авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
-- [ Страница 1 ] --

Министерство образования Республики Беларусь

Международный государственный экологический

университет им. А.Д.Сахарова

Факультет радиобиологии и экологической медицины

Кафедра биохимии и биофизики

А.И.Зинченко, Д.А.Паруль

Основы

молекулярной биологии вирусов

и антивирусной терапии

Минск

МГЭУ

2003

ББК

УДК 578:615.281

Авторы:

Профессор кафедры биохимии и биофизики, чл.-корр. НАНБ Зинченко А.И., ст. преподаватель кафедры биохимии и биофизики, канд. биол. наук Паруль Д.А.

Издано по решению Совета Международного государственного экологического университета им А.Д.Сахарова № от Зинченко А.И., Паруль Д.А. Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии / Мн.: МГЭУ им. А.Д.Сахарова, 2003, ххх с.

В учебном пособии рассмотрен широкий круг вопросов, включающий современные концепции учения о вирусах, свойства вирусов, химия и архитектоника вирусных частиц, влияние на них различных физических и химических факторов. Коротко описан арсенал биохимических методов, использующихся при очистке, концентрировании и анализе вирусных препаратов. На основе анализа молекулярных аспектов взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой рассмотрены механизм действия основных противовирусных химиопрепаратов, а также существующие и перспективные пути профилактики и терапии наиболее социально-значимых вирусных инфекций.

Рекомендуется для студентов ВУЗов, обучающихся по специальностям медико-биологического профиля.

Ил. 42, табл. 14, библиогр. 94 назв.

Предисловие Интерес к вирусам – мельчайшим объектам, стоящим на самой границе между живым и неживым, обусловлен двумя главными причинами. Первая заключается в том, что вирусы являлись в прошлом, остаются до сих пор и, по-видимому, будут еще долго оставаться в будущем одними из главных возбудителей инфекционных заболеваний. Достаточно напомнить, что оспа, уносившая в прошлом миллионы жизней, является вирусным заболеванием, известным человечеству тысячелетия.

Перечень заболеваний, вызываемых вирусами, весьма внушителен.

Уже общепризнано, что ряд вирусов непосредственно вовлечен в образование опухолей. Вирусы растений наносят колоссальный экономический урон и заметно снижают продовольственные ресурсы человечества. В тоже время успехи в терапии вирусных инфекций в сравнении с успехами в лечении бактериальных инфекций выглядят гораздо скромнее. Нет эффективных вакцин против большинства вирусных инфекций. В клиническую практику внедрены единичные высокоэффективные химиопрепараты. До сих пор не нашли широкого практического применения индукторы интерферона.

Постоянно появляются новые неизвестные ранее вирусные заболевания и получают распространение те, которыми ранее долгое время пренебрегали.

Несмотря на потрясающие успехи науки, достигнутые в ХХ веке, «головной болью» человечества в веке ХХI будут оставаться СПИД, грипп, эндогенные гепатиты и ряд др. вирусных и, вполне вероятно, прионовых заболеваний.

Сказанного достаточно, чтобы оправдать то внимание, которое уделяется изучению вирусов. Однако дело не исчерпывается огромной практической важностью вирусов для здравоохранения, ветеринарии и растениеводства.

В связи с простотой строения вирусы стали незаменимыми объектами и моделями, помогающими решать общебиологические, генетические, биохимические, молекулярно-биологические проблемы. Так, многочисленные исследования по выяснению механизмов репликации, транскрипции и трансляции нуклеиновых кислот, способов регуляции экспрессии генов, а также расшифровка генетического кода, структуры белков и нуклеиновых кислот – все это проводилось и продолжает проводиться при использовании как целых вирусных частиц, так и их отдельных компонентов. Другими словами, едва ли можно найти такую проблему в области молекулярной биологии, в разрешение которой изучение вирусов не внесло фундаментальный вклад.

Отсюда следует, что ни один биолог или врач не может считать себя достаточно образованным, если он не знаком с основами вирусологии в ее современном виде.

В основу настоящей книги легли лекции, читаемые в течение последних 5 лет одним из авторов студентам Государственного международного экологического университета им. А.Д.Сахарова по утвержденной программе в качестве раздела курса «Молекулярная медицина».

Весь материал книги условно подразделен на три части. В первой из них (главы 1 и 2) рассмотрен предмет и история развития вирусологии, даны представления о структуре и химии вирусов;

во второй (главы 3 и 4) – процессы, сопровождающие взаимодействие клетки с вирусами, а также представителями нового класса возбудителей инфекционных заболеваний – прионами. Назначение третьей части (главы 5 и 6) – ознакомить студентов с современными и перспективными возможностями контроля вирусных инфекций. При этом особое внимание уделено патологиям, вызываемым наиболее значимыми с медицинской и социальной точек зрения группам возбудителей, включая вирусы гриппа, иммунодефицита, герпеса и гепатита.

Материал подается с учетом того, что студенты уже имеют фундаментальную подготовку по химии, биохимии, генетике и др.

химическим и биологическим дисциплинам, необходимую и достаточную для продуктивного усвоения материала.

Вполне естественно, что ввиду ограниченного объема книги, в ней затронуты далеко не все аспекты молекулярной вирусологии и антивирусной терапии. Как и всегда в подобных случаях, отобранный материал в значительной степени отражает личные научные интересы авторов.

За редким исключением мы не приводим ссылок на авторов. Нашей задачей являлось рассмотрение принципиальных вопросов, а не устанавливать приоритет ученых. Кроме того, описание методов дано очень схематично и не претендует на полноту. Мы надеемся, что студенты обратятся к рекомендованной литературе, которая позволит им более подробно ознакомиться с интересующими их вопросами.

Авторы Список сокращений ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВПГ-1 – вирус простого герпеса первого типа (HSV-1) ВПГ-2 – вирус простого герпеса второго типа (HSV-2) ВТМ – вирус табачной мозаики CD4 – Т-лимфоциты хелперы / индукторы СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита ss – одноцепочечная (single-stranded) ДНК или РНК ds – двухцепочечная (double-stranded) ДНК или РНК АТФ – аденозин-5’-трифосфорная кислота ХТИ – химиотерапевтический индекс БКЯ – болезнь Крейцфельда-Якоба ОРВИ – острая респираторная вирусная инфекция БВДУ – 5-бром-2’-дезоксиуридин НТФ – нуклеозид-5’-трифосфат НМФ– нуклеозид-5’-монофосфат НДФ– нуклеозид-5’-дифосфат ИЛ – интерлейкин ВГА – вирус гепатита А ВГЕ – вирус гепатита Е ВГВ – вирус гепатита В ВГС – вирус гепатита С ВГD - вирус гепатита D ММА – молекулы межклеточной адгезии ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ПЦР – полимеразная цепная реакция IgA - иммуноглобулины класса А IgG - иммуноглобулины класса G IgM - иммуноглобулины класса М В/м – внутримышечно FDA – (Food and Drug Administration) Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США Глава 1.

ВВЕДЕНИЕ. НАУКА ВИРУСОЛОГИЯ.

ОБЩИЕ ВОПРОСЫ Некоторые болезни, в вирусной природе которых мы сейчас не сомневаемся, были известны людям еще тысячи лет назад. Первым документированным упоминанием о вирусной инфекции считается дошедшая до нас клинопись Мэмфиса (столица античного Египта), написанная около 1400 лет до н. э. и представившая типичные клинические проявления паралитического полиомиелита. Кроме того, фараон Рамзес V, который умер в 1196 году до н. э. и чья мумия сейчас хранится в Каирском музее, полагают, имел поражения на лице, похожие на поражения современных пациентов, страдающих от оспы.

Весьма напоминает оспу эпидемия, описанная в Х веке до н.э. в Китае.

В медицинскую практику Запада в конце XVIII в. была введена прививка Дженнера – вакцинация экстрактами, содержащими вирус коровьей оспы. В 1885 г. Луи Пастер приготовил вакцину против бешенства из ослабленного (аттенуированного) штамма вируса. Майер в 1986 г. продемонстрировал возможность передать болезнь табака путем механической иннокуляции соком больных растений. Успехи, достигнутые к концу XIX в. в изучении болезней человека, вызванных бактериями, усилили интерес к тем инфекционным болезням, возбудители которых были еще неизвестны.

Однако предположения о существовании субмикроскопических патогенных агентов еще не имели экспериментальной основы.

И вот в 1892 г. русский ботаник Д.И.Ивановский сообщил о возможности передачи мозаичной болезни табака соком, профильтрованным через керамический фильтр, задерживающий самые мелкие бактерии. Это сообщение осталось практически не замеченным. Даже сам автор до конца не осознал своего открытия. Потребовалось еще шесть лет (до открытия в г. Ф.Леффлером и П.Фрошем возбудителя ящура) для всеобщего принятия концепции фильтрующихся (т.е. ультрамелких) инфекционных частиц. В этом же году (1898) голландский исследователь М.Бейеринк подтвердил результаты Ивановского по вирусу табачной мозаики и явился первым, кто разработал современную идею вирусов, которые он назвал «contagium vivum fluidum”, т.е. жидким живым возбудителем.

Не смотря на открытие вирусов, вызывающих болезни у растений и животных, существовало сопротивление идее, что вирусы могут иметь какое либо отношение к заболеваниям человека. Наконец, сомнения были рассеяны Лэндстайнером и Поппером, которые в 1909 г. показали, что полиомиелит вызывается тоже фильтрующимся агентом. Это было первое заболевание человека, для которого была доказана вирусная природа.

