авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

«ЭКСТРАКТЫ МИЦЕЛИЯ ВЕШЕНКИ (Pleurotus ostreatus): МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ Под редакцией: ...»

-- [ Страница 4 ] --

Рисунок 5 - Диаграмма выживаемости мышей с солидной опухолью меланома В-16 у мышей, получивших препарат в виде геля 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде геля в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 6 - Результаты противоопухолевой активности препа рата в виде сиропа на модели солидной опухоли меланома В- 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде сиропа в дозе 75 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 7 - Результаты ингибирования роста солидной опухоли меланома В-16 у мышей под влиянием введенного препарата в виде сиропа 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде сиропа в дозе 75 мг/кг, перорально, десятикратно ежедневно в течение 1…10 суток.

Рисунок 8 - Диаграмма выживаемости мышей с солидной опухолью меланома В-16 у мышей, получивших препарат в виде сиропа 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 и с введением препарата в виде сиропа в дозе 75 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.

Рисунок 9 - Результаты противоопухолевой активности сочетан ного применения препарата в виде сиропа и циклофосфана на модели солидной опухоли меланома В-16 (4-я серия экспериментов) 1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16;

2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 с введением ЦФ в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки;

3 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной солидной опухолью меланома В-16 с введением сочетанного применения ЦФ в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки и препарата в виде сиропа в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1...10 суток.

Список литературы:

1. Трещалина Е.М. «Методические указания по изучению противо опухолевой активности фармакологических веществ»: книга «Руко водство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ»/ Е.М. Трещалина, О.С. Жукова, Г.К.

Герасимова, Н.В. Андронова, А.М. Гарин;

под ред. Р.У.Хабриев), издание 2. -М. : «Медицина», 2005. С. 637-651.

2. Экспериментальное исследование противоопухолевой активно сти препаратов мицелия вешенки: отчет о НИР / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 25с.

3.Экспериментальное исследование in vivo противоопухолевой активности препаратов выделенных из мицелия грибов Pleurotus ostreatus: отчет о НИР / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 29с.

4. Бейли Н. «Статистические методы в биологии»// М., Изда тельство иностранной литературы, 1962, -251 с.

ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИЙ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus 1137, ОБОГАЩЕННЫХ ИНЦИСТЕРОЛОМ, НА ПРОГРЕССИЮ ДИСЛИПИДЕМИИ, ИНДУЦИРОВАННУЮ АТЕРОГЕННОЙ ДИЕТОЙ С.В. Захаров, * Н.В. Перова, В.П. Герасименя, **В.Ю. Поляков, **Г.И. Кирьянов, *Г.А. Духина, Л.П. Семашева, *** К.З. Гумаргалиева.

ООО «Инбиофарм», Москва, Россия;

*Автономная некоммерческая организация «Институт медико-биологических исследований и технологий», Москва, Россия;

* *Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия;

***Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия.

Среди основных причин смертности взрослого населения экономически развитых стран мира в настоящее время уверенно лидируют сердечно-сосудистые заболевания. В современной России они составляют около 57 % от общей смертности. Самыми распрос траненными причинами сердечно-сосудистых заболеваний являются высокие показатели артериального давления (гипертензия) и аномально повышенный уровень липидов (в частности, холестерина) и/или липопротеинов в крови (гиперлипидемия).

В настоящее время наиболее эффективными лекарственными препаратами, снижающими уровень «плохого» холестерина и, соответственно, вероятность сосудистых заболеваний, являются статины. Статины оказывают ингибирующее воздействие на З – гидрокси-3-метил-глютарил-коэнзим А(ГМГ-КоА)-редуктазу фермент, катализирующий начальную стадию биосинтеза холестерина. В связи с тем, что конверсия ГМГ-КоА в мевалонат представляет собой ранний этап биосинтеза холестерина, считается, что применение статинов не должно вызывать накопления в организме потенциально токсичных стеролов. Тем не менее, одним из основных противопоказаний к применению статинов являются заболевания печени. В связи с этим, представляется актуальным поиск новых лекарственных препаратов, которые нормализуют липидный обмен и при этом не обладают токсическим действием на клетки печени.

Большой терапевтический потенциал для коррекции сердечно сосудистой патологии имеют вещества, выделенные из плодовых тел медицинских грибов - полисахариды, в том числе, -глюканы, и тритерпеновые кислоты, которые обладают иммуномодулирующими свойствами. Медицинские грибы являются одним из природных источников антигиперлипидемических средств. По мнению ряда авторов, все известные медицинские грибы и, в особенности, Pleurotus, Lentinus and Grifola, широко использующиеся в традиционной китайской медицине и отличающиеся высоким содержанием клетчатки, стеролов, белков, микроэлементов и низкой калорийностью, представляют собой идеальную диету для предотвращения сердечно сосудистых заболеваний (Breene, 1990;

Hobbs, 1995).

Ранее на модели экспериментального неалкогольного стеатогепатита нами было изучено гепатопротекторное действие лекарственного препарата (инцистерола), полученного на основе водно-этанольного экстракта мицелия гриба вешенки [1,2,3].

Показано, что развитие деструктивных изменений печени, вызванных атерогенной диетой, блокируется как на уровне общей организации печени, так и на клеточном уровне. Важно, что при этом биохимические пробы указали на тенденцию к нормализации показателей липидного обмена в крови подопытных животных.

В настоящей работе проведено детальное исследование действия инцистерола и других фракций экстракта на дислипидемию у крыс, вызванную атерогенной диетой.

Эксперименты выполняли на белых беспородных лабораторных половозрелых крысах (самцах) с исходной массой тела 300 - граммов, полученных из питомника лабораторных животных ФГУП ОПХ «Манихино» 10 марта 2009г., вет. свидетельство № 0010101.

Животных содержали в пластиковых клетках на стандартном рационе (комбикорм, свежие овощи, запаренные крупы, молоко, вареное мясо) в условиях свободного доступа к воде и корму.

Освещение вивария искусственное: 12 ч - свет, 12 ч - темнота.

Температуру воздуха поддерживали в пределах 18 - 22°C, относи тельную влажность 50 - 65%.

В опыте животные были разбиты на три группы.

1 группа - контроль.

2 группа - атерогенная диета. Атерогенную диету создавали, вводя животным 10% суспензии холестерина на рафинированном растительном масле с добавлением пропилтиоурацила (из расчета мг/кг живой массы) для подавления функции щитовидной железы.

Суспензию вводили натощак перорально 1 раз в день, ежедневно в течение 14 дней.

3 группа - экспериментальные животные. На фоне атерогенной диеты животные получали препараты хроматографически очищенных фракций экстракта мицелия вешенки Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F–819).

Для подавления синтеза эндогенного холестерина исполь зовался Зокор (симвастатин) («Мерк Шарп и Доум Б.В.»), Нидер ланды, серия NJ41170.

Препараты вводили животным перорально с интервалом 3 часа после атерогенной нагрузки в течение последних 10 дней атеро генной диеты.

В течение всего эксперимента следили за выживаемостью, общим видом, состоянием и поведением животных, фиксировали изменение массы тела (взвешивание крыс проводили один раз в неделю).

Биохимические анализы Кровь у контрольных и экспериментальных животных забирали методом декапитации.

