авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 |

«СЕКЦИЯ 2 БИОТЕХНОЛОГИИ И АППАРАТУРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ ПРОЦЕССОВ 1 ЗАО «АЛТАЙВИТАМИНЫ» - ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ ...»

-- [ Страница 2 ] --

В данной работе были исследованы шелуха овса урожая 2007-2008 гг. переработки ЗАО «Бийский Элеватор», солома овса урожая 2007 г. Бийского района и биомасса автор ской формы ИЦиГ СО РАН Мискантуса китайского урожая 2008 г., а также продукты их химической переработки.

Продуктами химической переработки перечисленного сырья являлись беленая цел люлоза, лигноцеллюлозный материал и волокнистый продукт. Беленая целлюлоза (из ше лухи и соломы овса, биомассы Мискантуса китайского) получена последовательно ще лочной делигнификацией (4 %-ный NaOH, модуль 1:20, температура 98 °С, продолжительность 4 ч) и отбелкой (1 %-ный NaOH, модуль 1:20, температура °С, добавление 36 %-ной H2O2 в соотношении сырье: отбеливающий агент =1,0:3,6). Лиг ноцеллюлозный материал (из шелухи и соломы овса, биомассы Мискантуса китайского) получен обработкой 3 %-ной HNO3 (модуль 1:15, 95-98 °С, 6 ч). Волокнистый продукт (из шелухи и соломы овса, биомассы Мискантуса китайского) получен последовательно ще лочной делигнификацией (4 %-ный NaOH, модуль 1:15, температура 98 °С, продолжи тельность 4 ч) и обработкой 3 %-ный HNO3 (модуль 1:15, 95-98 °С, 6 ч) [5, 6].

Не измельченная беленая целлюлоза (из шелухи овса) Концентрация глюкозы, г/дм Измельченная беленая целлюлоза ( из шелухи овса) Волокнистый продукт (из шелухи овса) Лигноцеллюлозный материал (из шелухи овса) Исходная шелуха овса 0 8 16 24 32 40 48 55 62 69 Продолжительность ферментации, ч Рисунок 1 - Зависимость концентрации глюкозы от продолжительности ферментации для исходной шелухи овса и продуктов её химической переработки Ферментацию исходного и обогащенных целлюлозой продуктов проводили в кол бах емкостью 500 мл на перемешивающей платформе марки ПЭ-6410М с частотой коле бания 50 мин-1 при температуре 50 °С в течение 72 ч. В каждую колбу поместили по 5 г исследуемого сырья, 150 см3 ацетатного буфера (рН = 4,7) [7], в котором было растворено 0,083 г ферментного комплекса «ЦеллоЛюкс-А» (производство г. Бердск;

состав комплек са по паспорту: целлюлаза, -глюканаза, ксиланаза, глюкоамилаза). Через определенные промежутки времени отбирали пробу объемом 2 мл и в фильтрате определяли концентра цию глюкозы спектрофотометрическим методом с использованием 3,5 динитросалициловой кислоты [8]. По окончании ферментации проводили фильтрование, сушку осадка на фильтре и определяли убыль массы сырья гравиметрическим методом, а также концентрацию редуцирующих веществ в фильтрате гидролизата по методу Бертра на.

Результаты зависимости концентрации глюкозы от продолжительности фермента ции для шелухи овса и продуктов её переработки представлены на рисунке 1.

Как следует из представленных результатов, исходная шелуха овса меньше всего подвергается ферментации. Это связано и с высоким содержанием лигнина, который эк ранирует действие ферментов, и с прочностью лигноцеллюлозной матрицы. Тем не менее, за 24 ч концентрация образовавшейся глюкозы достигает 1 г/дм3. Наибольшее содержание глюкозы получено при ферментации образца измельченной беленой целлюлозы, что свя зано с удалением лигнина и разрыхлением структуры целлюлозы под действием химиче ской и механической предобработок. Среднее положение занимают образцы, полученные обработкой азотной кислотой в одну и две стадии.

Физико-химические свойства и реакционная способность шелухи овса и обогащен ных целлюлозой продуктов ее переработки после 72 ч ферментации приведены в таблице 1.

Сравнение выходов по убыли массы сырья и редуцирующих веществ в гидролизате показывает высокую реакционную способность волокнистого материала, близкую по зна чению к беленой целлюлозе. При этом следует отметить, что эти два продукта имеют близкие значения зольности и остаточного лигнина. Реакционная способность лигноцел люлозного материала в 5 раз превышает способность исходной шелухи, хотя продукт имеет очень высокие значения и по зольности и по остаточному лигнину. Этот факт по зволяет рассматривать обработку азотной кислотой в одну стадию исходного сырья наи более перспективной для предобработки сырья с целью дальнейшей ферментации [9].

Кроме того, использование азотной кислоты предполагает достаточно легкую утилизацию вторичных растворов.

Таблица 1 - Физико-химические свойства и реакционная способность исходной шелухи овса и продуктов её химической обработки после 72 ч ферментации Показатель Ше- Беленая целлюлоза После обработки HNO луха Неизмель- Измельчен Лигноцел- Волокни овса ченная ная люлозный стый про материал дукт Влажность, % 6,10 5,30 5,30 5,30 5, Зольность, % 5,40 1,20 1,20 9,50 1, Остаточный лигнин, 17,60 4,98 4,98 14,70 4, % Убыль по массе, г 0,20 2,20 2,10 1,49 2, Выход (по убыли 4,00 44,00 42,00 29,80 40, массы), % Концен- Глюкоза 1,40// 6,48// 6,67// 3,37// 3,62// трация, 3,08 14,67 14,68 7,42 7, г/дм Редуци // 1,62// 12,05// 12,02// 8,50// 12,40// рующие Выход, 3,56 26,44 26,45 18,70 27, вещества % Результаты зависимости концентрации глюкозы от продолжительности фермента ции для соломы овса и продуктов её переработки представлены на рисунке 2.

Бел ена я цел лю ло за (из сол омы овса ) м 3, д / г, ы з 3 Воло кни сты й м а тери ал (и з о к со ломы о вса) ю л г 2, я и ц а р т Ли гн оце ллю л озн ый м а тер иал н е (и з с оло мы овс а) ц н 1, о К Ис хо дна я солома овс а 0, 0 8 16 24 32 40 48 55 62 69 Про до лж ител ьно ст ь ф ермент ации, ч Рисунок 2 - Зависимость концентрации глюкозы от продолжительности ферментации для исходной соломы овса и продуктов её химической переработки Данные эксперимента показали, что значительное накопление глюкозы в гидроли зате всех образцов происходит в первые 32 часа. Наиболее активным, по-прежнему, явля ется беленая целлюлоза, затем следует лигноцеллюлозный материал, волокнистый про дукт, и замыкает ряд исходная солома.

Физико-химические свойства и реакционная способность соломы овса и обогащен ных целлюлозой продуктов ее переработки после 72 ч ферментации приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Физико-химические свойства и реакционная способность исходной соломы овса и продуктов её химической обработки после 72 ч ферментации Показатель Солома Беленая овса целлюло- После обработки HNO за Лигноцеллюлоз- Волокнис ный материал тый продукт Влажность, % 5,00 4,30 5,50 5, Зольность, % 5,60 2,50 5,40 0, Остаточный лигнин, % 18,80 3,95 10,57 2, Убыль по массе, г 0,30 1,00 1,65 2, Выход (по убыли массы), 6,00 20,00 33,00 46, % Концен- Глюкоза 1,32// 3,73// 3,09// 2,69// трация, 2,90 8,21 6,80 6, г/дм Редуцирую 1,46// 8,70// 8,47// 12,71// // щие вещества Выход, % 3,21 19,14 18,64 27, Результаты, представленные в таблице 2, показывают аналогичные закономерно сти, полученные ранее для шелухи овса, а именно по реакционной способности (концен трация редуцирующих веществ) объекты ферментации располагаются в следующей по следовательности: волокнистый продукт беленая целлюлоза лигноцеллюлозный мате риал исходная солома овса.

Сравнение полученных результатов для шелухи овса и соломы овса позволяют от дать предпочтение наиболее гидролизуемой шелухе овса.

Результаты зависимости концентрации глюкозы от продолжительности фермента ции для Мискантуса китайского и продуктов его переработки представлены на рисунке 3.

Обнаружено, что основное накопление глюкозы в гидролизатах всех образцов про исходит в первые 40 часов, по истечении которых зависимость концентрации глюкозы от продолжительности ферментации выходит на плато для всех объектов исследования.

Также, как и в случае ферментации шелухи и соломы овса, исходный Мискантус китай ский меньше всего подвергается ферментации, а ферментация беленой целлюлозы дала наибольший выход глюкозы [10].

Беленая целлюлоза (из 4, Мискантуса китайского) Концентрация глюкозы, г/дм 3, 3 Волокнистый продукт (из 2,5 Мискантуса китайского) 1, Лигноцеллюлозный материал (из Мискантуса китайского) 0, 0 8 16 24 32 40 48 55 62 69 Продолжительность ферментации, Исходный Мискантус ч китайский Рисунок 3 - Зависимость концентрации глюкозы от продолжительности ферментации для Мискантуса китайского и продуктов его химической переработки Физико-химические свойства и реакционная способность соломы овса и обогащен ных целлюлозой продуктов ее переработки после 72 ч ферментации приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Физико-химические свойства и реакционная способность исходного Мискан туса китайского и продуктов его химической обработки после 72 ч ферментации Показатель Мис- Беленая После обработки HNO кантус целлюлоза китай- Лигноцеллюлоз Волокнистый ский ный материал продукт Влажность, % 5,00 3,80 5,00 5, Зольность, % 5,00 5,20 4,80 0, Остаточный лигнин, % 19,40 4,00 19,00 6, Убыль по массе, г 0,50 1,75 1,60 1, Выход (по убыли массы), % 10,00 35,00 32,00 39, Концентра- Глюкоза 2,26// 4,66// 3,23// 2,60// ция, г/дм 4,97 10,25 7,11 5, // Выход, % Редуцирующие 2,32// 12,47// 7,62// 13,48// вещества 5,11 27,44 16,76 29, По данным таблицы 3 видно, что закономерности, полученные ранее для шелухи и соломы овса, по реакционной способности субстратов наблюдаются аналогично и для Мискантуса китайского, а именно:

- по концентрации глюкозы: беленая целлюлоза лигноцеллюлозный материал волокнистый продукт исходный Мискантус китайский;

- по концентрации редуцирующих веществ: волокнистый продукт беленая цел люлоза лигноцеллюлозный материал исходный Мискантус китайский.

