авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии» _ ...»

-- [ Страница 5 ] --

Первая стадия, обеспечивающая начальный контакт между двумя цепя ми, является доминирующей с точки зрения термодинамически невыгодной энтропии, тогда как выигрыш в энтальпии, обусловленный образованием водородных связей между небольшим числом пар оснований, сравнительно незначителен.

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Рис.2.10. Стадии самосборки двойной спирали нуклеиновых кислот После завершения первой стадии и образования контакта между цепями за счет объединения нескольких пар оснований происходит ассоциация каж дой новой пары оснований, что приводит к дальнейшему увеличению вы игрыша энтальпии с незначительным изменением энтропии (рис.2.11). Так формируется двойная спираль.

Рис.2.11. Зависимость энергетических характеристик самосборки двойной спирали СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Термин «самосборка с ковалентной модификацией» в основном приме няют к системам, в которых образование ковалентных связей является необ ратимым. Поэтому, в отличие от точной самосборки, конечный продукт не обязательно должен быть системой с термодинамическим минимумом. Два самособирающихся компонента не могут провзаимодействовать, прежде чем не произойдет ковалентное химическое превращение одного из них. Это мо жет приводить к изменению его размера, формы или ориентации, а также к удалению блокирующего элемента. После этого две субъединицы готовы к самосборке. Самосборка с ковалентной модификацией может также вклю чать послесборочную обработку. В этом случае для сборки прекурсорного комплекса, фиксируемого затем в желаемом состоянии ковалентной моди фикацией, используются нековалентные силы. Такую процедуру можно рас сматривать как разновидность темплатного эффекта, когда части структуры, необходимые для темплатирования исходной самосборки, можно впоследс твии отщепить.

Превосходным биологическим примером этого является биосинтез гор мона млекопитающих — инсулина. Инсулин состоит из двух полипептидных цепочек (А и В), связанных парой дисульфидных (-S-S-) мостиков. Восста новление этих мостиков ведет к распаду молекулы инсулина. Однако, в про тивоположность вирусу табачной мозаики, индивидуальные полипептидные цепочки не содержат информации, необходимой для самосборки, и поэтому окисление продуктов восстановления не приводит к образованию активного инсулина.

Фактически инсулин синтезируют из полипептида намного большего раз мера — препроинсулина — в две стадии с посттрансляционной обработкой.

Препроинсулин способен к самосборке с использованием нековалентных сил в такой конформации, в которой фрагменты А и В синтезируемого инсу лина размещены в нужной относительно друг друга ориентации. Затем две цепи необратимо сшиваются за счет образования двух дисульфидных связей, при этом образуется проинсулин. Далее после надежного соединения цепей избыточную часть полипептида можно удалить с образованием конечного продукта, рис.2.12.

Рис.2.12. Биосинтез инсулина самосборкой Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

2.2.6. Органические супрамолекулы как темплаты Следуя формальному «нано-критерию», к нанотехнологии можно отнес ти ряд направлений генетической инженерии, микробиологии, вирусологии и фармакологии, связанных с созданием биологически активных нанострук тур, существующих или отсутствующих в природе. Такой подход может вы звать возражения оппонентов, рассматривающих нанобиотехнологию как область науки, создающую новые бионеорганические наноматериалы и на ноустройства (наноинструменты).

Рассмотрим ряд работ, выполненных в этой области с применением виру сов. К сожалению, набор вирусов, применявшихся до сих пор в качестве объ ектов нанотехнологии, очень ограничен. Наночастицы (вирионы) простых вирусов, содержащие белок и нуклеиновую кислоту, построены симметрич но. Несмотря на значительные различия в размерах и морфологии вирусов, природа использовала сравнительно небольшой набор «базовых структур ных стратегий» при конструировании вирусных частиц:

1. Палочковидные и нитевидные вирусы, которые построены на основе трансляционно-ротационной симметрии. Геном (одноцепочечная РНК) ви русов со спиральной структурой заключен в нуклеопротеиде, собранном на основе спиральной симметрии из субъединиц белка оболочки (БО). Внешняя оболочка (капсид) простых вирусов состоит из идентичных субъединиц БО, формирующих спиральную структуру. Кинетической единицей вирусного раствора является весьма компактная и плотно упакованная наночастица с некоторым количеством связанной с ней воды. Гидратация частиц бывает выражена в разной степени и зависит от плотности их упаковки и свойств вирусного БО. Было показано, что молекулярная структура вируса табач ной мозаики (ВТМ) остается неизменной независимо от содержания воды в препарате, а взаимодействие вирусных частиц с водой носит исключительно поверхностный характер. В вирионах «сложных» вирусов спиральный нук леопротеид (нуклеокапсид) заключен в липопротеидную мембрану.

2. Изометрические вирусы. Вирусный геном (РНК или ДНК) заключен внутри «сферического» капсида, построенного из субъединиц БО в соот ветствии с требованиями икосаэдрического 5:3:2 типа симметрии. Икосаэд рические структуры разных вирусов различаются по степени сложности и размерам (18-500 нм). Легко убедиться, что симметрично построенная ико саэдрическая частица должна содержать не менее 60 асимметричных субъ единиц БО. Частицы «сферических» вирусов обычно менее стабильны, чем спиральные, и подвержены деформациям. Нарушения структуры таких виру сов нередко сопровождаются потерей нуклеиновой кислоты. Об относитель ной неплотности некоторых «сферических» вирусов свидетельствует также тот факт, что их РНК доступна гидролитическому действию рибонуклеазы.

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ В вирионах «сложных» вирусов икосаэдрический нуклеокапсид заключен в липопротеидную мембрану.

Вирусные частицы могут быть использованы в качестве своеобразных шаблонов или матриц (scaffolds) для создания новых технологических ма териалов со спиральной структурой. Палочковидные наночастицы ( 300 нм) наиболее известного и доступного вируса – ВТМ состоят из идентичных субъединиц БО, упакованных в виде спирали с шагом 2.3 нм и внутренним осевым каналом. Диаметр внутреннего канала ВТМ составля ет 40. Цепь РНК расположена между витками субъединиц и следует их укладке. Важной особенностью вирусов является возможность обратимой диссоциации вирионов на БО и нуклеиновую кислоту (НК) и последующей самосборки вирусных наноструктур. Частицы ряда вирусов могут быть «реконструированы» in vitro с использованием препарата низкомолекуляр ного БО и нативной НК. В результате удается восстанавливать структуру и биологическую активность вируса. Процедура самосборки позволяет по лучать также «смешанные» частицы, состоящие из вирусного БО и гетеро логичной НК.

Самосборка (реполимеризация) низкомолекулярного БО может осущест вляться также в отсутствие РНК. Процесс реполимеризации БО протекает ступенчато с образованием серии промежуточных белковых агрегатов воз растающих размеров и заканчивается сборкой спиральных вирус-подобных частиц (ВПЧ), неограниченных по длине из-за отсутствия РНК. Симметрич но организованные вирусные частицы или полученные на основе самосбор ки реполимеры вирусного БО могут применяться в качестве строительных блоков-матриц для создания различных бионеорганических материалов:

нанотрубок, нанопроводников, наноэлектродов, наноконтейнеров для ин капсидации неорганических соединений и получения неорганических на нокристаллов контролируемых размеров. Новые материалы создаются при взаимодействии правильно организованных белковых вирусных структур с неорганическими материалами (наночастицы или атомы золота, платины и других металлов).

При этом вирусные структуры играют роль «металлизируемых» матриц, или «строительных лесов» (scаffolds). Металлoсодержащие неорганические соединения (хлориды серебра, золота, платины, окись железа, сульфиды кад мия или серы) связываются с БО на поверхности вирусных наноструктур или аккумулируются во внутренней полости капсида икосаэдрических вири онов и полых осевых каналах спиральных частиц.

В результате могут быть созданы новые наноматериалы: поверхностно декорированные и/или содержащие металл во внутренней осевой полости спиральные наноструктуры, металлические наноикосаэдры и магнитные на Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

ночастицы контролируемых размеров. Кроме того, вирусные структуры мо гут служить для образования нано-паракристаллических структур и жидких кристаллов.

Структура белковых субъединиц ВТМ изучена достаточно детально, что позволяет локализовать положение разных аминокислот на поверхности и внутри осевого канала вирусных частиц. Это открывает возможности селек тивной модификации внешней поверхности и осевого канала ВТМ специфи ческими реагентами. Для создания неорганических нанопроводников на ос нове вирусов частицы платины связывали с поверхностью ВТМ, а вирионы нитевидного бактериофага М13 были подвергнуты металлизации золотом.

При этом поверхность частиц ВТМ полностью покрывалась платиной за мин реакции с H2PtCl6. С применением проводников, созданных на осно ве металлизированных наночастиц ВТМ, были изготовлены электроды для легких литий-ионных аккумуляторов. Последнее связано с необходимостью снижения размеров и веса батарей электропитания в микроэлектронике.

Металлизация ВТМ методом нанесения атомарных слоев заканчивалась декорированием – образованием слоя Al2O3 или TiO2 на внешней поверхнос ти и на поверхности внутреннего канала вирусных частиц. Можно надеяться, что полученные этим способом нанотрубки будут использоваться как жест кие «цельнометаллические» проводники. Ниже кратко перечисляются неко торые варианты самосборки нанопроводниковых систем, планируемых или разрабатываемых в настоящее время в МГУ:

1. Применение препаратов низкомолекулярного БО, меченного атомами металла с последующей самосборкой «металлизированных» ВПЧ. Такие опыты реальны при использовании в качестве объектов БО ВТМ вируса мо заики папайи и вируса мозаики ячменя. Можно ожидать, что это позволит повысить эффективность декорирования металлом продуктов самосборки. В зависимости от условий модификации БО декорирование может локализо ваться на поверхности ВПЧ либо внутри осевого канала наночастиц.

