авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«ЭКСТРАКТЫ МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ (Pleurotus ostreatus): МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ Под редакцией: ...»

-- [ Страница 3 ] --

- активность диспептических проявлений лекарственной непереносимости снижалась к 7 дню приема препарата «ЭМВ», что выражалось в отсутствии рвоты и болевого синдрома, тошнота сохранялась только в утреннее время после непосредственного приема ПТП;

- к 21 дню приема препарата «ЭМВ» диспептические жалобы у больных отсутствовали, в том числе и диарея, связанная с приемом ПАСК;

- эозинофилия в крови у больных достоверно снижалась в интервале от 3 до 21 дня;

- моноцитоз в крови у больных достоверно снижался в интервале от 3 до 21 дня;

- активность проявлений суставного синдрома сохранялась на протяжении первых 7-9 дней, достоверно значимые изменения:

отсутствие арталгии и проявлений тендовагинита отмечались только к 21-30 дню приема препарата «ЭМВ».

Анализ полученных результатов показывает что, наиболее выраженные изменения гемограммы на фоне реакций непе реносимости были у 6-ти больных с аллергическим характером побочных реакций. У данных больных отмечалось не только увеличение числа эозинофилов, но и моноцитов, палочкоядерных нейтрофилов, лейкоцитов с одновременным снижением числа лимфоцитов, что можно было расценить как проявления иммуносупрессии. Динамические изменения показателей гемограм мы представлены в таблице 17.

Как видно из представленных в таблицы 17 данных, после проведенного курса терапии (препарат «ЭМВ», 21 день) у шести больных с аллергическим характером побочных реакций отмеча лись благоприятные изменения в показателях гемограммы.

В 2 раза снизилось процентное содержание палочкоядерных нейтрофилов, в 1,7 раз - эозинофилов, в 3 раза - моноцитов, в 3, раза числа лейкоцитов при увеличении в три раза процентного содержания лимфоцитов и в два раза показателя ЛИИ.

Указанные положительные динамические изменения гемограм мы свидетельствуют о дезинтоксикационном действии препарата «ЭМВ».

Переносимость препарата «ЭМВ» пациентами была удовлет ворительной, реакций непереносимости не отмечалось.

Оценка переносимости противотуберкулезной терапии по 10 бальной системе показала, что у больных группы В на момент развития побочных реакций переносимость химиотерапии оценивалась в 5, баллов, а после курса препарата «ЭМВ» (30 дней) в - 9,1 балла, т.е.

переносимость химиотерапии улучшилась в 1,8 раза.

Таким образом, оценка переносимости противотуберкулезной терапии в данной группе больных (группа В) по 10-бальной системе показала, что:

- побочные реакции токсико-аллергического характера наблю дались преимущественно у впервые выявленных больных туберку лезом легких - 90% наблюдений;

- среди развившихся побочных реакций у наблюдаемых больных превалировали реакции аллергического характера (60% наблю дений), которые сопровождались острой токсикодермией и выражен ными изменениями показателей гемограммы;

- на фоне приема препарата «ЭМВ» происходил быстрый регресс кожного зуда (первые 3 дня). Полное нивелирование кожных проявлений аллергических реакций происходило к 21-30 дню приема препарата «ЭМВ» при сохранении адекватной химиотерапии;

- полное купирование диспептического и суставного синдромов происходило к 21 - 30 дню приема препарата «ЭМВ»;

- динамическое исследование показателей гемограммы показа ло полную ее нормализацию, что выражалось в снижении в 2 раза процентного содержания палочкоядерных нейтрофилов, в 1,7 раз эозинофилов, в 3 раза - моноцитов, в 3,3 раза числа лейкоцитов при увеличении втрое процентного содержания лимфоцитов и вдвое показателя ЛИИ;

- на фоне лечения побочных реакций препаратом «ЭМВ»

переносимость химиотерапии составила 9,1 баллов, против 5, баллов исходно.

Анализ результатов клинического применения препарата «ЭМВ»-сироп и препарата «ЭМВ»-гель у больных туберкулезом легких показал достоверную эффективность препарата в профилактике и лечении нежелательных побочных реакций противотуберкулезной терапии у больных туберкулезом легких, включая больных с лекарственной резистентностью за счет применения известного препарата Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F 819) по новому назначению в комплексной терапии туберкулеза легких.

Полученные результаты позволили рекомендовать препарат «ЭМВ» в качестве терапии «сопровождения» у больных туберку лезом легких для профилактики побочных реакций противо туберкулезных препаратов и комплексном лечении больных туберкулезом легких.

Применение препарата в качестве «терапии сопровождения»

1.

позволило повысить качество комплексной лекарственной терапии при лечении туберкулеза легких [5,6].

Таблица 1 - Распределение впервые выявленных больных группы А и Г по клиническим формам туберкулеза легких Группы Клиническая форма туберкулеза легких больных инфильтра- каверно- туберкулема дисемини тивный зный рованный А, n=10 8 чел. 1 чел. 1 чел. Г, n=10 7 чел. 1 чел. - 2 чел.

Таблица 2 - Распределение больных по частоте бактериовыде ления и характеру лекарственной устойчивости МБТ Характер лекарственной устойчивости МБТ Число Группа Чувстви больных Поли- Моно больных тельность MDR XDR резистентность резистентность сохранена Группа А 9 1 3 1 5 Группа Г 10 1 2 1 5 Примечание: MDR - множественная лекарственная устойчивость;

XDR – обширная лекарственная устойчивость.

Таблица 3 - Сопутствующие заболевания у больных групп А и Г Сопутствующие заболевания Число больных Группа А Группа Г Сахарный диабет 2 Гипертоническая болезнь Болезнь Такаясу 1 Гастрит 2 Хроническая почечная 1 недостаточность Атопический дерматит 1 Ишемическая болезнь сердца 2 ВСЕГО: 11 Таблица 4 - Характер и частота побочных реакций ПТП у больных групп А и Г Группы Характер и частота побочных реакций больных аллергические токсические смешанные А, n=10 - 1 Г, n=10 2 2 Таблица 5 - Распределение больных по режимам ПТТ до развития побочных реакций и после их нивелирования Группа Режимы противотуберкулезной терапии больных 1-ый 2-ой «Б» 4-ый индивидуальный до после до после до после до после Группа А 2 2 3 3 5 4 - Группа Г 2 1 2 1 6 3 - Таблица 6 - Динамика показателей функции печени больных групп А и Г через 1 месяц противотуберкулезной терапии Показатели, Сроки Группы больных един. измере- исследования А;

n=10 Г;

n= ния, норма (дни) АЛТ до лечения 19,2+8,8 21,8+8, (муж. - до 42 Ед/л через 1 мес. 20,3+7,0^ 139,2+22,4* жен. - до 32 Ед/л) АСТ до лечения 19,9+6,9 22,7+10, (муж.- до 37 Ед/л через 1 мес. 23,6+6,3^ 134,6+25,2* жен. - до 31 Ед/л) ЩФ до лечения 62,5+25,3 33,1+4, (муж. - 117 Ед/л через 1 мес. 74,5+29,9 62,4+5, жен. - 104 Ед/л) ГГТП до лечения 28,3+12,8 27,2+2, (муж. - 11-50 Ед/л через 1 мес. 30,2+9,4 56,6+5, жен. - 7-32 Ед/л) * - различия с нормой достоверны р0,05;

^ - различия между группами больных достоверны р0,01.

Таблица 7 - Распределение больных группы Б по клиническим формам туберкулеза легких Группа Клиническая форма туберкулеза легких больных Инфильтра- фиброзно- туберкулема Дисемини тивный кавернозный рованный 7 чел. 1 чел. 1 чел. 1 чел.

Б, n= Таблица 8 - Распределение больных по частоте бактерио выделения и характеру лекарственной устойчивости МБТ Группа Число Характер лекарственной устойчивости МБТ больных больных Чувствитель- Полирезис- Монорезис- MDR XDR ность тентность тентность сохранена Группа Б 10 2 2 - 5 Примечание:

MDR -множественная лекарственная устойчивость;

XDR – обширная лекарственная устойчивость.

Таблица 9 - Сопутствующие заболевания у больных группы Б Группа больных Сопутствующие заболевания Группа Б Сахарный диабет Гипертоническая болезнь Гастрит Хроническая почечная недостаточность Ишемическая болезнь сердца ВСЕГО: Таблица 10 - Распределение больных группы Б по режимам ПТТ до развития токсического гепатита Группа Режимы противотуберкулезной терапии больных 1-ый 2-ой «Б» 4-ый индивидуальный Группа Б 2 2 6 Таблица 11 - Динамика показателей функции печени больных группы Б до и после лечения токсического гепатита с применением препарата «ЭМВ»

Показатели, Сроки Группа больных един. измерения, норма исследования (дни) Б;

n= АЛТ до лечения 236,9+27,8* (муж. - до 42 Ед/л, через 1 мес. 34,6+5, жен. - до 32 Ед/л) АСТ до лечения 150,4+19,3* (муж.- до 37 Ед/л через 1 мес. 27,5+5, жен. - до 31 Ед/л) ЩФ до лечения 134,4+11,2* (муж.- 117 Ед/л через 1 мес. 68,9+4, жен. - 104 Ед/л) ГГТП до лечения 95,4+14,2* (муж. - 11-50 Ед/л через 1 мес. 24,0+6, жен. - 7-32 Ед/л) * - различия с нормой достоверны р0,05.

Таблица 12 - ЛИИ у больных туберкулезом легких с токсичес кими гепатитами до и после курса препарата «ЭМВ»-сироп (7- дней) Группы больных Лейкоцитарный индекс интоксикации До лечения После лечения Б;

n=10 n1=6 0,19+0,04* 0,85+0, n2=4 2,9+0,05* 0,73+0, ЛИИ в норме – 0,5 -1,2 у.е.;

n1 - группа больных исходно с ЛИИ 0,5 у.е. ;

n2 - группа больных исходно с ЛИИ 1,2 у.е.;

* - уровень значимости р0,05 при сравнении с нормой.