Ф.Туорт (1915) и Ф.Д’эрель (1917) первыми открыли вирусы, патогенные для бактерий – бактериофаги (дословно – пожиратели бактерий). Начиная с 30-х годов XX в. Луриа, Дельбрюк и многие другие вирусологи стали широко использовать фаги в качестве модели для изучения многих аспектов вирусологии, включая структуру вирусов, генетику, репликацию и т.д.

Честь войти в историю вирусологии в качестве первого, кому удалось выделить вирус (ВТМ) в очищенном (кристаллическом) состоянии, принадлежит американскому биохимику В.Стэнли (1935).

Долгое время не существовало принципиальных трудностей в отнесении инфекционных агентов к вирусам или другим живым организмам.

Однако в настоящее время изучение молекулярных основ некоторых инфекционных агентов усложнило этот вопрос. Дело в том, что некоторые вновь открытые инфекционные агенты обладают свойствами, которые не позволяют отнести их к вирусам, хотя они гораздо ближе по своей природе к вирусам, чем к другим живым организмам. Речь идет о вироидах, вирусоидах и прионах. Вироиды – это очень мелкие (несколько сотен нуклеоидов) кольцевые молекулы РНК, с палочко-образной вторичной структурой. Они не обладают оболочкой и ассоциируются с некоторыми болезнями растений.

Их репликационная стратегия подобна вирусной: они - также облигатные внутриклеточные паразиты. Вирусоиды (сателлиты) – это вироид-подобные молекулы, несколько большие, чем вироиды (до 2000 нуклеотидов), которые зависят от присутствия в клетке других реплицирующихся вирусов (вирусов помощников). Прионы – инфекционные агенты, состоящие из единственной молекулы белка без какой-либо нуклеиновой кислоты. Удивительно то, что прионовый белок и ген, который кодирует его, находят в нормальных, неинфицированных клетках. Прионы ассоциируют с т.н. «медленными инфекциями», такими, например, как болезнь Крейцфельда-Якоба и куру человека, а также скрейпи овец и губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота. Кроме того, современные молекулярно-генетические исследования показали, что около 5-10% генома эукариотической клетки состоит из мобильных вирусоподобных элементов (транспозонов), которые могут играть значительную роль в эволюции как клеточных, так и вирусных геномов. Кроме того, геномы некоторых бактериофагов сильно схожи с бактериальными плазмидами в отношении структуры и механизмов репликации. Все это говорит о том, что взаимоотношения между вирусами и другими живыми организмами возможно более сложные, чем считалось ранее.

1.1. Зачем необходимо изучать вирусы Необходимость изучения вирусов диктуется рядом обстоятельств и, прежде всего, тем, что в настоящее время насчитывается более сотни вирусных заболеваний человека. Число вирусных патологий животных и растений во много раз больше. Ущерб мировой экономике, наносимый ежегодно вирусами, исчисляется многими миллиардами долларов, большая часть которых приходится на счет фитопатогенных вирусов.

Следует отметить, что в настоящее время накапливаются данные о том, что имеется связь вирусов с заболеваниями человека, которые никогда не считались вирусными. В качестве примера, отметим, что у больных рассеянным склерозом в 53 случаев из 100 в клетках обнаруживают геном одного из ретровирусов (MSRV). В контроле этот показатель составляет не более 7%. В этиологии сахарного диабета выявляется вирус Коксаки. При некоторых психических заболеваниях упорно выявляют вирус болезни Борна. Есть потенциальная связь между отторжением пересаженного сердца и обнаружением в таких трансплантантах вируса Эпштейна-Барр.

Итак, многие вирусы – это враги человека, животных и растений. И хотя мы уже знаем о них довольно много, этого далеко не достаточно для того, чтобы разработать успешную стратегию борьбы с каждым конкретным вирусным патогеном. Дело осложняется тем, что мир вирусов столь разнообразен, что порой один вирус отличаются от другого более кардинально, чем отличаются между собой кишечная палочка и слон, между которыми, на взгляд обывателя, вообще ничего нет общего. Кроме того, на наиболее уязвимых стадиях своего цикла развития вирусы столь тесно интегрируются с клеткой-хозяином, что трудно найти средство, позволяющее поразить вирус, не затрагивая при этом клетки. Отсюда не случайно, что противобактериальных средств (к примеру, антибиотиков) имеется несколько сот, а эффективных противовирусных препаратов нет и двух десятков.

Причем большинство из них имеет ограниченную терапевтическую ценность из-за побочных эффектов по отношению к нормальным органам и тканям.

Другая причина, по которой следует изучать вирусы, заключается в том, что в вирусах сконцентрировались многие кардинальные проблемы современной биологической науки, решение которых было бы немыслимо на более сложных объектах исследования.

Что же дало изучение вирусов для познания фундаментальных законов биологической науки?

Прежде всего, вирусы в свое время дали мощный толчок для развития разнообразных химических, физико-химических и физических методов исследования, в частности – ультрацентрифугирования (аналитического и в градиенте концентрации сахарозы или солей тяжелых металлов), электрофореза, хроматографии, электронной микроскопии и т.д.

В 1947 г. Шрамм открыл явление самосборки белковых оболочек вируса табачной мозаики (ВТМ). Впоследствии было обнаружено, что так собираются многие белковые ансамбли у различных живых организмов.

Херши и Чейз в 1952 г. открыли чрезвычайно важное с вирусологической и общебиологической точек зрения явление. Они показали, что инфекция кишечной палочки (Escherichia coli) фагом Т осуществляется его ДНК, не целым фагом.

В 1957 г. работами Френкель-Конрата и Зингер была показана возможность искусственного получения путем дезагрегации и реконструкции т.н. «химерных» вирусных частиц, в которых белок и РНК принадлежали разным штаммам ВТМ. Оказалось, что потомство таких химерных вирусов было неотличимо от штаммов-доноров РНК ни серологически, ни по симптомам заболевания, ни по аминокислотному составу белков. Эти эксперименты явились еще одним доказательством того, что материальными носителями генетической информации являются нуклеиновые кислоты, а не белки. Кроме того этими опытами впервые было продемонстрировано, что генетическая информация может быть закодирована не только в ДНК, но и в РНК.

Что касается роли белков, интересно отметить следующее. Холланд показал, что изолированные нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (в т.ч.

вирусов полиомиелита, Коксаки и ЕСНО) являются не только инфекционными (что само по себе в свое время казалось удивительным), но и могут заражать даже клетки тех организмов, которые к целому вирусу невосприимчивы. При этом в инфицированных клетках образуются зрелые вирусные частицы, идентичные исходным вирусам по всем без исключения биологическим и физико-химическим характеристикам.

У некоторых РНК-содержащих фагов обнаружены аналогичные явления. А именно, целые частицы способны заражать только F+ (мужские) особи бактерий, в то время как их нуклеиновые кислоты могут инфицировать как мужские, так и женские (F-) штаммы бактерий. Эти данные, многократно подтвержденные на самых различных вирусных моделях, позволили ученым придти к закономерному выводу о том, что тропизм вирусов по отношению к тем или иным клеткам-хозяевам обусловливается вирусными белками.

Интенсивные исследования вирусов привели к изменению взглядов на типы и формы нуклеиновых кислот: на двухспиральную структуру ДНК и односпиральную РНК, на тимин и урацил, которые непременно должны входить в состав ДНК и РНК, соответственно.

В 60-х годах появилось несколько сообщений об аномалиях химического состава в вирусных нуклеиновых кислотах. Так было доказано, что у Т-четных фагов цитозин полностью замещен 5-оксиметилцитозином.

Т.о. ученые впервые столкнулись с фактом полного замещения канонического азотистого основания на неизвестное ранее его производное.

Потрясением основ стало обнаружение в составе ДНК одного из фагов Bacillus subtilis урацила в сочетании с дезоксирибозой. По мере дальнейших исследований стало очевидным, что когда речь идет о вирусных нуклеиновых кислотах, нормой является, скорее, наличие самых разнообразных аномалий в их составе, а нуклеиновые кислоты с каноническими азотистыми основаниями и сахарами – большая редкость.

За период с 1962 по 1964 г. благодаря изучению макромолекулярной структуры вирусных нуклеиновых кислот было обнаружено, что в природе существуют другие, не известные на тот момент времени типы нуклеиновых кислот: одноцепочечные (ss) ДНК, двухцепочечные (ds) РНК и циклические формы ДНК и РНК.

Первое выделение мРНК было осуществлено в 1962 г. Баутцем и Холлом из клеток E. coli, инфицированной фагом Т2. Следует отметить, что для этой цели ученые применили весьма оригинальный метод комплементарной адсорбции мРНК на иммобилизованной фаговой ДНК.

Неоценимую роль сыграли вирусы в решении важнейших вопросов генетики. Благодаря таким положительным качествам вирусной модели, как большая скорость размножения, простота культивирования и выраженная способность к рекомбинации признаков, на ней были сделаны очень важные открытия в области общей и молекулярной генетики. Так к 1963 г. была составлена первая генетическая карта (фаг Т4), установлена единица генетической рекомбинации (равная одному нуклеотиду) и единица функции (цистрон). Весьма неожиданно генетическая карта оказалась кольцевой, а не линейной. Начиная с указанных исследований вирусы превратились в излюбленную модель для изучения молекулярных механизмов наследственности и изменчивости организмов вообще.

В 1950-1953 гг. Львову удалось открыть явление интеграции ДНК фагов с геномом клетки-хозяина с последующей репликацией вирусной ДНК в составе хромосомы бактериальной клетки, т.е. в состоянии т.н. «профага».

