авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

ЭКСТРАКТЫ МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ

(Pleurotus ostreatus):

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И

ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ

Под редакцией:

доктора технических наук, заслуженного деятеля науки

Российской Федерации, профессора ГЕРАСИМЕНИ В.П.;

доктора биологических наук, профессора ПОЛЯКОВА В.Ю.

Москва - 2013

УДК 615.322:582.28.015

ББК 52.81

Э41

Экстракты мицелия вешенки (Pleurotus ostreatus): медико биологические эффекты и возможные механизмы действия / Под ред. В.П. Герасимени, В.Ю. Полякова. - М.: Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, ООО «Инбиофарм», 2013, -224 с.

ISBN 978-5-9904905-1-2 В сборнике представлены 16 статей, в которых изложены результаты исследований по разработке нового полифункцио нального препарата на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F- 819).

Препарат предназначен для предупреждения и коррекции побочных реакций, вызванных применением сильнодействующих лекарственных средств у больных.

В исследованиях принимали участие ученые и ведущие специа листы следующих организаций:

- ООО «Инбиофарм», Москва, Россия;

- Научно-исследовательский институт физико-химической био логии им. А.Н. Белозерского Московского государственного универ ситета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

- Автономная некоммерческая организация «Институт медико биологических исследований и технологий», Москва, Россия;

- Московский государственный университет им. М.В. Ломоно сова, Москва, Россия;

- Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия;

- Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, Россия;

- Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва, Россия;

- Институт радиобиологии НАН Беларуси, Гомель, Беларусь.

Издание может представлять интерес для специалистов в различных областях биологии, медицины и для производителей лекарственных препаратов.

Печатается в соответствии с решением ученого совета Научно исследовательского института физико-химической биологии им.

А.Н. Белозерского Московского государственного университета им.

М.В. Ломоносова, Москва, Россия.

© Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН © ООО «Инбиофарм», СОДЕРЖАНИЕ ПРЕДИСЛОВИЕ………………………………………...…………………… ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭКСТРАКТОВ МЕДИЦИН СКИХ ГРИБОВ С.В. Захаров ………………… ……………………………………………… ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Л.П. Семашева, Г.И. Кирьянов..... ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) НА ТРАНСФОРМИРО ВАННЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ В СИСТЕМЕ in vitro В.Ю. Поляков, С.В.Захаров, В.П. Герасименя, Е.М. Лазарева, М.И.

Мурашева, Л.В. Исаева, Г.И.Кирьянов……………………………….… ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОЗМОЖНЫХ КЛЕТОЧНЫХ МИШЕНЕЙ ДЕЙСТ ВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ФАРМА КОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ Г.И. Кирьянов, С.В. Захаров, В.П. Герасименя, Е.М. Лазарева, М.И.

Мурашева, Л.В. Исаева, В.Ю. Поляков …………………………..…… ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) И ЦИКЛОФОСФАНА НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЖИВОТНЫХ В.П. Герасименя, С.В. Захаров, К.З. Гумаргалиева, Т.И. Милевич…..... ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГИПЕРТЕНЗИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКС ТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ФАРМАКОЛО ГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) С.В. Захаров, В.П. Герасименя …………………….………………….… ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО И ПРОТИВОВИРУСНОГО ДЕЙСТ ВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 НА ИНФЕКЦИЮ, ВЫЗВАННУЮ ВИРУСОМ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА, В КЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ in vitro Р.Р. Климова, Е.В.Чичев, С.В. Захаров, В.П. Герасименя, А.А. Кущ……………………………..……..………………………...... КЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ ® ВЕШЕНКИ ОВОДОРИН СИРОП НА КОРРЕКЦИЮ ЛЕКАР СТВЕННОЙ НЕПЕРЕНОСИМОСТИ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ В.В. Ерохин, Н.Л. Карпина, И.А. Васильева, Ю.Е. Коссий, М.В. Ерохина, В.П. Герасименя, С.В. Захаров, А.В. Трез вова, В.Н. Григорьева ………………………………….……..…… ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков, В.Н. Ташлицкий, В.А. Носков, Л.Н. Кинцурашвили, С.В. Захаров, В. П. Герасименя……... ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ СОСТАВА ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА И ЕГО ИДЕНТИФИКАЦИЯ В.Н. Ташлицкий, Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков, С.В. Захаров, В.П.

Герасименя………………………………………………………………. ДЕЙСТВИЕ ИНЦИСТЕРОЛА НА ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРА МЕТРЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК В.Ю. Поляков, Л.Н. Кинцурашвили, М.И.Мурашова, С.В. Захаров, В.П. Герасименя, Г.И. Кирьянов………………………………...…….. ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИИ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ, ОБОГАЩЕННОЙ ИНЦИСТЕРОЛОМ, НА ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ С.А. Голышев, Г.И. Кирьянов, Л.Н. Кинцурашвили, С.В. Захаров, В.П. Герасименя, В.Ю. Поляков………………………………...……... ПРОВЕРКА ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus Н.В. Перова, Г.А. Духина, С.В. Захаров, В.П. Герасименя ………. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 У ЖИВОТНЫХ НА МОДЕЛИ СОЛИДНОЙ ОПУХОЛИ МЕЛАНОМА В- С.В. Захаров, В.П. Герасименя, В.Ю. Поляков, Г.И. Кирьянов, Л.П.

Семашева, К.З. Гумаргалиева……………..……...…………………….. ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИЙ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137, ОБОГАЩЕННЫХ ИНЦИСТЕРОЛОМ, НА ПРОГРЕССИЮ ДИСЛИПИДЕМИИ, ИНДУЦИРОВАННУЮ АТЕРОГЕННОЙ ДИЕТОЙ С.В. Захаров, Н.В. Перова, В.П. Герасименя, В.Ю. Поляков, Г.И.

Кирьянов, Г.А. Духина, Л.П. Семашева, К.З. Гумаргали ева………………………………………………………….……………. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ КОМПОЗИЦИИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ДЕТОКСИКАЦИОННО ГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus Г.И. Кирьянов, В.П. Герасименя, С.В. Захаров, В.Ю. Поляков..… Предисловие редакторов Изучение лечебных свойств базидиальных грибов и создание новых лекарственных препаратов на их основе является одним из активно развивающихся направлений современной фармакологии и медицины. Результаты этих исследований особенно широко исполь зуются в Китае, России, Японии, Корее, США, Норвегии и Канаде.

Значительный вклад в решение задач по изучению культурально морфологических свойств штаммов базидиальных грибов, разра ботку биотехнологий их культивирования, выделение из мицелия и плодовых тел базидиомицетов биологически активных веществ и всестороннему изучению их медико-биологической активности в разные годы внесли ученые и специалисты Бухало А.С., Бисько Н.А., Гарибова Л.В., Герасименя В.П., Дудка И.Д., Дьяков Ю.Т., Ефременкова О.В., Капич А.Н., Касперовичюс М.М., Камзолкина О.В., Кирьянов Г.И., Краснопольская Л.М., Корзун В.Н., Конопля Е.Ф., Кузьминский Б.Б.. Морозова Г.Р., Медведев В.А., Мюллер Э., Милевич Т.И., Соломко Э.Ф., Таратутина Л.В., Решетников С.В., Поляков В.Ю., Преображенская Е.И., Феофилова Е.П., Bobek P., Bumett J.H., Hilber O., Li A., Begin M., Miller O.K., Nobles M.K., Peterson R. H., Wasser S.P., Weis A.L., Lavi I., Osdin L., Mizuno T. и др.

Из числа исследуемых штаммов базидиомицетов наибольший интерес представляют культуры съедобных грибов, лечебные свойства которых изучены достаточно глубоко.

В настоящее время в практику медицины внедрены следующие лекарственные средства и БАД к пище: из плодовых тел Lentinus edodes - лентинан (Япония);

из Inonotus obliguus - бефунгин (Россия);

Agaricus blazei (США);

из культуральной жидкости Schizophyllum commune - сонифилан, PSG;

шизофиллан (Япония) (Mizuno, 1996, Miles, Chang, 1997);

БАД к пище «Мипро-ВИТ» (Патент РФ 2092179, 1996);

БАД к пище из гриба Fusarium sambucinum Fuskel var.

ossicolum (berk. etcurf) bilai (РФ), (Патент РФ 2040932, 1993);

БАД к пище «Микотон», Украина (Горовой, Сенюк, Трутнева, 1997).

В то же время, анализ многочисленных данных литературы показывает, что потенциал базидиомицетов, как продуцентов биологически активных веществ, далеко не исчерпан. Одним из существенных факторов, препятствующих внедрению в практику медицины лекарственных препаратов на основе медицинских грибов, является трудоемкая и сложная работа по стандартизации методов культивирования мицелия.

Специалистами ООО «Инбиофарм» в сотрудничестве с учены ми других привлеченных научных организаций разработаны технологические регламенты культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной культуре. На их основе создана техно логия промышленного культивирования мицелия и разработаны методы получения из него экстракта с постоянным составом компонентов, которые являются по целому ряду факторов наиболее перспективными для производства фармакологической субстанции и действующего вещества для получения лекарственных препаратов.

Это позволило приступить к систематическому комплексному исследованию влияния стандартизованных составов экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 как на клеточном уровне (in vitro), так и на уровне in vivo (на лабораторных животных).

Некоторые результаты этой работы суммированы в данном сборнике научных статей.

Сборник может представлять интерес для специалистов в различных областях медицины и для производителей лекарст венных препаратов.