Результаты термогравиметрического анализа образцов беленой целлюлозы (из со ломы овса) до и после ферментации, а также TGA стандартов целлюлозы и глюкозы пока зали, что образец до ферментации представлял собой однородный материал с температу рой разложения 356 С, соответствующий целлюлозе с небольшим содержанием раство рителя. После ферментации материал уже неоднороден, содержание растворителя резко возросло. До ферментации образец содержал 81 % целлюлозы, после – 34 %. Кроме того, в образце после ферментации содержится 13 % глюкозы, что легко объяснить отсутствием промывки осадков после ферментации.

Результаты электронносканирующей микроскопии показали, что до ферментации фибриллы целлюлозы представляют собой гладкие, тонкие нити, а после ферментации эти же фибриллы уже деформированы, разбухли и имеют частичные продольные и попереч ные разрушения.

Таким образом, показана возможность использования шелухи и соломы овса, а также нового для России растения – Мискантуса китайского для ферментации промыш ленным ферментным препаратом «ЦеллоЛюкс-А» в сахара. Обнаружено, что волокнистые продукты всех видов сырья дают наибольший выход редуцирующих веществ, а беленые целлюлозы – наибольший выход глюкозы.

Литература Саловарова В.П., Козлов Ю.П. Эколого – биотехнологические основы кон 1.

версии растительных субстратов: Учебное пособие/ В.П. Саловарова, Ю.П. Козлов. – М.:

Изд-во «ЭНЕРГИЯ», 2007. – 544с.

Будаева В.В., Митрофанов Р.Ю., Золотухин В.Н. Исследование фермента 2.

тивного гидролиза отходов переработки злаков // Ползуновский вестник. – № 3, 2008. – С.

322–327.

Бурцева Е.А., Будаева В.В., Митрофанов Р.Ю. Ферментация шелухи овса / 3.

Перспективы создания и применения конденсированных высокоэнергетических материа лов: Доклады II научно-технической конференции молодых ученых, Бийск, 25-26 сентября 2008 г. – Бийск: Изд-во БТИ АлтГТУ, 2008. – С. 54–56.

Masahiro Kurakake Pretreatment with Ammonia Water for Enzymatic Hydrolysis 4.

of Curn Husk, Bagasse, and Switchgrass // Applied Biochemistry and Biotechnology. – (2001). – p. 251–259.

Будаева В.В., Сакович Г.В. Химическая переработка Мискантуса / Новые 5.

достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Материалы IV Все рос. конф., Барнаул, 21-23 апреля 2009 года – Барнаул: Изд-во АГУ, 2009. – Кн. 1. – С. 35– 37.

Будаева В.В., Золотухин В.Н., Митрофанов Р.Ю., Сакович Г.В. Химическое 6.

обогащение недревесного целлюлозосодержащего сырья / Химия XXI век: новые техноло гии, новые продукты: доклады XII междунар. науч.-практ. конф., Кемерово, 21-22 апреля 2009 года. – Кемерово: КузГТУ, 2009.

Толстова, С.В. Гидролиз пивной дробины целлюлазными препаратами / С.В.

7.

Толстова, К.А. Калунянц, А.И. Садова // Ферментная и спиртовая промышленность. – 1984. – №7. – С. 16-17.

Коренман, И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органиче 8.

ских соединений / И.М. Коренман. – М.: Химия, 1970. – 334 с.

Бурцева Е.А., Гора А.А., Будаева В.В. Ферментативный и химический гидро 9.

лиз недревесного целлюлозосодержащего сырья / Новые достижения в химии и химиче ской технологии растительного сырья: Материалы IV Всерос. конф., Барнаул, 21-23 апреля 2009 года – Барнаул: Изд-во АГУ, 2009. – Кн. 1. – С. 148–151.

Будаева В.В., Бурцева Е.А., Митрофанов Р.Ю., Золотухин В.Н. Фермента 10.

тивная способность Мискантуса китайского и продуктов его химической переработки/ Химия XXI век: новые технологии, новые продукты: доклады XII междунар. науч.-практ.

конф., Кемерово, 21-22 апреля 2009 года. – Кемерово: КузГТУ, 2009.

РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ИЗ ТРАВЯНИСТЫХ РАСТЕНИЙ Е.А. Трушкова1, Р.Ю. Митрофанов Бийский технологический институт, АлтГТУ им. Ползунова, Бийск Институт проблем химико-энергетических проблем СО РАН, Бийск Наращивание мировых объемов производства целлюлозы, широко используемой для получения ее производных и пластиков, невозможно без привлечения в эту отрасль дополнительных источников сырья.

В этой связи представляется достаточно перспективным использование недревес ного целлюлозосодержащего сырья (ЦСС). Привлечение нетрадиционных сырьевых ис точников обуславливает необходимость проведения исследований, направленных на оп тимизацию параметров выделения и очистки целлюлозы из этого вида сырья.

Целью работы является анализ основных технологических схем выделения целлю лозы [1] и выбор наиболее пригодных для ее получения из некоторых видов травянистых растений, а также разработка модифицированного способа обработки ЦСС, направленно го на улучшение качественных показателей целевого продукта.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Объектами исследования выступали опавшие листья тополя, солома и шелуха овса (август-сентябрь 2007 г., Бийский район), и новый для России вид ЦСС – Мискантус ки тайский (плантация ИЦиГ СО РАН, Новосибирск, 2008 г.).

Некоторые характеристики используемого в работе сырья представлены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристики ЦСС Целлюлозосодержащее Влаж- Зола, Лигнин, Пектиновые вещества сырье ность,% % на а.с.с и пентозаны, % % Листья тополя 4,8 6,0 25,4 30, Солома овса 5,0 5,6 18,8 36, Шелуха овса 6,1 5,4 17,6 35, Мискантус китайский 9,2 5,0 19,4 37, Процесс делигнификации проводили в качающемся автоклаве [2], представляющим собой стальной цилиндр длиной 1,1 м с внутренним диаметром 0,065 м. Общая ёмкость автоклава 4,2 л. Оптимальный коэффициент заполнения 0,6. Период колебания 20 мин– [3].

Делигнификация ЦСС В качающийся автоклав помещают 150 г измельченного сырья, 4 %-ный раствор NaOH (модуль 1:15) и герметизируют. Массу при непрерывном перемешивании нагрева ют до 140 °С и при этой температуре и постоянном перемешивании 1 ч. По окончании выдержки автоклавах охлаждают до 25–27 °С. Пульпу сбрасывают в рукавный фильтр из х/б ткани и отжимают. Волокнистый продукт промывают 500 мл 2 %-ным раствором NaOH, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и высу шивают при 105 °С либо во влажном состоянии передают на стадию отбелки.

Выход волокнистого продукта светло-серого цвета составляет от 30% до 40 %.

Отбелка целлюлозы Полученный на предыдущей стадии волокнистый продукт с влажностью 40–60% помещают в стеклянный стакан емкостью 2 л, снабженный верхнеприводной лопастной мешалкой, добавляют 1 %-ный раствор NaOH (модуль 1:20). Пускают в ход мешалку, на гревают пульпу до 60 °С и начинают дозировать H2O2 порциями от 5 до 10 мл через каж дые 20 мин до визуального исчезновения пены. По окончании отбелки массу охлаждают до 25–27 °С, сбрасывают в рукавный фильтр и хорошо отжимают. Беленую целлюлозу промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, тщательно отжимают и высушивают при 105 °С.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ При определении влажности исследуемого ЦСС было установлено, что она колеб лется от 5 до 9 %. Такая влажность позволяет легко измельчать и достаточно долго хра нить рассматриваемое сырье без каких-либо дополнительных затрат. С учетом этого факта можно организовать загруженность перерабатывающего предприятия равномерно в тече ние года, несмотря на то, что сбор сырья осуществляется в осенний период.

В настоящее время с целью получения целлюлозы отработано и внедрено в про мышленное производство достаточно большое количество способов варки традиционного ЦСС, однако не все они пригодны для варки биомассы травянистых растений [3]. В нашем случае наиболее целесообразными можно считать два способа: натронную и гидротроп ную варки. Как вариант щелочной варки, дополнительно рассматривалась варка в 25 % ном растворе гидроксида аммония, позволяющая регенерировать и повторно использовать варочный раствор путем отгонки гидроксида аммония из щелока, с последующим насы щением отгона аммиаком до концентрации 25 %.

В таблице 2 представлены выход и основные качественные характеристики продук тов переработки ЦСС.

Для получения волокнистого продукта были рассмотрены две наиболее часто упо минающиеся схемы: варка с предгидролизом (0,2М соляная кислота) и варка без предгид ролиза [1]. Принимая во внимание химический состав рассматриваемого сырья (значи тельное содержание легкогидролизуемых пентозанов) было принято решение двухста дийную схему проводить при атмосферном давлении. В результате предгидролиза около 50% массы исходного сырья переходит в растворимую форму и вымывается из сырья.

Выход волокнистого продукта в зависимости от условий и способа варки колеблет ся от 32 % до 63 %. Самым неудачным сырьем, для переработки рассматриваемыми мето дами, оказались листья тополя, дающие неоднородный продукт с завышенной зольностью и высоким содержанием остаточного лигнина. На наш взгляд, переработка такого сырья требует подбора специальных методов и в дальнейших экспериментах листва нами не рассматривалась. Наиболее удачные способы, по полноте делигнификации – натронная и гидротропные варки, однако стоит отметить, что степень провара сырья при натронной варке больше, что делает ее предпочтительнее для данных видов сырья. В случае исполь зования гидроксида аммония выход волокнистого продукта составил от 45 % до 54 %, что, на наш взгляд, обусловлено побочными реакциями взаимодействия функциональных групп лигнина с аммиаком. Зольность получаемых продуктов после обработки практиче ски не меняется и находится на уровне зольности исходного сырья. В случае гидротроп ной варки зольность волокнистого продукта падает относительно сырья в значительной степени.

Таблица 2. Выход и характеристика волокнистых продуктов М.д. остаточного Выход, Влажность, Зола, Исходное сырье лигнина, % на % % % а.с.с.