Одновременно Львов открыл феномен индукции профага под влиянием некоторых физических и химических факторов. Спустя 10 лет (Дульбекко и Фогт, 1960) явление, аналогичное лизогении, было открыто при изучении клеток животных, зараженных некоторыми вирусами. В 1961 г. было показано, что преобразование нормальной клетки в раковую способны вызывать не только целые вирусы (например, полиомы и папилломы), но и их очищенные нуклеиновые кислоты. Все эти данные подтвердили вирусо генетическую концепцию происхождения опухолей, сформулированную в 1944-1961 гг. советским исследователем Л.А.Зильбером. Все последующие гипотезы включали в себя основное ее положение – интеграцию вирусного генома с геномом клетки-хозяина – как обязательный элемент.

Необходимо отдельно подчеркнуть, что, как показано в последние годы, интеграция геномов (вирусного и клетки-хозяина) довольно широко распространена в природе и в определенной мере способствует обмену генетической информацией в биосфере. Другими словами, вирусы (по крайней мере, некоторые) являются инструментом бесконтактного обмена генетической информацией между живыми организмами, и этот обмен, возможно, имеет определенное эволюционно значение.

Действительно, обмен генетической информацией между пространственно разобщенными организмами весьма полезен для эволюции, но такой обмен – редкое событие, хотя бы по той причине, что генетический материал для его осуществления должен совершить довольно опасное путешествие по внешней среде перед тем, как попасть в потенциальную реципиентную клетку. В то же время вирусы, транспортируя свою нуклеиновую кислоту от клетки к клетке, могут быть идеальными медиаторами такого генетического обмена, в ряде случаев даже межвидового.

Таким образом, на вирусах как модели простейших живых организмов в прошлом были сделаны важнейшие открытия в области молекулярной биологии и молекулярной генетики.

В настоящее время вирусы служат инструментом в генно-инженерных экспериментах. На их основе создаются эффективные векторы для клонирования и переноса генетической информации от одних организмов к другим.

1.2. Природа вирусов Вирусы являются субмикроскопическими облигатными внутриклеточными паразитами. На первый взгляд, даже такое простое определение позволяет отличать вирусы от всех других групп живых организмов. Однако, это определение все же нельзя признать до конца исчерпывающим. Ясно, что нет проблем в том, чтобы увидеть разницу между вирусами и высшими организмами. Приведенного определения достаточно также и для того, чтобы отличить вирусы от прокариотов и микроскопических эукариотов таких, как грибы, простейшие и водоросли.

Однако существует несколько групп прокариотических организмов, имеющих в своих жизненных циклах особые паразитические стадии, которые делают непригодным приведенное выше определение вирусов. Речь идет о риккетсиях и хламидиях – облигатных внутриклеточных паразитических бактериях. Эти бактерии в результате эволюции настолько стали ассоциированы с клеткой – хозяином, что вне её они уже существовать не могут. В связи с этим, возникла необходимость в усложнении определения – что же такое вирус.

В настоящее время одним из наиболее приемлемых определений вирусов является следующее:

Вирусы – это субмикроскопические (20-300 нм) ДНК- или РНК содержащие объекты, репродуцирующиеся только в живых клетках, заставляя их синтезировать т.н. вирионы, которые содержат геном вируса и способны перемещать его в другие клетки.

Это определение отражает два главных качества вирусов: во-первых, наличие у вируса собственного генетического материала, который внутри клетки-хозяина ведет себя как часть клетки, и, во-вторых, существование внеклеточной инфекционной фазы, представленной специализированными частицами, или вирионами, которые служат для введения генома вируса в другие клетки.

Еще раз следует подчеркнуть, что внутриклеточный паразитизм свойственен не только вирусам. Однако паразитизм вирусов – особый. Его можно характеризовать, как паразитизм на генетическом уровне. В отличие от вирусов, такие паразиты, как риккетсии, малярийный плазмодий, имеют собственный рибосомный и митохондриальный аппараты и клеточную организацию.

Вирусы имеют ряд свойств, которые не укладываются в представления о них как о живых объектах, а именно:

- вирусы не дышат, - не проявляют раздражимости, - не способны самостоятельно двигаться, - не растут и не делятся, - способны (по крайне мере некоторые) в очищенном состоянии кристаллизоваться.

Итак, согласно традиционным зоологическим и ботаническим критериям, вирусы не являются живыми организмами. В то же время, все вирусы обладают главными свойствами живых организмов – способностью реплицироваться, изменяться и передавать эти изменения потомкам, т.е.

эволюционизировать. Другими словами, вирусы имеют собственную эволюционную историю.

Ни один из известных вирусов не имеет биохимических или генетических потенций для генерирования энергии, необходимой для осуществления своих биологических процессов. В этом отношении они абсолютно зависят от клетки-хозяина.

Как видим, вирус имеет две формы существования: внеклеточную (покоящуюся), представленную вирионом, или вирусной частицей, и внутриклеточную – вегетативную. Внутри клетки-хозяина вирионы не растут и не делятся. Они как бы собираются из «запчастей» как автомобили на конвейере. Подключив воображение, сам вирион можно представить как межпланетный корабль, который от планеты к планете (т.е. от клетки к клетке) переносит своих обитателей (лабильные геномы).

Часто спрашивают – живые вирусы или нет? Скорее всего, ответ должен быть таков: внутри клетки-хозяина вирус живой, в то время как вне её вирус представляет собой просто ансамбль из метаболически инертных химических соединений.

Несмотря на свою простоту, среди вирусов наблюдается разнообразие большее, чем среди бактерий, растений и животных, вместе взятых. Это явилось результатом тех «успехов», которых добились вирусы в паразитизме на всех известных группах живых организмов, и понимание этого разнообразия является ключом к постижению взаимоотношений вирусов с их хозяевами и разработке мер эффективной противовирусной защиты.

1.3. Происхождение вирусов С вопросом о природе вирусов тесно связаны вопросы об их происхождении и эволюции. В разное время были высказаны три основные гипотезы о происхождении вирусов. Ряд исследователей полагают, что вирусы – это потомки неких доклеточных форм жизни, ставшие в результате эволюции паразитами. Согласно второй гипотезе, вирусы – результат дегенеративной эволюции древних бактерий. Однако большинство ученых считают, что вирусы произошли от клеточных компонентов, т.е. фактически от генов. В настоящее время ни одна из перечисленных гипотез не может претендовать на роль теории, хотя предпочтение отдается двум последним предположениям.

Следует отметить, что когда рассматривают проблему происхождения каких-либо организмов, всегда строят т.н. «филогенетическое древо». Для его построения весьма полезными являются эксперименты по выяснению степени родства первичной структуры нуклеиновых кислот. Сиквенирование геномов множества вирусов и сравнение их геномов показало, что единого предка у вирусов нет. Это находит свое выражение в том, что в случае вирусов простое фамильное филогенетическое древо построить невозможно.

Эволюционные связи между вирусами скорее напоминают не дерево а отдельно растущие кусты.

При изучении эволюции организмов весьма полезным является также анализ ископаемых форм. Однако, никто еще не обнаружил ископаемых вирусов – они слишком малы и лабильны, чтобы выдержать процессы, которые сопровождают минерализацию. В результате, исследователи вынуждены изучать только вирусы, изолированные в настоящее время, или их предков, которым не больше нескольких десятков лет.

Итак, есть основания считать, что некоторые вирусы – это потомки древних бактерий, которые претерпели дегенеративную эволюцию. Это видно из сопоставления ряда: обычные бактерии – микоплазмы и риккетсии – хламидии – вирус оспы. Микоплазмы и риккетсии несомненно являются продуктами дегенерации бактерий. При этом микоплазмы потеряли клеточную стенку, а риккетсии уменьшились в размерах и упростили свою организацию. Хламидии еще больше упростились и потеряли митохондрии, став, таким образом, не только внутриклеточными паразитами, но и паразитами энергетическими. Резонно предположить, что вирусы оспы появились на дальнейшей стадии дегенеративной эволюции, в результате которой хламидиями были потеряны рибосомные системы синтеза белка.

Система репликации и транскрипции ДНК, однако, сохранилась, что позволило возникшим вирусам размножаться в безъядерных клетках. Именно поэтому в отличие от всех других ДНК-содержащих вирусов вирус оспы размножается в цитоплазме, а не в ядре клетки-хозяина.

С большой долей вероятности ретровирусы произошли от клеточных генов. Сходные генетические элементы, обладающие обратной транскриптазой, обнаружены у дрозофил и грибов. Всех их относят к мобильным генетическим элементам (транспозонам), и сами ретровирусы в сущности являются своеобразными транспозонами. Во всяком случае некоторые из них, будучи вирусоподобными, никогда не проходят стадии вирионов.

1.4. Эволюция вирусов Главный вывод, который делает всякий, кто знакомится с результатами изучения молекулярной филогении вирусов, заключается в том, что вирусы эволюционизировали совместно со своими хозяевами.

Вирусы почти всех главных классов организмов – животных, растений, грибов, бактерий и архей – очень долго эволюционизировали с их хозяевами еще в мировом океане, учитывая, что основная часть времени, отпущенного на эволюцию на нашей планете, пришлась именно на тот период. Это означает, что вирусы, вероятно, выходили из океана со своими хозяевами во время последовательных волн колонизации суши. Иными словами:

- вирусы бактерий, ныне обитающих на суше, вероятно, происходят от вирусов, обитавших 3500 млн. лет назад в первых бактериях «колонизаторах» суши;

- большинство вирусов наземных растений, вероятно, происходят от вирусов зеленых водорослей, которые появились около 1000 млн.

лет назад;

- большинство вирусов наземных насекомых происходит от вирусов вымерших ископаемых;

- большинство вирусов наземных позвоночных происходят от тех, что вышли на сушу с первыми дышащими воздухом позвоночными млн. лет назад.