В.П. Герасименя, В.Ю. Поляков ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭКСТРАКТОВ МЕДИЦИНСКИХ ГРИБОВ С.В. Захаров ООО «Инбиофарм», Москва, Россия В последнее десятилетие пристальное внимание различных областей медицины, биохимии и молекулярной биологии привлекает исследование так называемых медицинских грибов.

Современные научные и медицинские подходы выявили существенную эффективность экстрактов из базидиомицетных грибов при лечении бактериальных и вирусных инфекций, ВИЧ, диабета, гиперхолестеролемии и сердечно-сосудистых заболе ваний. Особый интерес вызывает способность экстрактов, получен ных из мицелия или плодовых тел базидиомицетов, подавлять рост злокачественных опухолей [1,2,3].

Предполагается, что такая полифункциональность экстрактов связана с их активностью, направленной на стимуляцию иммунной системы [4]. Так, показано, что полисахаропептиды (ПСП) Coriolus versicolor индуцируют у экспериментальных животных продукцию гамма-интерферона, интерлейкина-2, пролиферацию Т-клеток и предотвращает снижение иммунного статуса организма.

Однако действие экстрактов медицинских грибов не исчерпывается только стимуляцией иммунной системы [5-30]. Так, например, у компонентов экстракта гриба Albatrellus confluens обнаружена способность блокировать пролиферацию и индуци ровать апоптоз в различных культурах раковых клеток. Анало гичным свойством обладает бета-(1-6)-D-гликан, выделенный из гриба A. blazei, который оказывает выраженный цитотоксический эффект на клетки человеческой культуры рака яичника. В цитированных работах выявлена важная роль митохондриального цитохрома С в активации каспаз и других факторов индукции апоптоза.

Другим возможным механизмом противоопухолевого эффекта экстрактов грибов является их антиангиогенное действие. У мышей, получавших ПСП, выделенные из гриба Coriolus versicolor, наблюю далось подавление экспрессии эндотелиального фактора роста, существенное уменьшение плотности сосудов и, соответственно, редукция размера и массы опухоли по сравнению с контролем.

Большой интерес представляет работа, в которой изучена возможность гемопоэтического действия 1,3-бета-D-гликана из гриба Sparassis crispa на модели экспериментальной лейкопении у мышей.

Показано, что введение этого ПСП приводит к увеличению числа моноцитов, гранулоцитов и веса селезёнки по сравнению с контролем.

По данным, полученным на модели стеатоза, индуцированого атерогенной диетой у крыс, экстракт мицелия Pleurotus ostreatus блокирует развитие жировой дистрофии печени, тем самым проявляет свойства эффективного гепатопротектора [31]. Возможно, действие экстракта, направленное на нормализацию липидного обмена, связано с наличием в нем антисклеротических веществ, которые обнаружены в экстрактах некоторых представителей рода Pleurotus (Gunde-Cimerman, Cimerman, 1995).

Такое полифункциональное действие экстрактов грибов требует нетривиальных объяснений.

Оно может, с одной стороны, определяться многокомпонен тностью экстрактов по биологическим активностям. Показано, что разного рода экстракты представляют собой сложные системы, содержащие различные биологически активные компоненты:

убиквитин-подобные белки, лектины, протеазы и глюканы [5-8].

Одним из наиболее полно изученных действующих агентов экстрактов являются полисахариды, ассоциированные с белками (полисахаропептиды) [9].

В этом контексте задача для разработчиков новых лекарст венных средств - разделить биологические активности путем фрак ционированя экстрактов.

С другой стороны полифункциональность может объясняться некоторыми общими свойствами «патологических» клеток, напри мер, измененными свойствами их мембран и/или мембранных рецепторов, реагирующих на внешние сигналы.

Наиболее весомый аргумент - экстракт мицелия Pleurotus ostreatus1137 не вызывает апоптоз в нормальных фибробластах [32].

В этом случае актуальная задача - определение действующего начала экстракта и изучение механизма действия.

Для решения этих тесно связанных задач на современном этапе исследований требуется усовершенствование технологии выращи вания мицелия, гарантирующей стабильные параметры экстрактов.

Одним из первых шагов в установлении активно действующих веществ в составе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus является стандартизация методов культивирования мицелия и состава сырья для получения питательных сред. Под руководством профессора В.П. Герасимени были разработаны технологические регламенты культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в глубинной культуре и выделения из него экстракта низкомо лекулярных биологически активных веществ с постоянным составом компонентов [33-40]. Это позволило приступить к более строгому исследованию влияния стандартизованных составов экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 как на клеточном уровне (in vitro), так и на уровне in vivo (на лабораторных животных).

В системе in vitro исследования эффектов экстракта мицеллия вешенки на цитокинетически параметры культивируемых клеток (нормальных и трансформированных) проводились в НИИ ФХБ им.

А.Н. Белозерского (МГУ) под руководством докторов биологических наук В.Ю. Полякова и Г.И. Кирьянова. В работах этой группы показан эффект индукции апоптоза в раковых (но не в нормальных) клетках.

Получены отдельные фракции экстракта, обогащенные дейс твующим веществом. Наконец, выделено химическое вещество, обладающее этим эффектом - производное стерола, ранее не выявляемое в медицинских грибах.

Основные результаты экспериментов, обосновывающие поли функциональность и детоксикационные свойства лекарственного препарата, полученного на основе экстракта мицелия вешенки, изложены в данном сборнике научных статей.

Список литературы:

1. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов/ Е.П.

Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология. -1998, т.34, № 6, -С. 597-608.

2. Yang Q.Y., Jong S.C., Li X.Y., Zhou J.X., Chen R.T., Xu L.Z.

Antitumor and immunomodulating activities of the polysaccharide peptide (PSP) of Coriolus versicolor. J Immunol Immunopharmacol 1992a;

12: 29-34.

3. Wang H.X., Liu W.K., Ng T.B., Ooi V.E.C., Chang S.T.

Immunomodulatory and antitumor activities of a polysaccharide-peptide cоmplex from mycelial culture of Tricholoma sp., a local edible mushroom. Life Sci. 1995;

57: 269-81.

4. Collins R.A., Ng T.B. Polysaccharopeptide from Coriolus versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type infection. Life Sci. 1997;

60: PL 383-87.

5. Wang H., Gao J., Ng T.B. A new lectin with highly potent antihepatoma and anti sarcoma activitees from the oyster mushroom Pleurotus ostreatus.. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Sep 7;

275(3): 810- 6. Brechtel R., Watzig H., Rudiger H. The lectin from mushroom Pleurotus ostreatus: a phosphatase-activating protein that is closely associated with an alpha-galactosidase activity.A part of this paper has been presented as preliminary report at the 17 th Interlec. Meeting in Wurzburg, Germany. Plant Sci. 2001 APR;

160(5): 1025-1033.

7. Shin H.H., Choi H.S. Purification and characterization of cysteine protease from Pleurotus ostreatus. Biosci Biotechnol Biochem. 1998;

62(7): 1416-8.

8. Giardina P., Aurilia V., Cannio R., Marzullo L., Amoresano A., Siciliano R., Pucci P., Sannia G. The gene, protein and glican structures of laccase from Pleurotus ostreatus. Eur J Biochem. Feb 1;

235(3): 508-15.

9. Jian Cui, Yusuf Chisti. Polysaccharopeptides of Coreolus versicolor:

physiological activity, uses, and production. Biotech Adv. 2003;

21:109 122.

10. Ng T.B. A review of research on the protein-bound polysaccharide (polysaccharopeptide, PSP) from the mushroom Coriolus versicolor (Basidiomicetes: Polyporaceae). Gen Pharmacol.1998 Jan;

30(1): 1-4.

11. Hengstler J.G., Hengst A., Fuchs J., Tanner B., Pohl J., Oesch F.

Induction of DNA crosslinks and DNA strand lesions by cytochrome P450 2B1. Mutat Res. 1997 Feb 3;

373 (2): 215-23.

12. Benedict W.F., Banergjee A., Vencatesan N. Cyclophosphamide induced oncogenetic transformation, chromosomal breakage, and sister chromatid exchange following microsomal activation. Cancer Res. Sep;

38 (9): 2922-4.

13. Tafazoli M., Van Hummelen P., Kiefer F., Kirsch-Volders M.

Induction of micronuclei in metabolically competent rat hepatoma cell lines by the promutagens 7,12-dimethylenz[a]anthracene, benzo[a]pyrene and cyclophosphamide. Mutagenesis. 1995 Jan;

10(1):

15-21.

14. Miller B.M., Pujadas E., Gocke E. Evalution of the micronucleus test in vitro using Chinese hamster cells: results of four chemical weakly positive in the in vivo micronucleus test. Environ Mol Mutagen. 1995;

26(3): 240-7.

15. Swanson P. E., Carroll S.B., Zhang X.F., Mackey M.A. Spontaneous premature chromosome condensation, micronucleus formation, and non-apoptotic cell death in heated HeLa S3 cells. Ultrastructural observations. Am. J. Pathol. 1995, 146, 963-971.

16. Ianzini F., Mackey M.A. Spontaneous premature chromosome condensation and mitotic catastrophe following irradiation of HeLa S cells. Int. J. Radiat. Biol., 1997.72, 409-421.

17. Roninson I. B., Broude E.V., Chang BD. If not apoptosis, then what?

Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells.

Drug Resistance Updates. 2001. 4, 303-313.

18. Castedo M., Perfettini J-L., Roumier T., Andreau K., Medema R., Kroemer G., Cell death by mitotic catastrophe: molecular definition., Oncogene 2004;

23., 2825-2837.

