями растений томата, известными в пределах определенной местности под такими названиями, как Торрадо, Марчитец и/или шоколадная пятнистость.

Сочетанием таксономических признаков, приводящим к положительной идентификации изолята вируса как являющегося вирусом томата торрадо (ToTV), является такое сочетание, которое указывает на то, что изолят является более близко родственным (на основании многочисленных таксономических способов, хорошо известных специалисту в данной области) с ToTV, как описано в данном документе, чем с другими вирусами, и где указанный изолят предпочтительно вызывает у томата симптомы заболевания, типичные для торрадо, как описано в данном документе.

Таким образом, вирус, который, на основе многочисленных таксономических анализов таксономических признаков, в основном, определенных в таблице 1, является более близко родственным с вирусом, как определено в пункте 1 формулы изобретения в настоящем документе, чем с любым другим вирусом, известным ко времени подачи настоящей заявки, и который является вирусом, связанным с заболеванием, вызывающим некротические повреждения у томата, считают здесь являющимся ToTV и входящим в объем настоящего изобретения.

Таким образом, изобретение относится к изоляту вируса, который можно идентифицировать способом по изобретению как вирус растений, таксономически соответствующий вирусу, идентифицируемому как возможно принадлежащий к таксону вируса ToTV. В зависимости от филогенетического родства или своеобразия по отношению к другим вирусным таксонам таксон вируса ToTV может быть изолятом, видом, родом или даже семейством вируса.

Альтернативно, способы идентификации изолята вируса как вируса ToTV могут быть основаны на симптоматологии, т.е. идентификации вируса по связанным с ним симптомам заболевания.

Однако в предпочтительном варианте осуществления в качестве способа идентификации изолята вируса как вируса ToTV применяют антитела по изобретению при условии, что эффективно исключают перекрестную реактивность таких антител для родственных не относящихся к ToTV штаммам. Такие способы включают в себя стадию реакции указанного вирусного изолята или его компонента с антителом, как 45 предусмотрено в данном описании. Реакцией в данном документе называют обеспечение возможности связывания антитело-антиген. Это можно осуществить, например, с использованием очищенного или неочищенного вируса ToTV или его частей (белков, пептидов). Предпочтительно, инфицированные клетки или культуры клеток используют для идентификации вирусных антигенов с применением любого подходящего иммунологического способа. Особенно полезными в этом отношении являются антитела, индуцированные против белков капсида вируса ToTV.

Другие предпочтительные способы идентификации изолята вируса как вируса ToTV.: RU 2 411 290 C включают в себя реакцию указанного изолята вируса или его компонента со специфическим для вируса полинуклеотидом по изобретению, где полинуклеотид способен гибридизоваться в строгих условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, последовательностей, обладающих по меньшей мере 60% гомологией нуклеотидной последовательности с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, комплементарных им цепей и их ToTV-специфических фрагментов. Такую реакцию гибридизации можно проводить в любом формате, доступном специалисту в данной области, и она, как правило, включает в себя получение отпечатков тканей, способы дот-блоттинга, Саузерн/Нозерн-блоттинг или гибридизацию, гибридизацию in situ, PCR, RT-PCR и т.п.

Иммунологические способы детекции Способы по изобретению, которыми выявляют антигены, можно, в принципе, осуществлять с использованием любого иммунологического способа, такого как, например, классическая иммунофлуоресценция (IF), иммуногистохимические способы или сравнимые форматы анализа для детекции антигена. Предпочтительные способы детекции ToTV, основанные на детекции белка вирусной оболочки, могут, например, включать в себя такие способы, как тесты преципитации и агглютинации, радиоиммуноанализ (RIA), иммунологический метод мечения золотом, иммуносорбционную электронную микроскопию (ISEM), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг и иммуноблоттинг. Примерами типов иммунологических анализов, в которых можно использовать антитела по изобретению, являются конкурентный и не конкурентный иммунологические анализы либо в прямом, либо в непрямом формате. Антитела можно использовать в иммунологических анализах в жидкой фазе или связанными с твердофазным носителем. Кроме того, антитела в данных иммунологических анализах можно различными способами метить детектируемой меткой. Специалистам в данной области известны или легко понятны без излишних экспериментов подходящие форматы иммунологических анализов. Форматы анализов хорошо известны в литературе и описаны, например, у Harlow and Lane (1988).

Множество форматов иммунологического анализа можно использовать для отбора антител, специфически реагирующих с конкретным полипептидом по изобретению, таким как белки оболочки вируса ToTV. Например, для данной цели обычно используют твердофазные иммунологические анализы ELISA. См. описание форматов иммунологического анализа и условия, которые можно использовать для определения избирательного связывания, у Harlow and Lane (1988).

Антитела можно связывать со многими различными носителями и использовать для детекции присутствия молекул-мишеней. Альтернативно, антигены можно связывать со многими различными носителями и использовать для детекции присутствия антитела. Примеры хорошо известных носителей включают в себя стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и 45 модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Для целей настоящего изобретения носитель по своей природе может быть либо растворимым, либо нерастворимым. Специалистам в данной области известны другие подходящие носители для связывания антител, или они способны определить такие носители с использованием общепринятых экспериментов.

Анализы вестерн-блоттингом в общих чертах описаны у Harlow and Lane (1988). По данному способу вирусные белки (и другие белки в препарате вируса) разделяют гель электрофорезом и переносят на твердую фазу (т.е. мембрану, такую как.: RU 2 411 290 C нитроцеллюлоза). Последовательно проводят реакцию иммобилизованного антигена с антителом и системой детекции (например, конъюгированным со щелочной фосфатазой вторичным антителом). Как будет очевидно специалисту в данной области, предпочтительным будет включение в анализ соответствующих материалов для отрицательного и положительного контроля (таких как в основном очищенный антиген или вирус ToTV).

Твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) в общих чертах описаны у Harlow and Lane (1988). Анализ включает в себя реакцию вирусного компонента (например, белка капсида) с антителом. В одном из вариантов осуществления образец может содержать ткань растения, которую перемалывают и проводят ее реакцию с антителом, которым покрыта твердая фаза, такая как планшет для тестирования.

Если в образце присутствует вирус, меченное ферментом специфическое антитело будет связываться с комплексом антитело-вирус, и это можно выявлять реакцией фермента с субстратом с получением цветной реакции. Предпочтительными способами анализов ELISA являются ELISA с прямым сэндвичем с двойным антителом (DAS) (Clark and Adams, 1977), непрямой ELISA с DAS (Vela et al 1986) или TAS-ELISA. Специалистам в данной области будет очевидно, что иногда в ELISA или любом другом типе анализа будет желательным определение присутствия более одного белка вирусного капсида в одной реакционной смеси, например, путем смешивания двух или более антител с различными специфичностями и анализа любого или всех вместе связанных с защитным капсидом белков по изобретению.

Способы детекции на основе нуклеиновой кислоты ToTV состоит по меньшей мере из двух рибонуклеиновых кислот (РНК).

Существуют серьезные указания на присутствие трех белков защитного капсида.

Способы, описанные выше, направлены на иммунологическую детекцию вирусных белков для детекции вируса. Способом рекомбинантной ДНК можно получать зонды, напрямую или опосредованно гибридизующиеся с вирусными РНК (или комплементарными им) или с кДНК, полученными с них обратной транскрипцией, которые можно использовать в анализах для детекции вируса. Способы амплификации нуклеиновой кислоты позволяют амплификацию фрагментов вирусных нуклеиновых кислот, которые могут присутствовать в очень малых количествах.

Чтобы разработать способы детекции на основе нуклеиновой кислоты, необходимо определить специфические для вируса последовательности, для которых можно затем разработать праймеры или зонды. Для детекции ToTV посредством амплификации и/или гибридизации с зондом нуклеиновой кислоты белок капсида ToTV можно секвенировать или, альтернативно, можно выделить вирусную геномную РНК из очищенного вируса, провести обратную транскрипцию в кДНК и напрямую клонировать и/или секвенировать. Либо с использованием клонированной нуклеиновой кислоты в качестве зонда для гибридизации, либо с использованием информации о последовательности, полученной из клона, или путем конструирования 45 вырожденных праймеров на основании аминокислотной последовательности белка ToTV можно сконструировать зонды для гибридизации нуклеиновой кислоты и/или праймеры для амплификации нуклеиновой кислоты и использовать в анализе детекции для детекции присутствия вируса в образце, как определено в данном описании.