Это объясняет, почему вирусы разных типов хозяев так сильно различаются между собой – они имели слишком много времени для адаптации к своим жизненным нишам после дивергенции из возможно даже имевшегося общего предка. Так между бактериофагами и вирусами эукариот практически нет родства, поскольку эволюционно они разошлись слишком давно. Однако еще сохранилось некоторое сходство между вирусами растений и позвоночных и (еще большее) между вирусами позвоночных и насекомых.

Следует отметить, что, сосуществуя с одно- и многоклеточными организмами в течение миллионов лет, вирусы не только приспосабливались к клеткам-хозяинам, но и «приспосабливали» эти клетки к себе.

Так, нормальные диплоидные клетки человека (например, линии WI 38) могут делиться ограниченное число раз (50±10) и погибают в конце концов в результате т.н. феномена «запрограммированной смерти» апоптоза. В тоже время клетки, подвергшиеся вирусиндуцированой трансформации (малигнизации) становятся при пассировании в определенном смысле бессмертными. Есть предположение, что этот феномен возник не случайно, а как защитная мера вируса против апоптоза.

Действительно, поскольку инфицированные клетки самоуничтожались прежде, чем могло сформироваться потомство вируса, потребовались антиапоптозные меры (и вирусы в ходе эволюции их выработали), которые гарантировали бы вирусам возможность завершать цикл репликации.

Как уже отмечалось выше, очень вероятно, что некоторые вирусы произошли от клеточных транспозонов и эписомальных элементов. В ходе эволюции последние сумели захватить часть генома клетки-хозяина. В результате такого «молекулярного пиратства» они приобрели относительную автономность (по крайне мере, в течение части репликативного цикла), способность перемещаться от одной клетки-хозяина к другой, а в ряде случаев - интегрировать свой геном с геномом хозяина.

Интересной эволюционной «находкой» некоторых сложных вирусов явилось то, что они приобрели способность уклоняться от иммунологической атаки со стороны организма-хозяина путем своеобразного камуфляжа – включения в состав своей оболочки элементов мембраны клетки-хозяина.

1.5. Классификация и номенклатура вирусов Цель классификации любых классов организмов состоит в том, чтобы структурировать в разумные категории те из них, которые наиболее близки по каким-либо признакам. В основу такой группировки могут быть положены морфологические или физиологические критерии, либо те и другие. Идеал, к которому стремится человек, состоит в создании такой классификации, которая не противоречила бы эволюционным связям организмов, а также обеспечивала бы удобную и рациональную систему номенклатуры.

Если говорить о значении классификации вирусов, прежде всего, следует подчеркнуть, что классификация дает возможность предсказывать детали репликации вируса, патогенеза и способы распространения инфекции.

Это имеет особо важное значение в том случае, когда проводится идентификация нового вируса. Далее, если предпринимается изучение нового вида известного семейства или рода вирусов, его можно проводить, принимая во внимание информацию, которая уже накоплена исследователями при изучении других членов этой таксономической группы.

Классификация и номенклатура вирусов всегда вызывала и вызывает (в силу специфики объекта) большие трудности. Как уже отмечалось выше, вирусы, скорее всего, являются сборной группой представителей, имеющих различное происхождение. К такой группе, строго говоря, затруднительно применять таксономические критерии. Поэтому, все современные классификации вирусов не претендуют на то, чтобы отражать филогенетической родство, а служат главным образом в качестве «таблиц для определения», используемых исследователями в практических целях.

Часто вирусы подразделяют в соответствии с природой их хозяев на вирусы животных, вирусы растений, вирусы бактерий и т.д. Однако даже такое подразделение не свободно от противоречий, поскольку вирусы растений способны размножаться в насекомых-переносчиках. Вирусы микроскопических грибов (микофаги) могут размножаться в бактериях.

Поскольку подавляюще число вирусов было открыто как патогенные агенты в отношении человека, животных или растений, представляется рациональным в качестве главного критерия в классификации использовать вид хозяина, у которого впервые были обнаружены патогенные проявления того или иного вируса. Однако для самих вирусов часто более важны не те хозяева, которые представляют интерес для человека, а хозяева, в которых вирус как раз и вызывает наименьшие изменения.

Иногда при классификации вирусов используются особенности структуры вирусной частицы, которые могут быть установлены прямыми (электронная микроскопия) или непрямыми методами (биохимические или серологические исследования). Однако в последнее время самым надежным подходом к классификации вирусов считается подход, которые базируется на учете типа и структуры вирусного генома.

Долгое время при классификации вирусов использовалась унифицированная схема, которая представлена на рис. 1.1.

Рис. 1.1. Иерархическая таксономия вирусов, рекомендованная Международным комитетом по таксономии вирусов в 1966 г.

Руководствуясь приведенной схемой, надо помнить, что таксон «порядок» обязан иметь в своем латинском наименовании суффикс «virales»;

в наименовании семейств присутствует суффикс «viridae»;

подсемейств – «virinae». Наименование родов заканчивается суффиксом «virus». Бинарная номенклатура, обычная для обозначения видов животных, растений и микроорганизмов, в данном случае не применяется. Наименования семейств, подсемейств и родов пишутся с заглавной буквы и с использованием шрифтов типа “Italica”. Наименования самих вирусов пишутся со строчной буквы и без наклона.

Следует отметить, что с 1995 предложено вместо таксона «порядок»

указывать группу Балтимора. Как, согласно современным представлениям, выглядит таксономическое положение вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1) – иллюстрирует рис. 1.2.

Рис. 1.2. Таксономия ВПГ-1, согласно рекомендаций Международного комитета по таксономии вирусов 1995 г.

По типу нуклеиновой кислоты вирусы распределяют на две группы:

ДНК-содержащие вирусы и вирусы, содержащие РНК (табл. 1.1).

Из ДНК-содержащих вирусов патогенные для человека присутствуют в шести семействах. Поксвирусы и герпесвирусы вызывают у человека заболевания, сопровождающиеся поражением кожных покровов.

Аденовирусы – выделены из аденоидов носоглотки. Следующие два семейства объединяют онкогенные вирусы: парвовирусы (в переводе крошечные) и паповавирусы, получившие исторически название по первым слогам наименований вызываемых ими болезней (папиллома и полиома) и названия вируса (вакуолизирующий вирус SV-40). Наконец, в последние годы в самостоятельную единицу выделено семейство гепаднавирусов, в котором решено поместить вирус гепатита В.

Группа патогенных РНК-содержащих вирусов состоит из десяти семейств. Ортомиксовирусы и парамиксовирусы обладают сродством к мукопротеидам клеток. Пять семейств: тогавирусы, аренавирусы, вирусы Буньямвера, реовирусы и ретравирусы – составляют группу арбовирусов, которые циркулируют в природе среди животных и передаются человеку членистоногими. Остальные три семейства – это рабдовирусы, вызывающие бешенство, пикорнавирусы, отличающиеся небольшими размерами, и коронавирусы, частицы которых обрамлены своеобразной короной, вызывают инфекции животных, хотя могут иногда поражать и человека.

Таблица 1.1. Классификация вирусов – возбудителей инфекций человека Тип Семейство нуклеиновой Важнейшие представители кислоты ДНК Poxviridae Вирус натуральной оспы, вирус осповакцины.

ДНК Вирусы простого герпеса типа 1 и 2, вирус Herpesviridae ветряной оспы и опоясывающего лишая, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр.

ДНК Аденовирус человека, аденовирусы Adenoviridae млекопитающих.

ДНК Латентный вирус крыс Килхема, Parvoviridae аденовирусные сателлиты.

ДНК Вирус папилломы Шоупа, вирус полиомы, Papovaviridae вакуулизирующий вирус SV-40.

ДНК Вирус гепатита В.

Hepadnaviridae РНК Вирусы гриппа А, В и С.

Orthomyxoviridae РНК Вирусы парагриппа 1, 2, 3 и 4, вирус кори, Paramyxoviridae респираторно-синцитиальный вирус.

РНК Вирус иммунодефицита человека, вирус Retraviridae саркомы Рауса.

РНК Вирус Буньямвера, вирус Укуниеми.

Bunyaviridae РНК Вирус Синдбис, вирус желтой лихорадки, Togaviridae вирусы клещевого энцефалита, вирус краснухи.

РНК Коронавирус человека, вирус бронхита Coronaviridae птиц.

РНК Реовирус человека, реовирус позвоночных.

Reoviridae РНК Вирус полиомиелита человека, вирус Picornaviridae гепатита А, вирус ящура.

РНК Вирус лимфоцитарного хориоменингита.

Arenoviridae РНК Вирус бешенства, вирус везикулярного Rhabdoviridae стоматита.

Что касается названий вирусов, следует подчеркнуть, что при их формировании не прослеживается единого принципа. Вирусы могут называть в соответствии с вызываемыми заболеваниями (например, вирус герпеса) либо по названию географического места, где они были впервые изолированы (например, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Буньямвера). Иногда используют фамилии исследователей, впервые изучивших вирусы (например, вирус Эпштейна-Барр). Реже в названии отражаются их особые эпидемиологические свойства (например, арбовирусы).

Рекомендуемая литература Основная Ардаматский Н., Абакумова Ю. Клиническое подтверждение вирусной теории атеросклероза // Врач. 1995. № 7. С. 36-38.

Бобков А. Как и когда это могло случиться. Происхождение и эволюция ВИЧ // Мед. курьер. 2000. № 1-2. С. 17-20.

Кордюм В.А. О концепции «вирусы» и их месте в биосфере // Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16, № 2. С. 87-98.