2. Показано, что ДНК и белок можно эффективно пометить платиной с помощью комплексного соединения – хлордиэтилентриаминоплатины хло ристой, (диен)Pt. По нашим данным, аналогичным способом может быть получена вирусная РНК, меченная (диен)Pt. Это позволяет полагать, что Pt РНК и вирусный БО могут использоваться для изготовления in vitro двух ви дов нанопроводников: во-первых, спиральных ВПЧ, собранных из меченного (диен)Pt БО и не содержащих РНК;

во-вторых, спиральных псевдовирусных частиц (ПВЧ), содержащих меченную (диен)Pt РНК, «одетую» и изолирован ную от внешней среды нативным вирусным БО.

Итак, вирусы со спиральной структурой обладают рядом достоинств как матрицы для создания новых наноматериалов:

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ 1) возможность получения меченных металлом нативных вирусных частиц;

2) возможность диссоциации вируса на белок и РНК с последующей ре конструкцией – самосборкой частиц, не отличимых от нативного вируса;

возможность реконструкции «смешанных» частиц, содержащих РНК, мечен ную атомами металла;

3) возможность самосборки (реполимеризации) меченного металлом ви русного БО в отсутствие РНК с образованием частиц, идентичных вирусу по структуре, но не ограниченных по длине;

4) возможность заполнения внутреннего осевого канала спиральных час тиц солями металлов для создания нанопроводниковых систем;

5) возможность ориентации вирусных частиц с образованием анизотроп ных гелей со свойствами жидкого кристалла;

6) возможность получения микро-паракристаллов с использованием пре паратов спиральных вирусов или фибриллярных агрегатов вирусного белка.

При замещении вирусного генома гетерологичным материалом икосаэд рические вирусы могут служить:

а) матрицами для декорирования металлом и получения магнитных ви русных наночастиц, б) для заполнения капсида металлом с целью получения магнитных час тиц и металлических икосаэдрических нанокристаллов строго контролируе мого размера и в) контейнерами для хранения и доставки в клетки лекарственных препа ратов и «терапевтических» генов.

Вирионы «сферических» вирусов могут быть диссоциированы на БО и РНК с последующей сборкой «пустых» капсид (ВПЧ) из БО в отсутствие РНК или реконструкцией вируса. Частицы вируса хлоротической крапчатос ти коровьего горошка (ВХККГ) приобретают состояние метастабильности (обратимо «разбухают») при значениях рН 7.5 и отсутствии дивалетных ка тионов. Этот феномен облегчает процедуру высвобождения вирусной РНК и введения в икосаэдрический вирусный капсид-наноконтейнер разных мате риалов, включая анионные органические полимеры и ионы металлов (желе зо, платина, палладий). Создание магнитных наночастиц (МНЧ) посредством включения магнитного материала в вирусный капсид открывает определен ные перспeктивы применения МНЧ в нанотехнологии и медицине. Предпоч тительно для получения МНЧ применяется нетоксичный магнетит (Fe3O4).

Внутренняя полость вирусного капсида заполняется окисью железа, которая затем подвергается восстановлению. В результате вирусная РНК/ДНК заме щается ферромагнитным материалом. Размеры магнитных наночастиц опре деляются размером частиц вируса.

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Значительные трудности применения вирусных наноконтейнеров в ме дицине связаны с необходимостью их направленной доставки. В ряде слу чаев наблюдалось успешное применение системной иньекции и орального введения МНЧ (или псевдовирусных частиц, несущих оболочку вируса со специфическим тропизмом). При правильной доставке МНЧ магнитное поле может служить сигналом для высвобождения терапевтического препарата из МНЧ в определенном субклеточном компартменте. Кроме того, в случае до ставки МНЧ в клетки пораженного органа возможно применение гипертер мальнй обработки (нагревание магнитных частиц в магнитном поле до ~ °С) для уничтожения пораженных клеток.

Некоторые особенности «сферического» вируса мозаики коровьего го рошка (ВМКК) делают его перспективным для применения в нанобиотехно логии. Вирус стабилен при 37оС и низких значениях рН, т.е. может использо ваться в качестве наноконтейнера для доставки терапевтических препаратов и вакцин в организм животных «мукозным» путем через слизистую оболочку (mucosа) полости рта и пищевода. Уникальной особенностью ВМКК является его способность связываться с клетками млекопитающих и даже проникать в них. Этот эффект объясняется взаимодействием капсидного белка ВМКК с 54 К белком плазматических мембран клеток грызунов и человека. Было показано, что частицы ВМКК удается обнаружить в самых разных органах животного, включая селезенку, печень, почки, желудок, кишечник, легкие, костный и головной мозг. Последнее вовсе не означает, что ВМКК размно жается в клетках животных, однако он создает определенные возможности для целевой доставки к слизистым оболочкам наноконтейнеров ВМКК с те рапевтическим препаратом.

Недавно флуоресцентно-меченные наночастицы ВМКК (диаметр частиц ВМКК составляет 31 нм) использовали для изучения и визуализации сосу дов и тока крови животных. Кроме того, флуоресцирующий ВМКК приме нили для наблюдения за процессом ангиогенеза (греч. аngeon, «сосуд») с целью изучения состояния и диагностики аномалий сосудов. В частности, этот метод был применен для исследования состояния сосудов при развитии фибросаркомы человека.

Отличительной особенностью некоторых модифицированных вирусных частиц и их компонентов является включение активного чужеродного белка/ пептида в состав субъединиц БО. Это позволяет использовать такие структу ры в качестве наноинструментов для прямой реализации активности чуже родного белка/пептида в составе модифицированного вируса. Имеющиеся сведения о структуре БО многих вирусов позволяют направленно присо единять целевой полипептид к С- или N-концевым аминокислотам, лока лизованным на поверхности вирусной частицы. Так были сконструированы СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ частицы ВТМ, несущие на С-конце субъединиц БО крупный (133 аминокис лоты) фрагмент протеина А, сохранивший способность связывать монокло нальные антитела при их очистке. Важной особенностью такого наноинстру мента является его инфекционность и способность накапливаться в растении в большом количестве. Принципиально близкий подход был реализован для создания наночастиц Х-вируса картофеля, частицы которого несли молекулы фермента липазы (33 К), соединенные с N-концами субъединиц вирусного БО. Связанная с вирусом липаза сохраняла активность. Таким образом, была продемонстрирована возможность создания самореплицирующихся биока талитических наночастиц на основе вируса.

Важным направлением практической реализации этих принципов являет ся создание вакцинных препаратов с использованием самореплицирующих ся частиц, несущих на своей поверхности в качестве целевого пептида анти генную детерминанту (эпитоп) патогена либо иной функцонально активный полипептид.

Преимущества вакцин, созданных на основе включения эпитопа в ген БО перед аттенуированными, химически инактивированными вирусами и субъ единичными вакцинами, определяются рядом причин:

1) этот подход исключает возможность реверсий и рекомбинаций патогена;

2) вакцинные препараты, полученные таким образом на основе вирусов растений, безопасны для человека, так как растения и животные не содержат общих патогенов;

3) высокая иммуногенность вирусных частиц позволяет получить высо кие титры антител при иммунизации животных в отсутствие адьювантов.

Хорошие результаты были получены с использованием в качестве носи теля целевых эпитопов не инфекционных вирусов, а продуктов самосборки модифицированного структурного белка. Недавно субъединицы БО вируса мозаики папайи (см. ниже) были успешно использованы в качестве носителя эпитопа вируса гепатита С после реполимеризации in vitro и иммунизации животных.

Рекомбинантный ядерный антиген вируса гепатита В (HBcAg) как нано носитель чужеродных антигенных детерминант весьма перспективен для создания высокоиммуногенных структур и продукции антител к целевому антигену. HBcAg образует симметричные икосаэдрические (30 нм) частицы, придавая высокую иммуногенность встроенным чужеродным антигенным детерминантам. Разрабатываемый в Центре «Биоинженерия» РАН метод основан на продукции растительным вирусом-вектором рекомбинантного HBcAg-носителя со вставкой эпитопа вируса гепатита С.

Введение чужеродных пептидных фрагментов как в N-так и в С-концевую часть HBcAg не нарушает процесс его самосборки, и при этом пептиды ока зываются экспонированными на поверхности молекулы.

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Интерес для использования в качестве основы для получения новых на номатериалов могут представлять самые разные вирусы и агрегаты вирус ных белков. Между тем, из множества вирусов, известных вирусологии, в нанотехнологии используются несколько вирусов, включая палочковидный ВТМ, нитевидный, бактериофаг М13, а также икосаэдрические фитовирусы (ВХККГ и вирус мозаики коровьего горошка, ВМКГ).