Таблица 13 - Распределение больных группы В по клиническим формам туберкулеза легких Группа Клиническая форма туберкулеза легких больных инфильтра- фиброзно- туберкулема дисемини тивный кавернозный рованный В, n=10 5 чел. 1 чел. 2 чел. 2 чел.

Таблица 14 - Распределение больных по частоте бактерио выделения и характеру лекарственной устойчивости МБТ Группа Число Характер лекарственной устойчивости МБТ больных больных Чувстви- Полирезис- Монорезис- MDR XDR тельность тентность тентность сохранена Группа Б 10 1 2 1 3 Примечание:

MDR - множественная лекарственная устойчивость;

XDR - обширная лекарственная устойчивость.

Таблица 15 - Распределение больных группы В по режимам ПТТ до развития токсического гепатита Группа Режимы противотуберкулезной терапии больных 1-ый 2-ой «Б» 4-ый индивидуальный Группа В 1 1 2 Таблица 16 - Характер и частота побочных реакций ПТП у больных группы В Группы Характер и частота побочных реакций больных аллергические токсические смешанные В, n=10 6 - Таблица 17 - Динамика показателей гемограммы у больных туберкулезом легких с побочными реакциями аллергического харак тера на фоне лечения препаратом «ЭМВ» через 21 день Показатели До лечения;

После лечения;

n=6 n= Палочкоядерные нейтрофилы,% 6,2+0,03 3,4+0,01* Эозинофилы, % 13,2+0,02 8,0+ 0,06* Моноциты, % 11,4+0,04 3,0+0,02* Лимфоциты, % 8,2+0,03 23,0+0,08* Лейкоциты, тыс. 12,9+0,01 3,9+0,01* ЛИИ, у.е. 0,16+0,26 0,31+0,04* * - различия с исходными данными достоверны, p0, Рисунок 1 - Уровень активности АЛТ до и после 30 дневного курса препарата «ЭВМ»-сироп у больных туберкулезом легких.

Рисунок 2 - Уровень активности АСТ до и после 30 дневного курса препарата «ЭВМ»-сироп у больных туберкулезом легких.

Рисунок 3 - Уровень активности ЩФ до и после 30 дневного курса препарата «ЭВМ»-сироп у больных туберкулезом легких.

Рисунок 4 - Уровень ГГТП до и после 30 дневного курса «ЭВМ» сироп у больных туберкулезом легких.

Рисунок 5 - Уровень АЛТ у больных туберкулезом легких до и после 1 мес. противотуберкулезной терапии.

Рисунок 6 - Уровень АСТ у больных туберкулезом легких до и после 1 мес. противотуберкулезной терапии.

Рисунок 7 - Динамика эозинофилии на фоне приема препарата «ЭВМ».

Рисунок 8 - Динамика моноцитоза на фоне приема препарата «ЭВМ».

Список литературы:

1. Технологическая инструкция по производству БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» (ТУ 9317-01-87552538 08). / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. – 8 с.

2. Технологическая инструкция по производству БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» (сироп) к (ТУ 9317-02 87552538-08). / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. - 8 с.

3. Технические условия ТУ 9317-01-87552538-08. БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН». / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. – 22 с.

4. Технические условия ТУ 9317-02-87552538-08. БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» (сироп). / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. - 22 с.

5. Ерохин В.В. Применение БАД к пище Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении больных туберкулезом легких: пособие для врачей / В.В.Ерохин, Н.П.Карпина, И.А.Васильева, Ю.Е. Коссий, М.В.

Ерохина, В.П. Герасименя, С.В. Захаров, А.В. Трезвова, В.Н.

Григорьева. – М.: Мин. здравоохрн. соц. Развития, ЦНИИ туберкулеза РАМН, ООО «Инбиофарм», 2010. – 21 с.

6. Отчет по завершению открытого исследования клинической эффективности препарата «ОВОДОРИН» у больных туберкулезом легких с побочными реакциями на противотуберкулезные препараты:

отчет о НИР / Ерохин В.В. - М., ЦНИИ туберкулеза РАМН, 2010. – 50 с.

7. Герасименя В.П., Захаров С.В., Трезвова А.В. и др. Препарат на основе гриба Pleurotus 1137, для коррекции лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких.

Патент РФ на изобретение № 2435600 от 23.08. 2010 г. Бюл. № 34 от 10.12.2011 г.

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F–819) Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков, В.Н. Ташлицкий, В.А. Носков, Л.Н. Кинцурашвили, *С.В. Захаров, *В.П. Герасименя.

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Введение Базидиомицеты относится к обширной группе «медицинских»

грибов, которые используются в восточной медицине для профилактики и лечения многих тяжелых заболеваний, таких как бактериальные и вирусные инфекции, ВИЧ, диабет, гипер холестеролемия, сердечно-сосудистые патологии, лейкозы и онкологические заболевания. Это удивительное многообразие эффектов медицинских грибов привлекает пристальное внимание различных областей медицины, биохимии и молекулярной биологии.

В настоящее время из плодовых тел или культивируемого мицелия базидиомицетов выделены и охарактеризованы вещества, обладающие специфической биологической активностью. В современной медицинской практике широко используются статины, полисахариды, - глюканы и ганадермовые кислоты. На их основе созданы такие лекарственные препараты, как бефунгин (Россия) и лентанан (Япония), полученные из плодовых тел Lentinus edodes и Inonotus obliguus, сонифилан и шизофиллан (Япония), полученные из культуральной жидкости Schizophyllum commune (Mizuno 1996, Miles, Chang, 1997).

На основе экстрактов мицелия созданы биологически активные добавки «Мипро-ВИТ» (Патент РФ 2092179, 1997);

БАД к пище из грибов Fusarium sambucinum Fuskel var. ossicolum (berk. Etcurf) bilai (РФ) (Патент РФ 2040932, 1993);

БАД к пище «Микотин» (Украина), (Горовой, Сенюк, Трутнева, 1997) и др.

При этом, судя по работам зарубежных и отечественных исследователей, потенциал базидиомицетов, как продуцентов новых лекарств, далеко не исчерпан [1-6].

Цель настоящей работы - получение из экстракта мицелия ранее не идентифицированных химически Pleurotus ostreatus чистых веществ, обладающих выраженной биологической актив ностью.

Как показывает анализ литературы, на практике применяются два противоположных подхода к выделению из мицелия базидиомицетов биологически активных веществ: экстрагирование в водных средах или органических растворителях. В первом варианте в экстракт переходят полимерные вещества - белки и полисахариды ( - глюканы), во втором - различные низкомолеку лярные соединения, часть которых идентифицирована. Это эргостерины, никотиновая кислота, полифенолы, эллаготанины и гидролизуемые танины, а также антиоксиданты. Некоторые из них обладают антираковой активностью, заключающейся либо в прямом цитотоксическом действии на клетки опухоли за счёт индукции апоптоза, либо действуют опосредованно, путём стимуляции противоракового иммунитета.

Работа планировалась и осуществлялась в соответствии с алгоритмом, принятым для биотехнологических методов создания лекарственных препаратов.

Результаты и обсуждение В качестве продуцента биологически активных веществ в работе использовался штамм Pleurotus ostreatus №1137, ВКПМ, F 819, один из 14 штаммов, выделенных в чистую культуру под руководством проф. О.В. Камзолкиной (МГУ). Критерием отбора послужила наиболее выраженная антимикробная активность этого штамма.

Мицелии Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F – 819) выращивали в регулируемых асептических условиях методом жидкофазного глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей растительное сырье [7,8].

После культивирования отжатый от культурной среды мицелий экстрагировали этанолом, подкисленным до рН 2-3 в течение 18- часов. Очистку экстракта от фрагментов мицелия проводили фильтрованием, полученный экстракт упаривали в вакууме при температуре 40-500С до вязкого однородного гелеобразного состояния с содержанием воды до 30 % [7].

Полномасштабный скрининг экстракта, направленный на выявление его биологической активности в системе in vitro (на культивируемых клетках) и in vivo, на модели экспериментальных животных На этом этапе проявились достаточно неожиданные свойства экстракта (см. статью в настоящем сборнике).

Во-первых, сочетанное использование экстракта и медицин ских цитостатиков (циклофосфана, доксорубицина и 5-азацитидина) показывает ярко выраженный синергизм, который в зависимости от концентрации реагентов и способа их инсталляции выражается в подавлении пролиферации и в индукции апоптоза. Этот эффект зарегистрирован на клетках HeLa и на клетках миелоидного лейкоза, т. е. на моделях клеток как эпителиального, так и мезенхимного происхождения (см. статью в настоящем сборнике).

Во-вторых, испытания in vivo, на модели экспериментальных животных, выявили полифункциональность экстракта: он нормали зует липидный обмен, оказывает антигипертензивное действие и ингибирует развитие опухолевого роста (см. статью в настоящем сборнике).

Как известно, аналогичным спектром активностей обладают статины. С химической точки зрения группа статинов неоднородна и представлена совершенно неблизкими соединениями. Наиболее используемыми в фармакологии статинами являются производные стеролов, продуцируемые низшими грибами из рода Aspergillus, например, ловастатин, полусинтетические модификации которого выпускаются под десятками названий в качестве эффективных антигиперлипидемических средств. Эти препараты, в частности Зокор, уменьшают риск инсультов и формирования склеротических бляшек за счет снижения содержания холестерина и оптимизации соотношения липопротеидов низкой и высокой плотности.