19. Lee J.H., Park J.H., Yang M.N. The effect of cyclophosphamide on Fasmediated apoptosis. J Korean Med Sci. 1997 Jun;

12(3): 185-9.

20. Aoyagi H., Iino Y., Takeo T., Horii Y., Morishita Y., Horiuchi R.

Effects of OK-432 (picibanil) on the estrogen receptors of MCF-7 cells and potentiation of antiproliferative effects of tamoxifen in combination with OK-432. Oncology. 1997;

54: 414-23.

21. Hsien T.C., Kunicki J., Darzynkiewicz Z., Wu J. M. Еffects of extracts of Coreolus versicolor (I’m-Yunity(TM)) cell – cycle progression and expression of interleukins-1 beta, -6, and -8 in promyelocytic HL- leukemic cells and mitogenically stimulated and nonstimulated human lymphocytes. J Altern Complement Med. 2002;

8:591-602.

22. Dong Y., Yang M.M.P., Kwan C.Y. In vitro inhibition of proliferation of HL-60 cells by tetrandrine and Coreolus versicolor peptide derived from Chinese medicinal herbs. Life Sci 1997;

60: PL135-40.

23. Wei W.S., Tan J.Q., Guo F., Ghen H.S., Zhou Z.Y., Zhang Z.H., et al. Effects of Coreolus versicolor polysaccharides on superoxide dismutase activities in mice. Acta Pharmacol Sinica 1996;

17: 174-8.

24. Anderson D., Bishop J.B., Garner R.C., Ostrosky-Wegman P., Selby P.B. Cyclophosphamide: review of its mutagenicity for an assassment of potential germ cell risks. Mut Res. 1995 Aug;

330(1-2): 115-81.

25. Murata M., Suzuci T., Midorikawa K., Oikawa S., Kawanishi S.

Oxidative DNA damage induced by a hydroperoxide derivative of cyclophosphamide. Free Radic Biol Med. 2004 Sep 15;

37(6): 793-802.

26. Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами: обзор (International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol. 3, 1999 p. 31-62.

27. Захаров С.В. Роль и значение нового полифункционального препарата «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» в сопро вождении комплексной терапии онкологических заболеваний:

аналитический обзор / С.В. Захаров, В.П. Герасименя, Г.И.

Кирьянов, В.Ю. Поляков. - М.: ООО «Инбиофарм», 2010. – 33с.

28. Герасименя В.П. Гепатопротекторные свойства экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования:

информационные материалы. Выпуск 2 / В.П. Герасименя, С.В.

Захаров, А.В. Трезвова и др. - М.: ООО «Инбиофарм», 2009. -22 с.

29. Герасименя В.П. Потивоопухолевое действие экстракта мицелия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования:

информационные материалы. Выпуск 3/ В.П. Герасименя, С.В.

Захаров, Л.А. Путырский и др. - М.: ООО «Инбиофарм», 2009. - 44 с.

30. Герасименя В.П. Гиполипидемические свойства экстракта мице лия вешенки. Экспериментальные и клинические исследования:

информационные материалы. Выпуск 3 / В.П. Герасименя, С.В.

Захаров, З.Ш. Голевцева – М.: ООО «Инбиофарм», 2009. -20 с.

31. Поляков В.Ю. Гепатопротекторное действие препарата на основе экстракта мицелия вешенки при развитии экспери ментального стеатоза печени / В.Ю. Поляков, С.А. Голышев, Г.И.Кирьянов, Е.А. Арифулин, В.П. Герасименя, С.В. Захаров, К.З.

Гумаргалиева, Ю.Л. Путырский // Биологические мембраны. - 2011, том 28, № 4. С.1-7.

32. Поляков В.Ю. Синергизм действия экстракта мицелия гриба Pleurotus ostreatus и медицинских цитостатиков на пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток / В.Ю. Поляков, Г.И. Кирьянов, В.П. Герасименя и др. // Биологические мембраны. - 2007, том 24, №5. С. 379-388.

33. Инновационный детоксикационный препарат с полифунк циональной медико-биологической активностью для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении онкологических заболеваний и в реабилитационный период.

Технология, создание лекарственной формы, производство: отчет о НИР (Шифр «Онководин») / Захаров С.В., Герасименя В.П., Кирьянов Г.И. Поляков В.Ю. – М.: ООО «Инбиофарм»,2011. -146 с.

34. Справка о состоянии исследования, перспективы разработки и внедрения в практику медицины фармацевтической компанией ООО «Инбиофарм» нового поколения медицинских препаратов на основе биологически активных веществ экстракта мицелия (FR.) KUMM. 1137, обладающих Pleurotus ostreatus полифункциональной специфической фармакологической активностью: отчет о НИР/ Захаров С.В. Герасименя В.П.– М.: ООО «Инбиофарм», 2011. – 64 с.

35. Технологическая инструкция по производству БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «Оводорин» к ТУ 9317-01-87552538- / В.П. Герасименя, С.В. Захаров. – М.: ООО «Инбиофарм», 2008. – 8 с.

36. Технологическая инструкция по производству БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «Оводорин» (сироп) к ТУ 9317-02 87552538-08 / В.П. Герасименя, С.В. Захаров. – М.: ООО «Инбиофарм», 2008. – 8с.

37. Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И. и др. Препарат 4 hydroхy-17R-methylincisterol, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus 1137 для его получения.

Патент РФ на изобретение № 2435599 от 21.06.2010 г. Бюл. № 34 от 10.12.2011 г.

38. Герасименя В.П., Захаров С.В., Трезвова А.В. и др. Препарат на основе гриба Pleurotus 1137 для коррекции лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких.

Патент РФ на изобретение № 2435600 от 23.08. 2010 г. Бюл. № от 10.12.2011 г.

39. Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И. и др. Препарат с полифункциональной медико-биологической активностью, влияю щий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus для его получения. Патент РФ на изобретение № 2487930 от 19.06.2012 г. Бюл. № 20 от 20.07.2013 г.

40. Кирьянов Г.И., Герасименя В.П., Захаров С.В., Ташлицкий В.Н., Кинцурашвили Л.Н., Поляков В.Ю. Способ получения инцистерола.

Патент РФ на изобретение № 24877635 от 14.02.2012 г. Бюл. № 8 от 20.03.2013 г.

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Л.П. Семашева, *Г.И. Кирьянов.

ООО «Инбиофарм», Москва, Россия *Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия Получение фармакологической субстанции.

Мицелий Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) выращивали в регулируемых асептических условиях методом жидкофазного глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей растительное сырье [1,2]. После культивирования отжатый от культуральной среды мицелий экстрагировали этанолом, подкисленным до pH= 2-3, в течение 18 - 20 часов. Очистку экстракта от фрагментов мицелия проводили фильтрованием. Полученный экстракт упаривали в вакууме при t = 40 - 50оС до вязкого однород ного состояния в виде геля [2].

Экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137, произведенный в соответствии с разработанным технологическим процессом [3], по форме выпуска представляет собой сгущенный экстракт, полу ченный в виде вязкого однородного концентрата [4].

Анализ химического состава фармакологической субстанции.

Пробоподготовку субстанции проводили по ГОСТ 28495, ГОСТ 1511.0 - 77, ГОСТ 20438 - 75.

Для изучения химического состава экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 были использованы образцы экстракта, полученного в течение года (с начала января по декабрь включительно).

Проведенный анализ химического состава сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде геля по известным методам [5-12] показал, что экстракт содержит углеводы, аминокислоты, высшие жирные кислоты, органические кислоты, витамины и минеральные вещества, находящиеся в нем в природном соотно шении масс % (таблица 1).

Таблица 1 - Химический состав экстракта мицелия Pleurotus ostreatus Вещества Метод определения Количество Состав (%) Углеводы Сорбционная 47,0 – 48,0 Глюкоза, галактоза, хромотография, путем манноза, арабиноза, хроматографического ксилоза, глюкозамин.

разделении углеводов на анализаторе сахаров Biotronic LC 2000 с рефрактометрической детекцией бицинхенинатом и нингидрином соответственно [5].

Аминокислоты Ионообменная 3,5 – 9,6 Аспарагин, серин, хроматография на треонин, глутамин, сильном пролин, глицин, катионообменнике: аланин, валин, сульфированном изолейцин, лейцин, сополимере стирола с лизин, гистидин, дивинилбензолом, на аргинин, цистеин, аминокислотном метионин, тирозин, анализаторе «Hitashi» фенилаланин, модель 835, Япония [6]. этаноламин, орнитин, оксилизин.

Высшие Количественное 0,6 – 0,9 Каприновая (С10: 0), жирные выделение из сложных лауриновая (С12: 0), кислоты многокомпонентных миристиновая (С14:0), природных смесей с пентадекановая(C15:0), последующим пентадеценовая хроматографическим (C15:1), пальмитиновая анализом в виде (С16: 0), метиловых эфиров [7]. пальмитолеиновая (С16:1), гептадекановая (С17:0), гептадеценовая (C17:1), стеариновая (С18:0), олеиновая (С18:1), линолевая (С18:2), арахиновая (С20:0), эруковая (С22:1).

Органические Высокоэффективная 1,02 – 1,26 Масляная, молочная, кислоты жидкостная уксусная, яблочная, хроматография на щавелевая цветном хроматографе «Kontron» с УФ детектором [8].

Витамины Витамины Е, В1, В2, В6, 0,6 – 1,2 В1, В2, В3, В6, Вс, РР, Е, С, D определяли D, С, каратиноиды.

методом жидкостной хроматографии [9].