Гордеивирус щтриховатой мозаики (ВШМЯ) Жесткие, негнущиеся палочковидные вирионы со спиральной структу рой. Присутствуют три основных компонента наночастиц длиной около нм, 130 нм и 110 нм при диаметре 18 нм. Капсид состоит из идентичных субъединиц БО с молекулярной массой 23 К, уложенных в виде спирали с шагом 2.5-2.6 нм и внутренним каналом 3.4 нм. Полимеризация БО ВШМЯ in vitro протекает ступенчато с образованием серии агрегатов возрастающего размера (10 S, 20 S, 30 S). На электронных микрофотографиях 30 S агре гаты имеют форму двуслойных дисков и групп дисков с диаметром частиц ВШМЯ. Двуслойные 30S диски способны формировать на пленке-подложке кристаллические структуры разного типа. Дальнейшая полимеризация при водит к образованию длинных спиральных частиц двух типов:

1) спиральных агрегатов, неотличимых от вируса по структуре спирали, но не ограниченных по длине и 2) агрегатов БО, построенных на основе двузаходной спирали.

В присутствии 0.05 М CaCl2 pH 7.5 вирусные частицы и частицы реполи меризованного белка образуют микропаракристаллы.

Потексвирусы Х-вирус картофеля (ХВК) и вирус мозаики папайи (ВМПап) (papaya mo saic virus, PapMV). Гибкие нитевидные вирионы со спиральной структурой.

Длина частиц ХВК и ВМПап 515 нм и 530 нм соответственно, при диаметре частиц 13.5 нм. Около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки фор мируют полярную спираль ХВК с шагом 3.6 нм. Вирусная РНК заключена между витками этой спирали, каждый виток которой состоит из 8-9 субъеди ниц БО. Частицы имеют полый центральный осевой канал с диаметром 3 нм.

РНК ХВК состоит из пяти генов;

5’-концевой ген кодирует 165-kDa реплика зу, а 3’-концевой – БО вируса.

Между концевыми генами расположен тройной блок генов, кодирующих три транспортных белка (ТБ1, ТБ2 и ТБ3), которые вместе с БО ответствен ны за транспорт вируса по растению. Особенностью БО ХВК является чрез вычайно низкая способность реполимеризации. Неспособность БО ХВК к реполимеризации «компенсируется» необычайно высокой эффективностью реполимеризации БО другого потексвируса – вируса мозаики папайи (ВМ Пап). C другой стороны, ХВК был первым нитевидным вирусом, реконстру СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ ированным из БО и РНК. Данные оптической дифракции подтвердили иден тичность структуры нативных и реконструированных частиц ХВК.

С помощью атомно-силовой и электронной микроскопии показано, что первичным продуктом сборки in vitro являются вирусные РНП-комплексы, в которых 5’-концевой участок РНК защищен БО (частицы с «хвостом» сво бодной РНК и спиральной «головкой» из молекул БО).

Контрольные вопросы 1. Что вкладывается в понятие «запрограммированная система» в супра молекулярной химии?

2. Перечислите и охарактеризуйте три основных направления развития супрамолекулярной химии.

3. Объясните суть терминов супрамолекулярной химии: «темплатирова ние», «самосборка» и «самоорганизация».

4. Объясниете чем молекулярная самосборка отличается от супрамолеку лярной.

5. Что такое темплатный синтез, лигандный синтон и темплатный центр, хелант?

6. Какие варианты темплатного синтеза Вам известны, опишите их?

7. Какие варианты биохимической самосборки Вам известны, опи шите их.

8. Опишите использование органических супрамолекул в качестве тем платы.

2.3. Молекулярные машины 2.3.1. Общие вопросы 2.3.2. Биологические (природные) молекулярные машины 2.3.3. Синтетические молекулярные машины 2.3.4. Химически управляемые молекулярные челноки и нанолифты 2.3.5. Молекулярные челноки на солнечной энергии 2.3.6. Молекулярные пропеллеры 2.3.7. Молекулярные пинцеты 2.3.8. Молекулярные роботы 2.3.1. Общие вопросы Под термином «молекулярные машины» подразумевается дискретное число молекулярных компонент, скомпонованных так, чтобы возникало ме Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

ханическое движение как реакция в ответ на некоторое специфическое воз действие. Этот термин широко используется в нанотехнологии, он применим по отношению к разнообразным сложным специально сконструированным молекулярным ансамблям.

Наиболее привлекательными кандидатами для этих целей представляют ся сблокированные молекулярные компоненты. В последнее время развитие структурного и функционального проектирования таких систем привело к созданию и использованию сложных молекулярных приборов и машин, ко торые способны в целом ряде случаев выполнять особые задачи. Развитие человеческой цивилизации всегда было связано с конструированием новых приборов и машин. В зависимости от области применения приборы и маши ны могут быть очень большими или очень маленькими. Основной тенден цией в наше время является стремление к уменьшению веса и размера ис пользуемых компонентов насколько это возможно, в особенности, в области информационных технологий.

Миниатюризация компонентов для создания приборов и машин осущест вляется в наши дни на основе подхода нисходящего проектирования. Этот подход, который применяют физики и инженеры, заключается в манипули ровании все более мелкими компонентами материи с помощью фотолитог рафии и ей подобных технологий. Хотя полупроводниковые машины с га баритными размерами 65 нм уже доступны на рынке, а также сообщается о создании приборов с размерами в пределах 45 нм, становится ясно, что метод нисходящего проектирования имеет очень существенные недостатки, включая резкое увеличение затрат при приближении к наноразмерному из мерению. «Там внизу все еще много места» - утверждал Ричард П. Фейнман в своем знаменитом обращении к Американскому физическому обществу от 29 декабря 1959 г., эта мысль до сих пор остается актуальной. Науке и тех нологии надо искать новые пути для того, чтобы продвигаться дальше в деле миниатюризации в наноразмерном диапазоне.

Многообещающей стратегией использования науки и технологии в нано размерном масштабе является подход восходящего проектирования, кото рый предполагает работу по созданию наностурктур из объектов с нано - или субнаноразмерами (а именно, из атомов или молекул). В конце семидесятых годов, в рамках супрамолекулярной химии, начали поводить исследования молекулярных электронных машин, и в недрах некоторых лабораторий роди лась идея о том, что молекулы могут быть значительно более удобными стро ительными элементами, чем атомы, при создании наноразмерных машин и приборов. Эта идея основывается на следующих положениях:

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ 1) молекулы являются стабильными образованиями, в то время как с ато мами справиться нелегко;

2) в природе используются молекулы, а не атомы для строительства боль шого числа разнообразных наноприборов и наномашин, которые поддержи вают жизнь;

3) большинство лабораторных химических процессов имеют дело с моле кулами, а не атомами;

4) молекулы являются объектами, уже обладающими четкими формами и имеющими свойства, необходимые для работы таких машин (например, свойства, которыми можно манипулировать фотохимическими и электроме ханическими методами);

и 5) молекулы могут собираться самостоятельно или же их можно соеди нять для образования более крупных структур.

В последующие годы супрамолекулярная химия очень быстро развива лась, и вскоре стало ясно, что супрамолекулярный подход с продвижением снизу вверх открывает практически безграничные возможности для про ектирования и создания искусственных молекулярных приборов и машин.

Кроме того, становилось все очевиднее, что такой подход может внести не оценимый вклад в наше понимание молекулярных аспектов исключительно сложных приборов и машин, которые отвечают за биологические процессы.

Собственно говоря, эти системы представляют собой наглядную демонстра цию осуществимости и эффективности нанотехнологии.

Молекулярные машины можно разделить на две широкие категории: син тетической и биологической природы.

Исторически основой молекулярных машин стали умозрительные модели Maxwell's demon и «Храповик Фейнмана» («Храповик Броуна»). Представим очень простое устройство (рис.2.13), состоящее из двух шестеренок, закреп ленных на одной оси, но находящихся при двух различных температурах.

Одна из шестеренок на лопастях (в T2) имеет защелку, которая позволяет оси вращаться только по часовой стрелке, поднимая при этом груз (m) вверх.

Если температура T1 намного больше, тем T2, то кинетическая энергия удар молекул газа (красные шары) о лопасти в этой части устройства будет намно го выше, чем в другой части устройства. Поэтому противодействие враще нию оси в направлении часовой стрелки за счет противоположных по напрв лению соударений молекул газа о лопасти во второй части устройства будет очень малым.

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Рис.2.13. Храповик Фейнмана Макроскопические машины часто работают в газовой фазе и сопротив лением газа (воздуха) можно пренебречь. В отличие от макроскопических систем молекулярные системы постоянно подвергаются существенным воз действиям за счет броуновского движения молекул, окружающих рассмат риваемый молекулярный ансамбль. Причем эти воздействия могут быть со поставимыми по сравнению с воздействиями, которые могут приложены к ансамблю в соответствующем устройстве. Соответственно, плодотворной является стратегия использования энергии именно броуновского движения, а не противодействие ему.

И хотя идея использования броуновским движением является своеобраз ным вызовом природе, сама природа дает примеры таких устройств, созда ющих и использующих неравновесные распределения, такие как, например, клеточные мембраны. Липофильные мембраны позволяют создавать различ ные механические устройства, движение которых основано на перемещении ионов между различными сторонами мембраны.

В дизайне молекулярных устройств различают два различных важных типа: молекулярные переключатели (molecular switches, или челноки, shuttles) и молекулярные моторы. Принципиальное различие состоит в том, что молекулярные переключатели действуют как функция состояния сис темы, тогда как в молекулярных машинах основное действие определяется траекторий. Молекулярные переключатели подвержены трансляционным перемещениям и после возврата их в исходное состояние не возникает ника кого механического движения – энергия выделяется в систему;

они также не в состоянии за счет использования химической энергии удалять систему от равновесного состояния.