Активными исследованиями действия ловастатина выявлена одна из, по-видимому, главных мишеней его действия.

Показано, что ловастатин (и, возможно, ряд других статинов) является ингибитором одного из ферментов синтеза холестерина из мевалоната, а именно 3-гидрокси-3-метил-глутарил-коэнзим А редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы). В то же время ясно, что мишеней для действия статинов может быть и больше в соответствии с этапами синтеза и метаболизма холестерина.

В последнее время опубликованы чрезвычайно интригующие данные о том, что статины обладают онкопротекторными свойст вами, при этом механизмы таких эффектов остаются неизвестными.

На основании перечисленных данных возникло предполо жение, что действующим началом экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) являются вещества, относящиеся к классу статинов. В частности, на такую возможность указывают данные, по которым один из представителей статинов (ловастатин) обнаружен в вешенке (Alberts et.al., 1989;

Gunde-Cimerman et. al., 1995).

Однако, тщательный химический анализ ЭМВ с исполь зованием ВЭЖХ/МС не выявил в экстракте наличие статинов стероидной природы. В связи с этим настоятельной стала задача выявления активного вещества и идентификация его химической природы.

Для этого было использовано фракционирование ЭМВ с помо щью HPLC. В результате фракционирования материал ЭМВ функционально разнороден. Получены фракции, обладающие ярко выраженным эффектом индукции апоптоза, максимальная доля апоптических клеток в ряде случаев в 10-30 раз превышает контрольные значения. В то же время некоторые фракции HPLC обладают митотическим эффектом (рисунки 1 и 2).

Рисунок 1 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) на клетки HeLa.

Рисунок 2 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) на клетки HeLa.

Как и в случае исходного нефракционированного экстракта, полученная фракция не оказывает апоптогенного и митостати ческого действия на нормальные фибробласты.

В последующих экспериментах были предприняты попытки разделить материал экстракта с помощью различных раство рителей.

Одним из таких подходов было переосаждение материала фракций этанолом при подкислении. Биологические испытания полученных таким образом минимально очищенных фракций не показали существенного эффекта.

В дальнейшем была избрана стратегия, ранее хорошо оправдавшая себя на практике. Были подобраны органические растворители, образующие двухфазную систему с этанолом (т. е. с раствором материала фракции). Кроме того, эти растворители испытывали в двух областях рН - кислой (рН 1,7) и щелочной (рН 11,0).

Первые же результаты этих экспериментов были обнаде живающими. На рисунке 3 представлена оценка влияния субфрак ций на митотический и апоптотический индексы. Отметим два момента. Испытывали биологическое действие материала, перешедшего из этанольного суммарного экстракта в растворители.

Во всех случаях оценивали количество материала (весовое), перешедшее в растворитель. В среднем разные растворители (при разных значениях рН) экстрагировали из суммарного экстракта от до 5% материала.

Таким образом, условная степень очистки была 20…50 кратной. В опыты по биоиспытанию эти субфракции экстракта брали в концентрации, соответствующей концентрациям их в суммарном экстракте, что позволило сопоставить биологический эффект отдельных субфракций и суммарного экстракта. Из результатов отметим самые интересные:

1. Гексан при рН 1,7 экстрагирует «апоптотически активные»

вещества, эффект по сравнению с суммарным экстрактом в 3 - раза выше. Одновременно в этой фракции снижается количество «митотически активных» веществ.

2. Тот же гексан при рН 11,0 экстрагирует «митотически активные» вещества. Таким образом, при этом подходе становится реальной задача фракционирования двух разных активностей.

3. В экстракте хлористым метиленом резко обогащается количество «апоптотически активных» веществ вне зависимости от рН. Обогащение по активности составляет от 2 до 10 раз по сравнению с суммарным экстрактом. Наиболее ярким был эффект при рН 1,7 (рисунок 3).

Рисунок 3 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) на клетки HeLa.

В следующих экспериментах были выбраны 2 растворителя, наиболее эффективно экстрагирующие «апоптотическую актив ность» - хлористый метилен (рН 1,7) и эфир (рН 11,0). Был обнаружен факт стимуляции апоптоза материалом фракции хлористого метилена в опыте без обработки клеток цикло фосфаном (рисунок 4).

Рисунок 4 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) на клетки HeLa.

Более того, циклофосфан при некоторых концентрациях матери ала фракции снижал «апоптотический эффект» (рисунок 5).

Эффект «эфирной» фракции был меньше. Такие же результаты получены для бутанола.

Рисунок 5 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) на клетки HeLa.

В следующем эксперименте была поставлена задача проверки эффекта «апоптотического действия» материала фракции без сочетания с циклофосфаном. Кроме того, мы попытались выявить наличие дозовой зависимости эффекта (рисунок 6). В этом опыте была выявлена линейная зависимость «апоптотического действия»

от дозы фракции.

Рисунок 6 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки (ЭМВ) на клетки HeLa.

Суммируя этот этап работы, можно заключить, что оптимальным способом экстракции «апоптотически активного»

начала следует считать хлористый метилен (рН 1,7). Этот прием дает наиболее воспроизводимые результаты, выраженную дозовую зависимость, технологичность процедур. При этом очистка активного начала составляет от 20 до 50 раз.

В дальнейшем именно эта фракция была использована для выделения и идентификации действующего начала (основного) с помощью ВЭЖХ. Схема выделения приводится ниже. Выход этого вещества - инцистерола составляет в среднем около 2 мг на грамм фракции хлористого метилена (~0.1%).

Выделение активного вещества из экстракта хлористым метиленом Экстракт хлористым метиленом (1г) растворяется в 96% этанолом в концентрации 100 мг/мл. Полученный раствор (аликвоты по 400мкл) разделяем хроматографический на полупрепаративной ВЭЖХ - системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500мкл, колоночного термостата и делительного потока (1:10), УФ детектора с переменной длиной волны и управляющей программы.

Была использована полупрепаративная колонка 24*250мм с сорбентом Диасорб С 16Т (10мкм). Состав подвижной фазы: 96% этанол/0.1%ТФУ в воде=60:40, при скорости потока 10мл/мин и температуре 300С. Возможно использование аналогичной хромато графической системы и аналогичной обращено-фазной колонки.

Время анализа - 40 мин, детектирование при длине волны 230нм, интересующий пик имеет время удерживания 20-25 мин.

Фракцию, содержащую интересующий пик, собирают, добавляют 30% раствор аммиака до нейтрального значения рН 6-8 и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/ по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляют равный объем хлористого метилена, экстра гируют и органический слой отделяют на делительной воронке.

Органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания и растворяют в 1 мл 96% этанола. Полученный раствор (аликвоты по 100мкл) разделяют с помощью аналитической ВЭЖХ на системе Agilent 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStation.

Была использована аналитическая колонка 4,6*250мм с сорбентом Luna C18(2) (5мкл). Возможно использование аналогичной хроматографической системы и аналогичной обращено-фазной колонки. Состав подвижной фазы: ацетонитрил/вода=79:21, при скорости потока 1мл/мин и температуре 250С. Время анализа - мин, детектирование при длине волны 230нм, интересующий пик имеет время удерживания 15 - 18мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирают и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляют равный объем хлористого метилена, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке. Органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания, растворяют в 1мл хлористого метилена и сушат в эксикаторе. Выход составляет около 2мг.

Список литературы:

1. Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами: обзор (International Journal of Medicinal Mushrooms, Vol. 3, 1999 p. 31-62.

2. Корсун В.Ф. Противоопухолевые свойства грибов / В.Ф.Корсун, Л.М. Краснопольская, Е.В. Корсун, М.А. Авхукова. –М.:

«Мэйлер»,2012. -210 с.

3. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов / Е.П.

Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология -1998, т.34,- № 6, -С. 597-608.

4. Герасименя В.П. Роль и значение нового полифункционального препарата «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» в сопровождении комплексной терапии онкологических заболеваний:

аналитический обзор / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков. -М.: ООО «Инбиофарм», 2010. – 33с.

5. Герасименя В.П. Результаты экспериментальных (доклинических) исследований о противоопухолевой активности экстракта мицелия гриба «вешенка обыкновенная» и его способности потенцировать антибластомное действие цитостатических препа-ратов.

Аналитический обзор/ В.П.Герасименя, Т.И. Милевич, С.В. Захаров и др. // Журнал Здравоохранение Беларуси. -Минск.:

-2012. -12с.

6. V. P. Gerasimenia, S. V. Zakharov, V. Yu. Polyakov, G. I. Kirianov, K. Z.

Gumargalieva, L. A. Putyrskyi, Yu. L. Putyrskyi, and T. I. Milevich.

Application of a New Polyfunctional Preparation "Oyster Mushroom Mycelium Extract "Ovodorin®'" to the Correction of Drug Intolerance in the Complex Treatment of Oncological Diseases: The Overview of Cytological, Biological and Medical Results // Volume 2 Issue 1. The Overview of Cytological, Biological and Medical Results. 2012. -48s.

7. Технологическая инструкция по производству БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» (ТУ 9317-01-87552538-08). / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. – 8 с.

8. Технические условия ТУ 9317-01-87552538-08. БАД к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН». / - М., ООО «Инбиофарм». 2008. – 22 с.

9. (Jong, Donovick, 1990;

Babineau et al. 1994b;

Dellinger, E.P. et al.

1999), ганодермиевые кислоты.

10. Jong, S.C. and Donovick, R. 1990. Antitumour and antiviral substances from fungi. Advances in Applied Microbiology 34, 183-262.

11. Babineau, T.J. et al. 1994b. Randomised phase I/II trial of a macrophage-specific immunomodulator(PGG-glucan) in high-risk surgical patients. Annals of Surgery 220, 601-609.