Miller M.J. Viral taxonomy // Clin. Infect. Diseases. 1999. V. 29, N 4. P.

731-733.

Morse S.S., Schluederberg A. Emerging viruses: the evolution of viruses and viral diseases // J. Inf. Dis. 1990. V. 162. P. 1-7.

Дополнительная Краев В.Г. Современная классификация и номенклатура вирусов растений. По материалам Международного комитета по таксономии вирусов // Мiкробiол. ж. 2000. Т. 62, № 5. С. 45-71.

Borio L., Inglesby T., Peters C.J., Schmaljohn A.L., Hughes J.M., et al.

Hemorrhagic fever viruses as biological weapons: medical and public health management // JAMA. 2002. V. 287, N 18. P. 2391-2405.

Boudriau S., Gagnon A., Doyle D. et al. Epstein-Barr virus mediates graft in heart transplant patients // FASEB Journal. 1997. V. 11, № 3. Р. 64.

Herzum M., Schaefer J., Hufnage G., Maisch R. Zytomegalie-und herpes simplex-viren in pathogenese und progression der nativen arteriosnecrose und der rezidivstenose nach der intervention // Herz. 1998. B. 23, № 3. Р. 193-196.

Garson J.A., Tuke P.W., Giraud P. et al. Detection of virion-associated MSRV-RNA in serum of patient with multiple sclerosis // Lancet. 1998. V. 351, № 9095. Р. 33.

Fuhrman J.A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects // Nature. 1999. V. 399. P. 541-548.

Golubev D.B., Perevozchikov A.P. The role of herpes virus in etiopathogenesis of atherosclerosis // Russ. Med. J. 1996. V. 1, № 1. С. 8-15.

Hober D., Andreoletti L., Hober C. et al. Enterovirus et diabete de type 1 // Med. Sci. 1998. V. 14, № 4. Р. 398-403.

Cuilliton B. Emerging viruses, emerging threat // Science. 1990. V. 247. P.

279-280.

Virus Taxonomy: Sixth repot of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Ed. by F.A.Murphy, C.M.Fauquet, D.H.L.Bishop et al. Wien: Springer Verlag, 1995.

Planz O., Rentzsch C., Batra A. et al. Persistence of Borna disease virus specific nucleic acid in blood of psychiatric patient // Lancet. 1998. V. 352, № 9128. P. 623.

Глава 2.

СВОЙСТВА ВИРИОНОВ Физико-химическое изучение любого вируса, как правило, начинается с разработки метода его выделения и очистки. Обычно исходный материал представляет собой культуральную жидкость, тканевой экстракт и т.д. Во всех этих случаях вирус находится в смеси с большим количеством разнообразных балластных веществ – белков, пигментов, структурных компонентов клеток и т.п. Без удаления этих примесей невозможно проводить биохимические исследования вирусов.

2.1. Выделение и очистка вирусов Для очистки большинства вирусов с успехом применяют дифференциальное ульрацентрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы делает возможным более тонкое разделение частиц, седиментационные свойства которых незначительно отличаются друг от друга. Методом равновесной седиментации в градиентах плотности цезиевых солей можно разделить частицы, обладающие различной плотностью.

В случае если вирусы приходится выделять из больших объемов биологических жидкостей, прибегают к высаливанию сернокислым аммонием, осаждению органическими растворителями, осаждению в изоэлектрической точке. Наряду с этим используется ионообменная хроматография, гельфильтрация и т.д. Короче говоря, большинство методов, используемых для очистки белков, применимо и к вирусам. Однако существует и ряд специфических методов, применяемых для очистки только вполне определенных вирусов. Например, миксовирусы можно очистить, используя их способность адсорбироваться на эритроцитах.

Общей схемы, пригодной для очистки любого вируса, в настоящее время не существует. Поскольку свойства вируса, так же как и химические свойства примесей, могут значительно варьировать у различных вируссодержащих материалов, то и выбор приемов очистки будет зависеть от каждого конкретного случая.

Высокоочищенные вирусы можно получить только благодаря последовательному применению целого ряда методов.

2.1.1. Выделение вирусов из зараженных клеток Идеальным методом выделения вирионов был бы тот, который обеспечил сохранение их биологической активности при полном разрушении клеточных компонентов и мембран. Однако такого метода нет. В зависимости от характера исходного материала и природы вируса приемы извлечения вирусов различны.

Размалывание. Этот способ широко применяется в тех случаях, когда приходится работать с большим количеством вируссодержащего материала.

Наиболее простым и почти универсальным приспособлением для размельчения нативной животной ткани является обычная или электрическая мясорубка.

Гомогенизация. Более основательное разрушение ткани достигается при помощи гомогенизаторов. Из препаративных гомогенизаторов наиболее популярны высокоскоростные смесители типа “Warring”. Они снабжены стеклянными или стальными сосудами и набором четырехлопастных стальных ножей, которые соединены с мотором, способным вращаться со скоростью до 15 000 об/мин. Единственным недостатком такого гомогенизатора является то, что развиваемое большое гидродинамическое воздействие в сочетании со вспениванием иногда инактивирует некоторые лабильные вирусы. Эти неблагоприятные условия исключаются при использовании гомогенизаторов, состоящих из двух деталей: толстостенной конусной пробирки и пришлифованного к ней пестика из стекла или тефлона. К сожалению, производительность таких гомогенизаторов незначительна (3-8 г ткани за цикл).

Обработка ультразвуком. Очень широко используется также дезинтеграция клеток, зараженных вирусами, при помощи ультразвука. Если озвучивать жидкость ультразвуком, то при определенной интенсивности звука (около 20 Кгц/сек) в среде возникает явление т.н. кавитации. Благодаря очень быстрому чередованию давления и разрежения, возникает большое число крошечных воздушных пузырьков, которые разрываясь, образуют вокруг себя область с интенсивной ударной волной. При этом возникает мгновенный жесткий локальный градиент давления, который и разрушает клетки.

Лизис клеток. Часто чтобы разрушить зараженные клетки используют ферменты (лизоцим, трипсин, гиалуронидаза и т.д.). Для лизиса дрожжей и грибов эффективен комплексный ферментный препарат Геликаза, получаемый из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia.

Клетки животных можно эффективно разрушать мочевиной и детергентами (додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия и др.).

На практике часто обработка ультразвуком сочетается с другими способами дезинтеграции, такими, как осмотический шок в дистиллированной воде (протопласты бактерий и грибов), многократное замораживание и оттаивание (ткани животных), гомогенизация, что значительно уменьшает время обработки ультразвуком. Последнее благоприятно сказывается на выходе инфекционных вирусных частиц, поскольку ультразвуковая обработка приводит к значительному разогреву озвучиваемой суспензии.

2.1.2. Концентрирование и очистка вирусов Как уже отмечалось выше, значительные успехи, достигнутые молекулярной биологией, во многом обусловлены исследованиями химии и физики вирусов. Эта уникальная модель оказалась в руках исследователей после 1935 г., когда Стэнли очистил и получил в кристаллическом виде ВТМ.

Этот вирус длительное время играл роль основного и едва ли не единственного объекта исследований, пока не были созданы современные методы получения других высокоочищенных вирусов.

Осаждение солями. Вирусы, подобно белкам, осаждаются из водных растворов при определенных концентрациях солей, которые разрушают взаимодействие между молекулами воды и полярными группировками оболочки вируса. При этом вирус агрегирует и выпадает в осадок. Наиболее часто для высаливания вирусов применяют сульфат аммония.

Несмотря на простоту и дешевизну, метод высаливания сульфатом аммония обладает двумя недостатками. Во-первых, он неспецифичен для вирусов, поскольку вместе с ними высаливаются и белки клетки-хозяина, а во-вторых, при этой процедуре происходит деструкция некоторых вирусов.

Осаждение в изоэлектрической точке. Большинство вирусов преципитирует в кислой зоне рН, поскольку их изоэлектрические точки лежат в пределах 3,5-6,5.

Осаждение в изоэлектрической точке – наиболее простая и доступная операция из всех применяемых методов концентрирования и очистки вирусов. Однако, при рН ниже 5,0 также выпадают в осадок многие белки клетки-хозяина, что ограничивает возможность применения этого метода. К тому же подобная процедура не всегда желательна при очистке некоторых лабильных вирусов.

Преципитация спиртами. При добавлении к вируссодержащей суспензии охлажденного метанола или этанола вирус преципитирует вследствие уменьшения (как и в рассмотренном выше случае обработки сульфатом аммония) степени гидратации его белковой оболочки.

Оптимальная концентрация спирта для каждого вируса подбирается эмпирически. Эта величина колеблется от 15 до 35%. Процедура проводится при максимально возможных низких температурах, для избежания денатурации вирусных частиц. Метанол более выгодно использовать, чем этанол, т.к. применяя его, можно работать при более низких температурах.

Однако этот метод так же, как и метод высаливания сульфатом аммония, имеет недостатки. Он неспецифичен для вирусов (осаждается значительное количество балластных белков) и не может быть использован для некоторых вирусов животных, которые не устойчивы к спиртам (сложные вирусы, содержащие липопротеидные оболочки).

Обработка ферментами. Благодаря особой структурной организации вирионов, большинство вирусов, несмотря на их нуклеопротеидную природу, устойчиво к действию протеолитических ферментов и нуклеаз, в то время как клеточные нуклеиновые кислоты и белки этими ферментами легко разрушаются. Используя эту различную чувствительность вируса и клеточных примесей к ферментам, можно при помощи ферментов провести частичную очистку вирусов.