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ 2.3.2. Биологические (природные) молекулярные машины Создание молекулярных машин сегодня считается одной из важнейших задач сурпамолекулярной и нанохимии. Однако, такие машины не являют ся выдумкой или изобретением ученых – они давно и хорошо известны в биологии. Первая из таких машин называется АТФ-синтаза. Она занимается в митохондриях синтезом аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) из адено зиндифосфорной (АДФ) и ортофосфорной (Н3РО4) кислот;

АТФ – это моле кула, которая обеспечивает клетку энергией.

Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) Из АДФ и ортофосфорной кислоты получается АТФ, при этом образуется так называемая макроэргическая связь, и на ее образование затрачивается 30,6 кДж/моль. АТФ обеспечивает энергией большинство происходящих в клетке процессов, так как при гидролизе макроэргической связи запасенная в ней энергия освобождается.

Как же синтезируется эта молекула, то есть, как образуется макроэрги ческая связь между фосфатами? Это было одно время загадкой. Существо вало предположение о том, что есть какое-то вещество Х, химический пос редник, осуществляет связь между процессами, дающими энергию, то есть окислением питательных веществ до СО2 и Н2О, и каким–то образом энергия окисления (в своем роде медленное «горение» внутри организма) переходит в энергию макроэргической связи в молекуле АТФ. Это предположение о наличии химического посредника, которого никто найти не мог, называлось гипотезой химического сопряжения.

Но в 1961 г. английский ученый Питер Митчелл предложил другое объ яснение – хемиосмотическую гипотезу, которая заключается в том, что вода, которая образуется в процессе окисления, образуется не в виде молекулы воды, а виде протона H+ и иона гидроксила OH–. Энергия, получаемая при окислении, идет на то, чтобы продукты реакции – протон и гидроксил – раз Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

делить в пространстве. Протон выбрасывается из митохондрий через внут реннюю мембрану в межмембранное пространство (сам по себе протон не может проникнуть через мембрану митохондрии, эта мембрана непроницае ма для заряженных частиц), и гидроксид-ион, который остается внутри ми тохондрии.

В результате возникает разница концентраций ионов водорода (рН – то есть кислотности среды) и разница потенциала: положительные заряды сна ружи митохондриальной мембраны, а отрицательный внутри. У митохонд рий 2 мембраны, причем внешняя в энергетических процессах такой важной роли, как внутренняя, не играет. То есть энергия, полученная при окислении, запасена в виде электрохимической энергии. Электрический потенциал на мембране митохондрий достигает 200 мВ, а толщина мембраны не превы шает 10 нм.

Питер Митчелл первый высказал предположение о том, что химические реакции в клетке пространственно упорядочены, и продукты реакции рас пределяются асимметрично: протон в одну сторону, гидроксил в другую. За счет этого появляется электрохимический потенциал на мембране, (Н). Он состоит из химической, рН, и электрической, (разница в величине заря да), компоненты: (Н) =рН +. Электрохимический потенциал на мемб ране митохондрий – универсальная форма запасания энергии клеткой.

Протоны могут перекачиваться через мембрану и при фотосинтезе в хло ропластах или в клетках фотосинтезирующих бактерий, 2.14.

Рис.2.14.

Круговорот протонов в клетке СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ На рисунке представлена довольно простая система бактериального фо тосинтеза, сопряженного с синтезом АТФ на примере галобактерий. Гало бактерии живут в Мертвом море. Море настолько соленое, что соль выпадает в осадок, но в таких экстремальных условиях галобактерии прекрасно себя чувствуют. Галобактерии используют фотосинтез для получения энергии.

Белок бактериородопсин под действием света выкачивает протоны изнутри бактериальной клетки наружу, и на мембране снаружи избыток протонов, и, соответственно, образуется положительный заряд. То есть в данном случае электрохимический потенциал на мембране бактерии возникает не за счет окисления веществ в процессе дыхания, а за счет работы, связанной со све товой энергией.

Если протон «падает» сквозь мембрану внутрь митохондрии, при этом его потенциальная энергия уменьшается, так как он «падает» в электрическом поле от положительного заряда к отрицательному, и вдобавок по градиенту концентрации. Эта энергия используется для синтеза АТФ.

Синтезом АТФ занимается молекулярная машина, которая называется АТФ-синтаза. Она состоит из двух частей. Первая погружена в мембрану на зывается F0 (см. рис.2.14). Она представляет собой протонный канал, то есть это дыра в мембране, по которой протон может попасть внутрь митохондрии, но попадает он внутрь с потерей энергии, которую улавливает вторая часть молекулярной машины, которая называется F1. Эта часть АТФ-синтазы тор чит внутрь митохондрии и использует энергию «падающих» через F0 прото нов для того, чтобы аденозиндифосфат соединился с фосфатом посредством макроэргической связи и образовал молекулу АТФ.

При синтезе АТФ АТФ-синтазой прежде всего совершается работа меха ническая, так как для осуществления синтеза АТФ в АТФ-синтазе крутится белковая структура. Как устроена АТФ-синтаза? Она состоит из двух частей – статора (синий цвет на рис.2.15), и ротора (там же, красный цвет). Статор состоит из трех альфа субъединиц и трех бета субъединиц – они занимаются химической частью работы: синтезом АТФ из АДФ и фосфата. В собран ном состоянии все вместе эти субъединицы по форме напоминают слегка приплюснутый шар 8 нм в высоту и 10 нм в диаметре. К ним примыкает дельта субъединица, и все вместе эта система образует F1 субъединицу мо лекулярной машины. Здесь же есть опора, которая «якорит» всю систему в мембране.

Мембрана образована фосфолипидами (на рисунке показаны желтым).

Гидрофильные «головки» фосфолипидов обращены в водную поверхность, а гидрофобные «хвосты» погружены внутрь мембраны, и именно они пре пятствуют перемещению заряженных частиц через мембрану. Вращающаяся часть машины, ротор, состоит из гамма и эпсилон субъединиц. Эта конструк Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

ция погружена в структуру, сделанную из одинаковых белков, они обозна чаются буквой с. Статор держится в мембране, а ротор крутится. И энергия протона используется на то, чтобы прокрутить ротор этой машины.

Рис.2.15. Строение АТФ-синтазы Молекулярная машина работает в обе стороны (так же как и катализато ры, которые проводят реакцию как в прямую, так и в обратную стороны).

Если течет протонный ток с наружной мембраны внутрь, то синтезируется АТФ;

если же протонного потенциала нет, но подать с внутренней стороны АТФ, то машина начнет «выкачивать» протоны, создавая протонный потен циал. При этом ротор также вращается.

Для того, чтобы доказать, что в АТФ синтазе вращается часть машины, F1 фрагмент перевернули, «пришили» к неподвижной подложке, а к гамма субъединице навесили искусственным образом нить актина (длинный белок, который можно было увидеть в микроскоп, так как он был мечен флуорес центной меткой). Затем подали к этой системе энергию в виде АТФ, и ока залось, что при наличии АТФ гамма субъединица начала крутиться. Все это сняли на пленку. Было видно, как крутится флуоресцентная метка на актино вом хвостике, и было показано, что действительно происходит вращение во время работы этой молекулярной машины (рис. 2.16) СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Рис.2.16.

«Молекулярный ротор»

Как же используется протонный ток, чтобы крутить мотор? В статоре имеется протонный канал, т.е. такой белок, который образует проход для про тона. Но этот канал не сплошной. Если бы был канал, который пронизывал всю мембрану насквозь, то из-за разницы потенциалов все протоны потекли бы внутрь митохондрии, и произошла бы деэнергетизация мембраны, т.е. она бы разрядилась. Но канал устроен очень хитро. Он состоит из двух полови нок (полу-каналов), которые, к тому же, смещены одна относительно другой.

Структура этой машины такова, что протон проваливается через полуканал с наружной стороны митохондриальной мембраны, но попасть внутрь ми тохондрии он не может. Сваливается протон на подставленную ему амино кислоту ротора и эту аминокислоту протонирует, то есть на аминокислоте появляется дополнительный положительный заряд. Затем, когда протониро ванная аминокислота на вращающемся роторе доедет до следующей поло винки канала, ведущей уже внутрь митохондрии (а внутри протонов мало и, кроме того, там протон поджидают отрицательно заряженные ионы), то протон наконец «падает» внутрь и аминокислота освобождается от положи тельного заряда. Заряды в роторе и статоре расположены таким образом, что протонирование – депротонирование приводит к повороту машины. Таким образом, протон в два приема проваливается внутрь митохондрии, и за счет этого мотор проворачивается.

За объяснение ферментативного механизма, лежащего в основе синтеза АТФ, два исследователя получили Нобелевскую премию: Пол Д. Бойер, США и Джон Э. Уолкер, Великобритания (Нобелевская премия 1997 года).

Выше было рассказано, как мотор крутится, но не было объяснено, поче му синтезируется АТФ. Разрыв связи в молекуле АТФ приводит к образова нию АДФ и ортофосфорной кислоты;

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Собственно, почему при разрыве этой связи выделяется большое коли чество энергии, поскольку хорошо известно, что разрыв связи обычно со провождается поглощением энергии? При разрыве образуется отрицательно заряженный фосфат, который гидратируется, выделяя большое количество энергии. При этом синтез АТФ по обратной реакции, но с использованием незаряженной ортофосфорной кислоты идет в гидрофобной среде, то макро эргической эта реакция не является. Показано, что когда происходит образо вание ковалентной связи между фосфатными группами молекул АДФ и орто фосфорной кислоты, ферменту практически не требуется энергии. Реакции синтеза и гидролиза ATP в каталитическом центре фермента активно идут при отсутствии внешнего источника энергии. Условия, в которых находятся молекулы АДФ и Ф в каталитическом центре, существенно отличаются от условий протекания реакции в водной среде, благодаря чему образование мо лекулы АТФ в активном центре фермента может происходить энергетически «бесплатно». Энергия «падающих» протонов тратится потом на то, чтобы «выпихнуть» вон АТФ, отцепить его от каталитической субъединицы.