12. Dellinger, E.P. et al. 1999. Effect of PGG-glucan on the rate of serious postoperative infection or death observed after high-risk gastrointestinal operation. Betafactin Gastrointestinal Study. Archives of Surgery 13, 977- 14. Hirotani, M. and Ito, C. 1986. Ganoderic acids T, S and R, new triterpenoids from the culturedmycelia of Ganoderma lucidum. Chemical Pharmaceutical Bulletin 34, 2282-2285.

15. Chen, Y. and Zhou, M. 1997. Damage to macrophages by tetrabutyl hydroperoxide and the protective actions of the protein-bound polysaccharide Krestin. Medical Science Research 25, 606-609.

16. Mizuno, T. 1995. Bioactive biomolecules of mushrooms: food function and medicinal effect of mushroom fungi. Food Reviews International 11, 7-21.

17. Li, M. and Lei, L.S. 2000. Effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on oxygen-free radicals in murine peritoneal macrophages. Zhongguo Yadikxue Yu Dulixue Zazhi – Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology 14, 65-68.

18. Sheng, J.H. and Chen, Q.H. 1989. Antilipemic effect of polysaccharides from Auricularia aurantia, Tremella fuciformis and T. fuciformis spores. Journal of China Pharmaceutical University 20, 344-347.

19. Koichi, A. and Takahiro, I. 1999. Antihypercholesterolemic agent, hypocholesterolemic agent and agent for preventing and treating arteriosclerosis. JP Patent No. 11193244 published 21.07.1999.

20. Susuki, S. and Ohshima, S. 1974. Influence of shiitake Lentinus edodes on human serum cholesterol. Annual Report of National Institute of Nutrition 25, 89-94.

21. Alberts, A.W., MacDonald, J.S., Till, A.E. and Tobert, J.A. 1989.

Lovastatin. Cardiovascular DrugReviews 7, 89-109.

22. Gunde-Cimerman, N. and Cimerman, A. 1995. Pleurotus fruiting-bodies contain the inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase lovastatin. Experimental Mycology 19, 1-6.

ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ СОСТАВА ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА И ЕГО ИДЕНТИФИКАЦИЯ В.Н. Ташлицкий, Г.И. Кирьянов, В.Ю. Поляков, *С.В.Захаров, *В.П. Герасименя.

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Необходимость дополнительного выделения из состава сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 активного вещества обоснована, прежде всего, его очень малым природным содержанием в экстракте мицелия, колеблющимся, в зависимости от сезона культивирования мицелия, от 1,0 мг до 5,0 мг (от 0,001% до 0,005%) в 100,0 г экстракта, что явно недостаточно для проявления его полифункциональной медико-биологической активности в рекомендуемых для применения дозах экстракта в виде геля или сиропа (от 100 мг/кг до 200 мг/кг) [1].

Проведенные нами лабораторные испытания медико-биологи ческой активности очищенного вещества на крысах показали, что эффективная суточная доза его применения составляет 1,0 - 2,0 мкг [2].

Следовательно, если применять разработанный препарат без дополнительного обогащения фармакологической субстанции актив ным веществом, то не будет достигнут необходимый лечебный эффект при его применении в качестве препарата «сопровождения»

химиотерапии [3].

Для получения из сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 содержащегося в нем активного вещества и установления структуры этой молекулы, была разработана технология его выделения из 2000,0 г экстракта в виде геля [4], полученного из мицелия Pleurotus ostreatus 1137, культивируемого по разработанной нами технологии [5].

Для получения активного начала его обогащение из сгущен ного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 производили экстракцией хлористым метиленом следующим образом:

100 г препарата суспендировали в 500 мл дистиллированной воды, доводили при необходимости рН до 1,7 – 1,9 с помощью 1н H2SO4. Раствор центрифугировали 30 мин при 3000 об/мин. Осадок и флотирующие компоненты отбрасывали. Раствор переносили в стеклянную колбу вместимостью 2 л, добавляли 500 мл хлористого метилена и встряхивали на качалке 45 минут при комнатной температуре. Смесь разделяли при помощи центрифугирования ( мин при 3000 об/мин), отбирали нижнюю (органический растворитель) фазу. Водную фазу экстрагировали повторно:

переносили в колбу вместимостью 2 л, добавляли 500 мл хлористого метилена, встряхивали на качалке и центрифугировали. Экстракты объединяли и упаривали на роторном испарителе без нагревания.

Сухой остаток в колбе растворяли в 10 мл дистиллированной воды, переносили в стеклянные флаконы вместимостью 10 мл (по 1 мл на флакон), замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение ночи.

Обогащенный с помощью хлористого метилена экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде сухого остатка (100-200 мг) растворяли в 96% этаноле до концентрации 100 мг/мл. Полученный раствор (аликвоты по 400 мкл) разделяли хроматографически на полупрепаративной ВЭЖХ-системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500 мкл, колоночного термостата и делителя потока (1:10), УФ-детектора с переменной длиной волны и управляющей программы. Была использована полупрепаративная колонка 24*250мм с сорбентом Диасорб С16Т (10 мкм). Состав подвижной фазы: 96% этанол / 0.1% трифторуксусная кислота в воде 60:40, при скорости потока 10 мл/мин и температуре 30 0С. Время анализа - мин, детектирование при длине волны 230 нм, интересующий пик имеет время удерживания 20-25 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирали, добавляли 30% раствор аммиака до нейтрального значения рН 5-6 и упаривали на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляли равный объем хлористого метилена, экстрагировали и органический слой отделяли на делительной воронке.

Органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания и растворяли в 1 мл 96% этанола. Полученный раствор (аликвоты по 100 мкл) дополнительно разделяли с помощью аналитической ВЭЖХ на системе Agilent 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStation. Была использована аналитическая колонка 4,6*250мм с сорбентом Luna С 18(2) (5 мкм). Состав подвижной фазы: ацетонитрил / вода 79:21, при скорости потока 1 мл/мин и температуре 250С. Время анализа - 21 мин, детектирование при длине волны 230нм, интересующий пик имеет время удерживания 15-18 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирали и упаривали на роторном испарителе при температуре 45-550С на 2/ по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляли равный объем хлористого метилена, экстрагировали и органический слой отделяли на делительной воронке. Органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания, растворяли в 1 мл хлористого метилена и сушили в эксикаторе. Для наработки требуемого количества активного вещества технологический процесс многократно повторяли.

Общий выход вещества 4-hydroxy-17R-methylincisterol составил 10 мг.

Хроматограмма препарата, обогащенного дополнительной экстракцией хлористым метиленом, на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*150 мм (подвижная фаза: ацетонитрил / вода / 1% ТФУ в воде=79:16:5, скорость потока 1,5 мл/мин при 250С, детекция при 230 нм, время удерживания интересующего вещества 6 - 7 мин, время анализа 13 мин), приведена на рисунке 1.

Пример полупрепаративного разделения фракции (после препаративного ВЭЖХ) с использованием аналитической ВЭЖХ системы на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*250 мм (подвижная фаза: ацетонитрил / вода 79:21, скорость потока 1, мл/мин при 250С, УФ-детекция при 230 нм) приведен на рисунке (время удерживания вещества 16 мин).

Хроматограмма очищенного вещества на аналитической колонке Luna C18(2) (5мкм) 4,6*250 мм (подвижная фаза: ацетонитрил/вода 79:21, скорость потока 1,0 мл/мин при 25 0С, детекция при 230 нм) приведена на рисунке 3.

Молекулярный вес вещества был оценен методом UPLC/MS с использованием квадрупольного масс-спектрометра и электро спрей-ионизации. Молекулярная формула C21H32O3 была определена по точной массе методом времяпролетной масс-спектрометрии (TOF) с электроспрей-ионизацией. Результаты определения молеку лярного веса и брутто-формулы приведены на рисунках 4, 5, 6.

На рисунке 4 приведен масс-спектр в режиме регистрации позитивных ионов:

пик 356 представляет собой ион М+Na+(333+23(Na+)=356), пик 688 - это ион 2М+Na+(332.5*2+23=688.), пик 1021 - ион 3М+Na+(332.7*3+23=1021).

На рисунке 5 приведен масс-спектр в режиме регистрации негативных ионов: пик 331.38 соответствует молекулярному иону М Н- (масса 332.38), пик 663.97 является ионом 2М-Н- (332.5*2-1=664), пик 996 – ион 3М-Н- (332.33*3 -1=996), пик 1328 - ион 4М-Н- (332.25* -1=1328).

Таким образом, молекулярный вес составляет 332.25 - 333 ем.

На рисунке 6 приведено определение точной массы, которое проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (TOF).

355.2295 = С21 Н32 О3 Na+ (15ppm);

333.2452 = С21 НЗЗ О3+ (8ppm).

Проведенные с помощью программы Structure Elucida tor/ACDlabs (Канада) исследования позволили установить структуру вещества.

ЯМР спектр 13C содержит 21 сигнал атомов углерода. Число протонов, присоединенных к каждому атому, было определено комбинированием спектров 13C, 1H, APT и HMQC. Химические сдвиги и мультипликативность углеродных сигналов приведены в таблице 1.

Структура определялась комбинированием 13C, APT, HMQC, HMBC и COSY данных. Для определения относительной конфигурации оптически активных центров был использован спектр ROESY.

Программа генерирует набор структур, которые соответствуют исходным данным по химическим сдвигам и 2D корреляциям.

Спектр COSY содержит 27 однозначных корреляций, которые показаны на предложенной структуре в виде прерывистой линии (рисунок 7). Практически все теоретически возможные корреляции COSY присутствуют в спектре. Только корреляции между двумя парами атомов не были найдены в спектре - в основном из-за маскировки другими корреляциями с близким химическим сдвигом.