Витамины В3, Вс, и РР определяли микробиологическим методом [10].

Минеральные Инверсионная вольт- Натрий (Na), калий 1,4-1, вещества амперометрия [11]. (К), кальций (Са), магний (Mg), фосфор (Р), сера (S), железо (Fe), цинк (Zn), марганец (Мn), медь (Сu), алюминий (Аl), бор (В), барий (Ва), кремний (Si), строн ций (Sr), литий (Li).

Вода До 30, [12] При этом необходимо отметить, что минимальные и макси мальные значения ингредиентов химического состава биологически активных веществ экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 из отобранных образцов характеризуются только сезонными коле баниями их содержания в экстракте, полученного в течение 12-ти месяцев (с начала января по декабрь включительно).

Список литературы:

1. Герасименя В.П. Инструкция описания технологического проце-сса культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) и получения из него экстракта биологически активных веществ:

инструкция / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Л.П. Семашева – М.:

ООО «Инбиофарм», 2008. – 39 с.

2. Технологическая инструкция по производству БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «Оводорин» к ТУ 9317-01-87552538-08 / В.П. Герасименя, С.В. Захаров. - М.: ООО «Инбиофарм», 2008. -8с.

3 Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю.

Препарат с полифункциональной медико-биологической актив ностью, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-819 для его получения. Патент РФ на изобретение № 2487930 от 19.06.2012 г. Бюл. № 20 от 20.07.2013 г.

4. Технические условия ТУ 9317-01-87552538-08. БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН». / – М., ООО «Инбиофарм». 2008. – 22 с.

5. ГФ XI, вып. 1. С. 95 с изменениями.

6. S. Moore, D. Sparckman and W. Stein. Хроматография амино-кислот на сульфированных полистироловых смолах, Analit. Chem., V. 30, p.p. 1185 -1190. 1958.

7. Руководство по методам контроля качества Р 4.1.1672 – 03. -М.:

Минздрав России, 2004. С. 24.

8.Руководство по методам контроля качества Р 4.1.1672 – 03. -М.:

Минздрав России, 2004. С.109.

9. Руководство по методам контроля качества Р 4.1.1672 – 03. -М.:

Минздрав России, 2004. С.51, 58, 62, 69.

10. Official Methods of Analysis, 15 edition, 1990. Association of Official Analytical Chemists. Volume one, p. 129.

11. Руководство по методам контроля качества Р 4.1.1. 672 – 03. -М.:

Минздрав России, 2004. С.99.

12. ГФ XI, вып. 1. С. 24.

ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) НА ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ В СИСТЕМЕ in vitro В.Ю. Поляков, **С.В.Захаров,**В.П. Герасименя, *Е.М.

Лазарева, *М.И. Мурашева, *Л.В. Исаева, Г.И. Кирьянов.

МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

*НИИ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии, Москва, Россия;

**ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

В современной онкологии широко применяется стратегия комбинированной терапии с использованием определенной после довательности введения цитостатических и стимулирующих агентов, варьирования дозы и времени воздействия. В рамках этой стратегии особенно перспективно применение иммуностимуляторов, так как многие цитостатики (например, доксорубицин, циклофосфан и его производные) являются ярко выраженными иммунодепрессантами [1-4]. В связи с тем, что полисахаропептиды некоторых медицинских грибов индуцируют у экспериментальных животных продукцию гаммаинтерферона, интерлейкина-2, пролиферацию Т-клеток, их рекомендовано применять при химио- и радиотерапии рака и для лечения различных инфекционных заболеваний [5]. Другой возможный подход к детоксикации организма - снижение дозы токсикогенных лекарственных препаратов при одновременном сохранении эффективности их действия. В этом плане особый интерес представляет изучение совместного (сочетанного) действия экстрактов грибов и токсических лекарственных препаратов. Если будет показано, что экстракты обладают свойством изменять «доступность» клеток для химотерапевтических агентов, их можно рекомендовать для использования в качестве «препаратов сопровождения» при химиотерапии опухолей или других тяжелых патологий, требующих применения сильнодействующих токсических средств.

В работе проведен сравнительный анализ индивидуального и сочетанного действия экстракта гриба Pleurotes ostreatus и медицинских цитостатиков на культивируемые (трансформи рованные и нормальные) клетки человека.

В качестве модели использовались культивируемые транс формированные клетки человека (HeLa), клетки миелоидного лейкоза человека (линия К-562), клетки почки зеленой мартышки (линия Vero) и нормальные фибробласты человека. Модель культивируемых клеток исключает многие трудноучитываемые факторы, опосредующие действие экстракта и его отдельных фракций на уровне целого организма, и позволяет тестировать ряд функциональных показателей эффективности действия препарата в строго контролируемых и воспроизводимых условиях. Особый акцент сделан на анализе сочетанного действия экстракта и медицинских цитостатиков.

Для количественной оценки эффективности действия цитоста тиков и экстракта использовались показатели, характеризующие жизнеспособность популяции культивируемых клеток: митотический индекс (доля клеток, находящихся в состоянии деления) и апоптотический индекс (доля клеток с выраженными признаками программируемой смерти). Функциональное состояние плазма тических мембран оценивалось по способности клеток к витальному окрашиванию трипановым синим.

Индивидуальное и сочетанное с медицинскими цитостатиками действие экстракта на жизнеспособность нормальных и трансформированных клеток в системе in vitro Работа включает 2 этапа.

На первом этапе проведен анализ реакции трансформиро ванных клеток HeLa на индивидуальное действие экстракта.

Определение доли делящихся клеток (митотического индекса) в контрольных и обработанных экстрактом клетках показывает, что экстракт в дозе 50 мкг/мл и 100 мкг/мл практически не изменяет этот показатель через 8 часов инкубации (рисунок 1, А, Б, В). Детальный цитологический анализ клеток, культивировавшихся в присутствии экстракта, показал, что при этом в популяции появляются митозы с выраженными признаками патологии (рисунки 12,13). Значительное возрастание митотического индекса, сопровождающееся увеличе нием количества клеток с патологическими митозами, наблюдается через 24 часа воздействия (рисунок 1, Г, Д, Е). Таким образом, экстракт при его индивидуальном использовании индуцирует пато логию митозов.

Если после 8 часов обработки клетки отмыть от экстракта и перевести в нормальную среду на 18 часов, количество делящихся клеток снижается до контрольных значений, однако патологические митозы в популяции сохраняются (рисунок 1, Ж).

Определение доли клеток, включивших программу гибели (апоптотический индекс), показало, что при индивидуальном действии, в условиях однократного введения в среду культиви рования, экстракт, независимо от использованной дозы, практи чески не является индуктором апоптоза (рисунок 2, А, Б, В).

Неожиданный и интересный результат дал метод после довательного двукратного введения повышающихся доз экстракта.

После 3 дней культивирования к культуральной среде добавлялся экстракт в концентрации 50 мкг/мл на 8 часов, а затем экстракт в концентрации 100 мкг/мл. После повторного введения экстракта клетки инкубировали 16 час. Полученные результаты показывают, что использованный протокол воздействия повышает долю апоп тотических клеток в популяции примерно в 10 раз (рисунок 7, А, Б).

На втором этапе изучено индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие цитостатиков циклофосфана, доксорубицина и метотрексата, применяющихся при химиотерапии опухолей.

Циклофосфан относится к классу алкилирующих соединений, действие которых обусловлено, в первую очередь, модификацией пуриновых и пиримидиновых оснований, в результате чего нарушается целостность молекул ДНК. Клетки после воздействия алкилирующих соединений останавливаются в G 1 фазе и не входят в S-фазу. Высокой чувствительностью к этим веществам обладают клетки гиперплазированных (опухолевых) тканей и лимфоидной ткани. В настоящее время циклофосфан активно применяется в терапии злокачественных опухолей и некоторых других заболе ваний [1-4]. Его цитостатические свойства связаны с индукцией однонитевых разрывов в ДНК и формированием поперечных «сшивок» между молекулами ДНК. На клеточном уровне мутагенность циклофосфана тестируется по возникновению большого количества обменов между сестринскими хроматидами и появлению клеток с многочисленными микроядрами. По нашим данным, при индивидуальном действии циклофосфана в концентрации 100 и 300 мкг/мл на культивируемые клетки в течение 8 часов показатель митотического индекса незначительно возрастает за счет увеличения количества клеток с патоло гическими митозами (рисунок 1, З, И, К). Особенно много клеток с патологическими митозами появляется после 24 часов инкубации в присутствии циклофосфана (рисунок 1, Л, М, Н).

Определение апоптотического индекса показало, что при индивидуальном действии циклофосфана количество апопто тических клеток увеличивается с возрастанием дозы препарата (рисунок 2, Г, Д). С этим согласуются данные, показывающие, что циклофосфан, как и некоторые другие иммунодепрессанты, является индуктором апоптоза [1-4]. В наших экспериментах циклофосфан приводил примерно к двукратному возрастанию количества апоптотических клеток в популяции, независимо от дозы и длительности обработки.

Таким образом, действие циклофосфана приводит к апопто тической гибели клеток в интерфазе, к появлению клеток с признаками «митотической катастрофы» и вызывает в части клеток, завершивших деление, структурно-функциональный дисбаланс генома. При этом эффект цитостатического действия циклофосфана на культивируемые клетки зависит от дозы препарата и времени его воздействия.

Принципиально важные результаты получены при анализе сочетанного действия циклофосфана и экстракта. В этой серии экспериментов мы использовали концентрацию циклофосфана мкг/мл, которая эквивалентна «терапевтической» дозе, применя емой в химиотерапии опухолей, и которая оказывает более выраженное действие на клетки HeLa при индивидуальном использовании.