В эксперименте по реабилитации анализ проводили на индивидуальных животных: сразу после прекращения действия фракций испытываемого препарата кровь забирали из хвостовой вены, по окончании эксперимента – методом декапитации.

Кровь центрифугировали и полученную сыворотку исполь зовали для проведения биохимических анализов. Анализы проводились унифицированными методами на биохимическом фотометре «Стат факс 1904+», производства США с исполь зованием стандартных наборов реагентов.

Общий холестерин. Определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ХОЛЕСТЕРИН CHOL FS» (DiaSys) ферментативным фотометрическим методом.

Холестерин липопротеинов высокой плотности. Определение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ХОЛЕСТЕРИН ЛПВП ФС» (Диакон-ДС) ферментативным фотометрическим методом при длине волны 500 (480 – 520) нм.

Триглицериды. Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ТРИГЛИЦЕРИДЫ ФС» (Диакон-ДС) фотометрическим методом при длине волны 500 (480 – 520) нм.

Холестерин липопротеидов низкой и очень низкой плотности.

Зная количество холестерина ЛПВП, холестерин ЛПНП можно определить по схеме, основанной на формуле Фридвальда:

ЛПНП (ммоль/л) = ХС (ммоль/л) – ТГ (ммоль/л)/2,2 – ЛПВП (ммоль/л).

Содержание холестерина ЛПОНП рассчитывали по формуле:

ЛПОНП (ммоль/л) = ТГ(ммоль/л)/5.

На основании результатов анализа вычисляли индекс атерогенности, равный разности содержания общего холестерина (ХС) и холестерина в липопротеинах высокой плотности (ХС ЛПВП), отнесенной к содержанию ХС ЛПВП (индекс атерогенности = (ХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП).

К (атер.,у.е.) = (ХС – ЛПВП)/ЛПВП.

Аланинаминотрансфераза. Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗА ФС ДДС»

фирмы «ЮНИ-ТЕСТ» кинетическим методом при длине волны нм.

Щелочная фосфатаза. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА ФС ДДС (ЮНИ-ТЕСТ) кинетическим методом при длине волны 405 нм.

Общий билирубин. Определение содержания билирубина в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «Билирубин ДДС» (ЗАО ДИАКОН-ДС) количественным методом.

Общий белок. Определение содержания общего белка в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ОБЩИЙ БЕЛОК ФС» (ЗАО ДИАКОН-ДС) количественным методом.

Глюкоза. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «Глюкоза ФС» (ЗАО ДИАКОН-ДС) количественным методом.

Световая и электронная микроскопия Для гистологического и ультраструктурного анализа небольшой фрагмент печени отделяли ножницами, переносили в 4% р-р глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере Зеренсена.

Фрагмент разрезали бритвенным лезвием на кусочки объемом около 1 мм3, полученные образцы переносили в свежую фиксирующую смесь того же состава. Фиксацию проводили при комнатной температуре в течение 4-х часов. Затем образцы промывали в дистиллированной воде и постфиксировали 1% водным раствором тетроксида осмия в течение 12 часов при +4 С. Образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (70% этанол содержал 2% уранилацетата), ацетоне и заключали в эпоксидную смолу по стандартной методике.

Для гистологического анализа с помощью ультрамикротома Ultracut E (Reicher Jung) изготавливали «полутонкие» срезы толщиной около 1 мкм, окрашивали срезы метиленовым синим и изучали с помощью светового микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss) с использованием объективов 10 и 100.

Для электронной микроскопии получали ультратонкие срезы толщиной около 80 нм, контрастировали их 1%-ным водным раствором уранилацетата 20 минут и цитратом свинца и фотографировали в электронном микроскопе Hitachi H-700 (Япония).

Патоморфологические исследования После окончания эксперимента с помощью передозировки наркоза проводили эвтаназию для патоморфологических исследований внутренних органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патолого анатомической схеме. Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов AJ-CE/AJH-CE фирмы “Shinko Denshi CO.Ltd”, Япония с последующим вычислением массы печени, отношения массы печени к массе тела и их стандар тных отклонений.

Статистический анализ.

Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

Достоверным считали различие данных групп при р0,05.

Результаты исследования Характеристика фракций экстракта мицелия вешенки:

1. Ф1 - фракция без инцистерола;

2. Ф2 - фракция инцистерол;

3. ФС - суммарная фракция Ф1 + Ф2 (фракция ХМ );

4. (ЭМВ сироп +Г) - «ОВОДОРИН» сироп + 1-3 глюкан;

5. ФС 2 - фракция ХМ 2 мкг;

6. ФС 4 - фракция ХМ 4 мкг;

7. ГВ - очищенный от инцистерола экстракт ЭМВ в виде геля;

8. ЭМВ - суммарный экстракт ЭМВ в виде геля («ОВОДОРИН»);

9. ФС +Г - фракция ХМ + 1-3 глюкан.

Атерогенная диета индуцирует дислипидемию у подопытных животных.

В таблице 1 и на рисунке 1 представлены результаты действия атерогенной диеты на обмен холестерина и ЛП в крови эксперимен тальных животных.

Таблица 1 - Результаты действия атерогенной диеты на обмен холестерина и ЛП в крови экспериментальных животных Показатели (М m) Группа ХС общ. ТГ ХС ЛПВП ХС ЛПНП ХС индекс животных ЛПОНП атер.

Ммоль/л У.е.

Контроль 2,0 0,11 1,0 0,09 0,7 0,01 0,8 0,09 0,5 0,04 1,8 0, *** ** *** *** *** ** АД 3,0 0,18 0,7 0,06 3,7 0, 1,5 0,12 0,6 0,01 1,6 0, *, **, *** - достоверные отличия по отношению к интактному контролю Рисунок 1 - Действие атерогенной диеты на метаболизм липидов (Опыт 3).

Анализ полученных данных (таблица 1, рисунок 1) показывает, что в группе животных, находившихся на атерогенной диете, по отношению к контролю наблюдаются достоверное повышение содержания общего холестерина, триглицеридов и липопротеинов низкой и очень низкой плотности. При этом снижается уровень липопротеинов высокой плотности (Рисунок 1). В результате, у экспериментальных животных резко (примерно в 2 раза) возрастает индекс атерогенности (Рисунок 1).

Таким образом, использованная методика атерогенной диеты вызывает выраженую дислипидемию у крыс.

Эффективность антиатерогенного действия различных фракций ЭМВ существенно различается В таблице 2 суммированы данные трех экспериментов по анализу действия различных фракций ЭМВ на прогрессию дислипидимии, индуцированную атерогенной диетой. Исследованные вещества можно разделить на 2 группы. Фракции, обедненные инцистеролом (Ф1, ГВ) и фракции, содержащие инцистерол в различных количествах, в том числе обогащенная инцистеролом фракция (Ф2). Полученные данные показывают, что все фракции снижают долю общего холестерина и атерогенных липопротеинов (аЛП) (таблица 2).

Таблица 2 - Средние показатели липидногой обмена контроль ных и экспериментальных животных Показатели (М m) Группа ХС ХС ХС ХС индекс животных общ. ТГ ЛПВП ЛПНП ЛПОНП атер.