Способы по изобретению, которыми выявляют нуклеиновые кислоты, можно, в принципе, осуществлять с использованием любого способа амплификации нуклеиновой кислоты, такого как полимеразная цепная реакция (PCR;

Mullis and.: RU 2 411 290 C Faloona, 1987;

патенты США №№ 4683195;

4683202 и 4800159), или с использованием таких реакций амплификации, как лигазная цепная реакция (LCR;

Barany, 1991;

EP 0320308), самоподдерживающаяся репликация последовательности (3SR;

Guatelli et al., 1990), амплификация с замещением цепей (SDA;

Walker et al., 1992;

патенты США №№ 5270184 и 5455166), система транскрипционной амплификации (TAS;

Kwoh et al., 1989), с использованием Q-бета репликазы (Lizardi et al., 1988), амплификации по типу катящегося кольца (RCA;

патент США № 5871921), амплификации на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA;

Compton, 1991), полиморфизма длины фрагментов расщепления клевазой (патент США № 5719028), изотермической и инициируемой химерным праймером амплификации нуклеиновой кислоты (ICAN), способа амплификации с разветвленным удлинением (RAM;

патенты США №№ 5719028 и 5942391) или других подходящих способов амплификации нуклеиновых кислот.

Поскольку вирус является РНК-вирусом (т.е. последовательности на Фиг.5 и являются ДНК-эквивалентами вирусного РНК-генома), подходящий способ детекции может включать в себя выделение вирусных нуклеиновых кислот из образца, например из инфицированного растения, с использованием способов, известных по существу специалисту в данной области (например, Chomczynski and Sacchi, 1987;

Boom et al., 1990) или коммерчески доступных систем (например, набор для выделения общей РНК RNeasy или набор для выделения РНК растений RNeasy plant от QIAGEN GmbH, Hilden, Germany, или High-Pure-RNA-Isolation-Kit® (Roche Diagnostics, отделение F.

Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland).

Тотальную РНК можно, например, выделить из материала листа или протопластов клеток растений, и тотальную РНК, или конкретно вирусную геномную РНК, или ее часть, можно затем подвергать обратной транскрипции в кДНК с использованием, например, обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (AMV) или обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (M-MuLV). Подходящий способ может, например, включать в себя смешивание в подходящей водной буферной системе (например, в коммерчески доступном буфере для RT) подходящего количества тотальных РНК (например, 1-5 мкг), подходящего количества (например, 10 пмоль) праймера для обратной транскрипции, подходящего количества dNTP и обратной транскриптазы, денатурацию нуклеиновых кислот кипячением в течение 1 минуты и охлаждением их на льду с последующей обратной транскрипцией, например, при 45°C в течение 1 часа, как рекомендовано для конкретной используемой обратной транскриптазы, для получения кДНК-копий вирусных последовательностей.

В качестве праймера для обратной транскрипции можно использовать полинуклеотид по настоящему изобретению, например 18-26-мерный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную геномной последовательности ToTV, или предпочтительно, по меньшей мере способную гибридизоваться в строгих условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ 45 ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или ее ToTV-специфический фрагмент. Альтернативно, можно использовать неспецифический полиT-праймер (олигоdT-праймер), чтобы начинать обратную транскрипцию с мотивов поли-A РНК.

После RT-стадии полученную кДНК можно амплифицировать с помощью PCR, используя, например, ДНК-полимеразы Pfu и Taq и праймеры для амплификации, специфические для последовательностей вирусной геномной кДНК. Для RT-PCR можно использовать также полные коммерчески доступные системы (например, системы для RT-PCR Access и AccessQuick™ от Promega [Madison WI, USA], или система.: RU 2 411 290 C для RT-PCR в одной пробирке Titan™, или системы для двухступенчатой RT-PCR, поставляемые Roche Diagnostics [отделение F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland]).

Чтобы амплифицировать нуклеиновую кислоту с небольшим количеством несовпадений с одним или несколькими праймерами для амплификации, реакцию амплификации можно проводить в условиях пониженной строгости (например, амплификация PCR с использованием температуры отжига 38°C или в присутствии 3, мМ MgCl2). Специалист в данной области будет способен выбрать условия подходящей строгости.

Праймеры в данном описании выбирают «в основном» комплементарными (т.е. по меньшей мере на 65%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% точно комплементарными) их областям-мишеням, присутствующим на различных цепях каждой конкретной последовательности, подлежащей амплификации. Можно использовать последовательности праймеров, содержащие, например, остатки инозита или неопределенные основания, или даже праймеры, содержащие одно или несколько несовпадений по сравнению с последовательностью-мишенью. Как правило, последовательности, обладающие по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 80% гомологией с олигонуклеотидными последовательностями мишенями ДНК или РНК, считают подходящими для использования в способе по настоящему изобретению. Несовпадения последовательности также не являются критическими при использовании условий гибридизации низкой строгости.

Детекцию продуктов амплификации можно, в принципе, осуществлять любым подходящим способом, известным в данной области. Амплифицированные фрагменты можно окрашивать напрямую или метить радиоактивными метками, антителами, люминесцентными красителями, флуоресцентными красителями или ферментативными реагентами. Прямые красители для ДНК включают в себя, например, интеркалирующие красители, такие как красители акридин оранжевый, бромид этидия, моноазид этидия или краситель Хехста.

Альтернативно, фрагменты ДНК или РНК можно выявлять посредством включения меченых оснований dNTP в синтезированные фрагменты. Метки для детекции, которые могут быть связанными с нуклеотидными основаниями, включают в себя, например, флуоресцеин, краситель цианин, дигоксигенин (DIG) или бромдезоксиуридин (BrdUrd).

При использовании систем детекции, основанных на зондах, подходящий способ детекции для применения по настоящему изобретению может, например, включать в себя формат ферментного иммунологического анализа (EIA) (Jacobs et al., 1997). Для осуществления детекции способом процедуры EIA либо прямой, либо обратный праймер, используемый в реакции амплификации, может содержать группу для захвата, такую как группа биотина для иммобилизации ампликонов PCR ДНК мишени, например, на покрытых стрептавидином лунках планшета для микротитрования или на покрытых стрептавидином Dynabeads® (Dynal Biotech, Oslo, Norway) для последующей детекции EIA ампликонов ДНК-мишени. Специалисту в данной области понятно, что для иммобилизации ампликонов ДНК-мишени в формате EIA можно использовать другие группы.

Зонды, применимые для детекции последовательностей нуклеиновой кислоты мишени, как описано в данном документе, предпочтительно связывают только по меньшей мере часть области последовательности нуклеиновой кислоты, амплифицированной способом амплификации нуклеиновой кислоты. Специалисты в данной области без излишних экспериментов могут получить подходящие зонды для.: RU 2 411 290 C детекции на основе нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, как описано в данном документе. Также в качестве типоспецифических зондов для детекции в способе по изобретению, соответственно, можно использовать комплементарные нуклеиновой кислоте-мишени нуклеотидные последовательности, либо ДНК, либо РНК, либо химически синтезированные аналоги, при условии, что такую комплементарную цепь амплифицируют в используемой реакции амплификации.

Подходящие способы детекции для применения в данном изобретении могут, например, включать в себя иммобилизацию ампликонов и гибридизацию с зондами последовательностей их нуклеиновой кислоты, например, посредством нозерн- и Саузерн-блоттинга. Другие форматы могут включать в себя формат EIA, как описано выше. Для облегчения детекции связывания специфические зонды для детекции ампликона могут содержать группу метки, такую как флуорофор, хромофор, фермент или радиоактивная метка, так чтобы облегчать мониторинг связывания зондов с продуктом реакции амплификации. Такие метки хорошо известны специалистам в данной области и включают в себя, например, изотиоцианат флуоресцеина (FITC), галактозидазу, пероксидазу хрена, стрептавидин, биотин, дигоксигенин, 35S, 14C, 32P или 125I. Другие примеры будут очевидны специалистам в данной области.

Детекцию можно проводить также путем так называемого анализа блота с перевернутыми дорожками (RLB), такого как, например, описанный Van den Brule et al. (2002). Для данной цели зонды для RLB предпочтительно синтезируют с 5' аминогруппой для последующей иммобилизации, например, на покрытых карбоксилом нейлоновых мембранах. Преимуществами формата RLB являются простота системы и ее скорость, что, таким образом, позволяет более высокую производительность обработки образцов.