1.ПРЕДОБРАБОТКА ПРИ АТМОСФЕРНОМ ДАВЛЕНИИ 1.1 Предгидролиз Лигноцеллюлоза после предгидролиза 61,3 - - листвы (t=98 C) Лигноцеллюлоза после предгидролиза 54,2 - - соломы овса (t=98 C) Лигноцеллюлоза после предгидролиза 52,7 - - шелухи овса (t=98 C) 1.2 Натронная варка Волокнистый продукт после делигни фикации листвы 43,4 4,4 22,1 21, (t=98 C) Волокнистый продукт после делигни фикации соломы овса 37,1 3,5 1,7 5, (t=98 C) Волокнистый продукт после делигни фикации шелухи овса 32 5,4 0,7 4, (t=98 C) 2. ПРЕДОБРАБОТКА ПРИ ПОВЫШЕННОМ ДАВЛЕНИИ 2.1 Натронная варка Волокнистый продукт из соломы овса 36,4 4,0 9,8 4, (t=140 C) Волокнистый продукт из шелухи овса 34,5 4,8 4,2 5, (t=140 C) Волокнистый продукт из Мискантуса 40,0 5,6 5,1 4, китайского (t=140 C) 2.2 Аммиачная варка Волокнистый продукт из шелухи овса 53,7 5,3 4,9 9, (t=110 C) Волокнистый продукт из шелухи овса 45,3 4,3 6,8 8, (t=200 C) 2.3 Гидротропная варка Волокнистый продукт из шелухи овса 37,9 4,1 1,8 5, Волокнистый продукт из Мискантуса 37,4 4,0 1,6 4, китайского Предварительные результаты по отбелке волокнистых продуктов показали, что зольность беленой целлюлозы достаточно высока и находится на уровне зольности исход ного сырья. Также было установлено, что высушивание волокнистого продукта перед от белкой негативно сказывается на процессе отбелки, как по времени проведения процесса, так и по расходу перекиси водорода. В связи с этим на следующих стадиях эксперимента было решено отказаться от высушивания промежуточных продуктов. Полученные резуль таты сведены в таблицу 3.

Таблица 3. Выход и характеристика беленой целлюлозы М.д. ост.

Вы- Влажность, Зола, Время отбелки, Расход Исходное сырье лигнина, ход,% мин. Н2О2, мл % % % на а.с.с.

1.ПРЕДОБРАБОТКА ПРИ АТМОСФЕРНОМ ДАВЛЕНИИ 1.1 Натронная варка Беленая целлюлоза 41,2 5,3 18,0 29,1 100 из листвы Беленая целлюлоза 24,3 4,3 2,5 3,9 110 из соломы овса Беленая целлюлоза 20,0 5,2 3,2 3,7 120 из шелухи овса 2.ПРЕДОБРАБОТКА ПРИ ПОВЫШЕННОМ ДАВЛЕНИИ 2.1 Натронная варка Беленая целлюлоза 36,8 4,5 10,2 3,6 90 из соломы овса Беленая целлюлоза 30,6 4,2 3,5 1,2 80 из шелухи овса Беленая целлюлоза из Мискантуса ки- 41,4 3,1 4,4 1,3 95 тайского 2.2 Аммиачная варка Беленая целлюлоза (делигнификация 45,5 4,8 3,0 3,6 105 при t=110 C) Беленая целлюлоза (делигнификация 34,9 4,1 3,0 2,7 110 при t=200 C) 2.3 Гидротропная варка Беленая целлюлоза 37,9 4,1 1,8 5,5 100 из шелухи овса Беленая целлюлоза из Мискантуса ки- 37,4 4,0 1,6 4,7 120 тайского Для снижения зольности беленой целлюлозы была введена финишная обработка целевого продукта 1,5 %-ным раствором HCl (кисловка) при температуре 25-27 °С, кото рая позволила снизить зольность до уровня менее 1%. Высушивание беленой целлюлозы проводилось при температуре 105 °С, полученный продукт представлял собой ороговев шие сверху, очень жесткие частицы. Использование такого продукта при получении, на пример эфиров, было бы затруднительно, вследствие очень долгого и не полного набуха ния. Поэтому для разрыхления волокон нами была введена стадия промывки 80-86 %-ным этиловым спиртом для предотвращения слипания волокон и дополнительного их разрых ления во время сушки. В результате такого обезвоживания получали продукт с удельной поверхностью до 11 м2/г. Кроме того материал дополнительно обезжиривался, что поло жительным образом сказывается на его качестве. Использование 80-86% спирта обуслов лено, тем, что спирт такой концентрации может быть легко регенерирован перегонкой при атмосферном давлении без ректификационной колонны.

Для повышения производительности автоклава, был проведен ряд экспериментов в которых исследовалась зависимость качественных показателей получаемой целлюлозы Мискантуса китайского от модуля натронной варки. Полученные результаты сведены в таблицу 4.

Таблица 4. Выход и характеристика беленой целлюлозы полученной из Мискантуса китайского при натроной варке с различным гидромодулем М.д. ост. лигнина, % на Гидромодуль Выход, % Влажность, % Зола, % а.с.с.

1:15 41,5 2,3 0,4 1, 1:10 38,2 2,3 0,3 1, 1:8 41,5 2,0 0,5 1, Полученные результаты свидетельствуют о том, что уменьшение гидромодуля на тронной варки с 1:15 до 1:8 практически не влияют ни на выход целлюлозы, ни на оста точное содержание лигнина в ней.

Результаты проведенных исследований показывают, что применение различных модификаций существующих технологий играют существенную роль, повышая качество конечного продукта.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что гидротропная варка соломы и шелухи злаков, Мискантуса ки тайского позволяет получать волокнистый продукт с максимально низкой зольностью;

натронная варка дает продукт с самым низким содержанием остаточного лигнина;

амми ачная варка сопровождается протеканием процессов аминирования лигнина, что негатив но сказывается на качестве волокнистого продукта и последующей отбелке.

2. Снижение гидромодуля варки, позволяет повысить производительность основно го оборудования при неизменных качественных показателях беленой целлюлозы.

3. Введение стадии кисловки беленой целлюлозы позволяет значительно снизить ее зольность.

4. Введение финишной стадии спиртовой обработки предотвращает слипание во локон и дополнительно способствует разрыхлению их во время сушки.

Литература 1. Лендьел П., Морваи Ш. Химия и технологии целлюлозного производства /перевод с немецкого Ф.Б. Дубовицкий / под ред. А.Ф. Тищенко. – М.: Лесная промыш ленность, 1978. – 544 с.

2. П.М. 2518 РФ, МКИ5 6 B 01 J 3/04. Качающийся автоклав с электрообогревом для проведения гетерогенных процессов.

3. Севодина Г.И. Исследование гетерогенных процессов в качающихся автоклавах:

Автореф. канд. дис. – Бийск, 1998. – 20 с.

ХИМИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НЕДРЕВЕСНОГО ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ А.А.Гора1, В.В.Будаева2, Р.Ю.Митрофанов Бийский технологический институт (филиал) АлтГТУ им. И.И.Ползунова, г.Бийск Учреждение Российской академии наук Институт проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения РАН, г. Бийск В последние десятилетия активно исследуются альтернативные моторные топлива такие, как биодизель и биоэтанол. Недостатки получения топливного этанола заключают ся в том, что в настоящее время его получают из пищевого сырья.

Именно поэтому активно ведутся работы по использованию отходов сельского хо зяйства. Основным направлением переработки таких отходов на начальной стадии являет ся ферментативный гидролиз. Однако достаточно рентабельного способа гидролиза на се годняшний день не найдено. В связи с этим возникает потребность разработки или опти мизации способа гидролиза, который широко использовался в бывшем СССР и России.

Гидролизная промышленность бывшего СССР производила большое количество этанола для технических нужд. В связи с использованием этанола в качестве моторного топлива возникает необходимость расширения сырьевой базы. Альтернативным сырьем можно считать отходы сельского хозяйства, таких как, солома и шелуха злаков, а также ряд дру гих культур с большой скоростью прироста биомассы.

Целью данной работы является исследование химического гидролиза шелухи овса и Мискантуса китайского, исходных и брикетированных. Объекты исследования: шелуха овса урожая 2008 г. (отходы переработки овса ЗАО «Бийский Элеватор») исходная и бри кетированная по технологии [1], биомасса авторской формы ИЦиГ СО РАН Мискантуса китайского урожая 2008 года (Новосибирская область) исходная и брикетированная.

Химический гидролиз проводили известными способами: концентрированной 41 % - ной HCl [2] и разбавленной 10 % - ной H2SO4 [3, 4].

Химический гидролиз 41 % - ной HCl исходной шелухи овса был ранее исследован [5, 6], и результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты гидролиза концентрированной соляной кислотой исследуемых образцов Редуцирующие вещества Масса раство Концентрация Образец ренного веще спирта, % Концентрация, г/дм Выход, % ства, г Шелуха овса 12,3 4,57 37,2 Брикетированная 15,5 5,46 32,2 шелуха овса Ферментацию исходного и обогащенных целлюлозой продуктов проводили в кол бах емкостью 500 мл на перемешивающей платформе марки ПЭ-6410М с частотой коле бания 50 мин-1 при температуре 50 °С в течение 72 ч. В каждую колбу поместили по 5 г исследуемого сырья, 150 см3 ацетатного буфера (рН = 4,7) [7], в котором было растворено 0,083 г ферментного комплекса «ЦеллоЛюкс-А» (производство г. Бердск;

состав комплек са по паспорту: целлюлаза, -глюканаза, ксиланаза, глюкоамилаза). Через определенные промежутки времени отбирали пробу объемом 2 мл и в фильтрате определяли концентра цию глюкозы спектрофотометрическим методом с использованием 3,5 динитросалициловой кислоты [8]. По окончании ферментации проводили фильтрование, сушку осадка на фильтре и определяли убыль массы сырья гравиметрическим методом, а также концентрацию редуцирующих веществ в фильтрате гидролизата по методу Бертра на.

Результаты зависимости концентрации глюкозы от продолжительности фермента ции для шелухи овса и продуктов её переработки представлены на рисунке 1.

Подготовленный таким образом гидролизат разбавляли дистиллированной водой для дальнейшего брожения. В гидролизате определяли массовую концентрацию редуци рующих веществ по методу Бертрана [7]. По окончании брожения из бражки отгоняли этиловый спирт. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Гидролиз 10 % - ным раствором H2SO4 проводили следующим образом: навеску массой 5 г помещали в коническую колбу вместимостью 500 см3, добавляли 200 см3 10 % - ной H2SO4 (гидромодуль 1:40) и кипятили с обратным холодильником на электрической плитке. По окончании определенного времени, содержимое колбы охлаждали, фильтрова ли под вакуумом, осадок на фильтре промывали горячей водой до нейтральной реакции и высушивали. Гидролизат и промывные воды переносили в колбу и нейтрализовали 4 % ным NaOH. Затем отбирали пробу для определения концентрации глюкозы спектрофото метрическим методом [8] и концентрации редуцирующих веществ по методу Бертрана [7].