Ммоль/л У.е.

2,0 0,11 1,0 0,09 0,7 0,01 0,8 0,09 0,5 0,04 1,8 0, 2,0 0,17 0,9 0,08 0,7 0,04 0,9 0,16 0,4 0,04 1,8 0, Контроль -------- -------- ------- ------- ------- ------- *** *** ** ** 2,9 0,23 1,2 0,07 0,6 0,02 1,8 0,25 0,5 0,03 3,7 0, АД *** *** *** ** ** *** 3,0 0,18 1,5 0,12 0,6 0,01 1,6 0,17 0,7 0,06 3,7 0, 2,8 0,20 0,7 0,06 0,6 0,1 1,9 0,21 0,3 0,02 3,4 0, # ## ## # ## ## 2,1 0,11 0,9 0,06 0,7 0,01 1,1 0,13 0,4 0,03 2,1 0, АД+ФС -------- --------- ------- -------- ------- ------ 2 мкг/кг * *** * ** 2,3 0,14 0,7 0,05 0,8 0,03 1,2 0,12 0,3 0,02 1,9 0, # ## ## ## ## АД+Ф1 2,3 0,15 0,9 0,05 0,7 0,01 1,2 0,17 0,4 0,03 2,2 0, 2 мкг/г ------ -------- ------- ------- -------- ------- ------- ------- ------- ------- -------- ------- ## ## ## ## АД+Ф2 2,2 0,39 0,8 0,08 0,7 0,01 1,1 0,38 0,4 0,04 1,9 0, 2 мкг/г ------- ------- ------- -------- -------- ------ -------- ------- ------- -------- ------- ------ * ### ## * ### # 2,2 0,30 0,8 0,05 0,7 0,01 1,2 0,29 0,4 0,02 2,3 0, АД+ЭМВ сироп ## ### ### ## ### ## 4 мл/кг 2,2 0,12 0,8 0,04 0,7 0,02 1,1 0,12 0,4 2,3 0, ------- ------- -------- ------- ------- ------- *# * ### ## ** ** ### * ## 2,3 0,07 0,7 0,06 0,7 0,02 1,3 0,06 0,3 0,02 2,3 0, АД+(ЭМВ+Г) сироп ------- ------- ------- ------- ------- ------- 4мл/кг ------- ------- ------- ------- ------- ------ -------- -------- -------- -------- -------- ------- АД+ФС 2 ### ## ### ### ## ### 2мкг/г 2,0 0,16 1,1 0,13 0,7 0,01 0,8 0,16 0,5 0,06 2,0 0, ------- ------- ------- ------- ------- ------- -------- ------- -------- -------- -------- ------- # ## ### ## ## ### АД+ФС 2,3 0,15 1,2 0,15 0,7 0,01 1,0 0,12 0,5 0,07 2,2 0, 4мкг/г ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- # ### ### ## ### ## АД+ГВ 2,3 0,12 0,8 0,08 0,7 0,01 1,2 0,09 0,4 0,04 2,4 0, 50мг/кг ------- ------- ------- ------- ------- ------- -------- -------- -------- ------- -------- ------- ## ### ### ## * ## АД+ЭМВ 2,4 0,09 0,9 0,10 0,7 0,01 1,3 0,12 0,4 0,04 2,5 0, 50мг/кг ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- ------- АД+ФС +Г ** ## ** ### **### * ## ** ### ** ### 2мкг/мл+20мкг/мл 2,2±0,23 0,5±0,03 0,7±0,02 1,2±0,14 0,2±0,01 2,0±0, Верхние строки в ячейках - опыт №2, средние - №3, нижние - №4;

*, **, *** - достоверные отличия по отношению к интактному контролю при уровне достоверности 0,05, 0,01 и 0, соответственно;

#, ##, ### - достоверные отличия по отношению к группе с атерогенной диетой при уровне достоверности 0,05, 0,01 и 0, соответственно;

-------- - данные отсутствуют.

Эффективность действия различных фракций ЭМВ на обмен липидов хорошо иллюстрируется обобщающим показателем, кото рый называют «индексом атерогенности» (рисунок 2). По этому показателю наибольшую эффективность показывают фракции, содержащие в своем составе инцистерол (ФС 2 и ФС +г) и фракция, обогащенная инцистеролом (Ф2), (рисунок 2).

Рисунок 2 - Индекс атерогенности исследуемых препаратов Зокор, детоксикационного препарата и его составляющих веществ на фоне атерогенной диеты.

Именно эти фракции были отобраны для дальнейшего анализа.

В графическом виде конкретные показатели метаболизма холестерина и липопротеинов при совместном действии атерогенной диеты и фракций Ф2, ФС2 и ФС+г приведены на рисунках 3 - 9.

Рисунок 3 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на липидный обмен на фоне атерогенной диеты.

Рисунок 4 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на липидный обмен на фоне атерогеннной диеты.

Рисунок 5 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных общего холестерина на фоне атерогеннной диеты.

Рисунок 6 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных триглицеридов на фоне атерогеннной диеты.

Рисунок 7 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПНП на фоне атерогеннной диеты.

Рисунок 8 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПОНП на фоне атерогеннной диеты.

Рисунок 9 - Действие фракций экстракта мицелия вешенки на содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПВП на фоне атерогеннной диеты.

Как видно, их действие на фоне АД существенно снижает долю общего холестерина (рисунок 5). При этом наблюдается снижение уровня триглицеридов (ТГ) (рисунок 6), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (рисунок 7) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) (рисунок 8). Повышается доля липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (рисунок 9).

На фоне атерогенной диеты Зокор существенно изменяет соотношение различных фракций липопротеинов (таблица 3).

Таблица 3 - Действие препарата Зокор на липидный обмен на фоне атерогеннной диеты Показатели (М m) Группа ХС ХС ХС индекс животных ХС общ. ТГ ЛПНП ЛПВП ЛПОНП атер.

Ммоль/л У.е.

2,0 0,17 0,9 0,08 0,7 0,04 0,9 0,16 0,4 0,04 1,8 0, Контроль *** *** *** ** ** *** АД 3,0 0,18 1,5 0,12 0,6 0,01 1,6 0,17 0,7 0,06 3,7 0, * ### ## * ### * АД+Зокор 2,6 0,14 0,9 0,06 0,7 0,01 1,5 0,15 *0,4 0,03 3,0 0, *, **, *** - достоверные отличия по отношению к интактному контролю;

#, ##, ### - достоверные отличия по отношению к группе с атерогенной диетой при уровне достоверности 0,05, 0,01 и 0, соответственно.

В то же время, в условиях атерогенной диеты Зокор вызывает достоверное снижение уровня ТГ и ЛПОНП. Тенденция к снижению наблюдается для холестерина и ЛПНП (табл. 3, рис.10). Эти факты можно объяснить тем, что в клетках атерогенной печени под действием Зокора блокируется эндогенный синтез холестерина и тех белково-липидных комплексов, в состав которых входит холестерин.

Рисунок 10 - Действие препарата Зокор на липидный обмен на фоне атерогеннной диеты.

На основании этих данных можно вычислить вклад эндогенного синтеза в дислипидемию, индуцированную атерогенной диетой.