При сочетанном использовании экстракта и циклофосфана проявляется их ярко выраженное синергетическое действие на деление клеток (рисунок 3). При этом полученные данные показали, что конечный результат экспериментов зависит от дозы экстракта и от способа внесения экстракта и цитостатика в среду культивирования.

При концентрации экстракта 50 мкг/мл и циклофосфана мкг/мл наблюдается значительное увеличение митотического индекса за счет возрастания доли патологических митозов (рисунок 3, Б). Это значит, что вхождение клеток в митоз при этих дозах не блокируется, однако митозы не завершаются. При сочетанном действии экстракта в концентрации 100 мкг/мл и циклофосфана мкг/мл митотический индекс понижается примерно в 2 раза по сравнению с контролем, что свидетельствует о подавлении пролиферации (рисунок 3, В).

В том случае, когда перед инсталляцией экстракта в дозе мкг/мл клетки инкубировались с циклофосфаном 1 час, митотичес кий индекс не отличается от контроля. При 100 мкг/мл экстракта количество делящихся клеток уменьшается (рисунок 3, Г, Д).

Наиболее интересный феномен наблюдается в экспериментах по влиянию сочетанного действия экстракта и циклофосфана на индукцию апоптоза (рисунок 2).

При индивидуальном действии, в условиях однократного введения в среду культивирования, экстракт, независимо от использованной дозы, практически не является индуктором апоптоза (рисунок 2, А, Б, В).

Инкубация клеток с экстрактом (50 и 100 мкг/мл, 1 час обработки) и последующее добавление циклофосфана (300 мкг/мл, 7 часов совместного действия) резко стимулирует апоптоз:

количество апоптотических клеток в этих условиях возрастает примерно в 15 раз по сравнению с контролем (рисунок 2, Е, Ж).

По-видимому, в этих условиях экстракт детерминирует способ ность клеток к включению программы апоптотической гибели.

Таким образом, результаты, полученные в экспериментах с клетками HeLa, показали, что существует ярко выраженный синергизм действия экстракта и цитостатика циклофосфана на индукцию апоптоза, который особенно четко проявляется в усло виях предварительной обработки клеток экстрактом (рисунок 2).

Принципиально важно, что экстракт проявляет аналогичное синергетическое действие с цитостатиками доксорубицином и метотрексатом, которые широко используются в химиотерапии опухолей.

Доксорубицин - антибиотик антрациклинового ряда, выделен ный из культуры Streptomyces peuceticus. Показано, что доксору бицин интеркалирует в двойную спираль ДНК между парами азотистых оснований и, как следствие, подавляет репликацию ДНК.

Кроме того, доксорубицин является прооксидантом и индуцирует разрывы ДНК вследствие образования свободных радикалов.

Помимо этого, противоопухолевое действие, возможно, обуслов лено изменением клеточных функций в результате связывания с липидами клеточных мембран и взаимодействием с топоизомеразой II.

В концентрациях, принятых в практике химиотерапии, доксорубицин (0,01 и 0,001 мкг/мл) действует как эффективный блокатор клеточных делений (рисунок 4, В, Е).

При индивидуальном действии доксорубицин в дозе, принятой в химиотерапии опухолей (0,001 мкг/мл), является эффективным индуктором апоптоза - количество апоптотических клеток в присутствии доксорубицина возрастает примерно в 10 раз (рисунок 5, В).

При сочетанном действии экстракта и доксорубицина (рисунок 4, Г, Д) наблюдается полное ингибирование делений клеток.

Сочетанное действие экстракта (100 мкг/мл) и доксорубицина (0,01 мкг/мл) приводит к возрастанию доли апоптотических клеток примерно в 1,5 раза по сравнению с индивидуальным использованием доксорубицина (рисунок 5, Г). Увеличение дозы доксорубицина в 2 раза (0,02 мкг/мл) приводит к незначительному возрастанию доли апоптотических клеток по сравнению с дозой в 0,01 мкг/мл (рисунок 5, Д).

Таким образом, по сравнению с контролем или индивидуаль ным действием экстракта, количество клеток, включивших программу апоптоза при сочетанном действии экстракта и доксорубицина, возрастает примерно в 20 раз.

Другой медицинский цитостатик - метотрексат, антагонист фолиевой кислоты, ингибирует фермент дигидрофолатредуктазу, участвующую в восстановлении дигидрофолиевой кислоты в тетра гидрофолиевую кислоту (переносчик углеродных фрагментов, необходимых для синтеза пуриновых нуклеотидов и их произ водных). В результате блокируется синтез ДНК и клетки перестают делиться. Особенно чувствительны к действию метотрексата активно пролиферирующие клетки злокачественных опухолей, костного мозга, эмбриональные клетки, эпителиальные клетки слизистых оболочек. Метотрексат является сильным иммуно депрессантом.

В концентрации, принятой в практике химиотерапии (4,3 мкг/мл), метотрексат действует как эффективный блокатор клеточных делений (рисунок 4, В, Е).

При сочетанном действии экстракта и метотрексата (рисунок 4, Е, Ж) наблюдается полное ингибирование делений клеток.

При индивидуальном действии метотрексат не является индуктором апоптоза (рисунок 5, Е).

При сочетанном действии с экстрактом метотрексат примерно в 4 раза повышает долю апоптотических клеток по сравнению с конт ролем или его индивидуальным использованием (рисунок 5, Е, Ж).

Сочетанный эффект экстракта и цитостатиков проявляется не только на клетках HeLa, но и на трансформированных клетках миелоидного лейкоза, т.е. на моделях клеток как эпителиального, так и мезенхимного происхождения.

Исследования проводили на клетках миелоидного лейкоза, растущих в суспензионной культуре (рисунок 6).

Для анализа индивидуального действия экстракта и доксо рубицина клетки инкубировали 8 часов в нормальной среде, в среде, содержащей экстракт (100 мкг/мл) или доксорубицин (0, мкг/мл), рисунки 8 -10.

Для анализа сочетанного действия реагентов клетки инкубировали 1 час в присутствии экстракта (100 мкг/мл), после чего добавляли в среду культивирования, содержащую экстракт, доксорубицин (0,0002 мкг/мл) и инкубировали клетки в течение 8 и 24 часов.

Полученные данные показывают, что индивидуальное применение экстракта в концентрации 100 мкг/мл не влияет на пролиферативную активность этого типа клеток (рисунок 6, Б), тогда как доксорубицин в концентрации 0,0002 мкг/мл при индивидуальном и сочетанном с экстрактом действии практически полностью ингибирует деление (рисунок 6, В, Г).

При индивидуальном действии экстракта и доксорубицина доля апоптотических клеток в популяции возрастает более чем в 20 и раз соответственно (рисунок 6, Б, В).

Чрезвычайно эффективным индуктором апоптоза является сочетанное действие экстракта и доксорубицина. При таком применении доля апоптотических клеток миелоидного лейкоза возрастает в 90 раз (рисунок 6, Г). Важно, что использованная в данных экспериментах концентрация доксорубицина намного ниже рекомендованной для медицинского применения.

Цитотоксическое действие доксорубицина и доксорубицина в сочетании с экстрактом мицелия вешенки Доксорубицин в концентрациях от 39,06 мкг/мл до 625 мкг/мл вызывает гибель 100% клеток уже через сутки после внесения препарата в культуру (острая цитотоксичность). ЦД50 для доксо рубицина (гибель 50% клеток на третьи сутки после внесения в культуру клеток) составляет 9,8 мкг/мл.

Для определения сочетанного действия доксорубицина и экстракта готовили смеси доксорубицина в концентрациях от мкг/мл до 1,2 мкг/мл с препаратом ЭМВ (экстракт мицелия вешенки) в концентрации 10 мг/мл и вносили их на монослой клеток Vero.

Результаты изучения комбинаций препаратов представлены на рисунке 11. Показано, что ЦД50 для смеси двух препаратов составляет 19,53 мкг/мл. Полученные результаты позволяют заключить, что препарат ЭМВ снижает цитотоксичность доксору бицина при воздействии на клетки Vero в 2 раза, задерживая развитие патологических изменений.

Таким образом, сочетанное действие экстракта и доксору бицина после дополнительных исследований можно рекомендовать для терапии некоторых форм лейкозов.

Полученные в работе данные позволяют высказать предпо ложение, о том, что экстракт служит своеобразным «модулятором»

физиологической активности клеток, каким-то образом способствуя активному включению цитостатиков в клеточный метаболизм, в том числе в каскад событий, связанных с индукцией программы апоптоза. В связи с изложенным, принципиально важно определить те клеточные мишени, которые подвергаются воздействию экс тракта при его сочетанном использовании с цитостатиками.

Рисунок 1 - Индивидуальное действие экстракта и циклофосфана на пролиферацию (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;

В - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Г - контроль, 24 часа инкубации;

Д - экстракт (50 мкг/мл), 24 часа инкубации;

Е - экстракт (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;

Ж - экстракт 8 часов инкубации, отмывка от экстракта, 16 часов инкубации в нормальной среде;

З - контроль, 8 часов инкубации;

И - циклофосфан (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;

К - циклофосфан (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Л - контроль, 24 часа инкубации;

М - циклофосфан (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;

Н - циклофосфан (300 мкг/мл), 24 часа инкубации.