На рисунке 1 представлена зависимость убыли массы образцов от продолжительно сти гидролиза.

убы ль м ассы, г 2, убы ль м ассы, г 2, 1, 1, 0, 0, 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 продолжительность гидролиза, ч продолжительность гидролиза, ч (а) (б) Рисунок 1 - Зависимость убыли массы образцов от продолжительности гидролиза исходной (а) и брикетированной (б) шелухи овса 14 гл ю к о з ы, г/ д м гл ю к о з ы, г/д м к о н ц ен тр ац и я к о н ц ен тр ац и я 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 продолжительность гидролиза, ч продолжительность гидролиза, ч а) (б) Рисунок 2 - Зависимость концентрации глюкозы от продолжительности гидролиза исходной (а) и брикетированной (б) шелухи овса Из результатов, представленных на рисунке 1, следует, что активный гидролиз про исходил в первые 1,5 ч, и увеличение продолжительности гидролиза не приводило к росту убыли массы сырья.

На рисунке 2 приведена зависимость концентрации глюкозы от продолжительности гидролиза.

Из данных рисунка 2 видно, что основное накопление глюкозы в обоих образцах происходило в первые 0,5 ч гидролиза. Дальнейшее увеличение времени гидролиза не способствовало накоплению глюкозы в гидролизатах.

На рисунке 3 представлена зависимость образования редуцирующих веществ в гид ролизатах исходной и брикетированной шелухи овса до и после инверсии от продолжи тельности гидролиза.

Концентрация РВ, г/дм Концентрация РВ, г/дм 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность гидролиза, ч Продолжительность гидролиза, ч до инв ерсии после инв ерсии до инверсии после инв ерсии а) б) Рисунок 3 - Зависимость образования редуцирующих веществ в гидролизатах: ис ходной (а) и брикетированной (б) шелухи овса до и после инверсии от продолжительности гидролиза Из результатов, представленных на рисунке 3, следует, что концентрация редуци рующих веществ в образцах в течение первого часа гидролиза достигала максимума, при этом концентрация редуцирующих веществ после инверсии в гидролизате брикетирован ного сырья почти в 2 раза выше, чем в гидролизате исходного, и составляла 12 и 6 г/дм3, соответственно.

стандарта глюкозы, Концентрация г/дм 0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность гидролиза, ч Рисунок 4 - Зависимость концентрации глюкозы от времени пребывания в 10 % - ной серной кислоте Аналогичным образом был проведен опыт со стандартом глюкозы 10 г/дм3. Резуль таты опыта представлены на рисунке 4.

Из рисунка 4 видно, что концентрация глюкозы не меняется с продолжительностью обработки 10 % - ной серной кислотой при кипячении, что свидетельствует о стабильно сти глюкозы.

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что брикетированная шелуха овса подвергается химическому гидролизу лучше, чем исходная шелуха овса. Это связано с химическими превращениями лигноцеллюлозной матрицы шелухи в процессе брикетирования – термобарического прессования (200 С, 500 атм.), приводящего к час тичному гидролизу лигноцеллюлозных связей.

Плотность брикетированной шелухи овса (1,33 г/см3) почти в 7 раз выше плотности исходного сырья, этот факт создает дополнительное преимущество при транспортировке и складировании сырья. Кроме того, брикеты имеют максимальную прочность, гладкую, блестящую поверхность без трещин и сколов. Влагопоглощение при хранении брикетиро ванной шелухи овса в течение 1 месяца при температуре 18-20 С и относительной влаж ности воздуха 70-75 % не превышает 1,5-2,0 % [1].

Ранее брикетирование Мискантуса обсуждалось с целью компактирования биомас сы вблизи места выращивания и дальнейшей транспортировки до печей сжигания. Ис пользование брикетированного Мискантуса в качестве объекта для химического гидроли за в данной статье рассматривается впервые.

2,5 2, У б ы л ь м асс ы, г Уб ы ль м ассы, г 2 1,5 1, 1 0,5 0, 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность гидролиза, ч Продолжительность гидролиза, ч (а) (б) Рисунок 5 - Зависимость убыли массы образцов исходного (а) и брикетированного (б) Мискантуса китайского от продолжительности гидролиза К о нц е нт р а ц и я гл ю ко зы, К о н ц е н тр ац и я гл ю к о зы г /л г/л 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность гидролиза, ч Продолжительность гидролиза, ч (а) (б) Рисунок 6 - Зависимость концентрации глюкозы от продолжительности гидролиза исходного (а) и брикетированного (б) Мискантуса На рисунке 5 представлена зависимость убыли массы образцов от продолжительно сти гидролиза, а на рисунке 6 – зависимость концентрации глюкозы от продолжительно сти гидролиза для исходного и брикетированного Мискантуса.

Из результатов, представленных на рисунке 5, следует, что увеличение продолжи тельности гидролиза после 3 ч не приводило к росту убыли массы сырья исходного Мис кантуса, в то время как образец брикетированного Мискантуса продолжал вступать в ре акцию.

Из рисунка 6 следует, что основное накопление глюкозы в обоих образцах проис ходило за первый час реакции. Дальнейшее продолжение гидролиза не способствовало накоплению глюкозы в гидролизатах.

На рисунке 7 представлена зависимость образования редуцирующих веществ в гид ролизатах исходного и брикетированного мискантуса до и после инверсии от продолжи тельности гидролиза.

к о н ц е н т р а ц и я Р В, г /л К о н ц е н тр а ц и я Р В, г/л 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность гидролиза, ч Продолжительность гидролиза, ч до инверсии после инверсии до инверсии после инверсии (а) (б) Рисунок 7 - Зависимость образования редуцирующих веществ в гидролизатах: ис ходного (а) и брикетированного (б) Мискантуса до и после инверсии от продолжительности гидролиза Анализируя результаты, представленные на рисунке 7, следует отметить очевид ную синхронность зависимостей концентрации редуцирующих веществ от продолжитель ности гидролиза до и после инверсии, как для исходного, так и для брикетированного Мискантуса. Сложный характер кривых зависимости редуцирующих веществ от продол жительности гидролиза можно объяснить фактом побочных реакций в условиях выдержки в 10 % - ной серной кислоте в течение длительного времени. Кроме того, имеет место одинаковый характер зависимостей концентраций редуцирующих веществ для исходного и брикетированного Мискантуса при продолжительности гидролиза 1,5 ч, по истечении которых характер зависимостей различается. Концентрация редуцирующих веществ для исходного Мискантуса растет вновь и достигает 8 г/дм3 при 9 ч гидролиза, в то время как редуцирующие в брикетированном Мискантусе претерпевают повторный максимум при ч гидролиза.

По полученным результатам можно сделать выводы, что брикетированные шелуха овса и Мискантус китайский имеют более высокую реакционную способность к химиче скому гидролизу, чем исходное сырье.

Сравнение этих двух видов сырья по гидролизуемости позволяет отдать предпочте ние шелухе овса.

Обнаруженный сложный характер зависимости редуцирующих веществ от продол жительности гидролиза требует дополнительного исследования для объяснения этого факта.

Литература 1. Сакович Г.В., Ильясов С.Г., Василишин М.С., Будаева В.В., Егоров В.Ю. Резуль таты комплексной переработки биомассы // Ползуновский вестник. – № 3, 2008 – С. 259– 266.

2. Яковенко, А.З. Гидролиз древесины концентрированной соляной кислотой / А.З.

Яковенко. – М. – 1958, 60 с.

3. Холькин, Ю.И. Технология гидролизных производств / Ю.И. Холькин. – М.: Лес ная промышленность, 1989. – 496 с.

4. Структура и модификация хлопковой целлюлозы. – Вып. 3. – Ташкент: Издатель ство «Фан» Узбекской ССР. – 1966. – С. 305.

5. Гора А.А., Будаева В.В., Митрофанов Р.Ю. Этанол из шелухи овса./Перспективы создания и применения конденсированных высокоэнергетических материалов: Доклады II научно-технической конференции молодых ученых, Бийск, 25-26 сентября 2008 г. – Бийск:

Изд-во БТИ АлтГТУ, 2008. – С. 63–66.

6. Бурцева Е.А., Гора А.А., Будаева В.В. Ферментативный и химический гидролиз недревесного целлюлозосодержащего сырья / Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Материалы IV Всерос. конф., Барнаул, 21-23 апреля года – Барнаул: Изд-во АГУ, 2009. – Кн. 1. – С. 148–151.

7. ГОСТ 13192–1973. Вина, виноматериалы и коньяки. Метод определения сахаров.

– Введ. 1975–01–01. – М.: ИПК Издательство стандартов, 1999. – 15 с.

8. Коренман, И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений / И.М. Коренман. – М.: Химия, 1970. – 334 с.

ПУТИ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ ГРЕЧИХИ СОРТА «СИБИРЯЧКА»

IN VITRO ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА ЦЕЛОФОРМЕ А.И.Давыдова, А.С.Косолапова, М.Э.Ламберова Бийский технологический институт (филиал) АлтГТУ им. И.И.Ползунова, г.Бийск Гречиха является одной из главных сельскохозяйственных культур в Алтайском крае, поэтому актуальным является получение высокоурожайных сортов, устойчивых к неблагоприятным внешним условиям, особенно к недостатку света, тепла и влаги. Гречи ха при этом сбрасывает завязавшиеся плоды и заново начинает цвести вместо сбора уро жая.

Традиционные методы селекции в настоящее время всё больше заменяются био технологическими. К ним относится метод культуры клеток и тканей in vitro. Для введе ния в культуру различные экспланты изолируют из целого растения, стерилизуют и по мещают на стерильные питательные среды специального состава. Для клеточных культур гречихи это среда Мурасиге и Скуга с разным составом гормонов и других ростовых фак торов. Синтетические гормоны являются дорогостоящими и могут накапливаться в клет ках, вызывая мутации. Из литературы известно, что натуральные можно извлечь из расте ния водно-спиртовыми экстрагентами.

Проблемами являются выбор оптимального экспланта, способа его стерилизации и условий дальнейшего культивирования in vitro.

Стерилизация эксплантов проводится химическими веществами, чтобы избавиться от внешней и внутренней инфекции. При этом растительные клетки должны сохранить свою жизнеспособность. Дезинфицирующие химические вещества могут накапливаться в клетке, вызывая их дальнейшую мутацию. Известно, что проводить стерилизацию можно также при помощи ультразвука. Трудностью этого способа является подбор оптимальных режимов, не нарушающих питательную ценность и устойчивость растения.