Использование нуклеиновокислотных зондов для детекции фрагментов РНК или ДНК хорошо известно в данной области. Большинство данных способов включают в себя гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с зондом с последующими отмывками после гибридизации. Специфичность, как правило, является функцией отмывок после гибридизации, где критическими факторами являются ионная сила и температура конечного раствора для отмывки. Для гибридов нуклеиновой кислоты Tm можно приближенно вывести из уравнения Meinkoth-Wahl (1984): Tm=81,5°C+16, (log M)+0,41(%GC)-0,61 (%form)-500/L, где M представляет собой молярность моновалентных катионов, %GC представляет собой процент нуклеотидов гуанозина и цитозина в нуклеиновой кислоте, %form представляет собой процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и L представляет собой длину гибрида в парах оснований. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с полностью совпадающим зондом. Tm уменьшают приблизительно на 1°C для каждого 1% несоответствия;

таким образом, условия гибридизации и/или отмывки можно регулировать для гибридизации с последовательностями желаемой идентичности. Например, при поиске последовательностей с идентичностью 90% Tm можно увеличить на 10°C. Как правило, строгие условия выбирают приблизительно на 5°C ниже температурной точки плавления (Tm) для конкретной последовательности и комплементарной ей при определенной ионной силе и pH.

Однако для чрезвычайно строгих условий можно использовать гибридизацию и/или отмывку на 1, 2, 3 или 4°C ниже температурной точки плавления (Tm);

для умеренно строгих условий можно использовать гибридизацию и/или отмывку на 6, 7, 8, 9 или 10°C ниже температурной точки плавления (Tm);

для условий с низкой строгостью.: RU 2 411 290 C можно использовать гибридизацию и/или отмывку на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°C ниже температурной точки плавления (Tm). Обычному специалисту в данной области будет понятно, что с использованием уравнения, составов для гибридизации и отмывки и желаемой Tm по существу описывают варианты строгости гибридизации и/или растворов для отмывки. Если желаемая степень несоответствия приводит к Tm менее чем 45°C (раствор в воде) или 32°C (раствор в формамиде), предпочтительным является увеличение концентрации SSC, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот представлено в Tijssen, 1993;

Ausubel et al., 1998.

В другом аспекте изобретение относится к олигонуклеотидным зондам для детекции РНК или кДНК ToTV. Зонды для детекции здесь выбирают как «в основном»

комплементарные одноцепочечной молекуле РНК или одной из цепей двухцепочечных нуклеиновых кислот, полученных посредством реакции амплификации по изобретению. Предпочтительно, зонды являются в основном комплементарными, не обязательно, иммобилизованным (например, меченным биотином) антисмысловым цепям ампликонов, полученных с мишени РНК или ДНК.

Для зондов для детекции по настоящему изобретению допустимо содержать одно или несколько несоответствий их последовательности-мишени. Как правило, последовательности, обладающие по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 80% гомологией с олигонуклеотидными последовательностями мишенями, считают подходящими для использования в способе по настоящему изобретению.

Устойчивые к ToTV растения Кроме того, изобретение относится к способу идентификации устойчивого к ToTV растения или его части. Существуют различные возможности идентифицировать устойчивые к ToTV растения. В первом наборе вариантов осуществления такого способа можно применять активный/инфекционный вирус или полноразмерные инфекционные клоны, тогда как в альтернативном варианте осуществления используют только средства для детекции вируса.

Первая стадия способа идентификации устойчивого к ToTV растения с использованием активного/инфекционного вируса включает в себя воздействие на растение или часть растения, такую как фрагмент листа или стебля, инфекционной дозы ToTV, целью чего является достичь инфекции. Воздействие во многих случаях включает в себя установление физического контакта. Инфекционная доза может различаться между растениями и между тестируемыми изолятами ToTV. Теоретически, количество от приблизительно 1-10 до приблизительно 500-5000 вирусных частиц указанного вируса или его нуклеиновых кислот будет являться достаточным.

Инфекции, таким образом, можно достигать механической инокуляцией очищенных частиц вируса или нуклеиновой кислоты вируса в здоровые растения.

Альтернативно, инфекции можно достигать, например:

45 - выращиванием здорового черенка на зараженном ToTV корневище или наоборот;

- воздействием на здоровое растение переносчиков, содержащих вирус (включая инфицированные растения, например растения-паразиты, подобные видам Cuscuta);

- введением в здоровое растение экспрессирующего вектора, несущего кодирующую область генома вируса ToTV;

- применением агроинфекционных клонов, таких как штаммы Agrobacterium tumefaciens, содержащих экспрессирующий вектор, несущий кодирующую область генома вируса ToTV.

.: RU 2 411 290 C В контексте настоящего изобретения способы воздействия на растение или часть растения инфекционной дозы ToTV не являются ограниченными каким-либо конкретным способом.

Как указано, инфекция может включать в себя механическую инокуляцию вируса в здоровые растения. Например, часть пораженного заболеванием листа можно втереть непосредственно в лист подлежащего инфицированию растения. По альтернативному способу инокулят можно получить, например, перемалыванием содержащей вирус ткани растения, предпочтительно молодых листьев с выраженными симптомами, с помощью ступки и пестика, или любого другого типа гомогенизатора, например, в буфере, пригодном для инокуляции (например 0,03 M фосфатный буфер, pH 7,7). После перемалывания полученный гомогенат (сок) предпочтительно фильтруют, например, через суровую марлю. Затем сок можно инокулировать, например, путем осторожного приведения листьев в контакт с каким-либо количеством сока. Листья предпочтительно предварительно обрабатывают, чтобы разрушить нижний эпидермис и усилить проникновение вируса. Этого можно достигать, например, предварительным припудриванием листьев порошком карбида кремния.

Предпочтительно избегают избыточного повреждения. Предпочтительно используют порошок карбида кремния, обладающий микроскопически малыми частицами карбида кремния угловатой формы (400-500 меш). Порошок карбида кремния можно также добавлять непосредственно в сок, в этом случае предварительную обработку исключают. Сок можно наносить, например, указательным пальцем, тампоном из пропитанного соком пенопласта или ткани или даже пестиком, используемым для перемалывания, стеклянным шпателем, жесткой кистью или пульверизатором. После инокуляции листья предпочтительно немедленно промывают водой.

Вторая стадия способа идентификации устойчивого к ToTV растения включает в себя идентификацию указанного растения как устойчивого к ToTV растения, когда, после указанного воздействия, или i) симптомы заболевания в указанном растении или части растения остаются отсутствующими, или их проявление задержано, или по меньшей мере тяжесть уменьшена, или они являются локализованными по сравнению с восприимчивым и/или чувствительным контрольным растением, и/или ii) вирус ToTV или геномные последовательности ToTV не присутствуют в указанном растении или части растения, или присутствие вируса ToTV является по меньшей мере уменьшенным количественно по сравнению с чувствительным контрольным растением. Как используется в данном описании, термин локализованный означает ограниченный инокулированным листом.

Определение развития симптомов индуцированного ToTV заболевания в инфицированных растениях можно осуществлять количественными способами, например, где отмечают период, необходимый для развития явных (например, видимых) симптомов заболевания, или количественными способами, где после прекращения определенного периода растение проверяют на проявление симптомов и 45 отмечают присутствие или тяжесть симптомов.

В дополнение к определению развития индуцированных ToTV-симптомов заболевания или в качестве альтернативы ему, в зависимости от подлежащего детекции типа устойчивости к ToTV, выявляют присутствие вируса в растении или части растения. Для детекции отсутствия вируса в тестируемых растениях, в принципе, можно использовать любой способ. Например, можно применять способ, в котором используют специфическое для ToTV антитело, набор праймеров или зонд по настоящему изобретению. Альтернативно, часть тестируемого растения можно.: RU 2 411 290 C приводить в контакт с чувствительным индикаторным растением (например, N.hesperis '67A') для определения, присутствует или отсутствует вирус в тестируемом растении. Специалисту в данной области понятно, что для таких способов является важным дезинфицировать поверхность тестируемого растения, чтобы провести различие между переносчиком, толерантным тестируемым растением и устойчивым тестируемым растением, поскольку необходимо показать только присутствие вируса в клетках растения.