Ультрафильтрация. Метод концентрирования и очистки вирусов с помощью мембранных ультрафильтров имеет преимущества перед другими методами, как один из наиболее мягких и щадящих. Мембранные фильтры изготавливают из эстерифицированной целлюлозы. Размер пор у фильтров разных типов варьирует от 0,01 до 8 мк. Фильтры устойчивы к температуре (до 125оС), к воздействию разбавленных кислот и щелочей и неполярных растворителей. В идеале, используя последовательную ультрафильтрацию через две мембраны с убывающим размером пор (одна задерживает частицы, более крупные чем вирус, а вторая – только вирус) можно получить в чистом виде любой вирус. Недостатком метода является то, что часто происходит засорение фильтра или адсорбция вируса на фильтре.


Разделение в двухфазных системах. Метод основан на том, что распределение веществ в водной полимерной двухфазной системе зависит от их размера и поверхностных свойств и характеризуется определенным коэффициентом распределения. Например, вирусы и примеси в системах, содержащих декстран и полиэтиленгликоль, имеют разные коэффициенты распределения между двумя фазами. Поэтому в одной фазе собирается вирус, а в другой – примеси. Метод прост и не требует сложного оборудования.

Преимущество его также состоит в том, что концентрирование и очистка вируса производятся в «мягких» условиях. Кроме того, можно обрабатывать большие количества вируссодержащего материала.

Дифференциальное ультрацентрифугирование. Метод ультрацентрифугирования основан на разделении частиц по их различной способности седиментировать в центробежном поле, в частности по такому параметру, как константа седиментации. В свою очередь скорость осаждения частиц в центробежном поле зависит от сочетания таких параметров как масса и т.н. «парашютность» частицы, которая, в свою очередь, зависит от ее размера и формы.

Термин «седиментация» означает осаждение частиц под действием силы тяжести. Вирусы настолько малы, что обычной силы тяжести недостаточно для их осаждения. Для этого создается искусственное поле силы тяжести. Приборы, позволяющие добиться увеличения гравитационного поля до таких величин, при которых происходит седиментация макромолекул, называют ультрацентрифугами. Современные ультрацентрифуги позволяют увеличить поле силы тяжести в центрифужной пробирке с исследуемым веществом более чем в 300 тыс. раз.

Скорость осаждения частиц, приведенная к единице центробежного ускорения (коэффициент седиментации, S), является специфической характеристикой макромолекул и выражается формулой:

v dx / dt S= =2, x c где х – расстояние от оси вращения, см;

t – время, сек;

- угловая / Коэффициент седиментации имеет размерность времени, т.к. имеет размерность, обратную времени (радиан – величина безразмерная). Значения коэффициента седиментации для различных макромолекул имеют величины порядка 10-13-10-14 сек. Для удобства величина 10-13 принята за единицу коэффициента седиментации. Эту величину обозначают S (единица Сведберга).

Коэффициент седиментации обычно зависит от концентрации изучаемого вещества. На практике бывает необходимым знать седиментационные характеристики веществ при оседании в сравнимых и идеальных условиях, т.е. условиях, когда взаимодействие между частицами отсутствует. Для этого величина коэффициента седиментации, измеренная в воде при 20оС, рассчитывается для бесконечного разведения раствора и обозначается как S°20,w – константа седиментации.

В современных ультрацентрифугах достигается скорость вращения ротора 60 000 об/мин и выше. Для частиц, находящихся на расстоянии 5-6 см от оси вращения, эта скорость соответствует центробежной силе, превышающей силу тяжести в 250 тыс. раз.

Ядра клетки оседают при 800 g, митохондрии – при 10 000 g, а большинство вирусов - при 30 000–100 000 g за 0,5–3 часа. При низкоскоростном центрифугировании из вируссодержащей суспензии удаляются обломки клеток и их компоненты. Затем при центрифугировании надосадка при 100 000 g осаждают вирусные частицы, а основная часть белков и других низкомолекулярных соединений остается в надосадочной жидкости. Таким образом, с помощью цикла дифференциального центрифугирования удается разделить вирусную суспензию на ряд фракций, содержащих однородные по скорости седиментации частицы.

Следует отметить, что для большинства вирусов использование только одного метода дифференциального центрифугирования недостаточно, чтобы получить высокоочищенную вирусную суспензию. Как правило, конечный препарат содержит некоторые нормальные компоненты клеток, которые имеют очень близкие с вирусами седиментационные характеристики. К сожалению, многие вирусы, особенно палочкообразные, могут образовывать после центрифугирования осадки, которые затем очень трудно вновь суспендировать.

Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Это понятие относится к скоростному центрифугированию частиц в столбе жидкости с плотностью, увеличивающейся по направлению от оси ротора. Такой градиент плотности может быть образован с помощью, например, сахарозы, глицерина, фиколла или солей тяжелых металлов (цезия, рубидия).

Существует две наиболее важных разновидности метода: метод зонального ультрацентрифугирования и метод изопикнического (или равновесного) ультрацентрифугирования.

Метод зонального ультрацентрифугирования для разделения частиц в зависимости от коэффициента седиментации применяется с 1953 г. При этом исследуемую суспензию наслаивают на преформированный градиент.

Градиент обычно готовят пологим, и если центрифугирование продолжать длительно, то все частицы могут осесть. Поэтому центрифугирование надо прекращать до момента оседания частиц. Но вместе с тем времени должно быть достаточно для того, чтобы частицы могли мигрировать через градиент.

В результате указанной процедуры в центрифужной пробирке формируются зоны, из которых каждая состоит из частиц с близкими седиментационными свойствами.

Для извлечения вируса из центрифужной пробирки содержимое ее фракционируют. Обычно это осуществляется путем прокалывания дна пробирки и последовательного сбора фракций.

При равновесном ультрацентрифугировании частицы суспендируют в растворе хлористого цезия или сульфата цезия. После продолжительного центрифугирования в пробирке создается устойчивый градиент плотности.

Частицы собираются на том уровне, где плотность среды равна их собственной плотности. При этом значение плотности частиц, полученное таким образом, зависит от используемой среды и отличается от значения плотности для сухих частиц или для частиц, исследуемых в другой среде, т.к.

концентрированные растворы солей в значительной степени изменяют степень гидратации белков оболочки. Поэтому в этом случае принято говорить о «плавучей» плотности частиц.

Принцип работы самоустанавливающегося изоплотностного градиента иллюстрирует рис. 2.1.

Рис. 2.1. Схематическое изображение разделения двух вирусов с различной плавучей плотностью путем равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl.

Левую центрифужную пробирку наполняют водным раствором CsCl (=1,28 г/мл), в котором суспендируется некоторое количество вируса вакцины и вируса гриппа. После центрифугирования в течении 20 ч при 000 об/мин молекулы CsCl концентрируются на дне пробирки, образуя градиент плотности. При этом вирионы из нижней части градиента всплывают (т.к. они легче, чем находящийся здесь раствор CsCl), а вирионы из верхней части градиента, наоборот, осаждаются - до зоны, которая имеет ту же плотность, что и частицы вируса. В данном случае это зоны с плотностью 1,28 г/мл (вирус осповакцины) и 1,25 г/мл (вирус гриппа).

Разрешение, достигаемое при ультрацентрифугировании в градиентах плотности CsCl и Cs2SO4, очень велико. Например, при помощи этого метода удается легко разделить частицы бактериофагов, отличающиеся друг от друга по плотности всего на 0,05 г/мл. Этому различию в плотности соответствует относительное различие в содержании ДНК порядка 1%.

Адсорбционная хроматография. Метод основан на различной степени адсорбции вирусов и примесей при фильтровании через слой твердого адсорбента. Решающее значение имеют поверхностные свойства вирусной частицы и адсорбента, а также состав буфера, в котором суспендирован вирус. При элюировании соответствующим буфером вирусные частицы могут быть отделены от примесей. В качестве адсорбентов в вирусологической практике обычно используются фосфат кальция, гидроксилаппатит, фосфат алюминия, целит.

Хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация). Метод основан на способности пористых материалов разделять смесь веществ по размеру и молекулярной массе компонентов. Молекулярные сита не обладают сорбционным сродством к фракционируемым веществам. Обычно в качестве таких пористых материалов применяют гранулированные гели полисахаридов (сефадексы, агароза), полиакриламид (биогели) и пористое порошковое стекло.

Схематически процесс гельфильтрации можно представить следующим образом (рис. 2.2). Молекулы более крупные, чем размер пор в гранулах, не проникают внутрь их и поэтому движутся по колонке с жидкой фазой вне гранул. Мелкие молекулы проникают внутрь гранул и движутся относительно медленнее. Степень проникновения зависит от размера и формы молекул. Вследствие этого элюирование молекул из слоя гранул геля происходит в порядке уменьшения размера молекул. Когда из колонки элюируются все молекулы, она вновь готова к следующему эксперименту.

Эта автоматическая регенерация – одно из преимуществ гельфильтрации.

Метод гельфильтрации нашел широкое применение в вирусологической практике, т.к. он наиболее безвреден для лабильных вирусов. Кроме того, он очень удобен при использовании на последней стадии очистки многих вирусов, поскольку при этом можно удалить из препаратов сульфат аммония и др. низкомолекулярные вещества (например, использующиеся для формирования градиентов плотности).

Рис. 2.2. Схема фракционирования вируса и примеси на колонке с молекулярным ситом.