Количественно, он соответствует разности между двумя показа телями - уровнем ЛНП в условиях АД и уровнем ЛНП в тех же условиях, но на фоне действия Зокора. По данным, представленным на рис. 11-15 для холестерина уровень эндогенного синтеза составляет 0,4, для ТГ - 0,6, для ЛПВП и ЛПНП - 0,1 и для ЛПОНП 0,3 Ммол/л.

Рассчитанные таким образом показатели были использованы для оценки эффективности действия экстрактов, направленной на коррекцию атерогенной дислипидемии. Для этого значения показателей обмена ЛП, полученные после действия различных фракций экстракта, уменьшали на величину, соответствующую рассчитанному уровню эндогенного синтеза. Пример таких расчетов для атерогенных ЛП приведен в табл. 4 и в графическом виде представлен на рис. 11 - 15.

Таблица 4 - Результаты расчета показателей вклада эндоген ного синтеза в дислипидемию, индуцированную атерогенной диетой (Ммол/л.) Реагенты Контроль АД АД+зокор АД - Ф21 Ф21 - [АД (АД+зокор) (АД+зокор)] холестерин 2 3 2,6 0,4 2,2 0, ТГ 0,9 1,5 0,9 0,6 0,8 0, ЛПНП 0,9 1,8 1,5 0,3 0,7 0, ЛПОНП 0,4 0,7 0,4 0,3 0,5 0, Рисунок 11 - Содержание общего холестерина без эндогенного синтеза в сыворотке крови животных.

Рисунок 12 - Содержание в сыворотке крови животных тригли церидов без эндогенного синтеза.

Рисунок 13 - Содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПВП без эндогенного синтеза.

Рисунок 14 - Содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПНП без эндогенного синтеза.

Рисунок 15 - Содержание в сыворотке крови животных ХС ЛПОНП без эндогенного синтеза.

Полученные данные показывают, что экстракт мицелия вешенки, обогащенный инцистеролом (Ф2) эффективно блокирует дислипидемию экспериментальных животных, индуцированную атерогенной диетой.

Ферменты крови По данным биохимического анализа в крови экспериментальных животных атерогенная диета вызвала достоверное повышение щелочной фосфатазы (ЩФ) и глюкозы (таблица 5). Содержание аланинаминотрансферазы (АЛТ), билирубина и общего белка в сыворотке крови крыс изменяется незначительно и остается в пределах нормы. Испытанные фракции экстракта не изменили количественного содержания указанных компонентов за исклю чением фракции ФС, которая вызвала достоверное снижение уровня глюкозы по сравнению с атерогенной диетой.

Таблица 5 - Показатели биохимического анализа крови Группа Доза Показатели (М m) животных АЛТ ЩФ Билирубин Глюкоза О.Б.

Е/л Мкмоль/л Ммоль/л Г/л Контроль 6,6 0, --- 33,8 1,95 213,2 18,98 2,7 0,81 76,7 0, инт.

АД ** ** -- 47,0 9,30 546,7 95,06 3,8 2,17 8,0 0,11 67,7 6, АД+ФС # 2мкг/кг 44,8 9,40 408,1 67,81 2,7 0,44 6,8 0,47 61,8 2, АД+Ф2 * ** 2мкг/г 52,8 7,66 609,1 106,47 4,1 0,56 8,0 0,66 65,4 4, АД+(ЭМВ * 4мл/кг +Г) сироп 39,9 8,07 411,6 71,44 3,4 1,09 7,1 0,36 76,1 5, Примечание: *, **, *** - достоверные отличия по отношению к интактному контролю;

#, ##, ### - достоверные отличия по отношению к группе с атерогенной диетой при уровне достоверности 0,05, 0,01 и 0,001 соответственно.

Реабилитация В эксперименте по реабилитации анализ проводили на индивидуальных животных: сразу после прекращения действия фракций испытываемого препарата кровь забирали из хвостовой вены (контроль), по окончании эксперимента (14 суток) животных забивали методом декапитации. В данном эксперименте испытывали действие двух фракций экстракта - ФС и ФС+Г (см. рисунок 4) Средние показатели биохимического анализа крови животных представлены в таблице 6 и показан на рисунках 16-21.

Таблица 6 - Средние показатели биохимического анализа крови животных (липидный обмен) Сроки после Группы животных введения последней АД+ФС АД+ФС+Г дозы АД 2мкг/г 2мкг/г+20мкг/г испытываемых веществ Холестерин, ммоль/л контроль 2,8±0,20 2,3±0,14 * 2,2±0,23 ** 14 суток 1,5 0,09 1,4 0,13 1,3 0,08 * Триглицериды, ммоль/л контроль 0,7±0,06 0,7±0,05 0,5±0,03 ** 14 суток 0,7 0,05 0,6 0,05 0,5 0,01 ** ЛПВП, ммоль/л контроль 0,6±0,01 0,8±0,03 *** 0,7±0,02 ** 14 суток 0,6 0,01 0,7 0,01 0,6 0, ЛПНП, ммоль/л контроль 1,9±0,21 1,2±0,12 * 1,2±0,14 * 14 суток 0,6 0,08 0,4 0,14 0,4 0, ЛПОНП, ммоль/л контроль 0,3±0,02 0,3±0,02 0,2±0,01 ** 14 суток 0,3 0,02 0,3 0,02 0,2 0,00 ** Индекс атерогенности, у.е.

контроль 3,4±0,29 1,9±0,17 ** 2,0±0,17 ** 14 суток 1,4 0,12 1,1 0,23 1,1 0, Примечание: *, **, *** - достоверные отличия по отношению к группе с атерогенной диетой при уровне достоверности 0,05, 0,01 и 0, соответственно.

Рисунок 16 - Действие входящих в состав детоксикационного препарата биологически активных веществ на содержание в сыворотке крови животных общего холестерина на фоне атеро геннной диеты после реабилитации.

Рисунок 17 - Действие фракций препарата ЭМВ на содер жание в сыворотке крови животных триглицеридов на фоне атерогеннной диеты после реабилитации.

Рисунок 18 - Действие входящих в состав детоксикационного препарата биологически активных веществ на содержание в сыворотке крови животных ХСЛПВП на фоне атерогеннной диеты после реабилитации.

Рисунок 19 - Действие фракций препарата ЭМВ на содержание в сыворотке крови животных ХСЛПНП на фоне атерогеннной диеты после реабилитации.

Рисунок 20 - Действие входящих в состав детоксикационного препарата биологически активных веществ на содержание в сыворотке крови животных ХСЛПНП на фоне атерогеннной диеты после реабилитации.

Рисунок 21 - Индекс атерогенности на фоне атерогенной диеты после реабилитации.

Полученные данные показывают, что на фоне атерогенной дие ты обе фракции проявляют антигиперлипидемическую активность.

Фракция ФС достоверно понижает уровень общего холестерина (рисунок 16) и ЛПНП (рисунок 19) и повышает уровень ЛПВП (рисунок 18).

Фракция ФС+Г достоверно понижает уровень общего холестерина (рисунок 16), ЛПНП (рисунок 19), ТГ (рисунок 17) и ЛПОНП (рисунок 20).