Например, корреляция между атомами 8 и 12 (1.49 - 1.88 ppm) очень близка по химическому сдвигу к корреляции между двумя протонами, присоединенными к атому 7 (1.48 - 1.92). Корреляция между атомами 7 и 15 (1.48 - 1.50 ppm) слишком близка к интенсивным диаго нальным пикам. Дополнительно на спектре присутствует одна корреляция между атомами 14 и 17, показанная на рисунке 7 в виде прерывистой линии с точками. Информация, полученная из спектра COSY, позволила однозначно установить скелет молекулы.

Циклическая часть молекулы содержит несколько четвертичных атомов углерода, которые не могут быть установлены с помощью спектра COSY. Поэтому для определения этой части молекулы использован спектр HMBC. Спектр HMBC содержит 85 корреляций (рисунок 8 и таблица 1). Все теоретически возможные корреляции (2J и 3J) были найдены в спектре HMBC. Дополнительно дальнодействующие корреляции (4J) присутствуют в спектре. Эти корреляции выделены на рисунке 8 в виде прерывистой линии с точками.

Установленная структура имеет самое лучшее соответствие с углеродным спектром (среднее отклонение между рассчитанными и экспериментальными значениями составляет 2.6 ppm).

Все вышесказанное позволяет утверждать, что структура препарата установлена однозначно.

Определение стереоконфигурации Е-конфигурация двойной связи была определена на основании константы спин-спинового взаимодействия (15.1 Hz). Для опреде ления относительной стереоконфигурации четырех стереоцентров циклической системы использовался спектр ROESY. Два стерео центра в боковой цепи не рассматривались (из-за наличия свободного вращения). Для всех возможных 16 (24) стереоизомеров были рассчитаны расстояния между атомами и сравнены с соответствующими дистанциями, определенными из объемов пиков спектра ROESY. Наиболее вероятная стереоконфигурация изомера приведена на рисунках 9, 10.

На рисунке 9 стереоцентры с неопределенной конфигурацией отмечены звездочкой.

На рисунке 10 показана 3D модель структуры с ключевыми корреляциями NOE.

Следует учесть, что описанный метод пригоден только для определения относительной стереоконфигурации и соединение может иметь зеркальную стереоконфигурацию. Тем не менее, данная конфигурация является предпочтительной, т.к. в общих частях совпадает с конфигурацией известных природных соеди нений.

Химические сдвиги 1H вещества показаны на рисунке 11.

Химические сдвиги 13C вещества показаны на рисунке 12.

На основании полученных результатов исследований нами было установлено, что выделенное из первичного экстракта вещество - производное стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol (инцистерол) является принципиально новым веществом, ранее не описанным для известных медицинских грибов.

В мировой литературе есть сообщение об обнаружении такого аналога стерола в морских губках [6].

Рисунок 1 - Хроматограмма исходного раствора (анализ экст ракта обогащенного повторной экстракцией хлористым метиленом на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*150 мм.

Рисунок 2 - Повторное выделение целевого вещества на аналитической колонке Luna С18(2) (5мкм) 4,6*250 мм после полу препаративного ВЭЖХ.

Рисунок 3 - Хроматограмма очищенного вещества производ-ного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol (аликвота 10мкл: ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C18(2) (5мкм) 4,6*250 мм Рисунок 4 - Результаты определения молекулярного веса методом UPLC/MS в режиме регистрации позитивных ионов производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.

Рисунок 5 - Результаты определения молекулярного веса методом UPLC/MS в режиме регистрации негативных ионов производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.

Рисунок 6 - Результаты определения точного молекулярного веса и брутто-формулы методом времяпролетной масс спектрометрии (TOF) производного стерола 4-hydroxy-17R methylincisterol.

Рисунок 7 - Однозначные корреляции предполагаемой струк туры, найденные в спектре COSY.

Рисунок 8 - Корреляции спектра HMBC, соответствующие предполагаемой структуре.

Рисунок 9 - Наиболее вероятная стереоконфигурация изомера производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol на основании спектра ROESY.

Рисунок 10 - 3D модель структуры 4-hydroxy-17R-methylincisterol с ключевыми корреляциями NOE.

Рисунок 11 - Химические сдвиги 1H производного стерола 4 hydroxy-17R-methylincisterol.

Рисунок 12 - Химические сдвиги C производного стерола 4 hydroxy-17R-methylincisterol.

Таблица 1 - Химические сдвиги и мультипликативность углерод ных сигналов производного стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol Atom C Shift H XHn COSY H HMBC C HMBC Shift 1 11.74 0.62 CH3 1.52, 1.65, 48.85, 50.37, 1.99, 2.67 55.34, 35. 2 17.61 0.94 CH3 1.88 1.49, 1.88, 42.84, 33.05, 5.27 132. 3 19.65 0.84 CH3 1.49 0.86 19.97, 33.05, 42. 4 19.97 0.86 CH3 1.49 0.84, 1.49, 42.84, 19.65, 1.88 33. 5 21.03 1.06 CH3 2.07 2.07, 5.19 134.66, 40.13, 55. 6 21.38 1.52 CH2 2.67, 2.67 28.86, 11.74, 1.92, 48.85, 50.37, 1.74 35.06, 40.13, 170. 1.74 CH2 2.67, 2.67 55.34, 48.85, 1.92, 50.37, 28. 1. 7 28.86 1.48 CH2 1.92 1.52, 1.65, 55.34, 40.13, 1.74 50. 1.92 CH2 1.74, 1.52, 1.65, 48.85, 55. 1.52, 1. 1. 8 33.05 1.49 CH 0.86, 0.84, 0.86, 17.61, 42.84, 0.84 0.94, 1.88, 19.97, 132. 5. 9 35.06 1.65 CH2 2.31, 0.62, 1.52, 48.85, 50.37, 1.99, 1.88, 2.31, 55.34, 11.74, 1.88 2.67 28.86, 35.25, 105. 1.99 CH2 2.31, 0.62, 1.52, 48.85, 50.37, 1.65, 1.88, 2.31, 11.74, 35.25, 1.88 2.67 105. 10 35.25 1.88 CH2 2.31, 1.65, 1.99 105.00, 35. 1.65, 1. 2.31 CH2 1.99, 1.65, 1.99 48.85, 105.00, 1.88, 170.75, 35. 1. 11 40.13 2.07 CH 1.50, 1.06, 1.48, 21.03, 55.34, 1.06, 1.52, 5.19, 132.85, 134. 5.19 5. 12 42.84 1.88 CH 0.94, 0.84, 0.86, 132.85, 134.66, 5.27 0.94, 1.49, 17.61, 19.97, 5.19, 5.27 33. 13 48.85 C 0.62, 1.50, 1.52, 1.65, 1.74, 1.92, 1.99, 2.31, 2. 14 50.37 2.67 CH 1.74, 0.62, 1.48, 21.38, 112.22, 1.52, 1.52, 1.65, 170.75, 11.74, 5.65 1.74, 1.99, 35.06, 48.85, 5.65 55.34, 105. 15 55.34 1.50 CH 2.07 0.62, 1.06, 48. 1.48, 1.65, 1.74, 1.92, 2.07, 2.67, 5. 16 105.00 C 1.65, 1.88, 1.99, 2.31, 2.67, 5. 17 112.22 5.65 CH 2.67 2.67 105.00, 50.37, 171.19, 170. 18 132.85 5.27 CH 5.19, 0.94, 1.49, 17.61, 33.05, 1.88 1.88, 2.07, 134.66, 40.13, 5.19 42. 19 134.66 5.19 CH 5.27, 1.06, 1.88, 21.03, 132.85, 2.07 2.07, 5.27 40.13, 42.84, 55. 20 170.75 C 1.52, 2.31, 2.67, 5. 21 171.19 C 5. Список литературы:

1. Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю.

Препарат с полифункциональной медико-биологической активно стью, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-819 для его получения». Патент РФ на изобретение № 2487930 от 19.06.2012 г. Бюл. № 20 от 20.07.2013 г.

2. Гиполипидемическая активность составляющих веществ препа рата «Гиповодин» на основе биологически активных веществ «Экстракта мицелия вешенки «Оводорин», разработанного ООО «Инбиофарм», г. Москва: отчет о НИР / Перова Н.В. -М.: АНО «ИМБИИТ», 2009. - 25 с.

3. Экспериментальное исследование in vivo противоопухолевой активно сти препаратов выделенных из мицелия грибов Pleurotus ostereatus : отчет о НИР / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 29 с.

4. Герасименя В.П., Захаров С.В. Кирьянов Г.И., Ташлицкий В.Н.

Препарат 4-hydroхy- 17R- methylincisterol, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus 1137 для его получения. Патент РФ на изобретение № 2435599 от 21.06.2010 г.

Бюл. № 34 от 10.12.2011 г.

Герасименя В.П. Инструкция описания технологического 5.

процесса культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) и получения из него экстракта биологически активных веществ: инструкция / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Л.П.

Семашева – М.: ООО «Инбиофарм», 2008. – 39 с.

6. Tayyab A. Mansoor, Jongki Hong, Chong-O. Lee, Song-Ja Bae, Kwang Sik Im, Jee H. Jung Cytotoxic Sterol Derivatives from a Marine Sponge Homaxinella sp. J. Nat. Prod. 2005, 68, 331-336.

ДЕЙСТВИЕ ИНЦИСТЕРОЛА НА ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК В.Ю. Поляков, Л.Н. Кинцурашвили, М.И.Мурашова, *С.В. Захаров, *В.П. Герасименя, Г.И. Кирьянов Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Для оценки индивидуального действия инцистерола (4-hydroxy 17R–methylincisterol) в среду культивирования (10 мл среды) добавляли по 100 мкл раствора инцистерола в этаноле в концентрации 10, 25, 50, 100, 200 и 500 мкг/мл. Таким образом, конечная концентрация инцистерола в культуральной среде составляла 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 мкг на мл среды. В качестве контроля использовали интактные клетки и клетки, инкубируемые в среде с добавлением 1% этанола, что соответствует содержанию этанола во всех остальных точках.