При проведении второй стадии способа идентификации устойчивого к ToTV растения можно получить следующие результаты. Если после успешной инокуляции (например, после осуществления контакта растения с вирусом в условиях, приводящих к инфекции в восприимчивом и чувствительном контрольном растении):

i) симптомы заболевания остаются отсутствующими;

или вирусные частицы, или вирусная РНК не поддаются выявлению: растение является устойчивым;

ii) проявление симптомов заболевания задержано, или их тяжесть уменьшена;

или можно выявить низкие системные титры вирусных частиц или вирусной РНК: растение является частично устойчивым;

iii) симптомы заболевания являются тяжелыми, но остаются локализованными, ограниченными инокулированным листом и не распространяются системно за пределы инокулированной ткани;

или вирусные частицы, или вирусную РНК можно детектировать только локализованно: растение является гиперчувствительным;

iv) если симптомы заболевания остаются отсутствующими и можно детектировать вирусные частицы, или вирусную РНК: растение является толерантным.

v) если у растения развиваются симптомы заболевания и оно обладает высокими системными титрами вируса, тогда растение является восприимчивым и чувствительным. Примерами таких растений являются растения, из которых выделен вирус по настоящему изобретению. Эти растения могут служить подходящими контрольными растениями в способах по настоящему изобретению.

Для целей получения устойчивых растений и с точки зрения фитосанитарии только исходы i), ii) и iii) можно считать представляющими интерес. Для целей получения растений, пригодных для получения бессимптомного урожая и продуктов, исход iv) может представлять также конкретный коммерческий интерес.

В альтернативном варианте осуществления способа для идентификации устойчивого к ToTV растения используют только средства для детекции вируса.

Например, устойчивое к ToTV растение можно идентифицировать в полевых условиях посредством обнаружения или идентификации бессимптомного растения среди обладающих симптомами растений и определения отсутствия вируса в указанном растении любым из способов детекции вируса по настоящему изобретению.

Фактически, это соответствует способу идентификации устойчивого к ToTV растения, где стадию a) воздействия на растение или часть растения инфекционной дозы ToTV проводят пассивно (например, естественным образом). При осуществлении такого 45 способа предпочтительно использовать способ детекции присутствия ToTV в образце по настоящему изобретению, где присутствие вируса ToTV или его компонента демонстрируют посредством реакции указанного образца с полинуклеотидом или антителом по настоящему изобретению. Предпочтительно, для способа идентификации устойчивого к ToTV растения необходимо использование либо вируса по настоящему изобретению, либо полинуклеотида или антитела по настоящему изобретению.

Кроме того, изобретение относится к способу получения устойчивого к ToTV.: RU 2 411 290 C растения или его части. После идентификации устойчивого к ToTV растения это растение может служить донорным растением для генетического материала, который можно переносить от указанного донорного растения к реципиентному растению, чтобы обеспечить указанное реципиентное растение генетическим материалом.

Перенос генетического материала от донорного растения к реципиентному растению можно осуществлять любым подходящим способом, известным в данной области.

Генетический материал в большинстве случаев будет геномным материалом. Однако является важным переносить по меньшей мере одну сообщающую устойчивость часть генома донорного растения. В отсутствие способов определения, какие части генома донорного растения сообщают устойчивость к ToTV, перенос можно осуществлять, соответственно, посредством переноса целых хромосом. Предпочтительно, устойчивое к ToTV растение служит мужским или женским родителем в скрещивании для получения устойчивых растений-потомков, таким образом, растение-потомок получает геномный материал от устойчивого донора и действует как реципиентное растение. Хотя чувствительный родитель при скрещивании не обязательно является реципиентным растением в буквальном смысле, такой чувствительный родитель здесь также включен в термин реципиентное растение.

В способе получения устойчивого к ToTV растения можно также использовать слияние протопластов для переноса сообщающего устойчивость геномного материала от донорного растения к реципиентному растению, т.е. в качестве способа скрещивания указанных растений. Слияние протопластов является индуцированным или спонтанным объединением, таким как соматическая гибридизация, между двумя или более протопластами (клетками, клеточные стенки которых удалены ферментативной обработкой) для получения одной би- или многоядерной клетки.

Слитая клетка, которую можно получить даже из видов растений, которые не могут скрещиваться в природе, представляет собой ткань, культивируемую до гибридного растения, обладающего желаемым сочетанием признаков. Более конкретно, первый протопласт можно получить из растения томата или другой линии растений, обладающей устойчивостью к инфекции ToTV. Например, можно использовать протопласт из устойчивой к ToTV линии (томата, баклажана, перца, дыни, арбуза или огурца). Второй протопласт можно получить из второй, чувствительной, линии растений, не обязательно, из других видов растений или вариетета, предпочтительно, из тех же самых видов растений или вариетета, обладающих коммерчески желательными характеристиками, такими как, без ограничения, устойчивость к заболеванию, устойчивость к насекомым, различные характеристики плодов и т.д.

Затем протопласты сливают с использованием общепринятых способов слияния протопластов, известных в данной области для получения скрещивания.

Альтернативно, можно использовать спасение эмбриона для переноса сообщающего устойчивость геномного материала от донорного растения реципиентному растению, т.е. как способ скрещивания указанных растений. Спасение 45 эмбриона можно использовать как способ выделения эмбрионов из потомков скрещивания, когда растения неспособны производить жизнеспособные семена. По данному способу оплодотворенную завязь или незрелое семя растения культивируют для получения новых растений (этот способ подробно описан в Pierik, 1999).

Таким образом, способ получения устойчивого к ToTV растения в одном из вариантов осуществления включает в себя стадии идентификации устойчивого к ToTV донорного растения, как описано здесь выше, и скрещивания указанного устойчивого к ToTV донорного растения с реципиентным растением, как описано выше, таким.: RU 2 411 290 C образом, получая растения-потомки.

Способ получения устойчивого к ToTV растения дополнительно включает в себя стадию отбора из растений-потомков устойчивого растения способом идентификации устойчивого к ToTV растения, как описано ранее.

Предпочтительно, указанное устойчивое к ToTV донорное растение представляет собой растение семейства Solanaceae или Cucurbitaceae, даже более предпочтительно томат, баклажан, перец, дыню, арбуз или огурец.

Предпочтительно, указанное реципиентное растение представляет собой растение семейства Solanaceae или Cucurbitaceae, даже более предпочтительно томат, баклажан, перец, дыню, арбуз или огурец. Еще более предпочтительно, указанное реципиентное растение представляет собой томат видов Solanum lycopersicum, более предпочтительно растение S.lycopersicum, обладающее коммерчески желательными характеристиками. Реципиентное растение может быть восприимчивым к ToTV растением, чувствительным к ToTV растением или устойчивым к ToTV реципиентным растением. Как объясняется выше, выбор растения будет в первую очередь определяться тем, является ли признак устойчивости доминантным или рецессивным.

Специалист в данной области будет сознавать, что различные способы доступны для решения таких задач.

Также аспектом по настоящему изобретению является устойчивое к ToTV растение, или его часть, которые можно получить способом по изобретению.

Как указано, предпочтительный вариант осуществления способа для получения устойчивого к ToTV растения включает в себя перенос посредством интрогрессии указанной сообщающей устойчивость последовательности нуклеиновой кислоты от устойчивого к ToTV донорного растения к реципиентному растению путем скрещивания указанных растений. В устойчивых растениях, полученных по данному предпочтительному варианту осуществления, большинство признаков успешно могут происходить из реципиентного растения, а устойчивость к ToTV - происходить из донорного растения.

В одном из способов, который обозначается как племенное разведение, донорное растение, обладающее устойчивостью к ToTV, скрещивают с реципиентным растением, предпочтительно обладающим коммерчески желательными характеристиками, такими как, без ограничения, устойчивость к заболеванию, устойчивость к насекомым, полезные характеристики плодов, и т.д. Полученную популяцию растений (представляющих собой гибриды F1) затем подвергают самоопылению и обеспечивают возможность образования семян (семена F2). Затем растения F2, выращенные из семян F2, скринируют по устойчивости к ToTV.

Проводить скрининг популяции можно рядом различных способов, предпочтительно способом визуального контроля по настоящему изобретению.

Поскольку идентификация устойчивых к ToTV растений первоначально стала возможной только по настоящему изобретению, способ получения устойчивого растения является аспектом изобретения. Также аспектом настоящего изобретения является устойчивое к ToTV растение или его часть, которую можно получить способом по изобретению.

Настоящее изобретение относится к способам предотвращения распространения инфекции ToTV в растениях томата путем получения устойчивых растений томата, так же как путем уничтожения растений, несущих вирус ToTV. Данные меры могут составлять часть общей стратегии улучшения фитосанитарной профилактики по отношению к вирусу ToTV. Таким образом, можно идентифицировать и уничтожать.: RU 2 411 290 C толерантные растения, чтобы уничтожить такие источники вируса ToTV.