Две недели реабилитации приводят к тому, что у животных, которые получали только АД, уровень холестерина снижается почти в 2 раза (рисунок 16) а уровень ЛПНП - в 3 раза (рисунок 19).

Уровень остальных ЛП остается без изменений.

Животные, которые одновременно с АД получали фракцию ФС+Г, через две недели реабилитации показали достоверно выраженное снижение ХС (рисунок 9, А).

Животные, которые одновременно с АД получали фракцию экстракта ФС, через две недели реабилитации показали снижение уровня холестерина (рисунок 16) и значительное (примерно в 3 раза) снижение уровня ЛПНП (рисунок 19). Уровень остальных фракций по сравнению с АД остался без изменений.

Патоморфологические исследования.

При макроскопическом исследовании внутренних органов экспериментальных животных через 14 суток после последнего введения атерогенной нагрузки и препаратов видимых различий между крысами, находящимися только на атерогенной диете, и крысами, которым вводили испытуемые препараты, не выявлено (рисунки 22 - 24). Средний групповой вес печени и органо-сомати ческий показатель (масса печени, мг/масса тела, г) достоверно не различаются между группами (таблица 7).

Таблица 7 - Средние групповые показатели массы тела, печени и ОСП.

Группа Доза Масса тела Масса печени ОСП, животных (г) (мг) % АД 389,4 13,00 842,9 39,98 2,2 0, АД+Зокор 8 мг/кг 375,9 10,56 814,3 37,34 2,2 0, АД+ФС 2мкг/г 386,1 6,74 908,3 36,68 2,4 0, АД+ФС+Г 2 мкг/г + 398,3 11,24 941,7 68,82 2,4 0, 20мкг/г Рисунок 22 - Печень контрольного животного.

а - Участок дольки печени, “полутонкий” срез, световой микроскоп, ЯГ - ядро гепатоцита, Эц - эритроцит, Лц - лейкоцит.

б - Отдельный гепатоцит, ультратонкий срез, электронная микро фотография, Я - ядро, Як - ядрышко, ЭПР - эндоплазматический ретикулум.

Рисунок 23 - Печень животного, содержавшегося на атерогенной диете.

а - Участок дольки печени, “полутонкий” срез, световой микроскоп.

б - Отдельный гепатоцит, ультратонкий срез, электронная микро фотография.

Рисунок 24 - Печень животного, содержавшегося на атероген-ной диете и получавшего препарат.

а - Участок дольки печени, “полутонкий” срез, световой микроскоп.

б - Отдельный гепатоцит, ультратонкий срез, электронная микро фотография Обсуждение В работе использовались субстанции (фракции), полученные из мицелия Pleurotus ostreatus (вешенка).

Известно, что основными причинами возникновения атеро склероза являются гиперхолестеринемия и нарушение липидного обмена. Главную роль в этих процессах играют изменения в крови уровня ЛПНП и ЛПВП, которые регулируются, ферментными системами клеток печени (Климов, Никульчев, 1999). Основную опасность для развития атеросклероза представляют ЛПОНП, в то время как ЛПВП, наоборот, обладают антисклеротическим действием.

Как показали биохимические анализы крови, в группе животных, находившихся на атерогенной диете, наблюдается достоверное повышение содержания общего холестерина, триглицеридов (ТГ), липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) и снижается уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Таким образом, использованная методика атерогенной диеты вызывает выраженную дислипидемию у крыс и моделирует ситуацию, при которой возникает риск атеросклеротической патологии сосудов.

Важно, что индуцированая дислипидемия обратима: после двух недель реабилитации экспериментальных животных уровень липид ного обена возвращается к норме.

В качестве субстанций, способных корректировать дислипи димию, индуцированную атерогенной диетой, использовали фрак ции, обедненные инцистеролом (Ф1, ГВ) и фракции, содержащие инцистерол в различных количествах, в том числе фракции, обогащенные инцистеролом. Показано, что все фракции снижают долю общего холестерина и атерогенных липопротеинов (аЛП). При этом наибольшую эффективность показали фракции, содержащие в своем составе инцистерол (ФС2), инцистерол и глюканы (ФС +г) и фракция, обогащенная инцистеролом (Ф2).

При интерпретации полученных данных необходимо учитывать возможный вклад в дислипидемию, индуцированную АД, эндогенного синтеза холестерина и его производных. Для точного определения вклада эндогенного синтеза в метаболизм липидов в условиях атерогенной диеты мы использовали широко применяющийся в профилактике лечения дислипидемий препарат Зокор, который относится к семейству статинов. Полученные данные показали два важных факта. Во-первых, Зокор не блокирует прогрессию жировой дистрофии печени, а наоборот, усиливает патологические изменения гепатоцитов. Этот факт может служить дополнительным подтверж дением рекомендаций, по которым одним из основных противо показаний к применению статинов являются заболевания печени.

Во-вторых, на фоне атерогенной диеты Зокор частично снижает пул атерогенных ЛП (ТГ и ЛПОНП). Наиболее логичное предположение в условиях атерогенной диеты Зокор полностью блокирует синтез холестерина.

Такая ситуация дает возможность определить реальную эффективность действия использованных нами фракций на метаболизм введенного в организм животных экзогенного холестерина.

На основании простых расчетов мы определили показатель, который количественно соответствует разности между уровнем ЛНП в условиях АД и уровнем ЛНП в тех же условиях, но на фоне действия Зокора. Вычисленный таким образом показатель был использован для оценки эффективности действия экстрактов, направленной на коррекцию атерогенной дислипидемии. В целом, полученные данные показали, что экстракт мицелия вешенки, обогащенный инцистеролом (Ф2) эффективно блокирует дисли пидемию экспериментальных животных, индуцированную атероген ной диетой. Так как испытуемые фракции вводили животным после развившейся дислипидемии, речь может идти о лечении патологии, а не о ее профилактике. Определение структурной формулы действующего начала экстрактов показало, что инцистерол не относится к классу статинов (см статью в сборнике). Сравнительный анализ действия фракций экстракта и Зокора на метаболизм ЛП показывает, что инцистерол не блокирует эндогенный синтез холестерина. В то же время, метаболизм ЛП нормализуется.

Закономерно возникает вопрос о механизме действия инцистерола.

Прямого ответа на этот вопрос в настоящей работе не получено.

Можно предположить, что инцистерол препятствует проникновению холестерина внутрь гепатоцитов, блокируя рецепторы ЛПНП. Другая (но не альтернативная) гипотеза - инцистерол блокирует всасывание холестерина в клетках эпителия тонкого кишечника.

Список литературы:

1. Поляков В.Ю. Гепатопротекторное действие препарата на основе экстракта мицелия вешенки при развитии экспериментального стеатоза печени / В.Ю. Поляков, С.А. Голышев, Г.И.Кирьянов, Е.А.

Арифулин, В.П. Герасименя, С.В. Захаров, К.З. Гумаргалиева, Ю.Л.

Путырский // Биологические мембраны, - 2011, том 28, № 4, - С.1-7.

2 Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю.

Препарат с полифункциональной медико-биологической активно стью, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-819 для его получения». Патент РФ на изобретение № 2487930 от 19.06.2012 г. Бил. № 20 от 20.07.2013 г.