При промышленном производстве посадочного материала одной из главных про блем является дорогостоящий агар, и короткий срок между посадками на свежую агаризо ванную питательную среду. Агар является полисахаридом из морских водорослей. При попытке замены агара увидели, что растительные клетки не растут на желатине – белке животного происхождения. К растительным полисахаридам относятся целлюлозосодер жащие материалы разной степени измельчения. Целоформ – один из таких материалов, с размерами частиц 20-50 мкм. Он изготавливается из отходов производства хлопковой ва ты и бинтов, обладает бактерицидными свойствами за счет высокой сорбционной способ ности.

Целью данной работы является получение с помощью УЗ стимуляторов роста из гречихи сорта «Сибирячка» и применение их в культуре клеток и тканей in vitro, иммоби лизованной на целоформе.

Работа выполнялась на кафедре Биотехнологии Бийского технологического инсти тута.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- приготовить водно-спиртовые экстракты из различных частей растения гречихи сорта «Сибирячка»;

- изучить влияние методов обработки эксплантов на эффективность стерилизации;

- изучить влияние типа экспланта на каллусогенез;

- отработать методику иммобилизации и культивирования клеток in vitro на цело форме;

- исследовать влияние ультразвука на эффективность каллусообразования клеток, иммобилизованных на агаре и целоформе, при замене синтетических гормонов на нату ральные.

В работе использовалось природное сырье. Для приготовления экстрактов исполь зовались высушенные листья, стебли, корни полевых растений гречихи сорта «Сибиряч ка», для приготовления эксплантов - проростки семян, гипокотиль корня, зародышевые листья, части листьев.

Подготовленные экспланты и экстракты стерилизовали, обрабатывали УЗ. Иммо билизацию клеток in vitro производили на носителях: агар и целоформ. Культивирование клеток производили в темноте при 25 °С и влажности 70,0 %. На стадии инициации кал лусообразования оценивали показатели эффективности стерилизации и эффективности каллусообразования.

На стадиях иммобилизации клеток гречихи in vitro и инициации каллусообразова ния производили УЗ-обработку и отбор инфицированного материала.

Исходная вата (рисунок 1) состоит из однородных волокон диаметром от 2 до 4 мкм и длиной волокон порядка 20…50 мм, которые имеют гладкую поверхность и относитель ная удельная поверхность их невелика, что не позволяет получить большую сорбционную емкость по отношению к воде и биологическим жидкостям. Целоформ (рисунок 2,3) был получен при механохимическом активировании и измельчении из хлопкового волокна. У целоформа удельная поверхность увеличивается, так как размер волокон уменьшается на три порядка - до 20…50 мкм Сорбционная способность целоформа в 16 раз больше, чем у хлопковой ваты.

Диаметр волокна = 2-4 мкм;

длина волокна = 20-50 мм Рисунок 1 - Хирургическая хлопковая вата (увеличение 24000) Диаметр волокна = 2-4 мкм;

длина волокна = 20-50 мкм Рисунок 2 - Целоформ, полученный из отходов производства хлопковой ваты (увеличение 24000) Диаметр волокна = 2-4 мкм;

длина волокна = 20-50 мкм Рисунок 3 - Целоформ, полученный из отходов производства бинтов (увеличение 24000) При выбранных оптимальных режимах ауксины и гиббереллины были получены в экстрактах из листьев и стеблей, цитокинины в экстрактах из корней (табл.1).

Таблица 1 – Оптимальные режимы получения гормонсодержащих экстрактов из разных частей растения гречихи Соотношение Концентрация УЗ - обработка Фитогормо- Части сырья к этилового ны растения Вт мин экстрагенту спирта, % Листья 1: Ауксины 85,0 320 Стебли 1: Цитокинины Корни 1:20 85,0 320 Листья 1: Гибберелины 85,0 320 Стебли 1: Эффективность стерилизации, % Химическая УЗ Химическая+УЗ Проростки Гипокотиль Зародышевые Части листьев Апикальные Пазушные семян корня листья меристемы меристемы Тип экспланта Рисунок 4 – Сравнительная диаграмма зависимости эффективности стерилизации от способа обработки различных эксплантов гречихи На рисунке 4 представлена сравнительная диаграмма зависимости эффективности стерилизации от способа обработки различных эксплантов гречихи.

Эффективность стерилизации оценивали по количеству неинфицированных экс плантов в пробирках после стерилизации, выраженная в процентах, от исходного количе ства стерилизуемых эксплантов. Стерилизацию проводили тремя методами: химической обработкой 70,0 %-ным этиловым спиртом, обработкой ультразвуком заранее подобран ным оптимальными режимами воздействия, и совместной химической и ультразвуковой обработкой.

Наилучшие показатели эффективности стерилизации были отмечены при обработке эксплантов в виде проростков семя и зародышевых листьев совместной обработкой хими ческой и УЗ.

На рисунке 5 представлена сравнительная диаграмма зависимости эффективности каллусообразования от типа экспланта.

Эффективность каллусообразования, % 1 2 3 4 5 Варианты Варианты: 1 – проростки семян;

2 – гипокотиль корня;

3 – зародышевые листья;

4 – части листьев;

5 – апикальные меристемы;

6 - пазушные меристемы.

Рисунок 5 – Сравнительная диаграмма зависимости эффективности каллусогенеза от типа экспланта Эффективность каллусообразования определяли по количеству стерильных экс плантов, образовавших каллус, в процентах, от исходного количества вводимых в культу ру эксплантов.

Наилучшие показатели эффективности каллусообразования были получены при культивировании эксплантов в виде проростков семян и зародышевых листьев. Эти экс планты были использованы в последующих опытах.

Эффективность стерилизации, % неделя неделя неделя неделя неделя Химическая УЗ Химическая+УЗ Способ обработки Рисунок 6 – Сравнительная диаграмма зависимости эффективности стерилизации от способа обработки эксплантов На рисунке 6 представлена сравнительная диаграмма зависимости эффективности стерилизации от способа обработки эксплантов.

Стерилизацию проводили раз в неделю на протяжении 5 недель тремя методами.

На протяжении 5 недель культивирования наилучшие показатели эффективности стерили зации были отмечены при совместной обработке эксплантов ультразвуком и этиловым спиртом.

90 Эффективность каллусообразования, % Без УЗ УЗ 40 Агар Целоформ Тип носителя Температура (25±2) 0С, в темноте, влажность 70,0 % Доза цитокининсодержащего экстракта 10,0 % Доза ауксинсодержащего экстракта 10,0 % Режимы УЗ-воздействия: мощность 240 Вт, длительность 3 минуты Рисунок 7 – Сравнительная диаграмма зависимости эффективности каллусообразования клеток гречихи, иммобилизованных на различных носителях, от воздействия ультразву ком при замене синтетических фитогормонов на натуральные На рисунке 7 представлена сравнительная диаграмма зависимости эффективности каллусообразования клеток гречихи, иммобилизованных на агаре и целоформе, от воздей ствия ультразвуком при замене фитогормонов на натуральные.

На данном этапе изучали возможность использования натуральных гормонсодер жащих экстрактов вместо синтетических фитогормонов питательной среды. В ряде опы тах было установлено, что для культивирования клеток in vitro оптимальными дозами для ауксин- и цитокининсодержащего экстрактов являются по 10,0 % каждого от объема пи тательной среды.

Сравнивали эффективность каллусообразования клеток, иммобилизованных на но сителях без УЗ, и при обработке УЗ. При выбранных режимах УЗ-обработки мощностью 240 Вт и длительностью 3 минуты, эффективность каллусообразования на обоих носите лях выше, чем без УЗ-обработки.

Впервые показана принципиальная возможность и отработана методика иммобили зации и культивирования клеток гречихи in vitro на целоформе. Все контролируемые по казатели на агаризованных средах были выше, чем на целоформе.

К преимуществам целоформа относится его низкая стоимость, возможность его многократного использования по сравнению с дефицитным дорогостоящим агаром, что особенно важно при промышленном круглогодичном процессе.

По результатам данной работы можно сделать следующие выводы:

- приготовлены оптимальные водно-спиртовые экстракты из различных частей растения гречихи сорта «Сибирячка». Ауксинсодержащий экстракт - из листьев и стеблей;

цитокининсодержащий экстракт - из корней;

- изучено влияние методов обработки эксплантов на эффективность стерилизации.

Наилучший эффект стерилизации был получен при совместной химической и УЗ обработке, который на 53,0 % выше, чем при химической обработке, и на 25,0 % лучше, чем при УЗ-обработке;

- изучено влияние типа экспланта на каллусогенез. Оптимальными являются экс планты в виде проростков семян и зародышевых листьев, при этом эффективность каллу сообразования составляет 60,0 % и 70,0 % соответственно;

- впервые отработана методика иммобилизации и культивирования клеток гречи хи in vitro на целоформе;

- исследовано влияние ультразвука на эффективность каллусообразования клеток гречихи, иммобилизованных на агаре и целоформе, при замене синтетических фитогор монов на натуральные. При обработке ультразвуком эффективность каллусообразования на всех видах носителей больше, чем на носителях, необработанных УЗ на 12,0 %.

ПРИМЕНЕНИЕ АЛЮМОАДСОРБЕНТОВ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ СОИ СОРТА «АЛТОМ» IN VITRO И.В.Денисова, А.С.Косолапова, М.Э.Ламберова Бийский технологический институт (филиал) АлтГТУ им. И.И.Ползунова, г.Бийск Для Алтайского края соя не является традиционной сельскохозяйственной культу рой, и к районированным относится сорт «Алтом». Увеличение его урожайности возмож но за счет повышения устойчивости к неблагоприятным климатическим условиям, в том числе при освобождении растений от внутренней инфекции биотехнологическими мето дами. К ним относится технология культуры клеток и тканей in vitro, для которой акту альным является упрощение и удешевление процесса, замена синтетических гормонов и других стимуляторов роста в питательных средах на натуральные, а также дорогостояще го агара на другие носители, с помощью которых возможно разработать менее трудоём кую методику иммобилизации клеток. Так же можно подобрать носители, обладающие большей электропроводностью и способностью пропускать УЗ-волны, чем агаризованная среда. УЗ – обработка в оптимальных режимах может интенсифицировать процесс стери лизации эксплантов и рост клеток in vitro.