Контрольные и экспериментальные клетки инкубировали с препаратом в течение 8 часов, фиксировали параформальдегидом, окрашивали гематоксилином или флуорохромом Хехст и заключали в Мовиол по стандартной методике. Подсчет количества делящихся и апоптотических клеток проводили в микроскопе. В каждом препарате было проанализировано не менее 3000 клеток.

Полученные данные суммированы на рисунке 1.

Рисунок 1 - Действие инцистерола на пролиферацию и индук цию апоптоза в популяции трансформированных клеток HeLa.

Цифры 1 - 7 по оси «х» - данные для концентраций инцистерола в культуральной среде мкг/мл:

- 0;

0,1;

0,25;

0,5;

1,0;

2,0;

5,0 мкг/мл соответственно. На оси «у» - доля клеток (митотических и апоптотических) в процентах.

В популяции контрольных клеток HeLa (рисунок 1), наряду с активно пролиферирующими клетками, всегда присутствуют апоптотические клетки, количество которых может незначительно меняться в зависимости от штамма и времени культивирования (рисунок 2).

В условиях эксперимента, через 8 часов после инсталляции препарата, доля пролиферирующих и апоптотических клеток существенно не изменяется при концентрациях инцистерола от 0, до 1,0 мкг/мл (рисунок 1). В концентрации 2,0 мкг/мл препарат не влияет на пролиферацию, тогда как доля апоптотических клеток возрастает примерно в 3,5 раза по сравнению с контролем (рисунок 1). При концентрации инцистерола 5,0 мкг/мл доля делящихся клеток уменьшается примерно в 4 раза и одновременно резко (примерно в 20 раз) возрастает количество клеток, включивших программу апоптотической гибели (рисунки 1, 3).


Рисунок 2 - Популяция контрольных клеток HeLa.

Рисунок 3 - Популяция клеток HeLa в условиях эксперимента, через 8 часов после инсталляции препарата в дозе 5,0 мкг/мл.

ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИИ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ, ОБОГАЩЕННОЙ ИНЦИСТЕРОЛОМ, НА ЦИТОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ С.А. Голышев, Г.И. Кирьянов, Л.Н. Кинцурашвили, *С.В. Захаров, *В.П. Герасименя, В.Ю. Поляков Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Ранее [1,2] было показано, что мишенью апоптогенного дей ствия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 является рецептор зависимый («внешний») сигнальный путь, но не митохондриальный («внутренний») сигнальный путь.

В этом контексте фундаментальное значение имеет установ ление конкретных участников суперсемейства TNF-рецепторов в процессе индукции апоптоза и возможное привлечение других рецепторов, прямо или опосредованно участвующих в реализации программы «клеточной смерти».

В связи с тем, что домены TNF-рецепторов, связывающие разного рода лиганды-индукторы апоптоза, экспонированы на поверхности клеток, возникла идея о подавлении их активности с помощью сшивающего белки агента - глутарового альдегида.

Нами было показано, что обработка клеток низкими концентрациями глутарового альдегида приводит к модификации плазматических мембран, в результате чего клетки теряют способность адаптации к гипотонической среде и из цитоплазматического компартмента частично элиминируются ионы Ca2+.

Механизм взаимодействия глутарового альдегида с белками до конца не изучен, но, в целом, схему реакции можно представить в следующем виде:

1. -NH2+O=CH (CH2)3CH=O-N=CH (CH2)3CH=O;

2. -N=CH (CH2)3CH=O+NH2-белок-N=CH (CH2)3CH=N-белок.

Поскольку глутаровый альдегид, как «сшивающий» агент, не обладает ярко выраженной избирательностью по отношению к различным типам белков, логично допустить, что его ингибирующее действие может влиять на функционирование широкого спектра рецепторов, экспонированных на внешней поверхности клеток, в том числе и на рецепторы ионных каналов.

В любом случае, ответ клеток с модифицированными мембранами на действие лекарственных препаратов - агонистов апоптоза представляет большой теоретический и практический интерес.

Работа проводилась на трансформированных клетках (HeLa).

Клетки культивировались в среде ДМЕМ с добавлением эмбриональной сыворотки теленка и антимикотика (Sigma) в течение 3 дней, до стадии монослоя (фаза наибольшей метаболической активности клеток).

В качестве исследуемого реагента использовался препарат, обогащенный инцистеролом (фракция ХМ).

Инсталляция фракции, обогащенной инцистеролом, в среду культивирования трансформированных клеток с модифицированными плазматическими мембранами потен цирует апоптотгенное действие.

Для проверки действия глутарового альдегида как реагента, модифицирующего плазматические мембраны клеток HeLa, использован подход, ранее разработанный на модели клеток культуры ткани СПЭВ, адаптирующихся к гипотонической среде (Зацепина и др., 1982). По данным прижизненных наблюдений, первой реакцией клеток СПЭВ на гипотонический шок, вызванный 30% раствором Хенкса, является быстрая (1-2 мин) декомпак тизация митотических хромосом и сильное набухание интерфазных ядер. Через 10-15 мин начинается реконденсация хромосом, которая завершается на 25-30 минуте после начала воздействия. Через 1,5- часа хромосомы переходят в интерфазное состояние, что тестируется по формированию в цитоплазме делящихся клеток многочисленных микроядер, в которых восстанавливается репликация ДНК и транскрипция РНК (Киреев и др., 1988).

Клетки СПЭВ, обработанные глутаровым альдегидом, теряют способность к адаптации к гипотонической среде, в результате хромосомы в них не реконденсируются и, соответственно, не формируются микроядра. Логично предположить, что этот феномен прямо или косвенно связан с нарушением транспорта ионов Ca2+.

Действительно, по данным прямых измерений в модифици-рованных клетках концентрация Ca2+ остается резко пониженной по сравнению с контролем и не восстанавливается за все время наблюдений.

Быстрой реконденсации хромосом и образования микроядер в этом случае удается достигнуть добавлением к среде инкубации кальциевого ионофора А308. Таким образом, в использованной модельной системе (клетки СПЭВ) глутаровый альдегид модифицирует, по крайней мере, один из типов клеточных рецепторов, а именно ионные каналы.

Для клеток СПЭВ показано, что эффективная в отношении модифицирующего действия и нетоксичная концентрация глутаро вого альдегида составляет 0,001%. Именно в этих условиях глутаровый альдегид блокирует процесс адаптации клеток к условиям гипотоничной среды, но при этом не вызывает их гибели.

Предварительные эксперименты, проведенные на клетках HeLa, показали, что такая концентрация глутарового альдегида токсична для этого типа клеток.

Это потребовало проведения специальной работы по определению минимальной эффективной концентрации глутаро-вого альдегида, во-первых, не влияющей на жизнеспособность клеток и, во-вторых, блокирующей их адаптационный потенциал.

Для определения жизнеспособности клеток в условиях эксперимента использовали прижизненные наблюдения. Надежным показателем жизнеспособности клеток являются активные движения цитоплазматических органоидов, которые можно регистрировать методом цейтраферной съемки. В использованной модельной системе (клетки HeLa, растущие на полной среде с добавлением сыворотки) глутаровый альдегид в концентрации 0,001% вызывает остановку внутриклеточных движений, что принято интерпре тировать как свидетельство гибели клеток.

Отсутствия токсического действия глутарового альдегида удалось добиться при его концентрации 0,0001%. При этом наиболее достоверные и повторяющиеся результаты получены на клетках, растущих в среде без добавления сыворотки. С помощью прижизненных наблюдений показано, что в этих условиях полностью сохраняется подвижность цитоплазматических компонентов в течение как минимум 7,5 часов. Важно, что при этом после предварительного гипотонического шока наблюдается эффективное подавления формирования микроядер, что указывает на изменение осмотических свойств плазмалеммы. На основании этих данных для модификации плазматических мембран клеток HeLa в дальнейших экспериментах (а) использовался глутаровый альдегид в концен трации 0,0001% и (б) экспериментальные и контрольные клетки росли в среде без сыворотки.

В культивируемых клетках глутаровый альдегид потенцирует активность факторов апоптоза, присут ствующих в среде инкубации.

К клеткам, растущим в среде без сыворотки, добавляли глутаровый альдегид в концентрации 0,0001%. После инкубации в течение восьми часов клетки фиксировали параформальдегидом, окрашивали флуорохромом Хехст и заключали в мовиол. Для определения доли митотических и апоптотических клеток анализи ровали не менее 3000 клеток (рисунок 1).

Рисунок 1 - Действие глутарового альдегида на апоптоз и пролиферацию клеток HeLa в условиях эксперимента.

Приведенные на рисунке 1 полученные данные показывают, что глутаровый альдегид мало влияет на пролиферативную активность популяции и примерно в 4 раза увеличивает долю апоптотических клеток.

В культивируемых клетках фракция, обогащенная инцис теролом, потенцирует апоптогенное действие глутарового альдегида.

На основании полученных данных были поставлены экспе рименты по изучению сочетанного действия фракции, обогащенной инцистеролом, и глутарового альдегида. Эксперименты проводили по следующей схеме: клетки помещали в среду культивирования без сыворотки с добавлением 0,0001% глутарового альдегида и инкубировали в течение 30 минут, после чего вносили аликвоты тестируемого препарата. Конечные концентрации - 10, 25, 50, 100, и 500 мкг/мл, финальная концентрация растворителя (этилового спирта) в рабочем растворе составляла 1%. В присутствии реагентов клетки инкубировали в течение 7,5 часов. Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 - Действие фракции, обогащенной инцистеролом, на клетки HeLa в присутствии глутарового альдегида в условиях эксперимента.