Адсорбция на эритроцитах. Этот метод очень удобен для очистки тех вирусов, которые способны адсорбироваться на эритроцитах и элюироваться с них. К таким вирусам относятся вирус полиомы и многие представители миксовирусов. Впервые феномен адсорбции-элюции вирусов с эритроцитов был обнаружен в 1941 г. В частности было показано, что вирус гриппа адсорбируется поверхностью эритроцитов при 0-25оС и спонтанно элюируется с них при 37оС и выше. Этот метод позволяет при минимальном техническом оснащении лаборатории получать достаточно очищенные препараты вирусов. Следует отметить, что в настоящее время вместо нестабильных нативных эритроциов используют куриные эритроциты, обработанные формалином. Такие «формалинизированные» эритроциты более устойчивы к изменениям состава среды и менее загрязняют своими обломками вирусный элюат. При этом их можно (в отличие от нативных эритроцитов) использовать неоднократно.


Цикл адсорбции и элюции на эритроцитах обычно проводят перед основными этапами очистки вируса, например перед ионообменной хроматографией, гельфильтрацией или дифференциальным ультрацентрифугированием.

Ионообменная хроматография. Ионообменниками называют такие соединения, которые содержат фиксированные заряженные функциональные группы и подвижные противоионы. Последние могут обратимо обмениваться с другими ионами того же заряда, не изменяя физических свойств нерастворимой матрицы. Ионообменниками могут быть органические и неорганические соединения – алюмосиликаты, синтетические смолы, полисахариды, целлюлоза и т.д.

Тип ионообменника определяется активностью групп в матрице.

Введение фенольных, карбоксильных или сульфогрупп придает матрице катионообменные свойства, а введение алифатических или ароматических аминогрупп – анионообменные свойства (см. табл. 2.1).

Разделение компонентов при этом виде хроматографии осуществляется не за счет разницы в их размерах, а за счет различий в их зарядах.

Фракционирование вируссодержащих смесей, нанесенных на колонки, осуществляется пропусканием через колонку буферных растворов с возрастающей ионной силой или же растворов с возрастающей (или убывающей) величиной рН.

Применяя ионообменники, удается сравнительно легко и быстро проводить препаративную очистку и концентрирование различных вирусов.

В тоже время, имеются сообщения и о неудачах при использовании метода ионообменной хроматографии для очистки вирусов. Некоторые вирусы при элюции с ионообменников теряют до 90% активности.

Таблица 2.1. Основные типы целлюлозных ионообменников Ионообменник Сокращенное Функциональная Краткая название группа характеристика OC2H4N(C2H5)2 Сильноосновной Диэтиламиноэтил- ДЭАЭ целлюлоза целлюлоза анионообменник OC2H4NH Аминоэтил- АЭ-целлюлоза Несколько более целлюлоза слабый анионообменник, чем ДЭАЭ целлюлоза OCH2СООН Карбоксиметил- КМ-целлюлоза Слабокислый целлюлоза катионообменник ОРО3Н Фосфатцеллюлоза Ф-целлюлоза Несколько более сильный катионо обменник, чем КМ целлюлоза OC2H4SO3H Сульфоэтил- СЭ-целлюлоза Сильнокислый целлюлоза катионообменник 2.1.3. Критерии чистоты вирусных препаратов Вирусный препарат можно считать чистым, если в нем не обнаруживаются какие-либо посторонние примеси. Определение степени загрязненности зависит от чувствительности применяемых методов исследования. Следует помнить, что применяя какой-либо один метод, нельзя доказать гомогенность препарата.

Важным критерием чистоты считается кристаллизация. Часто как доказательство чистоты вирусного препарата используется наличие спектра поглощения в ультрафиолете, характерного для нуклеопротеидов.

Важнейшим методом оценки гомогенности вирусной суспензии является наблюдение за скоростью седиментации частиц при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Требованием для гомогенного препарата является симметричность соответствующего ему пика на седиментационной диаграмме.

Еще более чувствительным критерием гомогенности служит наличие одного пика при равновесном ультрацентрифугировании в градиенте плотности CsCl или Cs2SO4.

Применение метода электронной микроскопии для выявления примесей целесообразно, если этот материал имеет достаточный размер и по внешнему виду отличается от вируса.

Примесь клеточных веществ, которые способны диффундировать и обладают антигенными свойствами, можно выявить с помощью очень чувствительных серологических методов, таких, как иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез.

Для вирусов с хорошо установленным элементарным составом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяет обнаружить примеси, содержащие азот или фосфор, если они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоятельствах могут быть применены также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющих обнаружить всего-навсего одну аминокислоту.

Из вышеизложенного следует, что для вирусных препаратов нет одного вполне удовлетворительного метода определения чистоты. Поэтому в практической работе используют и критически сопоставляют результаты, полученные при помощи возможно большего числа разнообразных методов.

2.2. Структурно-функциональная организация вирионов При всем разнообразии форм и размеров вирусов структуре их капсидов присущи некоторые общие признаки (см. рис. 2.3) 2.2.1. Химический состав вирусов Все вирионы содержат геномную нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), покрытую снаружи белковой оболочкой – капсидом. По химическому составу вирусы – нуклеопротеиды, а по структуре – нуклеокапсиды. В состав многих вирусов, кроме белка и нуклеиновой кислоты, входят углеводы, липиды и некоторые другие соединения. Разнообразие вирусных нуклеиновых кислот иллюстрирует рис. 2.4.

Рис. 2.3. Схематическое изображение структуры вирусов. А – простой, икосаэдрическая симметрия. Б – сложный, икосаэдрическая симметрия.

В – простой, спиральная симметрия. Г – сложный, спиральная симметрия.

Рис. 2.4. Геномные нуклеиновые кислоты вирусов.

Полярность РНК. Одноцепочечные вирусные РНК разделяют на две группы. К одной группе относят РНК, которые способны в клетке-хозяине транслироваться рибосомами, т.е. играть роль мРНК. Такие РНК обозначают как (+)РНК, а геном, который они представляют, называют позитивным.

У другой группы РНК-содержащих вирусов РНК не узнается рибосомным аппаратом клетки и, поэтому, она не способна выполнять функцию мРНК. В клетке такая РНК служит матрицей для синтеза мРНК.

Такой тип РНК обозначают как ()РНК, а соответствующий геном носит название негативного.

Перечень вирусных геномов, которые найдены в вирионах, включает:

I. двухцепочечную ДНК - dsДНК;

II. одноцепочечную ДНК - ssДНК;

III. двухцепочечную РНК - dsРНК;

IV. одноцепочечную РНК позитивной полярности - ss(+)РНК;

V. одноцепочечную РНК негативной полярности - ss()РНК;

VI. диплоидную одноцепочечную позитивную РНК - ss(+)РНК, в цикле репликации которой имеется стадия обратной транскрипции;

VII. двухцепочечную ДНК – dsДНК, в цикле репликации которой имеется стадия обратной транскрипции.

Тип нуклеиновой кислоты, находящейся в вирионе, и стратегия ее репликации в клетке-хозяине положены в основу т.н. «Классификационной системы Балтимора». Согласно этой классификации, все известные в настоящее время вирусы разделены на 7 групп Балтимора, соответствующих приведенному выше перечню геномов.

Капсид состоит из одинаковых по строению субъединиц – капсомеров, которые располагаются согласно двум основным типам симметрии – кубической (икосаэдрической) или спиральной.

Капсомеры – это морфологические единицы капсида, которые, в свою очередь, могут состоять из одной или нескольких молекул белка – структурных единиц. Комплекс капсида и вирусной нуклеиновой кислоты обычно обозначают термином нуклеокапсид, который может обладать кубической (икосаэдрической) или спиральной симметрией. Вирионы т.н.

простых вирусов представлены только капсидом. Вирионы сложных вирусов дополнительно имеют двухслойные липидные мембраны, в которую включены белки (почти всегда – гликопротеиды), имеющие форму шипов.

Такие вирионы обычно имеют слой негликозилированного белка (матрикс), примыкающего к капсиду.

Простые вирусы, как правило, состоят только из вирусспецифических компонентов. Изредка такие вирусы могут «уносить» из клетки-хозяина ее компоненты, такие, например, как полиамины и гистоны – поликатионы, служащие для нейтрализации зарядов на вирусной нуклеиновой кислоте, что облегчает упаковку ее в капсид.

Сложные вирусы содержат ферменты, а также могут включать в состав вириона белки, входящие в состав мембраны клетки-хозяина. Это можно рассматривать как побочный эффект процесса отпочковывания вируса при выходе из клетки. Однако часто это служит вирусу своеобразным камуфляжем и позволяет уходить из-под атаки хозяйской иммунной системы.

Закономерен вопрос – почему у всех вирусов капсид имеет субъединичную структуру? Такое строение капсида, по-видимому, обусловлено необходимостью экономии генетического материала. В противном случае, как показывают расчеты, у многих вирусов его бы хватило для кодирования белков, способных покрыть не более 15% нуклеиновой кислоты. Очевидно также, что при наличии одного или немногих морфологических компонентов значительно облегчается самосборка капсида. В противном варианте вероятность ошибок в процессе самосборки резко бы возросла.

Наконец, существуют своего рода «технические» ограничения, которые снижают прочность упаковки на основе, скажем, тетраэдра или октаэдра. В этих вариантах промежутки между субъединицами будут слишком большими, а частица в результате - непрочной. Расчеты и опыт свидетельствуют, что чем больше число субъединиц и тем больше контактов их друг с другом, тем более стабильной получается структура и тем крупнее может быть капсид, в который, в свою очередь, может быть помещен более крупный и сложный геном.

Инкапсулирование генома необходимо вирусам, в первую очередь, для физической защиты лабильной по своей химической природе нуклеиновой кислоты от воздействия на внеклеточной стадии своего существования жестких факторов окружающей среды (таких, как экстремальные значения рН и температуры, УФ-облучение и т.д.).