Иммобилизация – это нанесение фермента, целых или разрушенных клеток на но ситель, нерастворимый в воде. Носитель может быть органической или неорганической природы, методы иммобилизации на них бывают физические химические. При иммобили зации клеток на органическом носителе – агаре, требуются частые пересевы на свежую агаризованную среду, это связанно с тем, что исчерпываются питательные вещества, на капливаются продукты жизнедеятельность клеток, ингибирующие их рост, кроме того, сам агар не может использоваться повторно.


Выбор алюмоадсорбента, как носителя, требует отработки способа нанесения на него клеток и питательной среды в стерильных условиях, для получения хороших показа телей клеточного роста.

Алюмоадсорбент – гиббсит используется в химической промышленности для уст ранения нежелательных примесей из смесей.

Целью данной работы является получение с помощью УЗ стимуляторов роста из сои сорта «Алтом» и применение их в культуре клеток и тканей in vitro, иммобилизован ной на алюмоадсорбенте.

Работа выполнялась на кафедре биотехнологии Бийского технологического инсти тута.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- приготовить оптимальные экстракты из различных частей сои сорта «Алтом»;

- подобрать оптимальное количество экстракта для замены синтетических стимуля торов роста в среде МС;

- отработать режимы стерилизации химическими реагентами и ультразвуком;

- отработать методику иммобилизации клеток на алюмоадсорбенте;

- оценить влияние ультразвука на эффективность стерилизации и каллусообразова ния;

- изучить влияние УЗ и стимуляторов в экстрактах из различных частей растения на инициацию каллусообразования ;

- изучить влияние УЗ и носителя на каллусообразование;

- установить зависимость прироста биомассы каллуса от различных факторов.

Для приготовления экстрактов использовались высушенные части растений сои сорта «Алтом». В приготовленных оптимальных экстрактах определяли присутствие фи тогормонов по методу биотестов.

В качестве эксплантов были выбраны зародышевые листья сои. Подготовленные экспланты и экстракты стерилизовали, обрабатывали УЗ. Экстракты затем использовались при приготовлении питательной среды МС (таблица 1).

Иммобилизацию клеток in vitro производили на носителях: агар, алюмоадсорбент гиббсит. Для этого агаризованную среду готовили по стандартной методике, а алюмоад сорбент помещали в сосуд, заливали жидкой средой МС (таблица 1), затем на поверхность носителя наносили эксплант. Носитель с закреплённым на нем эксплантом заливали новой порцией жидкой среды МС, в которой меняли состав факторов роста в зависимости от стадии культивирования. Это уменьшало возможность инфицирования клеток и среды и существенно уменьшало расход носителя.

Культивирование иммобилизованных клеток производили в темноте при темпера туре 26 °С и влажности 70,0 %. На стадиях иммобилизации и культивирования произво дили УЗ-обработку. На стадии культивирования оценивали эффективность стерилизации и каллусообразования клеток сои. На стадии размножения каллуса оценивали прирост биомассы. На всех стадиях проводили отбор инфицированного материала. Посуду, инст рументы, ламинар-бокс предварительно стерилизовали.

Таблица 1 - Состав модифицированной питательной среды Мурасиге-Скуга Химическая Конц-я, Наименование компонентов формула мг/л 1 2 Макроэлементы:

Аммоний азотнокислый 1, NH4NO Калий азотнокислый 1, KNO CaCl2 6H2O Кальций хлористый 0, MgSO47H2O Магний сернокислый 0, Калий фосфорнокислый однозамещенный 0, KH2PO Микроэлементы:

Кислота борная H3BO4 6, Калий йодистый KI 0, CoCl26H2O Кобальт хлористый 6 - водный 0, MnSO4 5H2O Марганец сернокислый 5-водный 22, CuSO45H2O Медь сернокислая 5 - водная 0, Натрий молибденовокислый Na2MoO4 0, ZnSO47H2O Цинк сернокислый 7 - водный 8, Хелаты железа:

FeSO47H2O Железо сернокислое 7 - водное 27, Трилон Б C10H14O8N2Na2 37, Органические вещества:

Сахароза 30, C12H22O Мезоинозит C6H6(OH)6 100, Никотиновая кислота (РР) C5H4NCOOH 0, Пиридоксинхлорид (В6) C8H10O3NCl 0, Тиаминхлорид (В1) C13H16ON4ClS 0, Носители:

Агар микробиологический 6, Алюмоадсорбент (гиббсит) Al(OH)3, фракционный состав 20-200 мкм Sудельная – 0,2 м2/г, Vпор= 0,01 см3/г Факторы роста:

1. Инициация каллусообразования :

2,4 - Д С8Н6О3Сl2 0, Кинетин C10H9N5O 0, 2. Размножение биомассы каллуса :

- НУК С12Н10О2 0, Кинетин C10H9N5O 0, эксперименталь Экстракты из листьев, стеблей и корней ный сои подбор на всех стадиях 1неделя 2 неделя 3 неделя стерилизации, % Эффективность 4 неделя 5 неделя 1 2 Варианты Экспланты – зародышевые листья сои.

Температура (26±1) °С, влажность 70,0 %, в темноте, агаризованная среда МС.

Стерилизация 70,0 %-ным этиловым спиртом и УЗ 240 Вт 1 мин.

Варианты обработки:

1 – однократная УЗ-обработка 240 Вт 1 мин после посадки, 2 – УЗ-обработка 240 Вт 1 мин каждый день в течение первой недели, 3 – УЗ-обработка 240 Вт 1 мин раз в неделю, в течение 5 недель культивирования Рисунок 1 – Сравнительная диаграмма зависимости эффективности стерилизации эксплантов сои от вариантов УЗ-обработки и продолжительности культивирования in vitro Эффективность каллусообразования, % 30 Агар Алюмоадсорбент(гиббсит) Экспланты – зародышевые листья сои. Температура (26±1) °С, влажность 70,0 %, в темноте.

Стерилизация 70,0 %-ным этиловым спиртом и УЗ 240 Вт 1 мин.

Варианты культивироваия:

1 – питательная среда МС с синтетическими гормонами, 2 – питательная среда МС с экстрактами:

10,0 % ауксинсодержащего и 10,0 % цитокининсодержащего, 3 – питательная среда МС с экстрактами:

10,0 % ауксинсодержащего и 10,0 % цитокининсодержего, УЗ-обработка 240 Вт 1 мин раз в неделю в течение 5 недель Рисунок 2 - Сравнительная диаграмма зависимости эффективности каллусообразо вания клеток сои от различных факторов В ходе проделанных опытов определили оптимальный метод стерилизации (этило вый спирт 70,0 %об. и УЗ). Мощность УЗ варьировали от 40 до 400 Вт, продолжитель ность от 1 до 5 минут. Оптимальная для стерилизации параметры мощность 240 Вт дли тельность 1 минута. Сосуды со стерильными эксплантами подвергали трем вариантам УЗ обработки: однократно после посадки, каждый день в течение первой недели культивиро вания, раз в неделю в течение пяти недель. Наиболее эффективным оказался третий вари ант, режимы которого использовались в дальнейших опытах.

На рисунке 2 представлена сравнительная диаграмма зависимости эффективности каллусообразования клеток сои от различных факторов. Концентрации в среде МС экс трактов, содержащих ауксины и цитокинины варьировали и установили оптимальные концентрации – по 10,0 % каждого.

Из диаграммы видно, что на питательных средах с экстрактами эффективность кал лусообразования несколько ниже, но при использовании УЗ этот показатель удалось уве личить. Также из диаграммы видно, что УЗ оказывает большее воздействие на экспланты, иммобилизованные на алюмоадсорбенте.

р р с и м с ы а л с,% П и о тб о а с к л у а Агар Алюмоадсорбент (гиббсит) Экспланты – зародышевые листья сои. Температура (26±1) °С, влажность 70,0 %, в темноте.

Стерилизация 70,0 %-ным этиловым спиртом и УЗ 240 Вт 1 мин.

Варианты культивироваия:

1 – питательная среда МС с синтетическими гормонами, 2 – питательная среда МС с экстрактами:

10,0 % ауксинсодержащего и 10,0 % цитокининсодержащего, 3 – питательная среда МС с экстрактами:

10,0 % ауксинсодержащего и 10,0 % цитокининсодержего, УЗ-обработка 240 Вт 1 мин раз в неделю в течение 5 недель Рисунок 3- Сравнительная диаграмма зависимости прироста биомассы каллуса сои от различных факторов На рисунке 3 представлена сравнительная диаграмма зависимости прироста био массы каллуса сои от различных факторов. В целом наибольший прирост биомассы кал луса наблюдался на среде с синтетическими гормонами, при культивировании на среде с экстрактами это значение несколько снижалось. При УЗ-обработке показатель прироста биомассы приблизился к значениям, полученным на средах с синтетическими гормонами.

По результатам данной работы можно сделать следующие выводы:

- приготовлены оптимальные водно-спиртовые экстракты из различных частей рас тения сои сорта «Алтом»;

- изучено влияние методов обработки эксплантов на эффективность стерилизации.

Наилучший эффект стерилизации был получен при совместной обработке химической и УЗ, который составил – 95,0…100,0 %, что на 36,8 % больше, чем при химической обра ботке, и на 42,0 % - чем при УЗ-обработке;

- изучено влияние типа экспланта на каллусогенез. Оптимальными являются экс планты в виде зародышевых листьев, при этом эффективность каллусообразования соста вила 60,0 %;

- отработана методика иммобилизации и культивирования клеток сои in vitro на алюмоадсорбенте;

- исследовано влияние ультразвука на прирост биомассы каллуса и эффективность каллусообразования и клеток сои, иммобилизованных на алюмоадсорбенте, при замене синтетических фитогормонов на натуральные. При обработке ультразвуком эффектив ность каллусообразования увеличилась на 12,0 %, при этом прирост биомассы увеличился на 7,5 %.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ РОСТСТИМУЛЯТОРОВ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ И УРОЖАЙ ЗЕРНОВЫХ Е.А. Комарова, Н.И. Мезенцева Бийский технологический институт (филиал) АлтГТУ им. И.И.Ползунова, г.Бийск В настоящее время одной из важнейших задач растениеводства является стабили зация экономически оправданных уровней урожайности зерновых и улучшения их техно логических качеств, а также сохранение плодородия земель.

В условиях Сибири и Алтайского края распространено явление послепосевных по терь семенного зерна, это свидетельствует об исключительно большом практическом зна чении проблемы всхожести и выживаемости ростков зерновых. Существует закономер ность: чем выше энергия прорастания семян, тем более высокий можно ожидать урожай [1].