Рисунок 2 - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана на индукцию апоптоза (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - экстракт(50 мкг/мл);

В - экстракт (100 мкг/мл);

Г - циклофосфан (100 мкг/мл);

Д - циклофосфан (300 мкг/мл);

Е - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло фосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Ж - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло фосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;

З - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации ;

И - циклофосфан (300 мкг/мл);

1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Рисунок 3 - Сочетанное действие экстракта и циклофосфана на пролиферацию (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло фосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации ;

В - экстракт, (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло фосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Г - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Д - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Рисунок 4 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие медицинских цитостатиков на пролиферацию (клетки HeLa) А - контроль, 12 часов инкубации;

Б - экстракт (100 мкг/мл), 12 часов инкубации;

В - доксорубицин (0,01 мкг/мл), 12 часов инкубации;


Г - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксору бицина (0,001 мкг/мл), 11 часов инкубации;

Д - экстракт (100 мкг/мл), добавление доксорубицина (0,02 мкг/мл), 11 часов инкубации;

Е - метотрексат (4,3 мкг/мл), 12 часов инкубации;

Ж - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление метотрек сата (4,3 мкг/мл), 11 часов инкубации;

З - 5-фторурацил (20 мкг/мл), 12 часов инкубации;

И - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление 5-фтору рацила (20 мкг/мл), 11 часов инкубации.

Рисунок 5 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие медицинских цитостатиков на индукцию апоптоза (клетки HeLa) А - контроль, 12 часов инкубации;

Б - экстракт (100 мкг/мл), 12 часов инкубации;

В - доксорубицин (0,001мкг/мл), 12 часов инкубации;

Г - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксору бицина (0,01 мкг/мл) 11 часов инкубации;

Д - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксору бицина (0,02 мкг/мл), 11 часов инкубации;

Е - метотрексат (4,3 мкг/мл),12 часов инкубации;

Ж - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление метотрексата (4,3 мкг/мл), 11 часов инкубации;

З - 5-фторурацил (20 мкг/мл) 12 часов инкубации;

И - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление 5-фторура цила (20 мкг/мл), 11 часов инкубации.

Рисунок 6 - Индивидуальное и сочетанное с доксорубицином действие экстракта на пролиферацию и индукцию апоптоза (клетки миелоидного лейкоза) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;

В - доксорубицин (1 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Г - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (1 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Рисунок 7 - Индукция апоптоза в клетках HeLa последова тельным действием низких и высоких доз экстракта А - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Б - после 8 часов инкубации в присутствии экстракта в концентрации 50 мкг/мл добавлен экстракт в концентрации 100 мкг/мл, клетки инкубировались 16 часов.

Рисунок 8 - Действие низких доз доксорубицина на пролифе рацию (клетки HeLa) А - контроль;

Б - доксорубицин (0,00002 мкг/мл), 8 часов инкубации;

В - доксорубицин (0,0001), 8 часов инкубации;

Г - доксорубицин (0,002 мкг/мл), 8 часов инкубации.

Рисунок 9 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом действие низких доз доксорубицина на индукцию апоптоза (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - доксорубицин (0,00002 мкг/мл), 8 часов инкубации;

В - доксорубицин (0,0001 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Г - доксорубицин (0,002 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Д - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,00002 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Е - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,0001 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Ж - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксорубицина (0,002 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Рисунок 10 - Сочетанное действие экстракта, циклофосфана и низких доз доксорубицина на индукцию апоптоза (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксоруби цина (0,00002 мкг/мл), 7 часов инкубации;

В - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление доксо рубицина (0,0001 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Рисунок 11 - Снижение цитотоксичности доксорубицина при его сочетанном использовании с экстрактом (клетки Vero).

Рисунок 12 - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосана на митотические хромосомы клеток HeLa А - контроль, метафаза;

Б - контроль, анафаза;

В - Г - действие экстракта, формирование микроядер и хромосом ных абераций;

Д - Е - Ж - действие циклофосфана, неправильная сегрегация хромосом.

Рисунок 13 - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосана на индукцию апоптоза в клетках HeLa А - контроль;

Б - действие циклофосфана, микроядра;

В - действие экстракта, апоптоз;

Г - сочетанное действие экстрактаи циклофосфана, апоптоз.

Список литературы:

1..Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии / Д. Б.

Корман - М.: Практическая медицина. -2006. - 503с.

2. Комбинированное и комплексное лечение рака легкого, молочной железы, пищевода и прямой кишки в условиях применения растительных адаптогенов и лазерного облучения крови: мето дические рекомендации. - Санкт-Петербург.: Министерство здраво охранения и медицинской промышленности РФ. - 1996. -14с.

3. Блохин Н.Н. Химиотерапия опухолевых заболеваний / Н.Н.

Блохин, Н.И. Переводчикова - М.: Медицина. 1984. - 303 с.

4. Химиотерапия злокачественных новообразований / Под редакцией Э.Чу и В. Де Виты-младшего. - М.: Практика, 2008. -439 с.

5. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов/ Е.П.

Феофилова //Прикладная биохимия и микробиология. -1998, т.34, № 6, -С. 597-608.

6. Yang Q.Y., Jong S.C., Li X.Y., Zhou J.X., Chen R.T., Xu L.Z. Antitumor and immunomodulating activities of the polysaccharide-peptide (PSP) of Coriolus versicolor. J. Immunol Immunopharmacol 1992 a;

12: 29-34.

7. Wang H.X., Liu W.K., Ng T.B., Ooi V.E.C., Chang S.T.

Immunomodulatory and antitumor activities of a polysaccharide-peptide cоmplex from mycelial culture of Tricholoma sp., a local edible mushroom. Life Sci. 1995;

57: 269-81.

8. Collins R.A., Ng T.B. Polysaccharopeptide from Coriolus versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type 1 infection.

Life Sci. 1997;

60: PL 383-87.

9. Wang H., Gao J., Ng T.B. A new lectin with highly potent antihepatoma and antisarcoma activities from the oyster mushroom Pleurotus ostreatus.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 Sep 7;

275(3): 810- 10. Brechtel R., Watzig H., Rudiger H. The lectin from mushroom Pleurotus ostreatus: a phosphatase-activating protein that is closely associated with an alpha-galactosidase activity. A part of this paper has been presented as preliminary report at the 17 th Interlec. Meeting 1997 in Wurzburg, Germany. Plant Sci. 2001 APR;

160(5): 1025-1033.

11. Shin H.H., Choi H.S. Purification and characterization of cysteine protease from Pleurotus ostreatus. Biosci Biotechnol Biochem. 1998;

62(7): 1416-8.

12. Герасименя В.П., Орлов А.Е. Камзолкина О. и др. Препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus 1137 для его получения. Патент РФ 2192873, 20.11.2002, Бюл. 32.

13. Gerasimenya V.P. Antimicrobial and antitoxical action of edible and medicinal mushroom Pleurotus ostreatus (Jacg.:Fr) Kumm. Extrasts.

International Journal of Medicinal Mushrooms, 2002. V. 4, pp. 127-132.

14. Поляков В.Ю. Синергизм действия экстракта мицелия гриба Pleurotus ostreatus и медицинских цитостатиков на пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток / В.Ю.Поляков, Г. И. Кирьянов, В.П. Герасименя и др. // Журнал «Биологические мембраны». -2007.

Том 24. №5. -С. 379-388.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОЗМОЖНЫХ КЛЕТОЧНЫХ МИШЕНЕЙ ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ Г.И. Кирьянов, **С.В.Захаров, **В.П. Герасименя, *Е.М. Лазарева, *М.И. Мурашева, *Л.В. Исаева, *В.Ю. Поляков.

МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

*НИИ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии, Москва, Россия;

**ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Несмотря на большой интерес, который проявляют к экст рактам базидиальных грибов представители различных направ лений медицины и фармакологии, до настоящего времени не определены молекулярные мишени, с которыми взаимодействуют компоненты экстрактов на организменном и клеточном уровнях.

Нами показано, что в части культивируемых клеток экстракт мицелия Pleurotus ostreatus1137 вызывает появление хромо сомных аберраций [1,2,3]. Аналогичные аномалии митозов возникают после действия циклофосфана, который, по данным литературы, вызывает «слипание» ДНК. В соответствии с этим, наблюдаемые нами в анафазах и телофазах хромосомные аберрации типа «мост» (после действия экстракта) могут рассматриваться, как следствие неспецифического «сшивания»

ДНК в интерфазных ядрах. В то же время наличие большого количества клеток с несколькими ядрами (поликарионов) показы вает, что циклофосфан и экстракт частично или полностью блокируют процесс нормального прохождения митоза на стадии метафазы. В современной литературе появление микроядер в делящихся клетках связывают с явлением, которое получило название «митотическая катастрофа» [1]. Показано, что митоти ческая катастрофа может контролироваться комбинированной системой факторов, включающих белки «критических точек» цикла (в том числе, ответственные за целостность ДНК генома и формирование митотического веретена), некоторыми фармаколо гическими агентами, а также апоптотическими факторами, в том числе, каспазами и/или представителями семейства Bcl-2.

Появление характерных хромосомных аберраций в клетках, обработанных экстрактом, свидетельствует, что одной из возмож ных мишеней его действия, прямого или опосредованного, является ДНК. Известно, что в клеточных ядрах ДНК в ассоциации с белками (гистонами) формирует высокоупорядоченные комплексы (хрома тин), которые контролируют ее доступность для ряда эндогенных и экзогенных факторов, в том числе для факторов, регулирующих транскрипцию. Если, действительно, одной из мишеней для экст ракта (или, его компонентов) является именно ДНК, то логично предположить, что искусственная декомпактизация хроматина может приводить к усилению эффекта действия экстракта. Эта идея была реализована с использованием реагентов, существенно изме няющих структуру хроматина - 5-азацитидина и бутирата Na [4].