Другой важнейшей функцией капсида является обеспечение адсорбции вируса на клетке-хозяине через взаимодействие с клеточными рецепторами.

У некоторых вирусов геном фрагментирован, и оболочка просто необходима для того, чтобы собрать его в единое целое.

У сложных вирусов наличие внешней липидной оболочки, из-за сродства ее с мембраной клетки-хозяина, способствует проникновению нуклеокапсида внутрь клетки. Кроме того, за счет включения в эту оболочку белков клетки-хозяина, вирус получает возможность успешнее преодолевать хозяйский иммунологический барьер.

2.2.2. Принципы вирусной архитектоники Морфология капсида. Структура вирусов чрезвычайно разнообразна, однако прослеживаются некоторые общие принципы, которые используют вирусы в построении своих капсидов. По характеру расположения капсомеров вирусы делят на три группы: с кубическим (икосаэдрическим), спиральным и смешанным типом симметрии. Большинство патогенных для человека вирусов обладают икосаэдрическим типом симметрии. Спиральный тип характерен для миксовирусов и некоторых арбовирусов. Смешанный тип симметрии выявлен у поксвирусов и бактериофагов.

По форме, выявляемой с помощью электронной микроскопии, вирусы можно разделить на сферические (паповавирусы, поксвирусы), палочкообразные (например, ВТМ) и нитевидные (вирус бешенства и др.).

Палочкообразные и нитевидные вирусы – обычно простые со спиральным типом симметрии. Среди сферических вирусов встречаются как простые (икосаэдрическая симметрия), так и сложные, у которых могут быть любые из вышеперечисленных типов симметрии.

В 1956 г. Крик и Уотсон предложили (главным образом на основе теоретических рассуждений) принципы структуры вирусов, которые впоследствии были полностью подтверждены экспериментально и сейчас считаются общепризнанными. Эти исследователи, прежде всего, заметили, что размера нуклеиновых кислот (в первую очередь, у мелких вирусов) хватает для кодирования только нескольких сравнительно небольших белков.

Отсюда, единственная возможность для вируса создать прочную оболочку – построить ее из идентичных молекул структурного белка.

Вторая часть предположения касалась способа, при помощи которого капсид может быть собран из субъединиц. Из общих соображений было предположено, что субъединицы должны соединяться друг с другом так, чтобы обеспечить для каждой из них одинаковое окружение. А это возможно только в том случае, если они будут паковаться с использованием принципов симметрии. Крик и Уотсон постулировали, что единственный способ обеспечить каждой субъединице одинаковое окружение – собрать из них некую структуру с кубической симметрией. Эти предсказания вскоре были подтверждены - капсиды икосаэдрической формы найдены у огромного числа совершенно неродственных вирусов. Таким образом стало очевидным, что икосаэдрическая симметрия капсида это не случайный результат естественного отбора, а один из основополагающих принцип архитектоники вирионов.

Структура икосаэдрического капсида. Икосаэдр насчитывает граней, каждая из которых является равносторонним треугольником, и вершин. Как показано на рис. 2.5, икосаэдр имеет 6 осей 5-го порядка, проходящих через вершины, 10 осей 3-го порядка, проходящих через каждую грань, и 12 осей 2-го порядка, проходящих через ребра. Крик и Уотсон указали, что вирусу с симметрией 5:3:2 требуется как минимум субъединиц, чтобы полностью закрыть ими поверхность воображаемой фигуры. При этом каждая субъединица оказывается связанной идентично со своими соседями и ни одна из них не совпадает с осью симметрии.

Действительно, к настоящему времени найдено несколько вирусов (например, бактериофаг X174), которые имеют только 60 субъединиц.

Однако большинство вирусов включает в свои капсиды гораздо большее число капсомеров.

Рис. 2.5. Простейший икосаэдр и способы получения из него икосаэдров более высокого порядка (класса Р=1, при f=2 и f=3).

При этом выполняется правило, согласно которому число структурных единиц любого икосаэдра должно составлять 60Т (минимальное число субъединиц в простейшем икосаэдре, помноженное на т.н. «число триангулирования»).

Число триангулирования, определяется из формулы, T = P f где P = 1, 3, 7, 13, 19, 21, 37 (класс икосаэдра);

f - любое целое число (при этом f 2 - число треугольников, на которые разделяется каждая грань).

Простейший икосаэдр (рис. 2.5) имеет 20 граней. Более сложные икосаэдрические структуры могут содержать 20Т граней. Говоря проще, при делении граней простейшего икосаэдра на более мелкие треугольники можно получить серию многогранников более высоких классов сложности.

Икосаэдрические вирусы, содержащие 60 субъединиц, имеют совершенную симметрию. Если же в состав вирусной частицы входит более 60 субъединиц, то расположить их эквивалентно относительно друг друга на поверхности икосаэдра не представляется возможным. По этой причине в структуре таких вирусов наблюдается явление неполной пространственной эквивалентности (т.е. квазиэквивалентности) субъединиц.

Чтобы это проиллюстрировать, рассмотрим частицу со субъединицами. Здесь белковые субъединицы располагаются не независимо, а кластерами, потому что это максимизирует межмолекулярные взаимодействия, которые стабилизируют частицу. Так, например, у вируса полиомиелита три субъединицы размещаются в центре каждого треугольника, образуя 60 морфологических единиц, т.е. капсомеров. У вируса морщинистости репы кластеры располагаются по центру ребер, образуя 90 капсомеров, являющихся димерами. В случае вируса желтой мозаики тюльпанов кластеры располагаются в вершинах треугольников, формируя 20 гексамеров и 12 пентамеров (всего 32 капсомера). Существенно, что связь между субъединицамми в составе капсомера сильнее, чем связь между самими капсомерами, поэтому капсомеры могут быть изолированы для структурно-функционального изучения.

Спиральные нуклеокапсиды представляют собой простейшую форму вирусных капсидов. Белок как бы «наматывается» на нуклеиновую кислоту (обычно это одноцепочечные РНК или ДНК) по спирали, наподобие винта. В случае ВТМ (рис. 2.6), образуемая структура – уже вирион. То же справедливо и для нитевидных вирусов, в составе которых нет внешних мембран (все представители сем. Tobamoviridae, Potyviridae и Closteroviridae).

Рис. 2.6. Элемент структуры ВТМ.

В других случаях палочкообразный спиральный нуклеокапсид может быть окружен матриксным белком и мембраной с шипами. Типичным примером таких вирионов являются члены сем. Paramyxoviridae.

В качестве примера сложного вируса рассмотрим структуру вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Рис. 2.7. Схематическое строение ВИЧ.

Как видно из рис. 2.7, ВИЧ содержит 2 идентичные копии (диплоидный геном) позитивной одноцепочечной РНК длиной около 9500 нуклеотидов.

РНК ассоциирована с основным (положительно заряженным) нуклеокапсидным белком. Этот белок предназначен для нейтрализации отрицательных зарядов на РНК, что облегчает укладку нуклеиновой кислоты в капсиде. Нуклеопротеиновый тяж (полагают, что он имеет спиральную симметрию) окружен икосаэдрическим капсидом, составленным из множества копий капсидного белка. Капсид, в свою очередь, окружен слоем матриксного белка, также имеющим икосаэдрическую симметрию.

Матриксный белок контактирует с двухслойной липидной мембраной (оболочкой). Оболочка ВИЧ происходит из клеточной плазматической мембраны и приобретается в процессе выхода вируса из клетки. Считается, что оболочка содержит липидные и белковые компоненты клетки. Кроме того, она содержит вирусные белки, имеющие форму шипов. Главным из них является белок, обозначаемый gp120/41. Этот сложный белок, состоящий из двух гликопротеидов, функционирует в качестве вирусного антирецептора (белка соединяющегося с рецептором клетки). На рисунке видно, что гликопротеид gp41 пронзает оболочку, а gp120 находится на ее внешней поверхности.

Внешняя оболочка, окружающая капсид, является обычным элементов вирусов животных и человека, в тоже время у вирусов растений она встречается редко. У ряда вирусов оболочка происходит из ядерной мембраны или мембраны телец Гольджи.

Многие вирусы имеют еще более сложное строение, чем мы описали выше, хотя они часто составлены из элементов, которые имеют или спиральную или икосаэдрическую симметрию. Хорошо известный пример – «хвостатые» бактериофаги такие, например, как Т4. Головка этих вирусов икосаэдрическая с триангуляционным числом, равным 7. Она, в свою очередь, прикреплена через воротничок к сокращающемуся хвосту, который уже имеет спиральную симметрию.

Рекомендуемая литература Основная Гринин А.С., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М.: Колос, 1971. 240 с.

Тихоненко Т.И. Методические основы биохимии вирусов. М.:

Медицина, 1973. 384 с.

Chiu W., Rixon F.J. High resolution structural studies of complex icosahedral viruses: a brief overview // Virus Res. 2002. V. 82, N. 1-2. P. 9-17.

Klug A. Architectural design of spherical viruses // Nature. 1983. V. 303. P.

378-379.

Milner J.J. Tobacco mosaic virus: The first century // Trends Microbiol.

1998. V. 6, № 12. Р. 466-467.

Дополнительная Knight C.A. Chemistry of viruses. New York, Wien: Springer-Verlag, 1975.

McKenna R. Atomic structure of single-stranded DNA bacteriophage X174 and its functional implications // Nature. 1992. V. 355. P. 137-143.

Structural Biology of Virus / Ed. by W.Chiu, R.Mburnett, R.L.Garcea.

Oxford: University Press, 1997.

Zaccomer B. The remarkable variety of plant RNA virus genomes // J. Gen.

Virol. 1995. V. 76. P. 231-247.

Глава 3.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.