В одном из вариантов осуществления способа получения устойчивого к ToTV растения или его части, настоящее изобретение относится к способу получения толерантного к ToTV растения. Из толерантного растения можно получать полноценный урожай, плоды и семена, поскольку, хотя растение может быть носителем вируса, для него не обнаруживают симптомов заболевания. Такой способ будет включать в себя идентификацию толерантных растений и использование таких толерантных растений в качестве источников или доноров желательного генетического материала. Целью является не получение растения, способного сопротивляться проникновению или размножению вируса в клетках, а получение растения, которое не страдает от симптомов.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу идентификации устойчивого к ToTV растения, включающему стадии: a) воздействия на растение или часть растения инфекционной дозы ToTV, и b) идентификации указанного растения как толерантного к ToTV растения, когда после указанного воздействия симптомы заболевания в указанном растении или части растения остаются отсутствующими, а ToTV присутствует в указанном растении или части растения.

Определение развития симптомов индуцированного ToTV заболевания в инфицированных растениях можно осуществлять количественными способами, например, где отмечают период, необходимый для развития явных (например, видимых) симптомов заболевания, или количественными способами, где после прекращения определенного периода растение проверяют на отсутствие проявления симптомов или отмечают уменьшение тяжести симптомов.

В предпочтительном варианте осуществления присутствие ToTV в указанном растении или части растения определяют на стадии b) способом, включающим определение в указанном растении или части растения присутствия вируса ToTV или его компонентов с помощью реакции указанного растения или части растения с полинуклеотидом по изобретению или антителом по изобретению.

Диагностические наборы Способы и средства, предоставленные в данном описании, являются, в частности, применимыми в диагностическом наборе для диагностики инфекции вируса ToTV посредством вирусологического диагноза. Такие наборы или анализы могут, например, содержать вирус, нуклеиновую кислоту, белковую молекулу или ее фрагмент и/или антитело по изобретению.

Изобретение относится также к диагностическому набору для диагностики инфекции ToTV, содержащему вирус ToTV, специфическую для вируса ToTV нуклеиновую кислоту, белковую молекулу или ее фрагмент и/или антитело по изобретению, и предпочтительно, средства для детекции указанного вируса ToTV, специфической для вируса ToTV нуклеиновой кислоты, белковой молекулы или ее фрагмента и/или антитела, где указанные средства, например, включают в себя 45 возбуждаемую группу, такую как флуорофор, или ферментативную систему детекции, применяемую в данной области (примеры подходящих форматов диагностических наборов включают IF, ELISA, анализ нейтрализации, анализ RT-PCR, анализы гибридизации). Подходящие анализы для детекции включают прямые и непрямые анализы, сэндвич-анализы, твердофазные анализы, такие как, среди прочих, анализы с использованием планшетов или гранул, и анализы в жидкой фазе. Подходящие анализы включают анализы с использованием первичных и вторичных антител и анализы с использованием связывающих антитело реагентов, таких как белок A.


.: RU 2 411 290 C Более того, по изобретению можно использовать множество способов детекции, включая колориметрический, флуоресцентный, фосфоресцентный, хемилюминесцентный, люминесцентный и радиоактивный способы.

Чтобы определить, можно ли компонент еще не идентифицированного вируса или его синтетический аналог, такой как нуклеиновая кислота, белковая молекула или ее фрагмент, идентифицировать как специфический для вируса ToTV, достаточно анализировать последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты указанного компонента, например фрагмент указанной нуклеиновой кислоты или аминокислоты, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 40 нуклеотидов или аминокислот (соответственно), путем сравнения последовательности с предоставленными последовательностями вируса ToTV и с известными последовательностями, не относящимися к вирусу ToTV (предпочтительно используют ближайшие филогенетические родственники ToTV), с использованием, например, филогенетических анализов, как предусмотрено в данном описании. В зависимости от степени родства с указанными вирусными последовательностями ToTV или не относящимися к ToTV, можно идентифицировать компонент или синтетический аналог.

Набор для детекции вируса ToTV может, в зависимости от формата анализа, содержать одно или несколько антител, специфических для белка, предпочтительно специфических по меньшей мере для одного белка капсида ToTV, и предпочтительно также содержать в основном очищенный белок ToTV или антиидиотипическое антитело для использования в качестве положительного контроля.

Противовирусные средства Изобретение относится также к способам получения противовирусного средства, применимого для лечения инфекции ToTV у растений, включающим получение культуры клеток или экспериментального растения, содержащего вирус по изобретению, обработку указанной культуры или растения потенциальным противовирусным средством и определение эффекта указанного средства на указанный вирус или его инфекцию указанной культуры или растения. Примеры такого противовирусного средства включают в себя нейтрализующее ToTV антитело или его функциональный компонент, как предусмотрено в данном описании, однако можно получать также противовирусные средства другой природы.

Существуют различные противовирусные средства, применимые для растений, такие как химические продукты, бактерии, грибы, насекомые и вирусы. Большинство из них связано с системной приобретенной устойчивостью (SAR). Настоящее изобретение относится к применению генома ToTV или его части в качестве индуктора системной приобретенной устойчивости у растения. Системная приобретенная устойчивость может быть направленной против ToTV или против других заболеваний.

По данному аспекту ToTV, его геном или его сообщающие устойчивость части можно 45 применять в качестве противовирусного агента.

Изобретение относится также к применению противовирусного средства по изобретению для получения композиции для лечения, в частности для лечения инфекции ToTV у растений, и относится к фармацевтической композиции, содержащей противовирусное средство по изобретению, применимой в способе лечения или предупреждения инфекции вирусом ToTV, где указанный способ включает введение такой композиции для лечения в отдельное растение.

Изобретение также относится к растительной модели, применимой для.: RU 2 411 290 C тестирования способов и/или композиций для лечения. По-видимому, некоторые виды Nicotiana можно инфицировать вирусом ToTV, благодаря чему наблюдать симптомы заболевания, отличающиеся от симптомов, обнаруженных у растений томата, страдающих от вируса ToTV. Подвергая растения Nicotiana противовирусному лечению либо до, либо во время инфекции вирусом можно иметь предсказуемое значение применения такого противовирусного средства для растений томата.

Изобретение также относится к применению ToTV или частей генома вируса ToTV в качестве экспрессирующего вектора, например, для применения для индуцированного вирусом молчания генов (VIGS). VTGS представляет собой технологию, использующую РНК-опосредованный механизм противовирусной защиты у растений.

У растений, инфицированных немодифицированными вирусами, механизм специфически направлен против вирусного генома. С использованием вирусных экспрессирующих векторов, несущих вставки, полученные из генов хозяев, механизм можно использовать также для атаки против соответствующих РНК растений. VIGS широко использовали в растениях для анализа функции генов и адаптировали для высокопроизводительной функциональной геномики. До настоящего времени большинство применений VIGS относилось к Nicotiana benthamiana. Однако настоящее изобретение относится к применению ToTV в качестве новых экспрессирующих векторных систем, позволяющих анализировать функцию генов в других растениях, таких как томат или другие виды семейства Solanaceae, такие как перец и картофель, и в видах семейства Cucurbitaceae.

Изобретение далее объясняется в примерах без ограничения ими.

ПРИМЕРЫ Пример 1. Выделение и характеризация ToTV из растений томата Методы Введение Образцы растений томата из Испании получали для диагностических исследований.

Симптомы у растений томата проявлялись в виде некротических пятен и хлороза на листьях и коричневых колец на плодах. Серологические тесты (ELISA) указывали на присутствие вируса мозаики пепино (PepMV), однако, принимая во внимание симптомы, по-видимому, присутствовал другой, еще не идентифицированный агент.

Электронно-микроскопическими исследованиями ткани инфицированного листа были обнаружены сферические вирусные частицы.

Затем проводили тест на инфекцию и обнаружили, что восприимчивыми к ToTV являлись многие образцы томата, некоторые из которых реагировали с явными симптомами (некроз листьев, начинающийся в основании отдельных листочков (см.

Фиг.1).

Перенос и размножение вируса ToTV выделяли, как описано ниже, из пораженных болезнью растений, полученных из Испании. ToTV можно было механически перенести к нескольким видам Nicotiana.

45 Показано, что общепринятый буфер для инокуляции является пригодным (например, 0,03 M фосфатный буфер, pH 7,7). Везде в данном примере ToTV механически инокулировали в N.glutinosa или N.benthamiana и размножали в них. Очистку вируса проводили приблизительно через 14 дней после инокуляции.