Сочетанное действия экстракта с факторами, влияющими на структурно-функциональное состояние хроматина Работа проводилась на трансформированных клетках HeLa.

Для оценки индивидуального действия 5-азацитидина реагент добавлялся к культивируемым клеткам на 56 час (48 час - время, соответствующее двум клеточным циклам;

8 час - время, принятое в работе для анализа митостатического и апоптогенного действия экстракта и циклофосфана).

Полученные данные показывают, что после обработки 5 азацитидином в концентрации 20 мкМ/мл количество делящихся клеток снижается приблизительно в 2 раза по сравнению с контролем (рисунок 1 А, Б). Это означает, что уменьшение уровня метилирования ДНК, индуцированное включением в реплициру ющуюся ДНК раковых клеток 5-азацитидина, является ингибитором пролиферации.

Эффект блока митозов под действием 5-азацитидина показан на культуре клеток [4].

При индивидуальном использовании 5-азацитидин более чем в 10 раз повышает количество клеток, включивших программу апоптотической гибели (рисунок 2 Б).

Для оценки сочетанного действия 5-азацитидина и экстракта, через 48 час инкубации клеток в присутствии 5-азацитидина в среду культивирования добавлялся экстракт в концентрации 100 мкг/мл и клетки инкубировали 8час в присутствии экстракта. При такой постановке эксперимента экстракт повышает митотический индекс, по-видимому, за счет блокирования митозов (рисунок 1 В).

Добавление экстракта после 48 часов инкубации клеток с 5 азацитидином повышает долю апоптотических клеток в популяции примерно в 1,5 раза по сравнению с индивидуальным действием 5 азацитидина (рисунок 2 В). Сочетанное применение 5-азацитидина, экстракта и циклофосфана, дополнительно усиливает митоста тический эффект (рисунок 1 Г).

Для оценки индивидуального действия бутирата Na реагент добавлялся к клеткам в концентрации 5 мг/мл среды на 9 час.

Для оценки сочетанного действия бутирата и экстракта использовалось несколько способов введения реагентов.

При индивидуальном использовании бутират в 2 раза повы шает митотический индекс по сравнению с контролем (рисунок 3 А, Б), что свидетельствует о его митостатическом действии.

Это означает, что изменение уровня ацетилирования гистонов, индуцированное действием бутирата, повышает доступность ДНК.

При сочетанном использовании с экстрактом после после довательного или одновременного добавлении реагентов бутират не изменяет значение митотического индекса по сравнению с его индивидуальным действием (рисунок 3 В, Г).

После предварительной обработки бутиратом и последующим одновременном введением экстракта и циклофосфана наблюдается незначительное увеличение митотического индекса (рисунок 3 Д).

При индивидуальном использовании бутират более чем в раза увеличивает долю клеток, находящихся в состоянии апоптоза (рисунок 4 А, Б).

При сочетанном действии бутирата и экстракта (1 час инкубации в присутствии бутирата, добавление экстракта и инкубация 7 часов), доля клеток, вступивших в апоптоз, увеличивается примерно в 5 раз по сравнению с контролем и в 2 раза по сравнению с индиви дуальным действием бутирата (рисунок 4 В).

В целом, полученные результаты показывают, что модифи кация структуры хроматина (частичная декомпактизация) делает его более доступным для факторов, индуцирующих апоптоз. В этих случаях экстракт действует как проапоптотический агент.

Определение роли митохондрий, как возможных мишеней действия экстракта на индукцию апоптоза Известно, что в индукции апоптотической гибели клеток важная роль принадлежит митохондриям. По некоторым данным, митохондрии не только участвуют в реализации программы апоптоза, но и служат важнейшим сенсором, способным иници ировать гибель клетки (Skulachev et al., 2009). Если апоптоз развивается по «каноническому» пути, то это сопровождается выходом из митохондрий белка цитохрома С [1].

В жизнеспособных клетках HeLa цитохром С локализуется в митохондриях, которые, в основном, представлены нитчатыми формами (рисунки 5, 6). Обработка клеток экстрактом не приводит к существенному изменению формы митохондрий и выходу цитохрома в цитоплазму. Обработка клеток циклофосфаном также не приводит к появлению в популяции значительного количества клеток с признаками апоптоза. После окрашивания антителами к белку цитохрому С сохраняется его локализация в митохондриях (рисунок 7).

При сочетанной обработке (экстракт 1 час, затем добавление циклофосфана и последующая инкубация клеток 8 час) на препаратах выявляются апоптотические клетки, в которых наблюдается значительные изменения структуры митохондрий (набухание и «ошаривание»), однако выхода цитохрома в цитоплазму также не наблюдается.

Индивидуальное и сочетанное с циклофосфаном действие экстракта на плазматические мембраны клеток Для определения клеток с измененными свойствами мембран, использовали прижизненное окрашивание красителем трипановым синим. Количественный анализ показал, что доля окрашенных клеток в значительной степени зависит от дозы экстракта.

В популяции культивируемых клеток в небольшом количестве присутствуют клетки, окрашивающиеся трипановым синим (рисунок 8). После 8 часов индивидуального воздействия экстракта в концентрации 50 мкг/мл доля окрашенных клеток возрастает примерно в 2 раза, а после использования экстракта в дозе мкг/мл - примерно в 3 раза (рисунок 8).

Более длительная инкубация (24 часа) практически не приводит к возрастанию доли окрашенных клеток, тогда как пролон гированная инкубация с экстрактом увеличивает долю окрашенных клеток в 4 раза при концентрации 50 мкг/мл и примерно в 9 раз при концентрации 100 мкг/мл (рисунок 8).

На основании этих экспериментов можно предположить, что «первичной» мишенью действия экстракта являются плазма тические мембраны.

Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана на культивируемые фибробласты Экстракт и циклофосфан как при раздельной, так и при сочетанной обработке не приводят к индукции апоптотической гибели фибробластов (рисунок 9, А - К).

На основании перечисленных данных можно сделать предварительное заключение о том, что клеточный ответ трансформированных (раковых) и нормальных клеток на инди видуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана принципиально различается.

Таким образом, согласно изложеным выше результатам, экстракт обладает синергизмом действия с медицинскими цито статиками на процессы деления и индукцию апоптоза в культивируемых трансформированных клетках. Анализ различных способов инсталляции экстракта и медицинских цитостатиков показыает, что для индукции апоптоза наиболее эффективна предварительная обработка клеток экстрактом в дозе 100 мкг/мл ( час) с последующим введением цитостатиков (7 час). При этом эффективность апоптогенного действия экстракта сильно зависит от типа цитостатика.

В ранних работах показано, что эффективность действия цитостатиков в значительной степени зависит от состояния окислительно-восстановительных систем клетки и от присутствия метаболических активаторов [1,2,3]. Это согласуется с предполо жением, что противоопухолевый эффект экстрактов медицинских грибов не связан непосредственно с их цитотоксическим дейст вием, а, скорее, приводит к активации некоторых ферментных систем, в том числе, супероксиддисмутазы [4].

Известно, что функциональный статус как нормальных, так и трансформированных клеток во многом определяется сигналь ными системами, локализованными в плазматических мембранах. В частности, на плазматических мембранах экспонированы рецепторы, контролирующие включение программы клеточной гибели (апоптоза). Используя витальное окрашивание клеток, культивируемых в присутствии экстракта, мы показали, что именно модификация плазматических мембран является «первичным»

ответом клетки на действие экстракта. При этом важно, что такую реакцию демонстрируют не все клетки популяции. На основании этих данных логично предположить, что экстракт в определенных дозах детерминирует переход части клеток в «предапопто тическое» состояние. В результате, последующая обработка цитостатиками, мишенью которых является геном клетки, приводит к включению программы апоптоза. Аналогичный результат дает последовательная обработка клеток низкими и высокими дозами экстракта. Этот чрезвычайно интересный факт можно объяснить тем, что низкие дозы экстрака «сенсибилизирут» клетки для действия проапоптотических факторов, которые активируются при повторном введении экстракта.

Принципиально важно, что апоптогенное действие экстракт в синергизме с цитостатиками оказывает только на трансформи рованные клетки, тогда как нормальные фибробласты не включают программу апоптоза при тех же дозах экстракта и цитостатиков.

Рисунок 1 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и циклофосфаном действие 5-азацитидина на пролиферативную активность (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - 5-азацитидин (20 мкМ), 56 часов инкубации;

В - 5-азацитидин (20 мкМ), 48 часов инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Г - смесь 5-азацитидина (20 мкМ) и экстракта (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Рисунок 2 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и циклофосфаном действие 5-азацитидина на индукцию апоптоза (клетки HeLa) А - контроль;

Б - 5-азацитидин, 56 часов;

В - 5-азацитидин, 48 часов, добавление экстракта (100 мкг/мл) на 8 часов;

Г - 5-азацитидин, 48 часов, добавление экстракта (100 мкг/мл) на 1 час, добавление циклофосфана (300 мкг/мл) на 7 часов Рисунок 3 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и циклофосфаном действие бутирата натрия на пролиферацию (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - бутират (5 мкг/мл), 8 часов инкубации;

В - бутират (5 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Г - смесь бутирата (5 мкг/мл), экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Д - бутират (5 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации Рисунок 4 - Индивидуальное и сочетанное с экстрактом и цикло фосфаном действие бутирата натрия на индукцию апоптоза (клетки HeLa) А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - бутират (5 мг/мл), 8 часов инкубации;

В - бутират (5 мг/мл) 1 час инкубации, добавление экстракта ( мкг/мл), 7 часов инкубации;

Г - смесь бутирата (5 мг/мл), экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Д - бутират, 1 час инкубации, добавление циклофосфана ( мкг/мл) и экстракта (100 мкг/мл).