3. Герасименя В.П., Захаров С.В. Кирьянов Г.И., и др. Препарат 4 hydroхy- 17R- methylincisterol, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus 1137 для его получения. Патент РФ на изобретение № 2435599 от 21.06.2010 г. Бюл. № 34 от 10.12.2011 г.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ КОМПОЗИЦИИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ДЕТОКСИКАЦИОННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МИЦЕЛИЯ Pleurotus ostreatus Г.И. Кирьянов, *В.П. Герасименя, *С.В. Захаров, В.Ю. Поляков.

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия.

*ООО «Инбиофарм», Москва, Россия.

Введение Одна из актуальных проблем современной медицины преодоление токсичности сильнодействующих лекарственных препаратов, которые используются для лечения пациентов с тяжелыми патологиями.

Препараты, обладающие высокой токсичностью, применяются в различных областях медицины. Так, например, в онкологии широко используются цитостатики (циклофосфан, доксорубицин, метотрексат, 5-фторурацил, таксаны и др.) [1-5], при комплексном лечении больных туберкулезом легких - изониазид, рифампицин, фторхинолоны, этамбутол и др. [6-10]. Токсичные препараты применяются и для лечения целого ряда других распространенных патологий, например, сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, бронхиальной астмы, метаболического синдрома и т.д.


Известно, что применение такого рода препаратов оказывает серьезные побочные действия на организм человека, в частности, вызывает нарушения функции печени, астению, диспепсию, панкреатит и т.п. [5,8,9,10].

Именно по этой причине в современной фармакологии большое внимание уделяется разработке и производству новых лекарственных препаратов. Основа стратегии в этом направлении поиск эффективно действующих, но малотоксичных средств и разработка препаратов, обладающих детоксикационным дейст вием. Тем не менее, несмотря на определенный прогресс в этой области, спрос на лекарственные средства, снижающие побочные явления химиотерапии, к тому же обладающие полифунк циональной медико-биологической активностью, остается чрез вычайно высоким.

Приведенные в настоящем сборнике работы, вместе с много численными данными литературы показывают, что перспектив ными продуцентами такого рода лекарственных средств могут служить грибы, относящиеся к классу базидиомицетов, в том числе, Pleurotus ostreatus (вешенка) [11-20].

Выявленные эффекты действия экстракта мицелия Pleurotus ostreatus и выделенного из экстракта активного вещества (инцистерола), вместе с известными данными литературы, позволяют предложить композицию инновационного детоксика ционного препарата, в состав которого входит четыре компонента:

экстракт мицелия (фармакологическая Pleurotus ostreatus субстанция), инцистерол (действующее вещество), -глюканы (имунностимуляторы), дигидрокверцетин (антиоксидант). Биологи ческая активность -глюканов и дигидрокверцетина подробно описана в литературе и поэтому не требует особых комментариев.

Для обоснования применения экстракта и инцистерола ниже приводится расширенное описание их биомедицинских свойств.

Композиция детоксикационного препарата 1. Фармакологическая субстанция - экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137. Экстракт содержит низкомолекулярные (от 100 до 500 дальтон) биологически активные вещества: углеводы, аминокислоты, высшие жирные кислоты, органические кислоты, витамины, минеральные вещества и воду.

Полномасштабный скрининг экстракта, направленный на выявление его биологической активности в системе in vitro (на культивируемых клетках) клетках показал, что при индивидуальном действии в концентрации 50 и 100 мкг/мл среды экстракт не обладает цитотоксичностью и является слабо выраженным индуктором апоптоза.

Сочетанное использование экстракта и медицинских цитоста тиков (циклофосфана, доксорубицина и 5-фторурацила) показывает ярко выраженный синергизм, который в зависимости от концентрации реагентов и способа их инсталляции выражается в подавлении пролиферации и в индукции апоптоза. Этот эффект зарегистрирован на трансформированных клетках (HeLa и миелоидный лейкоз), т.е. на моделях раковых клеток как эпителиального, так и мезенхимного происхождения.

Принципиально важно, что экстракт в синергизме с цитоста тиками не оказывает апоптогенное действие на нормальные, нетрансформированные клетки (первичные фибробласты человека и фибробласты зеленой мартышки штамма Vero).

В практическом плане синергизм при совместном использовании с цитостатиками позволяет значительно понизить используемую в химиотерапии опухолей дозу крайне токсичных медицинских препаратов - циклофосфана, доксорубицина, мето трексата и 5-фторурацила.

Проведен поиск возможных мишеней индивидуального и сочетанного с цитостатиками действия экстракта на модели культивируемых клеток.

Учитывая, что одной из возможных мишеней действия экстракта может служить ДНК генома, проведены эксперименты, в которых воздействию экстракта подвергались клетки с модифи цированной структурой хроматина. Полученные результаты показали, что частичная декомпактизация хроматина под действием 5-азацитидина или бутирата натрия значительно усиливает апоптогенное действие экстракта. В этих условиях экстракт действует как проапоптотический агент.

При этом показано, что апоптоз развивается не по митохон дриальному пути Особый интерес представляют данные, по которым «первич ным» ответом клетки на действие экстракта является изменения свойств плазматических мембран. При этом важно, что такую реакцию демонстрирует не все клетки популяции.

Полученные результаты позволили высказать предварительное предположение о том, что экстракт служит своеобразным «модуля тором» физиологической активности некоторых, вероятно, патоло гических, клеток, каким-то образом способствуя активному включению цитостатиков в клеточный метаболизм, в том числе в каскад событий, связанных с индукцией программы апоптоза.

Известно, что функциональный статус как нормальных, так и трансформированных клеток во многом определяется сигналь ными системами, локализованными в плазматических мембранах. В частности, на плазматических мембранах экспонированы рецепторы, контролирующие включение программы клеточной гибели (апоптоза). На основании этих данных логично предположить, что экстракт в определенных дозах детерминирует переход части клеток в «предапоптотическое» состояние. В результате последующая обработка цитостатиками, мишенью которых является геном клетки, приводит к включению программы апоптоза. Аналогичный результат дает последовательная обработка клеток низкими и высокими дозами экстракта. Этот чрезвычайно интересный факт можно объяснить тем, что низкие дозы экстракта «сенсибилизируют» клетки для действия проапоптотических факторов, которые активируются при повторном введении экстракта.

Испытания экстракта в системе in vivo показали полифунк циональность его действия. На модели экспериментальных животных (гипертензивные крысы, экспериментальный стеатоз, перевиваемые опухоли, туберкулез) показано, что экстракт блокирует прогрессию гипертонии, помогает купировать лекарственную непереносимость при туберкулезе, нормализует состав крови у животных, получавших циклофосфан, вызывает регрессию опухолей у экспериментальных животных, обладает гипертензивными и гепатопротекторными свойствами, нормализует липидный обмен в условиях искусственно вызванной гиперли пидемии. При этом для практики не существенно, каков механизм действия экстракта, прямой или, опосредованный. Важно, что при этих патологиях экстракт можно использовать как прямое лекарственное средство.