Таким образом, за счет электрохимического потенциала на внутренней мембране митохондрий внутри клетки или митохондрий совершается меха ническая работа, сопряженная с химическим синтезом. На рисунке виден срез митохондрии (рис.2.17). Внутри содержится матрикс и выросты (склад ки) – кристы, на которых и расположена АТФ-синтаза. Зачем нужны склад ки? Чтобы увеличить площадь поверхности. Количество складок внутри ми тохондрий зависит от того, насколько интенсивно ей приходится работать, сколько энергии нужно клетке. Митохондрии в клетках печени имеют гораз до меньше крист, чем, например, в клетках сердца.

В хлоропластах происходит точно такой же процесс синтеза АТФ, так же работает АТФ-синтаза, как и в митохондриях, но источником протонного потенциала является уловленная энергия света. Там тоже есть складки, они называются тилакоидами. Только в хлоропластах все как бы вывернуто на изнанку. То есть протоны за счет энергии света накапливаются снаружи этих образований.

Двигатель бактерий. Известно, что не все, но некоторые бактерии могут двигаться. Для того чтобы двигаться, они вертят хвостом, т.е. жгутиком. Если СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ жгутиков несколько, то во время вращения они сплетаются в единый жгут, и вращаются, двигая бактерию, примерно как лопасти у катера (рис. 2.18).

Жгутик очень маленький, в световой микроскоп его трудно увидеть. Для того чтобы проверить, действительно ли жгутик вращается при движении бактерии, бактериальную клетку за жгутик прикрепили к стеклу. В раствор добавили вещество, которое она любит, например, сахар, и она начала вер теться, потому что она явно хотела добраться до сахара, если не добавляли, то она вела себя более спокойно.

Рис.2.17. Срез митохондрии Рис.2.18. Движение бактерий Расположение жгутиков на клетке кишечной палочки при их вращении против часовой стрелки (а) и по часовой стрелке (б) Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Для того чтобы жгутик вращался, в его основании находится так называе мое базальное тело, которое представляет собой электромотор (рис.2.19). Его задача заключается в том, чтобы крутить жгутик.

Рис.2.19. «Принципиальная схема жгутика»

На рисунке изображена мембрана бактериальной клетки (желтая), и час ти мотора статор (синий) и ротор (зеленый). К ротору прикручен жгутик.

Пока неизвестно, как именно передается движение, но в этой молекулярной машине есть свои подшипники, своя молекулярная смазка, и есть белок, в котором, также как и в АТФ-синтазе, имеются два протонных полуканала, смещенных друг относительно друга. И принцип вращения такой же: заряд ка-перезарядка группы COOH в аминокислотах. Число протонов, которые должны «провалиться» в канал за время одной прокрутки жгутика,- порядка тысячи;

остальные параметры приведены в табл.2.3.

Таблица 2.3.

Некоторые параметры жгутика как молекулярной машины Электрохимический градиент Движущая сила (протонный или натриевый) Число протонов на оборот ~ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Энергия, освобождаемая на оборот ~ 2.5·10- Максимальная скорость 300 Hz (H+);

1700 Hz (Na+) Максимальная мощность ~ 10-35 Вт Число шагов ротора на оборот ~ В целом наиболее сложные молекулярные машины природного проис хождения обнаружены в живых клетках. Сюда следует включить моторные протеины, как, например, миозин, отвечающий за сокращение мышц, мик ротрубочки клетки с ассоциированными белками (динеином и кинезином) способны осуществлять работу по, например, транспорту митохондрий, дви жению ресничек (волосоподобных выростов клетокв эпителии легких, ки шечника и яйцеводов).

2.3.3. Синтетические молекулярные машины Молекулярные приборы и машины представляют собой химические сис темы и поэтому функционируют с помощью химических реакций, которые, вообще говоря, подразумевают как электронные, так и ядерные перестановки.

В ряде случаев выполняемая функция существенно основывается на перено се электронов или энергии электронов без существенной ядерной перегруп пировки. В других случаях функционирование основывается на осуществле нии более или менее существенных ядерных перемещений, происходящих под воздействием перегруппировки электронов. Как и в макроскопическом мире, приборы и машины молекулярного уровня нуждаются в энергии для функционирования и сигналах для осуществления связи с оператором. Энер гия, необходимая для функционирования молекулярного прибора или маши ны, может поставляться в виде:

1) химической (химического реактива), 2) квантов энергии (поглощенного фотона), или 3) электрохимической (добавления или удаления электрона – т.е. оксиле ния или восставновления).

Принимая во внимание ограниченность химических видов топлива и всевозрастающие проблемы с окружающей средой, идеальным первичным энергетическим источником можно считать свет и наилучшими являются процессы, при реализации которых не образуется отходов. В самом деле, даже в интеллектуальном обществе потребление не возобновляемых энер гетических ресурсов и накопление отходов будет продолжаться и создавать очень существенные проблемы.

Для того чтобы осуществлять управление и контроль работы молекуляр ных приборов или машин, необходим подходящий сигнал. Поскольку хотя бы один молекулярный компонент системы изменяет свое состояние при Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

выполнении требуемой функции, можно использовать любой сигнал, свя занный с таким изменением. В этом отношении полезными могут оказаться самые различные химические или физические методы. Чаще всего управле ние состоянием системы осуществляется с помощью спектроскопического метода (ядерный магнитный резонанс - ЯМР, поглощение ультрафиолетовой и видимой области спектра, люминесценция и т. д.). Для некоторых систем, например, систем, основанных на донорно-акцепторном взаимодействии, можно с успехом использовать электрохимические методы.

Поскольку прибор и машина должны работать с повторяющимися цикла ми, важным требованием является перезагрузка. Это означает, что исполь зуемая при выполнении данной операции химическая реакция должна быть обратимой. Хотя ни одна из химических реакций не является полностью об ратимой, это требование довольно хорошо выполняется с помощью процес сов передачи энергии, переноса электронов (окисление-восстановление), и переноса протонов (кислотно-основной процесс), а также некоторых видов фотоизомеризации и координационных реакций металл-лиганд.

Шкала продолжительности работы молекулярного прибора и машины может находиться в диапазоне от пикосекунды до нескольких дней в зави симости от природы осуществляемых процессов. Процессы переноса энер гии, электронов и протонов, а также реакции изомеризации могут протекать очень быстро, но крупные и сложные перемещения составных частей могут происходить значительно медленнее. Информация о константах скорости реакций может быть получена с помощью обычных кинетических методов при реализации медленных процессов, с помощью электрохимии и хрома тографии с прерыванием потока при относительно быстрых процессах, и с помощью спектроскопии вспышки (с разными временными шкалами) для очень быстрых процессов.

Молекулярные приборы и машины могут выполнять очень разнообраз ные функции. Они могут участвовать в передаче сигналов (в виде энергии, электронов, протонов и т. д.), обработке информации (например, с помощью логической схемы молекулярного уровня), преобразовании энергии (напри мер, преобразовании света в электрохимический потенциал или химическое топливо), и в целом ряде процессов механического типа (например, переме щении вещества через мембрану).

Сообщается о попытках разработки набора компонентов молекулярного уровня для обработки информации, эти химические соединения способные играть роль проводов, выключателей, элементов памяти, сенсоров, антенн, вилок-розеток, систем удлинительных кабелей, и логических схем для на норазмерных машин. В частности, исследование молекулярных соединений, способных выполнять бинарные логические операции, может привести к СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ практическому применению, к такому как маркировка и разметка очень ма леньких объектов и, в конечном итоге, к проектированию и созданию моле кулярного компьютера. Следует отметить, что все фундаментальные логи ческие операции осуществлялись молекулярными системами, что позволило не так давно провести лабораторную демонстрацию бинарной арифметики с помощью молекулярных приборов: полного сумматора и полного вычитате ля. Эти системы, в которых в качестве входных/выходных сигналов исполь зуются свет, молекулы и ионы, действуют в растворе, эти идеи позаимствова ны из процессов обработки информации в живых организмах.

Независимо от возможности скорейшей реализации применения таких машин, разработка набора приборов молекулярного уровня представляет ся достойным вложением инвестиций. Имеется много обзоров по данному вопросу, и уже опубликована подробная монография. В настоящем обзоре мы проиллюстрируем некоторые последние достижения в этой области с ис пользованием последних примеров создания молекулярных машин, заимс твованных из совместной работы с коллективом Дж. Фрейзера Стоддарта, Университет шт. Калифорния, Лос Анжелес.

Целый ряд достаточно простых молекулярных машин был синтезирован химическим путем. К настоящему времени созданы молекулярные маши ны, способные перемещаться в пространстве под действием энергии извне, например, под действием света или реакций с другими молекулами. Сюда входят как отдельные молекулы, но так и большей частью механически пере ключаемые молекулярные архитектуры, такие как катенаны и ротаксаны.