Для решения этой проблемы ведется поиск новых эффективных препаратов, спо собных повлиять на интенсификацию процесса прорастания семян и связанного с ним по вышения активности ферментов. Создаются фиторегуляторы нового поколения, воздейст вующие на растение в минимальных дозах (несколько мг на га посевов). Это имеет огром ное экологическое значение [2].


Многолетние исследования действия предпосевной обработки семян и растений во время вегетации препаратами растительного происхождения показали их стимулирующую эффективность в усилении обменных и ростовых процессов. Комплексное воздействие препаратов вызывало изменение в обмене веществ растений, которые в определенной сте пени сохранялись в первом поколении обработанной пшеницы [3,4].

В нашей работе исследовались девять видов ростстимуляторов растений, получен ных на кафедре биотехнологии БТИ г. Бийска, НИИ Агрохимии г. Барнаула и НИИ генети ки и селекции г. Новосибирска (В – вьюнок полевой - конар, Л- лариксин, Т – талисман, Н – новосил, ННГ – смесь новосил-гуматы, ЛНГ – смесь лариксин-новосил-гуматы, ГС – гуматы смесь, ЛТН – смесь лариксин-талисман-новосил, контрольный варианты: Г – гиб береллин и без обработки).

Целью работы являлось изучение влияния обработки зерновок пшеницы в юве нильный период развития различными стимуляторами роста и их смесями на энергию прорастания, изменение активности гидролитических и окислительных ферментов, а также на показатели урожая пшеницы.

В задачи исследования входило:

- провести проращивание пшеницы при действии стимуляторов роста в различных дозах и определить энергию прорастания зерновок пшеницы в лабораторных условиях;

- определить амилолитическую активность и активность каталазы проростков пше ницы при действии используемых препаратов;

- провести анализ урожая опытных и контрольных вариантов;

- изучить последействие применяемых препаратов на амилолитическую, каталаз ную и пероксидазную активность прорастающего зерна второго поколения пшеницы;

- определить характер стимуляционного эффекта препаратов.

В первой части работы изучалась действие предпосевной обработки различными дозами вышеперечисленных препаратов на энергию прорастания пшеницы [5], а также на активность ферментов [6,7] прорастающего зерна в динамике и на седьмые – восьмые су тки развития.

Контроль (вода) Лариксин Конар Новосил ННГ ЛНГ ГС Гибберрелин ЛТН Талисман 2 3 Сутки Рисунок 1 – Энергия прорастания семян пшеницы при действии ростстимуляторов в гидромодуле 1:1000000 (что соотвествует дозе 0,9 мл/т) Согласно графику большая часть ростстимуляторов оказывает благотворное влия ние на энергию прорастания опытных растений. Она особенно высока в варианте с гиббе реллином, а также Конаром и смесью Лариксин – Талисман - Новосил., то есть стимуля торы индуцируют ростовые процессы зерновок пшеницы.

Далее исследовалась влияние препаратов на активность амилаз прорастающего зерна.

Контроль Лариксин Конар Новосил ННГ ЛНГ ГС Гибберрели 0 н ЛТН 90 мл/т 9 мл/т 0,9 мл/т мл/т Талисман Доза препарата Рисунок 2 – Амилолитическая активность проростков пшеницы на седьмые сутки развития при действии ростстимуляторов (в % к контролю) Из графика видно, что добавление ростстимуляторов, как правило, повышает ак тивность амилазы. Очевидно, что обработка зерновок препаратами почти во всех вариан тах оказывает активирующее действие на ферментативную активность при прорастании пшеницы за редким исключением.

Контроль Лариксин 120 Конар 100 Новосил ННГ ЛНГ ГС Гибберрелин ЛТН Талисман 90 мл/т 9 мл/т 0,9 мл/т Доза препарата Рисунок 3 – Влияние препаратов на каталазную активность проростков пшеницы на восьмые сутки развития (в % к контролю) Согласно графику можно сказать, что добавление ростстимуляторов повышает ка талазную активность. При этом с уменьшением концентрации ростстимулятора эффект возрастает. Из этого следует, что наилучшим действием обладают дозы 9,0 мл/т и 0,9 мл/т.

Контроль Лариксин Конар Новосил ННГ ЛНГ ГС Гиббереллин ЛТН Талисман 3 4 5 6 Сутки Рисунок 4 - Изменение амиолитической активности проростков пшеницы под действием ростстимуляторов в динамике (АС ед./г) Из графика видно, что активность амилазы в течение ювенильной вегетации при действии ростстимуляторов достигает своего максимального отклонения от контроля на пятые сутки, а затем эта разница уменьшается. Самая высокая активность наблюдается при обработке препаратом Талисман и смесью ГС. Остальные стимуляторы оказывают более мягкое действие По результатам исследований были выбраны наиболее эффективные препараты и изучено их последействие.

В 2007–2008гг были заложены полевые опыты, на базе НИИ Агрохимии.

Проводилась предпосевная обработка зерновок пшеницы Алтайская - 100 выбран ными для полевых опытов препаратами. Затем посевы обрабатывались 1 раз в период ве гетации. В конце опыта были определены важнейшие физиолого-биохимические показа тели урожая пшеницы и установлен класс зерна.

Таблица 1 - Показатели урожая пшеницы Алтайская-100, в последействии используемых препаратов БАВ Масса Выход Средняя Класс зерна 1000 зерен (г) клейковины, урожайность НСР05=0,7 г % (ц/га) НСР05=1,9 ц Контроль 32.2 30.0 25.8 II Новосил – 50 мл/т 32.6 30.8 29.2 II Новосил – 30 мл/т 32.3 32.8 28.6 I Лариксин – 50 мл/т 31.6 32.0 30.0 I Лариксин – 100 мл/т 32.5 30.4 25.7 II Лариксин ТН – 50мл/т 33.3 30.4 29.2 II Лариксин Б – 100 мл/т 33.5 31.6 30 II Конар – 30 мл/т 32.0 31.2 29 II Конар – 70 мл/т 32.8 30.2 26.8 II Смола № 76 – 70 мл/т 29.9 33.2 27.5 I Осина – 30 мл/т 33.7 33.2 26.6 I На основании табличных данных можно отметить, что обработка биологически ак тивными веществами улучшает качество зерна.

Далее было изучено последействие ростстимуляторов на активность ферментов прорастающих зерновок пшеницы второго поколения.

Контроль 500 Новосил – 50 мл/т Новосил – 30 мл/т Лариксин – 50 мл/т Лариксин – 100 мл/т Лариксин ТН – 50мл/т Лариксин Б – мл/т Конар – 30 мл/т 2-е сутки 5-е сутки 7-е сутки Рисунок 5 – Изменение амилолитической активности (АС ед./г) пшеницы Алтайская - 100 в последействии препаратов в первую неделю прорастания зерно вок На седьмые сутки активность амилазы в контроле максимальна. Во всех остальных вариантах амилолитическая активность не только ниже контроля, но также и ниже, чем на пятые сутки. Это свидетельствует о том, что пик активности амилолитических ферментов в последействии у прорастающих зерновок пшеницы наступает раньше, чем обычно. Про исходит ускорение процессов метаболизма. Нужно отметить, что самая высокая актив ность амилазы наблюдается в последействии Новосила в дозе 30 мл/т и Лариксина - мл/т и 50 мл/т.

Контроль Новосил – 50 мл/т Новосил – 30 мл/т Лариксин – 50 мл/т Лариксин – 100 мл/т 60 Лариксин ТН – 50мл/т Лариксин Б – 100 мл/т Конар – 30 мл/т Осина – 30 мл/т Смола № 76 – 70 мл/т 4 сутки 8 сутки Рисунок 6 – Последействие ростстимуляторов на пероксидазную активность (в % к контролю) проростков пшеницы Алтайская- Из графика видно, что пероксидазная активность снижена во всех опытных вариан тах, исключение действие Новосила. Лариксин ТН понижает пероксидазную активность на 60 %.

Контроль Новосил – 50 мл/т Новосил – 30 мл/т Лариксин – 50 мл/т Лариксин – 100 мл/т Лариксин ТН – 50мл/т Лариксин Б – 100 мл/т Конар – 30 мл/т Осина – 30 мл/т Смола № 76 – 70 мл/т 4 сутки 6 сутки 8 сутки Рисунок 7 - Последействие ростстимуляторов на каталазную активность (в % к контролю) проростков пшеницы Алтайская- Последействие ростстимуляторов незначительно влияет на активность каталазы пшеницы. Показатели активности близки к контрольному варианту или ниже его.

Итак, препараты оказали стимулирующее воздействие на физиологические и росто вые процессы порастающего зерна, а также на продуктивность пшеницы Алтайская – 100.

Обработка различными ростстимуляторами зерновок пшеницы повлияло на друж ность прорастания, а также на рост и развитие в онтогенезе.

В действии ростстимуляторов в начале развития (ювенильный период) привело к активации амилаз во всех вариантах, особенно следует отметить препарат Талисман, Ла риксин и Конар.

Активность каталазы проростков пшеницы ингибировалась большими дозами пре паратов и значительно возрастала при уменьшении этой дозы, (исключение составляет вариант ГС).

Стимуляция обмена веществ и роста опытных растений препаратами в конечном итоге сказывается на продуктивности пшеницы. Увеличился абсолютный вес зерна, озер ненность колоса и количество зерна в ц на гектар. Зерно опытных растений имело повы шенный выход клейковины.

Показано сохранение эффекта увеличения активности амилаз в проростках пшени цы второго поколения на ранних этапах развития.

Предполагается, что наблюдаемый стимуляционный эффект есть один из случаев вторичной стимуляции растительного организма.

Таким образом, исследование стимуляционного эффекта в далеком последействии применяемых веществ в целях ускорения прорастания и связанной с этим активации фер ментного аппарата, возможного влияния на продуктивность и качество урожая зерновых представляет практический интерес.

Литература 1. Реймерс, Ф.Э., Илли, И.И. Прорастание семян и температура.Новосибирск:

Наука. – 1978. - С.104- 2. Серова, О.К. Последействие закаливания проростков пшеницы на урожай.

Физиологические механизмы адаптации и устойчивости у растений. Новосибирск: Наука.

– 1983. – С.19- 3. Сельскохозяйственная биотехнология./ Под. ред. В.С. Шевелухи, М:

Высшая школа. – 1999. – 405с.

4. Мезенцева, Н.И., Лаптев, С.В., Бастер, Ю.В., Индукция гидролаз прорастающего ячменя биологически активными веществами растительного происхождения. // Производные хитозана и стимуляторы роста в сельском хозяйстве. – Материалы 4-ой межрегиональной научно-практ. конф. – Бийск 2006. – С. 84-94.