Вопрос о том, чем именно определяется полифункциональность экстракта Pleurotus ostreatus, имеет не только сугубо практическое, но и большое теоретическое значение для клеточной и молекулярной биологии. Можно предположить, что экстракт содержит специфический индуктор (или, индукторы), которые «узнают» патологически измененные клетки, обладающие общим свойством включать программу апоптотической гибели в ответ на взаимодействие с определенным классом веществ.

2. Действующее вещество экстракта Производное стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol IUPAC:

(3aS,5aR,6R,8aR)-6-[(2R,3E,5S)-5,6-dimethylhept-3-en-2-yl]-3a hydroxy-5a-methyl-3a,4,5,5a,6,7,8,8a-octahydro-2H-indeno[5,4-b] furan 2-one молекулярной массы 332,2452 дальтон (инцистерол).

Инцистерол получен методом фракционирования экстракта Pleurotus ostreatus 1137.

В испытаниях на различных типах культивируемых клеток (нормальные фибробласты человека, фибробласты зеленой мартышки Vero, трансформированные клетки человека Hela, клетки миелоидного лейкоза человека), а также на лабораторных животных выявлен и экспериментально подтвержден круг фармакологических эффектов инцистерола.


В целом, полученные данные показывают, что именно инцистерол обусловливает специфическую активность экстракта, в этом смысле является его «действующим началом», однако обладает гораздо более высокой биологической активностью.

По степени важности обнаруженных фармакологических эффектов инцистерола они могут быть расположены в следующей последовательности:

1) Апоптогенный эффект на трансформированных клетках, где препарат проявляет свойства агониста апоптоза (в сочетании с химиотерапевтическими агентами, такими как циклофосфан, доксорубицин, метотрексат) и также выступает в роли промотора (индуктора) апоптоза. Цитотоксичность инцистерола для нормаль ных клеток на три порядка ниже, чем для трансформированных клеток (при оценке биологически активных концентраций).

При использовании реагентов, вызывающих нарушения характера репликации ДНК и формирования нормальной пострепли кативной структуры хроматина (5-азацитидин, трихостатин) совмест ная инсталляция клеток с инцистеролом приводит к резкой стимуляции (в разы) апоптоза трансформированных клеток.

Эти работы открывают перспективу для фундаментальных исследований по установлению конкретных участников суперсемейства TNF-рецепторов в процессе индукции апоптоза, возможное привлечение других рецепторов «клеточной смерти», а также возможной модификации рецепторов, обеспечивающей их предактивацию. В целом, эта работа включает в себя исследование взаимодействия инцистерола с мембранными рецепторами нормальной и трансформированной клетки.

В практическом плане синергизм с цитостатиками позволяет использовать инцистерол (как и экстракт) для существенного снижения дозы используемых в химиотерапии опухолей крайне токсичных медицинских препаратов.

2) Антигиперхолестеринемический и гепатопротекторные эф фекты.

Доклинические исследования инцистерола проведены на модели индуцированного холестерином стеатогепатита у крыс.

Установлено, что при действии инцистерола на фоне атерогенной диеты наблюдается снижение в крови животных содержания холестерина, триглицеридов, липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП, соответственно), повышение содержания липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), что свидетельствует о стабилизации гепатобилиарной системы печени.

Анализ с помощью световой и электронной микроскопии печени экспериментальных животных показал, что инцистерол обладает выраженным гепатопротекторным эффектом.

Все эти количественные и качественные показатели превос ходят эффект, вызываемый препаратом сравнения Зокор (симва статин), особенно это ярко видно на гепатопротекторном эффекте.

Проведенные эксперименты подводят к выводу, что мишенью действия инцистерола в данном случае является рецепторный путь транспорта холестерина в организме, включающий в себя как этап образования мицелл холестерина, так и функционирование клеточных рецепторов ЛПНП. В обоих случаях инцистерол может обладать антогонистическим эффектом. Фундаментальное значение будут иметь исследования влияния инцистерола на клеточные рецепторы холестерина в тонком кишечнике и печени. Необходимо также проверить возможное участие инцистерола в ингибировании фермента 3-гидрокси-3-метил-глутарил-кофермента А-редуктазы (ТМК-К0А-редуктазы) - мишени для всех статинов.

Для практики медицины важно, что фракции, обогащенные инцистеролом, блокируют прогрессию экспериментальной дислипидемии у крыс. В этом случае инцистерол можно позиционировать как препарат сопровождения с лекарствами, провоцирующими патологию печени и развитие атеросклероза.

3. 1-3 глюкан с молекулярной массой глюкозы 512 дальтон ди- и трисахарида 674 и 836 дальтон. По данным литературы глюканы стимулируют иммунную систему, используются для профилактики и лечения онкологических заболеваний, снижают уровень холестерина, оказывают положительное влияние на рост пробиотических бактерий в кишечнике.

4. Дигидрокверцетин (2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4 дигидроксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-он) с молекулярной массой 304,26 дальтон.

По данным литературы дигидрокверцетин оказывает ангиопротекторное, антиоксидантное, дезинтоксикационное, гепатопротекторное (антитоксическое), радиопротекторное и противоотечное действие;

стимулирует процессы регенерации слизистой оболочки желудка. Препятствует пероксидному окислению липидов клеточных мембран, предохраняет стенки сосудов от повреждения, уменьшает отечность при воспалении, обладает гиполипидемической и диуретической активностью Проведенные испытания композиционного состава показали, что препарат в рекомендованных для использования дозах не обладает токсичностью.

При этом, состав препарата сбалансирован таким образом, что позволяет использовать его для снижения токсического действия медицинских цитостатиков и других токсических реагентов, используемых при лечении тяжелых патологий.

Заключение Рассматривая перечисленные выше биологические эффекты инцистерола необходимо сделать несколько обобщающих выводов.

На первый взгляд кажется парадоксальным широта спектра биологических ответов на действие инцистерола, логически трудно связываемых между собой. Эра фундаментальных открытий в области стероидов и их клеточных рецепторов привела к постулату о тонкой настроенности цепочки лиганд (стероидный гормон) рецептор (ядерный белок) (ДНК сайт узнавания) транскрипция одного гена. В этой цепочке инцистеролу, как чрезвычайно деструктированной форме стероида, может в лучшем случае отводиться роль антагониста лиганда.

Однако с середины 70-х годов появились первые данные, породившие новую эру - эру исследования негеномного сигнального пути стероидов и их рецепторов. Был обнаружен феномен быстрого клеточного ответа на стероидный гормон, несопоставимый по времени со скоростью выключения экспрессии гена и синтеза конкретного белка. Более того, такой быстрый клеточный ответ наблюдался на клетках с полностью репрессированным геномом и даже в клетках, лишенных ядер.

Можно перечислить некоторые примеры такого быстрого сигнального пути стероидных гормонов:

- стрессовые ответы на глюкокортикоиды;

- быстрое действие тироидных гормонов на сердечную дея тельность;

- подвижность (миграция) гладкомышечных клеток и остеоцитов под действием витамина D;

- генерация NO и быстрое уменьшение давления крови под действием тироидных гормонов и половых стероидов.