Полученные результаты (рисунок 2) показывают, что после инсталляции фракции, обогащенной инцистеролом в концентрации 50 мкг/мл, резко возрастает митотический индекс. По данным морфологического анализа большинство митозов имеют различную степень патологии (трехполюсные митозы, отставание хромосом, хромосомные аберрации). По данным литературы такого рода нарушения являются характерными признаками гибели клеток по типу, называемому «митотической катастрофой».

При концентрации 100 мкг/мл фракция, обогащенная инцисте ролом, потенцирует апопоптогенное действие глутарового альдегида (количество апоптотических клеток возрастает примерно в 2 раза по сравнению с глутаровым альдегидом и в 10 раз по сравнению с контролем). Снижение митотического индекса при этой концентрации фракции, обогащенной инцистеролом, можно объяснить переходом клеток с признаками «митотической катастрофы» в апоптоз, что хорошо соответствует данным литературы.

Следует отметить два важных факта.

1. После модификации плазматических мембран фракция, обогащенная инцистеролом, проявляет митостатическую актив-ность уже при концентрации 50 мкг/мл, а апоптогенную активность - при концентрации 100 мкг/мл. В клетках с немодифицированными мембранами, обработанных фракцией, обогащенной инцистеро-лом, при аналогичных концентрациях обе активности препарата отсутствуют.


2. В условиях предобработки клеток глутаровым альдегидом фракция, обогащенная инцистеролом в концентрации 200 и мкг/мл, в отличие от не обработанных глутаровым альдегидом клеток, приводит к массовой гибели популяции, сопровождающейся появлением большого количества некротических клеток.

На основании проведенных экспериментов и данных ранее опубликованной работы (Amchenkova et al., 1998), можно заключить, что низкие концентрации глутарового альдегида в клетках СПЭВ и HeLa блокируют активность клеточных рецепторов, относящихся к группе ионных каналов. Судя по полученным в цитированной работе данным, одной из первых мишеней глутарового альдегида являются рецепторы кальциевых каналов, блокирование которых препятствует активному транспорту кальция через плазмалемму. Ясно, что это не исключает действия фракции, обогащенной инцистеролом, на другие типы клеточных рецепторов.

В опытах с клетками, мембраны которых модифицированы глутаровым альдегидом, ответ клеток зависит от использованной концентрации фракции, обогащенной инцистеролом. При концен трации 50 мкг/мл фракция, обогащенная инцистеролом, проявляет митотстатический эффект и при этом снижает количество апоптозов.

При концентрации 100 мкг/мл фракция, обогащенная инцистеролом, сильно увеличивает количество апоптозов, но не оказывает митостатического эффекта.

Одно из возможных объяснений такого концентрационно зависимого эффекта - наличие двух различных мишеней (клеточных рецепторов) для рекрутирования фракции, обогащенной инцистеролом, в частности, рецепторов группы TNF. Проверка этой гипотезы требует проведения дополнительных исследований. В любом случае, наблюдаемые эффекты, по-видимому, опосредо ваны негеномными механизмами.

Известно, что к числу патологий, индуцированных нарушением транспорта Ca2+, относятся гипертония и сердечная недоста точность. Ранее в наших экспериментах на модели крыс линии HSR было показано, что экстракт мицелия вешенки обладает выраженным антигипертензивным действием (статья в настоящем сборнике), что может быть опосредовано участием фракции, обогащенной инцистеролом, как лиганда для рецепторов ионных каналов.

Список литературы:

1. Изучение и установление механизма действия «Экстракта мицелия вешенки «Оводорин»: отчет о НИР / Поляков В.Ю., Кирьянов Г.И. – М.: ООО ИЛЦ «Универсал», 2009. - 49 с.

2. Поляков В.Ю. Синергизм действия экстракта мицелия гриба Pleurotus ostreatus и медицинских цитостатиков на пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток/ В.Ю. Поляков, Г. И. Кирьянов, В.П. Герасименя и др. // Журнал «Биологические мембраны». – 2007. –Том 24. №5. -С. 379-388.

ПРОВЕРКА ТОКСИЧНОСТИ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus Н.В. Перова, Г.А. Духина, *С.В. Захаров, *В.П. Герасименя.

Автономная некоммерческая организация «Институт медико биологических исследований и технологий», Москва, Россия;

*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Введение В эксперименте были задействованы две группы мышей по особей в каждой группе.

Исследования проводили на мышах обоего пола линии BA LB/C с массой ~ 40 г разведения питомника РАМН «Столбовая», в остром эксперименте для двух его однократных суточных доз 100 мг/ кг, мг/ кг при однократном внутрижелудочном способе введения препарата. Перед применением препарат растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды. Срок наблюдения составил 14 суток.

Состав препарата (100 мг однократной суточной дозы):

- 79,0 мг экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде геля (фармакологическая субстанцию препарата);

- 1,0 мг инцистерола (4-hydroxy-17R-methylincisterol);

- 10, 0 мг полисахарида 1-3 глюкана;

- 7,5 мг дигидрокверцетина.

В составе препарата (200 мг однократной суточной дозы) доза всех ингридиентов удвоена.

Критериями токсического действия исследуемых доз препарата служили: количество павших животных, сроки гибели животных, клиническая картина интоксикации, изменение массы тела в течение всего срока наблюдения, поведение животных, данные аутопсии.

Результаты токсического действия исследуемых доз препарата приведены в таблицах 1, 2.

В результате проведения указанной серии экспериментов установлено следующее:

- при однократном внутрижелудочном введении препарата в испытываемых дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг в обеих группах мышей внешних клинических проявлений не наблюдалось;

- внешний вид. В течение 14 суток наблюдения животных шерстяной покров гладкий. По внешнему виду животные между группами не отличались;

- у животных не отмечали ухудшения аппетита. Стул оформлен, обычного цвета;

- поведение. В течение наблюдения животных подавленности общего состояния животных не наблюдалось;

- смертность. Смертности, произошедшей от введения препарата, не выявлено на протяжении всего срока наблюдения (таблица 1);

- масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено два контрольных взвешивания. Резкой потери или увеличения массы не выявлено, однако в группе 2 замечено общее снижение массы тела на 1 г. (таблица 2);

- внутренние органы. При аутопсии мышей по окончании опыта (после14 суток наблюдения) макроскопические внутренние органы без патологии. По состоянию внутренних органов обеих групп мышей они не отличались друг от друга;

По результатам исследования токсического действия препарата установлено, что препарат в применяемых дозах (100 мг/кг и мг/кг) не проявляет токсических эффектов и, в соответствии с классификацией токсичности веществ, относятся к IV классу токсичности (малотоксичные вещества) [1-4].

Таблица 1 - Выживаемость мышей в эксперименте Таблица 2 - Масса тела мышей Изменение массы тела мышей Суточная № доза групп препарата До эксперимента После эксперимента 100 мг/кл 1 40,3 + 0,6 39,3 + 0, 200 мг/кг 2 40,5 + 0,4 39,0 + 2, Р Р 0,05 Р 0, Список литературы:

1. Трещалина Е.М. «Методические указания по изучению противо опухолевой активности фармакологических веществ»: книга «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ»/ Е.М. Трещалина, О.С. Жукова, Г.К. Герасимова, Н.В. Андронова, А.М. Гарин;

под ред. Р.У.Хабри ева), издание 2. -М.: «Медицина», 2005. -С. 637-651.

2. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М.: Медицина 1975.

3. Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств/ Т.А. Гуськова – М.: Издательский дом «Русский врач», 2003.

4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – М.: Изд. «Медицина», 2005.

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137 У ЖИВОТНЫХ НА МОДЕЛИ СОЛИДНОЙ ОПУХОЛИ МЕЛАНОМА В- С.В. Захаров, В.П. Герасименя, *В.Ю. Поляков, *Г.И. Кирьянов, Л.П.

Семашева, **К.З. Гумаргалиева ООО «Инбиофарм», Москва, Россия;

*Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

**Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия.

Исследования проводились на базе Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН (Москва) при участии ученых и специалистов ООО «Инбиофарм» (Москва), Научно-исследова тельского института физико-химической биологии им. А.Н. Бело зерского Московского государственного университета им. М.В. Ло моносова (г. Москва) и Института химической физики им. Н.Н.

Семенова РАН (Москва) под научным руководством доктора биологических наук, профессора Островской Л.А.

Материалы и методы При изучении противоопухолевой активности препарата у мышей на модели солидной опухоли меланома В-16 были прове дены четыре серии экспериментов.

В первой серии экспериментов исследовалась противо опухолевая активность детоксикационного препарата в виде геля и сиропа и его составных частей на модели солидной опухоли меланома В-16.

Эксперименты проведены на инбредных мышах BDF 1 - гибриды первого поколения f1(C57Bl6 x DBA2) из питомника РАМН «Столбовая». В опытах использовано 100 мышей, самцов с массой тела 18–20 г.

В качестве опухолевой тест-системы служила перевиваемая солидная опухоль животных меланома В-16. Опухоль перевивалась в соответствии со стандартным регламентом под кожу правого бока мышей измельченными фрагментами опухолевой ткани, содержа щимися в 0,3 мл физиологического раствора хлористого натрия [1].

В первой серии эксперимента подвергались испытанию 5 групп мышей (по 8 мышей в каждой группе) [2].

Во второй третьей и четвертой сериях эксперимента подвергались испытанию по 3 группы мышей (по 8 мышей в каждой группе) [3].