5. Инструкция по технохимическому контролю пивоваренного производства.

– М.: Пищевая промышленность, 1975 г.

6. Рухлядьева, А.П., Полыгалина, Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 288с.

7. Кучеренко, Н.Е., Бабенюк, Ю.Д., Васильев, А.Н. Биохимия: Практикум.

Киев: «Высшая школа». Издательство при Киевском университете, 1988 - с. 100-102.

ПОЛУЧЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ УЛЬТРАЗВУКА СТИМУЛЯТОРОВ РОСТА ИЗ КАРТОФЕЛЯ СОРТА «ЛУГОВСКОЙ» И ПРИМЕНЕНИЕ ИХ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА МКЦ Е.С. Карташова, А.С. Косолапова, М.Э. Ламберова Бийский технологический институт (филиал) АлтГТУ им. И.И.Ползунова, г.Бийск В настоящее время для Алтайского края является актуальным выведение новых сортов картофеля и улучшение уже существующих устойчивых к воздействию стрессовых природных факторов, а так же к различным видам бактерий, грибов и вирусов, сорнякам и насекомым-вредителям. Традиционно для этого требовалось проведение сезонных поле вых экспериментов. По – другому проблему можно решить методом культуры клеток и тканей за счет микроклонального размножения оздоровленных растений – регенерантов и получить в лабораторных условиях суперэлитный безвирусный посадочный материал.

Технология культуры клеток и тканей является фундаментальной и трудоемкой, поэтому актуальным является ее интенсификация, например за счет подбора стимулято ров роста.

Стимуляторы клеточного роста делят на синтетические и натуральные. Из литера туры известно, что к ним относятся пептиды, аминокислоты, фитогормоны и другие ве щества. Синтетические накапливаются в клетках при длительном их культивировании на питальных средах и это может привести к мутациям. Из исходного растения натуральные можно получить путем экстракции с применением режимов, разрушающих клеточные компоненты, например, с помощью ультразвука. При введении в культуру клеток и тканей in vitro картофеля обязательно нужно отработать выбор оптимального экспланта, способ стерилизации в зависимости от типа экспланта, а затем состав среды и режимы культиви рования клеток, введенных в культуру.

Установлено, что наиболее оптимальной питательной средой для каллусообразова ния картофеля in vitro является агаризованная среда Мурасиге и Скуга (МС).Для интен сификации этих процессов среда МС может подвергается различным модификациям. На пример, путем замены дорогостоящего и дефицитного полисахарида агара на носитель микрокристаллическую целлюлозу.

К факторам, влияющим на скорость роста клеток, относится ультразвук (УЗ).

Целью данной работы является получение с помощью УЗ стимуляторов роста из картофеля сорта «Луговской» и применение их в культуре клеток и тканей in vitro, иммобилизованной на микрокристаллической целлюлозе.

Работа выполнялась на базе лаборатории кафедры «Биотехнология» Бийского тех нологического института.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- приготовить оптимальные экстракты целевого назначения из различных частей картофеля сорта «Луговской»;

- подобрать оптимальное количество экстракта для замены синтетических стимуля торов роста в среде МС;

- отработать режимы стерилизации эксплантов картофеля химическими реагентами и ультразвуком;

- отработать методы иммобилизации клеток на МКЦ;

- оценить влияние ультразвука на эффективность стерилизации и каллусообразова ние;

- изучить влияние стимуляторов в экстрактах из различных частей растения на инициацию каллусообразования ;

- изучить влияние носителя на каллусообразование.

На рисунке 1 представлена блок – схема эксперимента. Из наземного растения кар тофеля были взяты стебли, листья, корни, для приготовления водных и водно - спиртовых экстрактов. Они изготавливались из листьев, стеблей и корней которые предварительно высушивали и измельчали. В различных соотношениях добавляли воду и этиловый спирт с разной концентрацией, затем воздействовали УЗ при различной длительности и мощно сти. Экстракты контролировали по концентрации общих аминокислот, по содержанию общего белка и наличию: ауксинов, гиббереллинов, цитокининов, определяемых методом биотестов. После этого оптимальный экстракт подвергали стерилизации. И использовали при приготовление питательной среды МС для культивирования стерильных эксплантов.

Из растения картофеля сорта «Луговской» были приготовлены экспланты в виде почек клубня, пазушных и апикальных меристем, а также проростков семян, которые стерилизо вались различными химическими способами и УЗ. После этого осуществляли стадию им мобилизации клеток in vitro на двух видах носителей – это агар и МКЦ. На этой стадии была применена УЗ – обработка. После этого происходила инициация каллусообразования - на этой стадии был отбор инфицированного материала, а также оценивали показатели:

эффективность стерилизации, рассчитанную по количеству неинфицированных эксплан тов в % от общего количества эксплантов, вводимых в культуру in vitro, а также эффек тивность каллусообразования, которую вычисляли по количеству эксплантов, давших каллус, от общего числа стерильных эксплантов.

Все опыты проводились в трехкратной повторности, средние значения записыва лись в таблицы, по которым строились графики, из которых выбирались оптимальные значения, которые использовались в дальнейших опытах и при построении сравнительных диаграмм.

Сырье (картофель сорта “Луговской”) стебли листья Почки клубня, пазушные и корни апикальные меристемы, проро стки семян Приготовление экстрактов стерилизация Приготовление пита- Водно-спиртовые Водные экстракты тельной среды МС экстракты Иммобилизация клеток Соотношение сырья и экстрагента in vitro Концентрация спирта в водно-спиртовых экстрактах Агар МКЦ УЗ-обработка Приготовление УЗ- оптимального обработка экстракта Определение показа телей белки Оценка показа аминокислоты телей ауксины Эффективность сте гиббереллины рилизации Инициация каллусообразования цитокинины Отбор инфициро- Эффективность каллу ванного материала сообразования Рисунок 1 - Блок схема эксперимента В таблице 1 представлены стимуляторы клеточного роста, из них в данной работе были получены неспецифические – пептиды и аминокислоты, а также специфические – фитогормоны ауксины, цитокинины, гиббереллины в экстрактах из разных частей натив ных растений картофеля.

Таблица 1 - Стимуляторы клеточного роста Неспецифические Специфические ПАВ Фитогормоны в том числе:

Пептиды ауксины Аминокислоты цитокинины Жирные кислоты гиббереллины Антиоксиданты Абсцизины Нуклеотиды Ферменты в том числе:

Витамины РНК – азы ДНК – азы АБК – абсцизовая кислота ГА – гиббереллины ИУК – индолил 3-уксусная кислота ЦК – цитокинины Рисунок 2 - Схема локализации синтеза и транспорта фитогормонов в растении Таблица 2 – Экспресс - метод биотестов по определению наличия фитогормонов в экс тракте [1] Наименование фитогормона Наблюдаемый результат Ауксин Происходит быстрое образование корней у черенка Гиббереллин Происходит увеличение черенка в длину Цитокинин Образуется каллус в местах среза, то есть делящиеся клетки, не дифферен цированные в ткани 62,3 61, 59, 57, 55, Содержание общего белка, мкг/мл 47, Водные экстракты Воно-спиртовые экстракты Листья Стебли Корни Варианты Листья: соотношение сырья к экстрагенту – 1:40, концентрация этилового спирта – 60, 0 % Стебли: соотношение сырья к экстрагенту – 1:60, концентрация этилового спирта – 40, 0 % Корни: соотношение сырья к экстрагенту – 1:80, концентрация этилового спирта – 60, 0 % Рисунок 3 - Сравнительная диаграмма зависимости содержания общего белка в экстрактах от соотношения сырья к экстрагенту, типа экспланта, концентрации этилового спирта Листья: соотношение сырья к экстрагенту – 1:40, концентрация этилового спирта – 60, 0 % Стебли: соотношение сырья к экстрагенту – 1:60, концентрация этилового спирта – 40, 0 % Корни: соотношение сырья к экстрагенту – 1:80, концентрация этилового спирта – 60, 0 % Режимы УЗ-обработки – 1 минута, 320 Вт Рисунок 4 - Сравнительная диаграмма зависимости содержания общего белка в экстрактах от соотношения сырья к экстрагенту, типа экспланта, концентрации этилового спирта и УЗ - обработки 1,4 1, 1, 1, 1, 1, aH л 0, О ъ 1НN O, м 0, 0, Водные экстракты Воно-спиртовые экстракты 0, б ем 0, 0, Листья Стебли Корни Варианты Листья: соотношение сырья к экстрагенту – 1:60, концентрация этилового спирта – 60, 0 % Стебли: соотношение сырья к экстрагенту – 1:20, концентрация этилового спирта – 90, 0 % Корни: соотношение сырья к экстрагенту – 1:60, концентрация этилового спирта – 70, 0 % Рисунок 5 - Сравнительная диаграмма зависимости содержания общих аминокислот в экс трактах от соотношения сырья к экстрагенту, типа экспланта, концентрации этилового спирта Листья: соотношение сырья к экстрагенту – 1:60, концентрация этилового спирта – 60, 0 % Стебли: соотношение сырья к экстрагенту – 1:20, концентрация этилового спирта – 90, 0 % Корни: соотношение сырья к экстрагенту – 1:60, концентрация этилового спирта – 70, 0 % Режимы УЗ-обработки – 1 минута, 320 Вт Рисунок 6 - Сравнительная диаграмма зависимости содержания общих аминокислот в экс трактах от соотношения сырья к экстрагенту, типа экспланта, концентрации этилового спирта и УЗ - обработки На рисунке 3, 4, 5, 6 представлены сравнительные диаграммы зависимости содер жания в водных и водно – спиртовых экстрактах общего белка, суммы аминокислот от концентрации этилового спирта (которая изменялась от 10 до 90 % об.), соотношения сы рья к экстрагенту (от 1:10 до 1:100) и УЗ – обработки с изменением мощности от 40 до Вт и длительности от 1 до10 минут. При выбранных оптимальных соотношениях сырья к экстрагенту для листьев, стеблей и корней, а также при оптимальной концентрации этило вого спирта наибольшее содержание общего белка наблюдалось в водно – спиртовых экс трактах из листьев и стеблей. Использование УЗ в опимальном режиме повысило содер жание общего белка в водных и водно – спиртовых экстрактах из листьев и стеблей, пони зило в экстрактах из корней. Понижение общего белка в экстрактах говорит о его разру шении как до пептидов так и до аминокислот, которые относятся к неспецифическим сти муляторам роста.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.