Очистка вируса Выполняли несколько попыток очистки ToTV согласно общепринятым способам, например, для неповирусов или лютеовирусов (с помощью органических растворителей). Эти способы всегда приводили к потере инфекционности вируса.

.: RU 2 411 290 C Более того, ToTV проявлял тенденцию к агрегации, когда на стадиях центрифугирования использовали низкие температуры (ниже 5°C).

В конечном счете, очень мягким способом очистки в результате получали приемлемо чистые препараты вируса, на которых можно было проводить дальнейшие эксперименты.

Для очистки ToTV использовали следующий способ (все стадии центрифугирования проводили при 6°C). Инфицированные листья N.glutinosa или N.benthamiana гомогенизировали в 5 частях 0,1 M Трис-HCl (pH 8) плюс 20 мМ Na2SO3, 10 мМ Na DIECA и 5 мМ Na-EDTA (буфер для гомогенизации) и гомогенат центрифугировали в течение 30 минут при 49000g. Супернатант помещали на подушку 20% сахарозы и центрифугировали в течение 1,5 часов при 70000g. Осадок ресуспендировали в 2 мл Трис-HCl, pH 8, суспензию наносили на градиент сахарозы (10-40% сахарозы в буфере для гомогенизации) и центрифугировали в течение 2 часов при 110000g. Поскольку полоса с вирусом не была видимой, градиент аликвотировали на отдельные фракции и присутствие вируса в каждой фракции определяли путем инокуляции части указанной фракции в листья N.hesperis '67A', как описано в данном документе, и наблюдения наличия инфекции. Содержащую вирус фракцию помещали в 10-40% градиент сульфата цезия (в Трис-HCl, pH 8) и центрифугировали в течение 16 час при 125000g.

Полосы с вирусом собирали и концентрировали центрифугированием или диализовали против 0,1 M Трис-HCl, pH 8.

Инфекционность ToTV после каждой стадии очистки проверяли инокуляцией в N.hesperis '67A' (перед инокуляцией фракции градиента сульфата цезия диализовали против Трис-HCl, pH 8).

Электронная микроскопия Суспензии вируса «монтировали» на сетке, покрытой Formvar®, известным иначе как поливинилформаль, окрашивали 2% уранилацетатом и исследовали на электронном микроскопе Philips CM12.

Анализ PAGE Вирусные белки разделяли электрофорезом в 12% денатурирующем полиакриламидном геле (SDS-PAGE, Laemmli, 1970) и окрашивали серебром.

Выделение и оценка нуклеиновой кислоты Очищенный вирус концентрировали центрифугированием (2 часа при 115000 g).

Осадки подвергали экстракции РНК по способу очистки Qiagen RNeasy MinElute (Qiagen, Hilden, Germany). Концентрацию РНК определяли на УФ спектрофотометре (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, USA).

Целостность РНК проверяли электрофорезом в агарозном геле. После электрофореза в течение 2 часов при 60 В РНК окрашивали с использованием ортотолуидина синего.

Синтез и клонирование кДНК кДНК синтезировали с использованием системы для синтеза кДНК Invitrogen Superscript Choice (Invitrogen, Breda, The Netherlands) согласно инструкциям производителя. Первую цепь кДНК праймировали с использованием либо олиго-d(T), либо случайных гексамерных праймеров. После синтеза второй цепи лигировали адаптеры для EcoRI для облегчения клонирования. После фосфорилирования кДНК с адаптерами для EcoRI нелигированные линкеры удаляли колоночной хроматографией.


Полученную кДНК лигировали в предварительно расщепленный EcoRI экспрессирующий вектор pBluescript II (Stratagene, La Jolla, USA) и лигатом трансформировали компетентные клетки Top10 (Invitrogen).

.: RU 2 411 290 C 5'-Конец последовательности ToTV определяли с использованием системы быстрой амплификация концов кДНК 5'RACE (LifeTechnologies) с использованием dCTP согласно инструкциям производителя.

Анализ кДНК После трансформации в рекомбинантных клонах анализировали присутствие вставок посредством PCR с использованием праймеров, специфических как для T3, так и для T7. Размер продуктов PCR анализировали в 1% агарозном геле. Клоны, содержащие вставки приблизительно по 1500 нуклеотидов, использовали для дальнейшего анализа последовательности. Полученные данные о последовательности анализировали с использованием пакета программ DNASTAR.

Определение аминокислотной последовательности трех белков капсида ToTV Очищенные частицы ToTV наносили на денатурирующий гель для PAGE и разделяли белки капсида. Полосы с разделенными белками капсида вырезали из геля, обрабатывали трипсином и гидролизаты анализировали с использованием тандемного масс-спектрометра (MSMS), по существу с использованием способа, описанного Kinter & Sherman, 2000. В результате этого получали аминокислотные (ак) последовательности малых пептидов, каждая из которых проявляла гомологию с аминокислотной последовательностью, прогнозируемой из нуклеотидной последовательности RNA2 ToTV. Сравнение с другими данными о вирусных последовательностях выполняли с помощью программ из пакета PHYLIP.

Результаты Перенос и размножение вируса Для размножения ToTV можно использовать N.glutinosa и N.benthamina. Виды табака N.hesperis '67A' и N.occidentalis 'P1' являются очень восприимчивыми к ToTV и проявляют симптомы после 3-4 суток. В этих видах табака развивается сильный некроз за короткое время, и, таким образом, их считают более подходящими в качестве индикаторного растения, чем хозяина для размножения. N.glutinosa и N.benthamiana реагируют с местными очагами хлороза и системным хлорозом, а также с умеренной деформацией листьев.

Очистка вируса Очистка вирионов из инфицированной ткани листа оказалась довольно сложной.

ToTV является неустойчивым к органическим растворителям и проявляет тенденцию к агрегации при центрифугировании при низких температурах. Используемым протоколом очистки (см. 1.2.) получили две видимые содержащие вирус полосы в градиенте сульфата цезия. Полосы появлялись в нижней части градиента, что указывает на довольно высокую плавучую плотность в Cs2SO4, равную или превышающую 1,4 г/см 2.

Сульфат цезия влиял на инфекционность ToTV, однако она не терялась полностью при высокой концентрации вируса в исходном материале. Фракции градиента сульфата цезия, содержащие обе полосы с вирусом, были инфекционными.

Инфекционность отдельных полос не определяли.

Электронная микроскопия Две полосы анализировали электронной микроскопией, и они содержали частицы вируса диаметром приблизительно 28 нм (Фиг.2).

Анализ PAGE Электрофорезом в полиакриламидном геле (PAGE) очищенных фракций вируса с последующим окрашиванием геля серебром обнаружили три белка капсида (CP) приблизительно 23, 26 и 35 кДа (см. Фиг.3, где показаны очищенные верхняя (TAgV-T).: RU 2 411 290 C и нижняя фракции (TAgV-B) очищенного вируса).

Выделение нуклеиновой кислоты и анализ кДНК Выделением РНК из обеих полос с вирусом вместе получили две РНК:

приблизительно 5,5 т.н. и 8 т.н. (см. Фиг.4). Выделением РНК из верхней полосы получали только фрагмент РНК 5,5 т.н.

РНК 5,5 т.н. из верхней полосы использовали в качестве матрицы для синтеза и клонирования кДНК. Для различных клонов проводили реакции секвенирования с использованием прямого и обратного праймеров для секвенирования (T3/T или M13F/M13R). Для определения точного 5'-конца РНК выполняли быструю амплификацию концов кДНК (RACE). В результате анализа полученных данных о последовательности с использованием пакета программ Lasergene® (DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA), получили полную последовательность РНК2 вируса (SEQ ID NO:1;

см. фиг. 5). Размер РНК составляет 5389 нуклеотидов, исключая поли A-хвост. В РНК обнаружили две открытые рамки считывания (ORF). ORF1 локализована от нуклеотида 182 до 742, обладает длиной 561 нуклеотидов и кодирует белок из аминокислот. Для данной последовательности не обнаружено гомологии в базах данных NCBI на белковом и нуклеотидном уровне.

ORF2 простирается от нуклеотида 702 до 4298, обладает длиной 3597 нуклеотидов и кодирует белок из 1199 аминокислот. После поиска BLAST в базе данных NCBI обнаружили небольшую гомологию с несколькими вирусными полибелками. Для обнаруженных гомологов инвентарные номера из базы данных NCBI приведены вместе с названием вируса и типом белка. Как последовательности нуклеиновой кислоты, так и производные аминокислотные последовательности во всех трех рамках считывания использовали для анализа BLAST. Для идентификации ORF использовали MAPDRAW из пакета программ Lasergene®.