2.3.4. Химически управляемые молекулярные челноки и нанолифты Молекулярные челноки (molecular shuttles) – устройства, в которых воз можно пространственное перемещение молекул или ионов в некоторой це лостной системе между различными возможными устойчивыми состояни ями этой системы. Обычный молекулярный челнок состоит из ротаксана, внутри которого макроцикл может перемещаться между двумя (или более) положениями по цепи ротаксана.


Химически управляемой системой с хорошими рабочими параметрами с точки зрения переключения и стабильности является соединение ротак сан 1-H3+, рис.2.20. Оно состоит из гантелеобразного компонента, содержа щего в цепи вторичную аминогруппу и 4,4-бипиридиновый фрагмент, а в качестве кольцевого фрагмента использован дибензо-24-краун-8 (DB24C8) – краун-эфиром, обладающим свойствами донора электронных пар. В качес тве ограничителя на конце этой сборной молекулы встроен антрацен. Этот фрагмент важен, поскольку его адсорбционные, люминесцентные и окисли тельно-восстановительные свойства могут быть использованы для контроля Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

за состоянием системы. В связи с тем, что энергия связей атомов водорода протонированной аминогруппы с краун-эфиром намного прочнее энерги ей взаимодействия этого макроцикла краун-эфира с бипиридиновым фраг ментом, ротаксан существует в виде одиного из двух возможных изомеров (рис.2.20a, положение 0). Депротонирование аммониевого центра ротаксана 1-H3+ (рис.2.20b) ослабляет взаимодействия водородных связей и вызывает перемещение кольца DB24C8 за счет броуновским движениям к звену би пиридина (рис.2.20c, положение 1). И наоборот, протонитрование ротаксана 1-12+ кислотой (рис.2.20d) направляет кольцо обратно к аммониевому цент ру. Такой процесс переключения исследовался в растворе методом ЯМР и с помощью электрохимических и фотофизических измерений. Не так дав но также была исследована кинетика кольцевого челночного перемещения в растворе и свойства Ленгмюр-Блоджеттовских пленок, содержащих 1-H3+.

Полная химическая обратимость этих реакций между кислотами и основа ниями обеспечивает обратимость механического движения, несмотря на об разование отходов. Следует отметить, что ротаксан является бистабильной системой и, в принципе, его можно использовать для хранения бинарной ин формации.

Рис.2.20. Функционирование ротаксана 1-Н3+ Путем включения архитектурных особенностей рассмотренного кислот но-переключаемого ротаксана 1-H3+, был спроектирован и создан двухкомпо нентный молекулярный прибор 2-H39+ (рис.2.21а).

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Рис.8.9. Химическое строение и схема работы лифта 2-Н39+ Данная наномашина, которая имеет размеры примерно 2,5 нм в высоту и диаметр 3,5 нм, состоит из компонента с тремя опорами, содержащими по две различные зоны: одну в виде аммониевого центра и одну в виде со единения 4,4-бипиридина. Опоры соединены с тремя вершинами основным механизмом, который играет роль платформы, которую можно останавли вать на двух различных уровнях. Три опоры треноги снабжены стопорами на концах, чтобы не допустить потери платформы. Изначально платформа находится исключительно в «верхнем» положении, т. е. с тремя кольцами вокруг аммониевых центров (рис.2.21b, положение 0). Это происходит из за образования достаточно сильных водородных связей N+-H…O и слабых стабилизирующих - взаимодействий между ароматическими ядрами плат формы и ароматическими компонентами вершины треноги. После добавле ния сильного, ненуклеофильного фосфазенового основания к ацетонитриль ному раствору 2-H39+, происходит отрыв протона от аммониевого центра и, в результате, платформа сдвигается на более «низкий» уровень, т. е. на уровень где три DB24C8 кольца окружают звенья бипиридина (рис.2.21с, положение 1). Эта структура стаблизируется, в основном, за счет взаимодействий с пе реносом заряда между богатыми электронами ароматическими соединени ями платформы и испытывающими нехватку электронов соединениями би пиридина треноги. Последующее добавление кислоты к 26+ восстанавливает аммониевые центры, и платформа двигается в обратном направлении на вер хний уровень. Такое лифтовое движение вверх вниз, которое соответствует количественному переключению и может повторяться многократно, можно контролировать с помощью ЯМР спектроскопии, методов электрохимии, аб сорбционной спектроскопии и флуоресцентной спектроскопии.

Следует отметить, что механическое движение с кислотно-основным уп равлением в 2-H39+ связано с представляющими интерес структурными мо дификациями, такими как открытие и закрытие большой полости, и управ Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

ление положением и свойствами бипиридиновых ножек. В принципе, такое поведение можно использовать для управления приемом и выпуском госте вой молекулы – функции, представляющей интерес для разработки систем доставки лекарственных веществ.

2.3.5. Молекулярные челноки на солнечной энергии Искусственные наномашины на химической энергии, описанные выше, не являются автономными, поскольку, после того как химический ввод ини циирует механическое движение, необходим другой, противоположный химический ввод для перезарядки, а это значит, что будут вырабатываться побочные вещества - отходы. Тем не менее, добавление реагента (топлива) не является единственным способом, которым можно доставить топливо в химическую систему. В самом деле, сама природа показывает, что в зеленых растениях энергия, необходимая для поддержания жизни, в конечном счете, поставляется солнцем. Введение энергии в виде фотонов может и в самом деле вызвать механическое движение за счет обратимых химических реак ций без образования отходов. Как уже было упомянуто выше, использова ние возобновляемых энергетических источников для снабжения наномашин энергией вполне целесообразно.

Проектирование и создание молекулярных челноков, снабжаемых только световой энергией, является, таким образом, интересным и перспективным де лом. Так, например, был специально разработан ротаксан 36+ для достижения челночного движения кольца в растворе за счет воздействия света, рис. 2.22.

Рис.2.22. Химический состав (a) и схематическое изображение (b) ротаксана 36+ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Эта архитектура собрана из электронного донора, кольца (R), и гантеле образного компонента, содержащего несколько соединений: рутениево(II) полипиридиновый комплекс (P2+), который играет двойную роль энергетичес кой установки и ингибитора p-терфенилового типа (S), 4,4-бипиридиновый фрагмент (A12+) и 3,3-диметил-4,4-бипиридиновый фрагмент (A22+) в качестве акцепторов электронов, и тетраарилметановую группу в качестве второго ин гибитора (T). Стабильный переносной изомер ротаксана 36+ является образо ванием, в котором компонент R окружает соединение A12+, так как эта станция является лучшим акцептором электронов во всей сложной молекуле.

Стратегия, разработанная для получения движение макроцикла R между положениями A12+ и A22+, представленная на рис.2.23, основана на следую щих четырех операциях:

a) под действием кванта света возбуждается фотоактивный фрагмент P2+ (процесс 1);

это приводит к переносу одного электрона на «станцию A12+», которая до этого была окружена кольцом R (процесс 2);

при этом фрагмент A12+ восстанавливается до состояния A11+;

оба процесса завершаются релак сацией возбужденного окисленного состояния концевого фотоактивного фрагмента P2+ Р3+ (процесс 3);

b) восстановленный фрагмент A11+ уже слабее взаимодействует с макро циклом по сравнению с соседним акцептором A22+, что и является причи ной перемещения кольца (процесс 4) на 1.3 нм влево на рис.8.11. Эта стадия должна завершиться процессом обратного переноса электрона с A1+ (все еще окруженного R) к окисленному соединению P3+ (процесс 5) вследствие де стабилизации такого состояния с уходом макроцикла;

c) далее происходит эта «перезарядка» (процесс 6), восстанавливающая исходное соотношение акцепторной способности частей ротаксана, приво дящая, в конечном счете к возврату кольца на исходное положение.

Рис.2.23. Схема работы ротаксана 36+ Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Спектроскопические исследования в сочетании с электрохимическими, проведенные в растворе в ацетонитриле, подтвердили, что при поглощении кванта света в ротаксане 36+ происходят рассмотренные выше перемещения.

По проведенным оценкам, доля энергии возбужденного состояния, исполь зуемая для движения кольца, составляет примерно 10%, и система может вы рабатывать механическую энергию порядка 3•1017 Вт на молекулу. Низкий квантовый выход челночного перемещения кольца (2% при 30°C) компен сируется тем фактом, что исследуемая система вобрала в себя следующие черты:

1) она работает от энергии видимого света (другими словами, солнечного света);

2) она демонстрирует независимое поведение, подобно белкам;

3) она не создает отходов;

4) ее функционирование может зависеть только от внутримолекулярных процессов, в принципе позволяя работать только на молекулярном уровне;

5) ее можно заставить работать при частоте примерно равной 1 кГц;

6) она работает в умеренных условиях окружающей среды (т. е. в жидком растворе при температуре окружающей среды);

и 7) она стабильна на протяжении, по крайней мере, 10 циклов.

Хотя система в ее нынешнем состоянии и не смогла выйти на полезную работу при полном цикле эксплуатации, она показала, что структурная и функциональная интеграция различных молекулярных соединений в много компонентную структуру представляет собой эффективную стратегию для создания наноразмерных машин. Благодаря своей модульной конструкции, ротаксан 36+ восприимчив к изменениям структуры для того, чтобы попы таться улучшить его рабочие параметры при использовании в качестве моле кулярного челнока, работающего на световой энергии.