Рис. 5 - Окраска родамином (клетки HeLa) А - контроль, нитевидные митохондрии (стрелка);

Б - действие циклофосфана, митохондрии сферические (стрелка);

В - действие экстракта, в некоторых клетках митохондрии укорочены (стрелка).

Рис. 6 - Окраска антителами против цитохрома С (клетки HeLa) Рис. 20 - Окраска антителами против цитохрома С (клетки HeLa).

А, Б - контроль, окраска локализуется в нитчатых митохондриях;

А, Б – контроль, окраска локализуется в нитчатых митохондриях;

В, Г - действие циклофосфана, митохондрии приобретают В, Г – действие циклофосфана, митохондрии приобретают сферическую форму, цитохром не выходит из митохондрий.

сферическую форму, цитохром не выходит из митохондрий.

Рисунок 7 - Сочетанное действие экстракта и циклофосфана на плазматические мембраны (клетки HeLa) А - контроль 8 часов инкубации;

Б - экстракт (50 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло фосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;

В - экстракт (100 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление цикло фосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Г - цикофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Д - цикофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации.

Рисунок 8 - Действие экстракта и циклофосфана на плазма тические мембраны (клетки HeLa) А – контроль, 8 часов инкубации;

Б - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;

В - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Г - циклофосфан (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Д - циклофосфан (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Е – контроль, 24 часа инкубации;

Ж - экстракт (50 мкг/мл), 24 часа инкубации;

З - экстракт (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;

И - циклофосфан (100 мкг/мл), 24 часа инкубации;

К - циклофосфан (300 мкг/мл), 24 часа инкубации Рисунок 9 - Индивидуальное и сочетанное действие экстракта и циклофосфана на пролиферацию и индукцию апоптоза нормальных фибробластов человека А - контроль, 8 часов инкубации;

Б - циклофосфан (300 мкг/мл), 8 часов инкубации;

В - экстракт (50 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Г - экстракт (100 мкг/мл), 8 часов инкубации;

Д - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (50 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Е - циклофосфан (300 мкг/мл), 1 час инкубации, добавление экстракта (100 мкг/мл), 7 часов инкубации;

Ж - экстракт (50 мкг/мл), 7 часов инкубации, добавление циклофосфана (300 мкг/мл), 7 часов инкубации;

З - экстракт (100 мкг/мл), добавление циклофосфана ( мкг/мл), 7 часов инкубации;

И - смесь экстракта (50 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), часов инкубации;

К - смесь экстракта (100 мкг/мл) и циклофосфана (300 мкг/мл), часов инкубации.

Список литературы:

1. Поляков В.Ю. Синергизм действия экстракта мицелия гриба Pleurotus ostreatus и медицинских цитостатиков на пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток / В.Ю.Поляков, Г. И. Кирьянов, В.П. Герасименя и др. // Журнал «Биологические мембраны».- 2007.

Том 24. №5. -С. 379-388.

2. Анализ действия водно-этанольного экстракта мицелия гриба вешенки на цитокинетические параметры культивируемых клеток в норме и при воздействии цитостатика циклофосфана: Отчет о НИР / Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Герасименя В.П. и др. - М., ООО ИЛЦ «Универсал». 2005. - 40 с.

3.Анализ действия водно-этанольного экстракта мицелия гриба вешенки на цитокинетические параметры культивируемых клеток в норме и при воздействии цитостатика циклофосфана: Отчет о НИР / Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Герасименя В.П. и др. - М., ООО ИЛЦ «Универсал». 2005. - 34 с.

4. Изучение и установление механизма действия «Экстракта мицелия вешенки «ОВОДОРИН» : Отчет о НИР / Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Герасименя В.П. Захаров С.В. и др. - М.. ООО Испытательный лабораторный центр «Универсал». 2009. -49.

5. Поляков В.Ю. Гепатопротекторное действие препарата на основе экстракта мицелия вешенки при развитии эксперимен тального стеатоза печени / В.Ю. Поляков, С.А. Голышев, Г.И.

Кирьянов, Е.А. Арифулин, В.П. Герасименя, С.В. Захаров, К.З.

Гумаргалиева, Ю.Л. Путырский //Биологические мембраны. -2011, том 28, №4.- С. 1-7.

ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus (ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ) И ЦИКЛОФОСФАНА НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЖИВОТНЫХ В.П. Герасименя, С.В. Захаров, *К.З. Гумаргалиева, **Т.И. Милевич ООО «Инбиофарм», Москва, Россия;

*Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия;

**Институт радиобиологии НАН Беларуси, Гомель, Беларусь.

В одной из работ, посвященных фармакологическому действию экстрактов медицинских грибов изучена возможность гемопоэ тического действия 1,3-бета-D-гликана из гриба Sparassis crispa на модели лейкопении у мышей, вызванной введением циклофосфана (Harada et al., 2005). Показано, что оральное введение гликана приводит к увеличению числа моноцитов, гранулоцитов и веса селезёнки по сравнению с контролем. Этот эффект усиливается при совместном применении с другими гемопоэтическими препаратами.

Рекомендовано применение бета-гликанов грибов для реабилитации онкологических больных после химиотерапии.

Нами проведено изучение действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 и циклофосфана (ЦФ) на гематологические показа- тели периферической крови здоровых животных (мыши линии С BL/6, возраст - 8 недель, вес 23 - 30 г).

В ходе эксперимента измерялось количество лейкоцитов в периферической крови (перед введением ЦФ и на первые, четвер тые и седьмые сутки после введения ЦФ). Измерение количества лейкоцитов проводилось по стандартной методике.

Результаты этой серии экспериментов приведены в таблице 1 и показаны на рисунке 1.

Подсчет количества лейкоцитов в периферической крови показал, что экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137 улучшает восстановление лейкоцитов животных после лечения ЦФ.

В 4-й группе, получавшей ЦФ и экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137, количество лейкоцитов на следующий день после введения ЦФ было выше количества лейкоцитов, чем во 2-ой группе, получавшей только ЦФ (соответственно, 43% и 29% от исходного). На третий день количество лейкоцитов в 4-й группе выросло до 51%, в то время как 2-ой группе несколько упало, до 27%. На седьмой день количество лейкоцитов нормализовалось у всех мышей.

Полученные результаты исследования хорошо согласуются с ранее проведенными исследованиями в данном направлении другими авторами [1 - 10].

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что применение экстракта мицелия Pleurotus ostreatus вызывает более раннее и интенсивное восстановление количества лейкоцитов в периферической крови леченых мышей после применения ЦФ и снижает гематотоксичность, в частности, выра женность и продолжительность лейкопении, вызванную введением животным ЦФ в дозе 300 мг/кг веса тела.

Таблица 1 - Динамика изменения количества лейкоцитов в пери ферической крови животных после начала введения препаратов (в процентах от интактного контроля) Группы животных Контролируемый день Интактный Циклофосфан Экстракт Экстракт контроль мицелия мицелия Pleurotus Pleurotus ostreatus ostreatus 1137 +ЦФ 0 100,0 100,0 100,0 100, 126,9 ± 12,3 28,9 ± 8,9 80,4 ± 15,8 42,5 ± 4, 100,1 ±3,2 27,40 ± 10,2 91,4 ±25,7 50,8 ± 15, 89,7 ± 14,7 108 ± 16,3 91,6 ± 14, 7 102,9 + 35, Рисунок 1 - Результаты изучения влияния фармакологической субстанции препарата и циклофосфана на гематологические показатели периферической крови здоровых мышей.

- группа 1 - интактный контроль (ИК);

- группа 2 - введение мышам ЦФ;

- группа 3 - введение мышам фармакологической субстанции препарата (ФС Пр);

- группа 4 - введение мышам сочетанного применения ЦФ и фармакологической субстанции препарата (ФС Пр + ЦФ).

Список литературы:

1. Богуш Т.А. Исследование фракции МК, выделенной из гриба вешенки, на гематологическую токсичность противоопухолевых препаратов: Заключение. / Т..А.. Богуш. -М.: НИИ эксперименталь ной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН. 2001. -10 с.

2. Милевич Т.И. Влияние экстракта (Фр. МК) Pleurotus ostereatus (Fr.) Kumm на гематотоксические эффекты у мышей вызванные противоопухолевыми препаратами: Заключение / Т.И. Милевич. Минск, Институт радиобиологии НАН Беларуси. 2001. - 19 с.

3. Герасименя В.П. Антимикробная и антитоксическая активность экстра кта Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. Тезисы доклада / В.П. Герасименя, О. В.

Ефременкова, О.В Камзолкина, Т.А. Богуш // International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol.3, Num. 2-3, 2001. - С. 147.

4. Конопля Е.Ф. Влияние экстракта (фр. МК) Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm на гематотоксические эффекты у мышей, вызванные противоопухолевыми препаратами/ Е.Ф. Конопля, Т.И. Милевич, Л.А. Путырский, В.П. Герасименя, О.В Ефременкова, А.Е. Орлов // Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии: Сб.

науч. работ. - Минск: ГУ НИИ онкологии и мед. радиологии им.

Н.Н.Александрова, 2001.- С. 380-383.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.