Карты ORF на обеих РНК РНК РНК1 содержит одну ORF (ORF1) с мотивами, типичными для геликазы, РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRp). Помимо этого, для аминокислот в положениях 106-338 обнаружили низкий уровень гомологии аминокислотной (ак) последовательности с кофактором протеазы (Pro-Co) вируса слабой мозаики пачули (PatMMV) (NP647592.1), с идентичностью 22%.

Типичные мотивы геликазы A (GKS), В (D), С (N) идентифицированы в положениях 398-400, 444 и 495 предположительного полипептида.

Для области геликазы наиболее близкую идентичность обнаружили со сферическим вирусом риса тунгро (RTSV;

42% идентичности в перекрывающихся 140 ак), вирусом карликового хлороза кукурузы (MCDV;

43% идентичности в перекрывающихся ак), вирусом крапчатости земляники (SMoV;

42% идентичности в перекрывающихся 135 ак) и вирусом желтой пятнистости пастернака (PYFV;

42% в перекрывающихся 138 ак). В предположительной области VpG не обнаружено 45 сходства последовательности с другими вирусами.

Наибольшее сходство по протеазе обнаружено для ак 1000-1100, где обнаружено 25% идентичности с вирусом картофеля V (PVV;

в перекрывающихся ак протеазы NIa).

Область RdRp между мотивами I (KDE)-VII (FLSR) обнаружили между ак 1303- (Koonin 1991).

Наиболее близкую идентичность последовательности полибелка обнаружили с:

сферическим вирусом риса тунгро (RTSV) с 29% идентичности в перекрывающихся.: RU 2 411 290 C ак, вирусом карликового хлороза кукурузы (MCDV) с 28% идентичности в перекрывающихся 742 ак, вирусом желтой пятнистости пастернака (PYFV) с 33% идентичности в 501 ак, сферическим латентным вирусом яблока (ALSV) с 32% идентичности в 472 ак, вирусом крапчатости земляники (SMoV) с 30% идентичности в 680 ак и вирусом рашпилевидности листьев вишни (CRLV) с 33% в 465 ак.

Таблица Общий уровень гомологии (в %) между мотивами RdRp в ORF1 в RNA1 ToTV и мотивами RdRp из других вирусов растений NIMV PYFV RTSV SDV SMoV ToTV ALSV CRLV MCDV 10 NIMV 100 32,7 33,9 88,6 49,4 33,1 39,6 39,6 35, PYFV 100 43,7 33,2 32,0 35,2 36,4 36,0 42, RTSV 100 34,3 32,7 35,1 37,5 35,1 69, SDV 100 50,2 33,1 38,4 38,4 36, SMoV 100 35,7 40,6 38,5 38, ToTV 100 38,1 38,1 33, ALSV 100 79,5 35, CRLV 100 35, MCDV NIMV=вирус инфекционной крапчатости апельсина Навель (Sadwa);

PYFV=вирус желтой пятнистости пастернака (Sequivirus);

RTSV= сферический вирус риса тунгро (Waikavirus);

SDV=вирус карликовости мандарина уншиу (Sadwavirus);

SmoV=вирус крапчатости земляники (Sadwavirus);

ToTV - вирус томата торрадо (предположительно, род);

ALSV=сферический латентный вирус яблони (Cheravirus);

CRLV=вирус рашпилевидности листьев вишни (Cheravirus);

MCDV=вирус карликового хлороза кукурузы (Waikavirus) Таблица Общий уровень гомологии (в %) между мотивами геликазы в ORF1 в RNA1 ToTV с мотивами геликазы из других вирусов растений SDV SMoV ToTV ALSV CRLV MCDV PYFV RTSV SDV 100 42,5 37,2 31,9 33,6 39,8 39,8 38, SMoV 100 42,5 31,0 31,9 32,7 33,6 32, ToTV 100 36,0 34,2 46,5 40,4 44, ALSV 100 86,7 34,5 31,0 30, CRLV 100 34,5 30,1 31, MCDV 100 39,8 69, PYFV 100 42, RTSV PYFV=вирус желтой пятнистости пастернака (Sequivirus);

RTSV=сферический вирус риса тунгро (Waikavirus);

SDV=вирус 35 карликовости мандарина уншиу (Sadwavirus);

SmoV=вирус крапчатости земляники (Sadwavirus);

ToTV - вирус томата торрадо (предположительно, род);

ALSV=сферический латентный вирус яблони (Cheravirus);

CRLV=вирус рашпилевидности листьев вишни (Cheravirus);

MCDV=вирус карликового хлороза кукурузы (Waikavirus) РНК РНК2 содержит две потенциальные ORF (Фиг.7). ORF1 кодирует предположительный белок из 187 ак с молекулярной массой 20 кДа. Анализом последовательности не выявили гомологии с каким-либо белком из баз данных EMBL.

Неизвестно, кодирует ли данная ORF реально существующий белок.

Вторая ORF, частично перекрывающаяся с ORF1, начинается с трех стартовых кодонов ATG в рамке. Она кодирует предположительный белок из 1198 ак с предсказанной молекулярной массой 134 кДа. Идентификацией белков посредством масс-спектрометрии выделенных белков оболочки четко картировали три цистрона белков оболочки на C-конце РНК2-ORF2.

N-концевая область РНК2-ORF2 для полибелка наиболее вероятно кодирует предположительный двигательный белок (MP), поскольку в положении ак 262- обнаружен мотив LRVPML, очень похожий на консенсусную последовательность предположительного двигательного белка LxxPxL (Mushegian, 1994). Других.: RU 2 411 290 C гомологий последовательности для N-конца ORF2 РНК2 не обнаружено.

ORF2 предположительно кодирует четыре белка, которые должны отщепляться из полибелка-предшественника посредством протеолитического расщепления. Однако невозможно идентифицировать очевидную гомологию с участками расщепления известных полибелков. Остается необходимость определить точное положение этих участков расщепления.

Для последовательности полибелка CP1 авторы настоящего изобретения обнаружили только некоторую гомологию с парэховирусом человека (HPeV) с 21% идентичностью в 103 ак. Наиболее близкую идентичность с последовательностью полибелка CP2 обнаружили для вируса обыкновенной черемуховой тли (RhPV) с 25% идентичностью в 168 ак, вируса энцефаломиелита птиц (AEV) с 33% в 74 ак, вируса черного маточника (BQCV) с 43% идентичностью в 37 ак и вируса красного огненного муравья (SINV-1) с 30% идентичностью в 51 ак. Не обнаружено гомологий с последовательностью полибелка CP3.

Нетранслируемые области (UTR) 3'-UTR РНК1 и РНК2 составляют 1210 н. и 1092 н., соответственно. Существует 98% идентичность концевых 988 нуклеотидов обеих РНК. Для подтверждения того, что 3' области UTR обеих РНК являются идентичными, проводили RT-PCR тотальной вирусной РНК с одним обратным праймером, выведенным из идентичной области 3' UTR и двух специфических для каждой РНК прямых праймеров. Полученные продукты PCR секвенировали.

По этим результатам заключили следующее: вирус, выделенный из растений томата и предварительно названный вирусом томата торрадо (ToTV), обладает сферическими (икосаэдрическими) частицами диаметром приблизительно 28 нм. При очистке вирус проявляет на дисплее по меньшей мере две видимые полосы в градиенте сульфата цезия. Обе объединенные полосы являются инфекционными при инокуляции растений табака. Частицы вируса, по-видимому, состоят по меньшей мере из трех белков капсида приблизительно 23, 26 и 35 кДа.

Верхняя фракция вируса из градиента сульфата цезия содержит молекулу РНК приблизительно 5,5 т.н. (РНК 2;

SEQ ID NO:1), а нижняя фракция - молекулу РНК приблизительно 8 т.н. (РНК 1;

SEQ ID NO:2).

В результате синтеза и клонирования кДНК с использованием РНК 5,5 т.н. из верхней вирусной фракции и последующего анализа информации о последовательности несколько контигов собрали в SEQ ID NO:1. Два контига явно содержали поли-A-хвост, что позволяло предполагать, что вирусная РНК обладает поли-A-хвостом. Анализ BLAST нуклеотидной и производной аминокислотной последовательности не выявил какой-либо существенной гомологии с каким-либо известным вирусом из базы данных EMBL.

Приведенная выше информация указывает, что ToTV является новым и до настоящего времени не описанным вирусом. Полученная до настоящего времени 45 информация еще не позволяет группировать вирус с конкретным вирусным семейством или родом.