2.3.6. Молекулярные пропеллеры Молекулярный двигатель (пропеллер, molecular propeller) – молекула, которая может перемещать флюиды при вращении благодаря специальной форме, напоминающей макроскопический пропеллер. Она имеет несколько молекулярных лопастей, присоединенных под некоторым углом к наноси.

Построение таких молекул может быть основано на различных синтетичес ких приемах, среди которых, выделяется получение сложных конденсиро ванных ароматических структур, строение которых не может быть планар ным вследствие стереохимических напряжений, рис.2.24.


СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Рис.2.24. Схема строения молекулярного пропеллера В качестве оси такого пропеллера группа проф. Краля (Prof. P. Krl) ис пользовала углеродную нанотрубку. Модуляция методами молекулярной ме ханики показала, что такие структуры могут служить эффективными насо сами для перекачивания и перемешивания жидкости. Их активность в этом отношении зависит от химических свойств материала пропеллера. Для ло пастей, изготовленных из гидрофобных материалов эффективность перекач ки воды оказывается высокой, но для гидрофильных материалов вследствие сольватации этот эффект сильно ослабевает. Для вращения таких пропелле ров могут быть использованы молекулярные моторы.

2.3.7. Молекулярные пинцеты Молекулярные пинцеты (molecular tweezers) – молекулы (хозяева), кото рые способны удерживать молекулы гостя между двух «рук». При открытой полости молекула гостя связывается с пинцетом нековалентными связями, рис.2.25. Известны примеры молекулярных пинцетов, сконструированных из ДНК и они называются ДНК-машинами.

Рис.2.25. Примеры строения молекулярных пинцетов Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Молекулярный пинцет, предложенный Леном, рис 2.25а, образован дву мя антраценовыми «руками», между которыми может поместиться молекула гостя, удерживаниясь за счет --взаимодействий с каждой из «рук».

Другой класс молекулярных пинцетов состоит из двух замещенных порфириновых макроциклов, объединенных амидной связью с варьируе мой длиной этой связи. Этот класс пинцетов обладает потенциальной мо бильностью, поскольку параметры пинцета могут определяться молекулой гостя.

Другая структура молекулярных пинцетов селективно связывает фулле рены и называется лассо (buckycatcher);

она образована двумя связанными фрагментами – коранулена, повторяющими выпуклую поверхность фуллере на. Константа равновесия захвата фуллерена-С60 этим пинцетом равна моль-1. А. Sygula и сотр. синтезировали это соединений по достаточно прос той схеме:

Схема синтеза молекулярного пинцета Sygula A.

2.3.8. Молекулярные роботы Хотя сегодня имеются средства для манипуляций отдельными атомами, напрямую применить эти методы для монтажа полезных веществ в сколь ко-нибудь заметных количествах нельзя — слишком много атомов придет ся «монтировать». Однако возможностей существующих технологий уже достаточно, чтобы соорудить из нескольких молекул простейшие механиз мы, которые смогут манипулировать другими молекулами и создавать себе подобные устройства или более сложные механизмы. Те, в свою очередь, смогут изготовить еще более сложные устройства. В конце концов этот про цесс приведет к созданию молекулярных роботов — механизмов, сравнимых по размерам с крупной молекулой и обладающих собственным встроенным компьютером. В создании таких молекулярных машин нет ничего фантас СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ тического, активные электронные элементы таких размеров уже получены в лабораторных условиях.

Технология должна быть экономически выгодной, а производство деталей молекулярных машин с помощью зондовых микроскопов требует гигантских денег. Поэтому основное требование к молекулярным машинам — научиться воспроизводить самих себя: как только будут получены первые такие маши ны, они сразу же начнут производить свои копии, и микромир машин зажи вет своей автономной жизнью, не требуя от нас особых затрат (по крайней мере, так планируют ученые).

Основные усилия брошены на создание так называемого сборщика — машины, способной собирать другие молекулярные машины. Из опублико ванных в открытой печати проектов наиболее впечатляюще выглядит проект сборщика Xerox Corporation. Работа сборщика основана на использовании своеобразного молекулярного аналога руки. Молекулы будут захватываться «рукой», доставляться к определенному месту «сборочной линии» и при крепляться точно к нужному атому, наращивая тем самым очередную деталь производимой на «конвейере» молекулярной машины.

Даже простейший сборщик имеет довольно сложную конструкцию в не сколько миллионов атомов. В качестве реального механизма для получения молекулярных машин до того, как будет запущен процесс их самовоспро изводства, предложен «эволюционный» подход, при котором сначала будут синтезированы самые простые детали, которые в дальнейшем будут исполь зованы для производства более сложных, и так до тех пор, пока молекуляр ные машины не станут способны производить другие машины.

Радужные перспективы молекулярных машин — это только половина кар тины. Опыт технологического прогресса показывает, что любое техническое достижение будет прежде всего приспособлено для военного применения. То же самое, видимо, произойдет и с нанотехнологией. А возможности испор тить жизнь «потенциальному противнику» с помощью молекулярных машин весьма разнообразны: от разведки до разрушения всего подряд. Из совре менных достижений «военной мысли» на работу молекулярных диверсантов больше всего похоже химическое или биологическое оружие (также действу ющее на молекулярном уровне).

Основным фактором, сдерживающим развитие наномашин, является вовсе не сложность их изготовления. Ученые уже умеют собирать атомы и молекулы в определенные конструкции. Главная сложность состоит в том, что такую машину надо сначала рассчитать, сконструировать. Моделирова ние такой конструкции — дело настолько сложное, что для этого не хватает мощности даже современных суперкомпьютеров. Дело в том, что на молеку лярном уровне уже перестают действовать обычные законы механики. Вмес Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

то этого вступают в действие законы квантовой механики, которые приводят к совершенно неожиданным последствиям. А любая ошибка в конструкции может стоить многих лет работы больших научных коллективов. Поэтому пока основная работа идет над теоретическим обоснованием работоспособ ности молекулярных устройств.

Основные работы в области вычислительной молекулярной нанотех нологии ведутся в лабораториях NASA Ames Research Center и в Material Simulation Center, а также в Institute for Molecular Manufacturing и Xerox Corporation. По прогнозам ученых, можно ожидать появления молекулярных роботов лет через десять.

Контрольные вопросы 1. Что обозначает термином «молекулярные машины»?

2. Что обозначает подход «нисходящего проектирования»?

3. Перечислите основные положения подхода «восходящего проектиро вания»?

4. Какие две категории «молекулярных машин» Вам известны?

5. Какие биологические «молекулярные машины» Вы знаете. Принцип их действия 6. Синтетические «молекулярные машины» и принцип их работы.

7. Какие функции выполняют химически управляемые молекулярные челноки и нанолифты?

8. Каков принцип работы молекулярных челноков на солнечной энергии?

9. Какова схема строения молекулярного пропеллера?

10. Что такое молекулярные пинцеты и их роль в молекулярных маши нах?

11. Что вкладывают ученые в понятие «молекулярный робот»?

2.4. Методы исследования супрамолекулярных ансамблей 2.4.1. Краткий обзор методов 2.4.2. Капиллярный электрофорез (и гель-эксклюзивная хроматография) 2.4.3. Метод ВЭЖХ 2.4.4. Метод ВЭЖХ с использованием краун-эфиров 2.4.1. Краткий обзор методов Одним из блистательных, основополагающих научных достижений, кото рыми был богат XX век, стал рентгеноструктурный анализ кристаллов. Вес ной 1912 года в Мюнхене, следуя гениальной догадке М. Лауэ о возможности СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке, В. Фридрих и П. Книппинг осуществили опыт, который А. Эйнштейн назвал «самым кра сивым экспериментом XX века». Уже в 1913 году открытие этого физичес кого явления позволило английским физикам У.Г и У.Л Брэггам установить строение поваренной соли, алмаза, цинковой обманки. В течение последу ющих лет были получены сведения о десятках кристаллических структур, и в настоящее время метод рентгеноструктурного анализа является одним из наиболее эффектных и эффективных методов определения супрамолеку лярных структур кристаллических объектов неорганической и органической природы.

В органической химии изначально интерес представляло исследование взаимного расположения атомов в молекулах. Именно это направление ис следований привело к получению ценнейшей информации о строении мо лекул белков, полинуклеотидов. И лишь с развитием супрамолекулярной химии внимание стали уделять и тому, как эти молекулы организованы в кристаллах. Первая структура органического кристалла была исследована в 1922 году – Р. Дикинсон и А. Реймонд установили внутреннее строение кристаллов уротропина. Только через шесть лет С. Хендрикс исследовал кристаллические структуры карбамида и тиокарбамида. Естественно, что и в настоящее время такой метод очень желателен для исследования супра молекулярных структур, но необходимо учесть ограничение – необходимо получение монокристалла исследуемой композиции.

Однако для решения задач создания искусственных молекулярных ма шин необходимо не только знание взаимоедйствия молекулв стационарных (кристаллических) рамках, но и поведение в нестатической (с точки зрения координат молекул) фазе – в фазе растворов, где рентгенофазовый метод не применим. Такие исследования требую использования принципиально иных методов. Исследование взаимодействия белков со специфическими лиганда ми, такими как лекарственные субстанции и токсины, относится к важней шим аспектам биологических исследований в поисках новых эффективных лекарств. Характеризация явлений связывания и определение параметров таких взаимодействий, таких как константы устойчивости, стехиометрия взаимодействий принципиально значимы при оценке биоаффинности пре паратов и понимания принципов и специфики взаимодействия рецептор – лиганд. Обычные биологические методы предполагают определение связан ных и/или свободных компонентов в равновесных смесях. При этом либо ис пользуется метод радиоактивных индикаторов, который позволяет работать с небольшими количествами веществ, либо требуется относительно большое количество веществ, что не всегда возможно вследствие либо невысокой чувствительность аналитических методов.