Ежедневно во всех группах четырех серий эксперимента проводили осмотр животных для оценки наличия и степени выраженности опухоли (визуально и пальпаторно), а также признаков возможной интоксикации. Фиксировали: среднюю массу опухоли (г);

торможение роста опухоли (ТРО) (в %);

среднюю продолжительность жизни животных (сутки);

увеличение средней продолжительности жизни животных экспериментальных групп относительно продолжительности жизни животных контрольной группы (в %).

Наблюдение за животными продолжалось в течение всего периода развития опухоли вплоть до гибели животных.

Статистическая обработка данных проведена с использованием пакета компьютерных программ «Statistica 6.0». Оценка достоверности различий между средними значениями, характеризующими массу опухоли в группах контрольных и леченных животных, проведена с помощью t-критерия Стьюдента.

Различия между леченными и контрольными группами животных признаются достоверными при условии, что вычисленные значения t превышают значения критерия Стьюдента для определённых уровней значимости при заданном числе степеней свободы f [4].

Результаты экспериментов представлены в виде кинетических кривых, каждая точка которых соответствует данным, полученным от 6 животных.

Основные результаты исследований Результаты исследований четырех серий экспериментов приведены в таблицах 1 - 4 и на рисунках 1 - 9.

При анализе представленных в табл. 1 и показанных на рис. 1 8 данных динамики изменения контролируемых показателей противоопухолевой активности веществ установлена зависимость их активности от типа применяемого состава. Из изученных четырех составов индивидуального применения препарата наибольшее торможение роста опухоли вызвали варианты препарата в виде геля (4-я группа) и сиропа (5-я группа), которое соответственно на 21-е сутки после перевивки мышам опухоли составили 61% и 55%.

При этом средний объем опухоли у мышей этих групп, по сравнению с интактным контролем (1-я группа), на 21-е сутки уменьшился соответственно в 2,9 и 2,5 раза.

Средняя продолжительность жизни животных, принимавших препарат увеличилась по сравнению с группой интактного конт-роля, соответственно на 117% и 109,5% и значительно превос-ходила среднюю продолжительность жизни животных, применяя-вших фармакологическую субстанцию препарата (2-я группа) или его активное начало (3-я группа).

Для наглядной оценки противоопухолевого эффекта препарата в виде геля и сиропа на всем протяжении рост-ингибирующего эффекта опухоли меланома В-16 полученные данные представлены в виде зависимостей, характеризующих динамику изменения размеров опухоли у леченых животных в процентах по отношению к контролю (показатель Т/С %, см. рисунки 4, 7).

Приведенные на этих рисунках зависимости подтверждают эффективность торможения роста опухоли на протяжении наблю даемого периода ее развития, которые по выраженности и характеру противоопухолевого действия имеют свою индивидуальность.

Установлено, что спустя 11 суток после окончания курса терапии препарат в виде геля или сиропа оказывает устойчивое противо опухолевое действие, сохраняющееся на уровне 55-60%.

После исследования противоопухолевой активности препарата у животных после их гибели (на 43 сутки перевивки опухоли) извлекалась оставшаяся часть опухоли, и проводились гистоло гические исследования. В результате проведенных исследований было установлено, что у леченой опухоли нет четко выраженной зональности. Под поперечнополосатой мускулатурой присутствуют множественные очаги некротической гибели клеток. Под слоем мышечных волокон располагаются сосуды с клетками крови и многочисленные апоптотические клетки.

Многочисленные мелкие сосуды пронизывают опухоль, для клеток которой характерна базофилия, ядра гетерогенны по размеру и форме. В опухоли присутствуют многочисленные меланоциты с гранулами. Обширные очаги некроза проникают вглубь опухоли. В составе опухоли на границе лейкоцитарного вала, часто в отдельных лакунах выявляются апоптотические клетки с характерными выростами мембран и гетеропикнотичными ядрами. Зоны некроза окружены лейкоцитарным валом (воспаление) из лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов.

Таким образом, в результате индивидуального применения препарата в первые 1-10 суток после перевивки мышам солидной опухоли меланома В-16 сделано заключение о том, что оставшаяся после лечения часть опухоли пронизана многочисленными очагами некротической и апоптотической гибели клеток. Опухоль активно разрушается.

При анализе представленных в таблицах 2 - 4 и показанных на рис. 9 данных динамики изменения контролируемых показателей противоопухолевой активности исследуемых фармакологической субстанции и активного вещества 4-hydroxy-17R–methylincisterol (таблицы 2, 3), а также непосредственно разработанного препарата в виде сиропа (таблица 4, рисунок 9) при их сочетанном примене-нии с ЦФ установлена зависимость активности от применяемого состава.

В результате проведенной серии экспериментов показано, что совместное применение исследуемых составов веществ и ЦФ вызывает глубокое торможение роста опухоли меланома В-16, изменяющееся в пределах от 70% до 96%, по сравнению с нелеченным интактным контролем мышей.

При этом средний объем опухоли у мышей этих групп по сравнению с интактным контролем (1-я группа) уменьшился практически на всем протяжении при испытании фармакологической субстанции с ЦФ в 14,3 раз (таблица 2), при испытании активного вещества 4-hydroxy-17R–methylincisterol препарата с ЦФ в 3,75 раза (таблица 3) при испытании препарата в виде сиропа с ЦФ в 23 раза (таблица 4, рисунок.9).

Обобщая результаты изучения эффективности сочетанного комбинированного применения препарата в виде сиропа в дозе 100 мг/кг в течение первых 1…10 суток и ЦФ в дозе 50 мг/кг однократно, в первые сутки после перепрививки опухоли, можно сделать вывод, что такая схема практически приводит к полному ингибированию роста опухоли по сравнению с интактным неле ченным контролем, не оказывая при этом отрицательного влияния на противоопухолевый эффект цитостатика.

Более того, необходимо подчеркнуть, что обладая деток сицирующим действием, разработанный препарат существенным образом улучшает клиническую картину «качества жизни» животных (активность, внешний вид, состояние шерсти, поведенческие реакции, масса тела, отсутствие диареи) по сравнению с животными, получавшими только циклофосфан, а также по сравнению с нелеченными мышами интактного контроля.

Таблица 1 - Результаты оценки противоопухолевой активности заявляемого препарата в виде геля и сиропа и его составных частей на модели солидной опухоли меланома В- Увеличение Средняя средней Средний продолжи Суточная продолжи № Характер объём тельность доза ТРО тельности групп групп опухоли жизни (мг/кг) (%) жизни (см ) животных животных (сутки) (%) 1 Интактный - 8,6±1,6* - 19,6±1,6 контроль 2 Фармаколо- 100 5,4±1,6* 36 21,2±3,7 гическая на субстанция 13 сут препарата 3 Активное 2 4,5±0,55* 20 25,0±0,9 начало на препарата 18 сут 4 Препарат в 100 3,0±1,9* 61 43,0±2,1 виде геля на 21 сут 5 Препарат в 75 3,5±1,8* 55 41,5±2,8 109, виде сиропа на 21 сут Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 20-е сутки после перевивки опухоли.

Таблица 2 - Результаты оценки противоопухолевой активности сочетанного применения фармакологической субстанции препарата в виде геля и циклофосфана на модели солидной опухоли меланома В-16 (вторая серия экспериментов) Увеличение Средняя средней Средний продолжи Суточная продолжи № объём тельность Характер групп доза ТРО тельности групп опухоли жизни (мг/кг) (%) жизни (см ) животных животных (сутки) (%) Интактный - 8,6±1,6* - 19,6±1,6 контроль 0,3±0,02 на ЦФ 100 29,7±2,9 * сут Фармаколо гическая 100 + 0,6±0,02 на субстанция 30,2±3,0 100 * препарата в сут виде геля + ЦФ Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 20-е сутки после перевивки опухоли.

Таблица 3 - Результаты оценки противоопухолевой активности сочетанного применения активного вещества производного стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol препарата в виде геля и цикло фосфана на модели солидной опухоли меланома В-16 (третья серия экспериментов) Увеличение Средняя средней Средний продолжи Суточная продолжи № объём тельность Характер групп доза ТРО тельности групп опухоли жизни (мг/кг) (%) жизни (см ) животных животных (сутки) (%) 1 Интактный - 6,0±2,8* - 26,8±2,7 контроль ЦФ 2 на 100 1,6±0,2* 34,8±3,0 сут 3 Активное начало на 2 + 50 1,8±0,9* 36,4±4,5 препарата + ЦФ сут Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 21-е сутки после перевивки опухоли.

Таблица 4 - Результаты оценки противоопухолевой активности сочетанного применения препарата в виде сиропа и циклофосфана на модели солидной опухоли меланома В-16 (четвертая серия экспериментов) Увеличение Средняя средней Средний продолжи Суточная продолжи № объём тельность Характер групп доза ТРО тельности групп опухоли жизни (мг/кг) (%) жизни (см ) животных животных (сутки) (%) 1 Интактный - 4,6±1,6* - 19,8±1,6 контроль 0,1±0,02 на ЦФ 50 22,7±6,2 * сут Препарат в 0,2±0,01 на виде сиропа 100 + 50 22,4±6,3 * + ЦФ сут Примечание: *оценка торможения роста опухоли (ТРО) - на 20-е сутки после перевивки опухоли.

Рисунок 1 - Результаты противоопухолевой активности фарма кологической субстанции препарата в виде геля на модели солидной опухоли меланома В- 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 с введением фармако логической субстанции препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 2 - Результаты противоопухолевой активности актив ного вещества производного стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol препарата на модели солидной опухоли меланома В- 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением активного начала производного стерола 4-hydroxy-17R–methylincisterol в дозе 2 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 3 - Результаты противоопухолевой активности препа рата в виде геля на модели солидной опухоли меланома В- 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 4 - Результаты ингибирования роста солидной опухоли меланома В-16 у мышей под влиянием введенного препарата в виде геля 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.



Pages:     | 1 | 2 || 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.