Для целей детекции и идентификации вируса сконструированы два набора праймеров для RT-PCR (таблица 4) на основе последовательности SEQ ID NO:1.

Таблица Праймеры для RT-PCR для детекции ToTV длина/ Набор праймеров A: Последовательность SEQ ID No темп прямой праймер 17-мер 5'-GAGAGCCGGCATTCACA-3' SEQ ID NO:.: RU 2 411 290 C обратный праймер 17-мер 5'-GCACAGCTTGGCGACAC-3' SEQ ID NO: Длина продукта 493 п.н. Оптимальная темп. отжига 54,8°C Набор праймеров B: прямой праймер 24-мер 5'-CCCATCATCACCCTCCTCTTCGTA-3' SEQ ID NO: обратный праймер 22-мер 5'-TTCCAGTAATGATCCAACCAAT-3' SEQ ID NO: Длина продукта 585 п.н. Оптимальная темп. отжига 54,9°C Подходящий способ RT-PCR включает в себя следующее. Выделяют и очищают общую РНК из приблизительно 100 мкг материала инфицированного листа с использованием набора для очистки РНК, например, такого как Qiagen RNA-Easy. Из этой общей РНК количество приблизительно 1 мкг используют в 50 мкл реакционной смеси для одноступенчатой реакции Superscript RT-PCR (Invitrogen), где реакционная смесь дополнительно содержит 25 мкл 2 реакционной смеси, 1 мкл (100 нг) как верхнего, так и нижнего праймера, 1 мкл смеси RT/Taq и 22 мкл воды MilliQ. Чтобы провести обратную транскрипцию РНК в кДНК и амплифицировать эту кДНК, можно использовать следующую программу RT-PCR: стадия 1: 30 минут при 50°C (реакция обратной транскрипции);

стадия 2: 3 минуты при 94°C (активация Taq полимеразы);

стадия 3: 30 секунд при 94°C;

стадия 4: 30 секунд при 55°C;

стадия 5: минута при 72°C;

стадия 6: повтор стадий (3-5) 40;

стадия 7: 10 минут при 72°C;

стадия 8: 10°C так долго, как потребуется. Продукты PCR можно анализировать в 1% агарозном геле в буфере TAE или TBE.

2.6. Определение аминокислотных последовательностей трех белков капсида ToTV Фрагменты наибольшего белка оболочки (CP1: приблизительно 35 кДа) можно выровнять с частями области ORF2 РНК2 (ак 487-729). Фрагменты белка оболочки из средней полосы с белком (CP2: прибл. 26 кДа) можно выровнять с областью ORF РНК2 между ак 730 и 983.

Фрагменты наименьшего белка оболочки (CP3: прибл. 23 кДа) можно выровнять с C-концом ORF2 РНК2 (ак 984-1195). Из этих результатов можно заключить, что кодирующие последовательности трех белков капсида локализованы в ORF2 РНК (5,5 т.н.) ToTV, и следовательно, что выделенные молекулы вирусной РНК являются частью частиц вируса ToTV.

Пример 2. Выделение и характеризация возбудителя заболевания Марчитец В 2003 г. обнаружили растения томата с симптомами, сходными с симптомами, вызванными ToTV, выращенные в Центральной Америке (Мексика и Гватемала).

Предположили, что возбудитель заболевания является вирусным. Заболевание в пределах определенной местности известно под названиями «Шоколад», «Марчитец (вирус)» или «Заболевание шоколадной пятнистости». Восприимчивые растения, выращенные в полевых условиях, становились сильно инфицированными с 2003 г. и позже.

Целью настоящего исследования являлось сравнение последовательности до настоящего времени неизвестного вируса, вызывающего «Заболевание шоколадной пятнистости», с последовательностью ToTV, выделенного в примере 1.

Методы РНК выделяли из приблизительно 100 мкг материала листа, инфицированного 50 «Заболеванием шоколадной пятнистости» с использованием системы для выделения тотальной РНК (Promega SV 96). Два мкл тотальной РНК использовали в 50 мкл реакционной смеси для одноступенчатой реакции Superscript RT-PCR (Invitrogen), где реакционная смесь дополнительно содержит 25 мкл 2 реакционной смеси, 1 мкл (.: RU 2 411 290 C нг) как прямого праймера, так и обратного праймера, 1 мкл смеси RT/Taq и 22 мкл воды MilliQ. Чтобы провести обратную транскрипцию РНК в кДНК и амплифицировать эту кДНК, использовали следующую программу RT-PCR: стадия 1:

30 минут при 50°C (реакция обратной транскрипции);

стадия 2: 3 минуты при 94°C (активация Taq-полимеразы);

стадия 3: 30 секунд при 94°C;

стадия 4: 30 секунд при 55°C;

стадия 5: 1 минута при 72°C;

стадия 6: повтор стадий (3-5) 40;

стадия 7: 10 минут при 72°C;

стадия 8: 10°C так долго, как потребуется. Продукты PCR анализировали в 1% агарозном геле в буфере TAE или TBE.

Для RT-PCR использовали различные наборы праймеров, известных как отжигающиеся в различных положениях РНК1 или РНК2 из генома ToTV.

Таблица Праймеры для RT-PCR на основе последовательности РНК-2 ToTV, используемые для характеризации вируса-возбудителя заболевания шоколадной пятнистости, как применяли в примере 2 и как показано на Фиг. 15 Набор праймеров Последовательность SEQ ID No Р1048/1049:

прямой праймер 5'-CAAGCCATCACGGAACCTAC-3' SEQ ID NO: обратный праймер 5'-AGCATCTTCTTCCTCCGCT-3' SEQ ID NO: Длина продукта От основания 36-544=508 оснований Набор праймеров 20 P1056/1057:

прямой праймер 5'-TGCTGAGGTGCTATCACTGG-3' SEQ ID NO: обратный праймер 5'-CACACTTTCCACGATTTCCA-3' SEQ ID NO: Длина продукта От основания 2422-2955=523 основания Набор праймеров P1060/1061:

прямой праймер 5'-AAAGGAAAGAAGCAGCCACA-3' SEQ ID NO: обратный праймер 5'-GGAAATCTTGGTCAAGCCAG-3' SEQ ID NO: Длина продукта От основания 3599-4170=571 основание Набор праймеров P1064/1065:

30 прямой праймер 5'-GCAATGCCAGTGGTTCAGAG-3' SEQ ID NO: обратный праймер 5'-GGTCAAATGGATACTCGGGA-3' SEQ ID NO: Длина продукта От основания 4820-5327=507 оснований Результаты Как ожидали, использованные наборы праймеров обеспечивали амплификацию части последовательности ToTV, однако при использовании для RT-PCR четырех различных наборов праймеров, основанных на последовательности РНК- (P1048/1049, P1056/1057, P1060/1061 и P1064/1065), получили также амплификацию части генома возбудителя «Заболевания шоколадной пятнистости». Участки отжига этих наборов праймеров проиллюстрированы на фиг. 1.

Продукты RT-PCR для четырех наборов праймеров, с которыми амплифицировали фрагменты возбудителя «Заболевания шоколадной пятнистости», секвенировали, и они обладали 100% идентичностью с соответствующими частями последовательности вирусного генома вируса, описанного в примере 1.

ПОЯСНЕНИЯ К ЧЕРТЕЖАМ На Фиг.1 показана фотография листьев растения томата с симптомами ToTV заболевания.

На Фиг.2 показана электронная микрофотография очищенных частиц ToTV.

Частицы обладают диаметром приблизительно 28 нм.

На Фиг.3 показан результат окраски серебром геля для PAGE с очищенными верхней (TAgV-T) и нижней (TAgV-B) фракциями вируса ToTV, показывающий три.: RU 2 411 290 C белка капсида приблизительно 23, 26 и 35 кДа.

На Фиг.4 показан результат денатурирующего гель-электрофореза в агарозе.

Размеры фрагментов указаны в тысячах нуклеотидов (т.н.). Гель окрашивали с использованием ортотолуидина синего. M: стандарт размера молекул. TAgV: 1 мкг выделенной РНК ToTV.

На Фиг.5 показана полная последовательность молекулы РНК 2 ToTV (SEQ ID NO:

1).

На Фиг.6 показана полная последовательность молекулы РНК 1 ToTV (SEQ ID NO:

2).

На Фиг.7 показана общая структура вируса ToTV с отмеченными участками отжига различных наборов праймеров, как использовали в примере 2 для РНК 2.

Источники информации Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., 215:403-410.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.