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

2.4.2. Капиллярный электрофорез (и гель-эксклюзивная хроматография) Капиллярный электрофорез является методом, обладающим высокими потенциальными возможностями решения различных задач помимо чисто аналитических, включая исследование различных реакций в растворах, опре деление констант равновесий. Так, например, известно использование мето да для определения констант связывания белков с лекарственными субстан циями и даже для определения числа активных точек белков, участвующих в связывании субстанций – в методе аффинного капиллярного электрофореза.

С использованием капиллярного электрофореза разработано 5 методов определения констант связывания лекарственных субстанций с белками а) аффинного капиллярного электрофореза (afnity capillary electrophore sis, ACE);

б) метода Hummel-Dreyer (HD);

в) метода фронтального анализа (FA);

г) метода вакансионного пика (VP);

д) вакансионного аффинного капиллярного электрофореза (VACE).

Взаимодействующие компоненты могут находиться либо в составе элек тролита – буфера, либо во вводимой в систему пробе, и возможны вариан ты когда эти компоненты находятся один – в пробе, другой в буфере. При фиксированной концентрации одного из взаимодействующих компонентов варьируют концентрацию другого, добиваясь максимума в специфичности взаимодействия. Параметры связывания при этом могут быть рассчитаны:

• по изменению электрофоретической подвижности лекарственного компонента;

• по концентрации несвязанной формы субстанции;

• по количеству связанной субстанции.

Метод аффинного капиллярного электрофореза (ACE) основан на из менении электрофоретической подвижности комплексов по сравнению с ис ходными индивидуальными составляющими. Метод привлекателен тем, что в нем используются такие благоприятствующие свойства капиллярного элек трофореза, как высокая степень разделения компонентов, высокая скорость и чувствительность детектирования, возможность автоматизации измерений.

В методе нет необходимости во введении радиоактивных меток, возможен контроль одновременно нескольких процессов комплексообразования в ис следуемой смеси.

В работе2 при исследовании связывания кедарцидина и апопротеина ис пользовали буферный раствор цитрат-MES (рН = 6.0) с добавками органи ческих растворителей – ДМСО или ацетонитрила. Аффинный буфер гото 2 Liu J. et al // Analyst. – 1998. – V.123. – P.1455- СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ вили введением соответствующих добавок. Пробы белка вводили в смеси с отрицательно заряженной частицей небольшого размера (салицилат-ионом), выполнявшей роль внутреннего стандарта.

Аффинные взаимодействия между белком и лигандом исследовали из мерением времени миграции внутреннего стандарта и белка как функции концентрации лиганда. Коэффициент смещения пика, R, рассчитывали по формуле:

где М0 и М – подвижности свободного и связанного белка, соответствен но.

Экспериментальные данные наносили на график (анализ по Скэтчарду):

«R/[L] vs R», где [L] – концентрация лиганда. В этих координатах экспери ментальные данные аппроксимирую прямой линией, в которой угол наклона, равный -1/К, используют для нахождения константы связывания, К.

Об изменении электрофоретической подвижности белка при связывании с лигандом можно судить по рис.2.26, а график Скэтчарда представлен на рис.2.273.

Метод Hummel-Dreyer (HD). Впервые гель-проникающая хроматогра фия была использована для исследования образования комплексов между макромолекулами и вещствами небольшой молярной массы. Метод может быть использован в том случае, когда равновесие между исследуемыми ком понентами устанавливается длительное время и когда нет возможности раз делить комплекс и белок.

Пусть белок, Р, и субстанция (лиганд, L) образуют комплекс:

Константа равновесия связывание двух веществ имеет вид:

3 Разрешение на опубликование в открытой печати не получали.

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Рис.2.26. АСЕ профили взаимодействия кедарцидина и апопротеина (Liu J. et al // Analyst. – 1998. – V.123. – P.1455-1459) Рис.2.27. График Скэтчарда для взаимодействия кедарцидина и апопротеина (Liu J. et al // Analyst. – 1998. – V.123. – P.1455-1459) СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Когда образец, содержащий оба компонента и их комплекс, вводится в колонку, содержащую тот же лиганд с известной концентрацией [L]0, на чальная концентрация лиганда в общем случае отличается от этой вели чины. Но вследствие различной скорости перемещения зоны комплекса и белка (имеющих одинаковую подвижность так как между ними существует лишь небольшое различие в массах), с одной стороны и лиганда – с дру гой, концентрация лиганда в равновесии с комплексом оказывается равной именно [L]0. В таком случае константа равновесия может быть переопре делена:

Следовательно, для определения константы связывания достаточно опреде лить рапределение белка между комплексом и несвязанным состоянием. Для этого можно приготовить несколько смесей белка с лигандом с изменяющейся концентрацией лиганда и выдержать смесь до установления равновесия.

Далее необходимо выполнения следующих условий:

1. Размер белка должен быть намного больше, чем лиганда (что в случае капиллярного электрофореза эквивалентно одинаковой электрофоретичес кой подвижности белка и комплекса).

2. Установление стационарного режима должно быть достигнуто до элю ирования белка (или комплекса) из колонки, т.е. в элюционном объеме равно весная концентрация лиганда должна быть равной [L]0.

В таком случае элюционная картина будет зависеть от того, как соотно сятся друг с другом равновесная концентрация свободного лиганда во вво димой пробе, [L]s, и элюенте [L]0, в соотношении между которыми возможно три варианта, рис.2.28.

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

Рис.2.28. Характер элюционной кривой в зависимости от параметров записи Таким образом, количество лиганда, связанного в комплекс, можно оп ределить либо записывая хроматограммы в одном составе подвижной фазы для различных соотношений белок – лиганд в исходной смеси, либо изменяя состав подвижной фазы для одного и того же образца. Впрочем, недостаю щий параметр, n, для расчета константы связывания любом случае может быть найден при использовании обоих вариантов. Отметим, что точное зна чение [L]0 может быть определено интерполяцией площадей пика лиганда на нулевую площадь (для отрицательных пиков используется отрицательное значение площади), рис.2.29.

Методы вакансионного пика (VP) и вакансионного аффинного капил лярного электрофореза (VACE). Если в первом из рассмотренных методов для расчетов используют изменение подвижности аналитов, а во втором – площадь вакансионного пика, то в близких ко второму методах VP и VACE также используют «вакансионный» пик. В методе VP в систему, в буферную систему, содержащую оба компонента, впрыскивают чистый буфер. При этом концентрация одного из компонентов фиксируется, а второго – изменяется, что позволяет рассчитать искомую константу (обычно используют фиксиро ванную концентрацию белка и изменяют концентрацию лиганда). В методе СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ VACE контролируют изменение подвижности компонентов. Принципы рас четов во многом аналогичны рассмотренным выше.

Метод фронтального анализа (FA). Принцип метода прост и очевиден:

можно выбрать условия так, чтобы при постоянном токе через капилляр элю ента, содержащего равновесную смесь белка, лиганда и комплекса, вначале появится «плато» чистого компонента (например, белка), а затем смеси рав новесной концентрации белка и комплекса. Концентрации этих компонентов находят предварительной градуировкой отклика детектора.

Рис.2.29. Зависимость площади пика лиганда от [L] 2.4.3. Метод ВЭЖХ с использованием циклодекстринов Использование циклодекстринов для разделения энантиомеров в услови ях обращено-фазовой хроматографии возможно вследствие различных конс тант связывания энатиомеров в циклодекстринами.

Фактор удерживания сорбата Х, k(X) связан с константой распределения этого вещества между двумя фазами через фазовое соотношение колон ки, :

Пусть коэффициент распределения сорбата между стационарной и под вижной фазами в отсутствии в подвижной фазе циклодекстрина равен K:

Пусть сорбат образует комплекс с циклодекстрином в подвижной фазе, удерживанием которого можно пренебречь:

Дейнека В.И., Лебедева О.Е.

При этом в уравнении для константы распределения сорбата в знамена теле должна быть сумма концентраций обеих форм сорбата в подвижной фазе:

Таким образом, величина, обратная фактору удерживания вещества долж на линейно зависеть от концентрации циклодекстрина в подвижной фазе, что и было подтверждено экспериментально, рис.2.30. В таком случае по пара метрам линейного уравнения может быть рассчитана константа комплексо образования циклодекстрина с сорбатом.

В данном случае в качестве стационарной фазы была использована обыч ная СN-фаза (Zorbax CN). При этом эффективность разделения энантиомеров эфедрина и псевдоэфедрина оказалась различной, несмотря на одинаковый набор функциональных групп для всех четырех веществ. В целом, наилуч шие результаты получены при использовании подвижных фаз, содержащих циклодекстрин на пределе его растворимости (порядка 20 ммоль/л) с добав ками триэтаноламина и уксусной кислоты, регулирующими процесс комп лексообразования. Если разделение энантиомеров псевдоэфедрина удается выполнить, то пара энантиомеров эфедрина в использованных составах под вижной фазы почти не разделялась.

СУПРАМОЛЕКУЛЯРНАЯ ХИМИЯ Рис.2.30. Зависимость параметров удерживания эфедрина и псевдо эфедрина от концентрации -циклодекстрина в подвижной фазе.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.