Сложившаяся на сегодня концепция состоит, вкратце, из следующей цепочки событий: лиганд (стероидный гормон) взаимодействует с рецептором, фиксированным на клеточной оболочке. Это происходит на внеклеточных доменах рецептора, изменение конформации которого приводит к активации цитозольного домена рецептора, функции которого сводится к синтезу цАМФ (и цГМФ). В дальнейшем при участии G-белков происходит активация семейств протеиновых киназ, модифици рующих (с их активацией) группу ферментов, что и приводит к направленной метаболической перестройке клетки.

Таким образом, стероидный гормон в данном случае функционирует как триггер, запускающий или выключающий каскад быстрых реакций, и приводящий к быстрому выбору потенциально возможного для данного типа клеток ответа.

Многие детали этого нового для нас механизма еще не понятны.

Какой рецептор для гормона - тот же что и ядерный или другой? Что обеспечивает селективность клеточного ответа? И т.д.

В приложении к теме настоящей работы интересны два свойства рецепторов, во-первых, их множественность - несколько десятков тысяч на клеточную мембрану, и, во- вторых, отсутствие выраженной тонкой настройки лиганд - рецептор. Это приводит к тому, что один и тот же рецептор в разных клетках может связываться с разными лигандами, например, с эстрогенами и прогестеронами.

На основании проведенных экспериментов по модификации мембран клеток глутаровым альдегидом и данных ранее опубликованной работы (Amchenkova et al., 1998), можно заключить, что низкие концентрации глутарового альдегида в клетках СПЭВ и HeLa блокируют активность клеточных рецепторов, относящихся к группе ионных каналов. Судя по полученным в цитированной работе данным, одной из первых мишеней глутарового альдегида являются рецепторы кальциевых каналов, блокирование которых препятствует активному транспорту кальция через плазмалемму. Тот факт, что инцистерол потенцирует эффект глутарового альдегида, позволяет предположить, что мишенью его действия являются именно кальциевые каналы. Известно, что к числу патологий, индуциро ванных нарушением транспорта Ca2+, относятся гипертония и сердечная недостаточность. В экспериментах на модели крыс линии HSR было показано, что экстракт мицелия вешенки обладает выраженным антигипертензивным действием, что может быть опосредовано участием инцистерола как лиганда для рецепторов ионных каналов. Ясно, что это не исключает действия инцистерола на другие типы клеточных рецепторов.

В конечном счете, инцистерол может играть роль лиганда для мембранных рецепторов, выступая в одних случаях в качестве агониста, а в других - антагониста гормона.

Вырожденность тонкой специфичности акцептора гормона у мембранных рецепторов и их множественность может в таком случае обеспечивать полифункциональность аналога стероидных гормонов - инцистерола.

В дальнейшем можно рассчитывать, что дополнительные модификации инцистерола приведут к созданию линейки фармакологически активных препаратов строго направленного действия.

Список литературы:

1.Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии / Д. Б.

Корман – М.: Практическая медицина. -2006. - 503с.

2. Комбинированное и комплексное лечение рака легкого, молочной железы, пищевода и прямой кишки в условиях применения растительных адаптогенов и лазерного облучения крови:

методические рекомендации. – Санкт-Петербург.: Министерство здравоохранения и медицинской промышленности РФ. - 1996. -14с.

3. Блохин Н.Н. Химиотерапия опухолевых заболеваний / Н.Н. Блохин, Н.И. Переводчикова – М.: Медицина. 1984. - 303 с.

4.Химиотерапия злокачественных новообразований / Под редакцией Э.Чу и В. Де Виты-младшего. – М.: Практика, 2008. -439 с.

5. Александров Б.Л. Рак глазами физика. Механизм возникновения, профилактика, лечение, защита / Б.Л. Александров - Санкт-Петер бург: Издательская группа «Весь», 2010. -258 с.

6. Ерохин В.В. Применение лейкинферона для коррекции нарушений функции печени у больных прогрессирующим туберкулезом легких:

пособие для врачей / В.В. Ерохин, Н.Л. Карпина, Л.Н. Лепеха. – М.:

ЦНИИТ РАМН, 2008. -14 с.

7. Концепция федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями» (2007 - 2011г.г.).

Распоряжение правительства РФ от 11.12.2006. -М.: 2006. -33с.

8. Мишин В.Ю. Лекции по фтизиопульмонологии / В.Ю. Мишин, А.К.Стрелис, В.И. Чуконов. - М.: ЦНИИТ РАМН, 2006. -С. 271-307.

9. Сухов Д.С. Гепатопротективная активность сукцинатсодержащих растворов при туберкулезе легких: информационное письмо для врачей / Д.С. Сухов, А.К. Иванов, М.Г. Романцов. – Санкт Петербург: 2007. - 47 с.

10. Титюхина М.В. Комплексное лечение токсического гепатита у больных туберкулезом органов дыхания: материалы 15 Российской конференции «Гепатология сегодня» 15-17 марта 2010 г / М.В. Титюхина, Ф.А. Батыров, Ж.Ю. Яровая. – М.: ЦНИИТ РАМН, 2010. - С. 68.

11. Экспериментальное исследование противоопухолевой активно сти препаратов мицелия вешенки: отчет о НИР / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 25с.

12. Экспериментальное исследование in vivo противоопухолевой активности препаратов, выделенных из мицелия грибов Pleurotus ostereatus: отчет о НИР / Островская Л.А. – М.: ИБХФ РАН, 2009. – 29с.

13. Инновационный детоксикационный препарат с полифункцио нальной медико-биологической активностью для коррекции лекарственной непереносимости в комплексном лечении онкологических заболеваний и в реабилитационный период.

Технология, создание лекарственной формы, производство: отчет о НИР (Шифр «Онководин») / Захаров С.В., Герасименя В.П., Кирьянов Г.И. Поляков В.Ю. – М.: ООО «Инбиофарм»,2011. -146 с.

14.Справка о состоянии исследования, перспективы разработки и внедрения в практику медицины фармацевтической компанией ООО «Инбиофарм» нового поколения медицинских препаратов на основе биологически активных веществ экстракта мицелия Pleurotus ostreatus (FR.) KUMM. 1137, обладающих полифункциональной специфической фармакологической активностью: отчет о НИР/ Захаров С.В. Герасименя В.П. –М.: – М.: ООО «Инбиофарм», 2011. 64 с.

15. Захаров С.В. Инструкция описания технологического процесса культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) и получения из него экстракта биологически-активных веществ :

инструкция / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, Л.П. Семашева –М.:

ООО «Инбиофарм», 2008. – 39 с.

16. Герасименя В.П., Захаров С.В., Кирьянов Г.И. и др. Препарат с полифункциональной медико-биологической активностью, влияю щий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus для его получения. Патент РФ на изобретение №2487930 от 19.06.2012 г. Бюл. № 20 от 20.07.2013 г.

17. Герасименя В.П., Ефременкова О.В, Камзолкина О.В. и др.

Препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба P. Ostreatus 1137 для его получения, патент РФ 2192873.

20.11.2002. Бюл. № 32.

18. Герасименя В.П., Захаров С.В. Кирьянов Г.И., и др. Препарат 4 hydroхy- 17R- methylincisterol, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus 1137 для его получения.

Патент РФ на изобретение № 2435599 от 21.06.2010 г. Бюл. № 34 от 10.12.2011 г.

19. Герасименя В.П., Захаров С.В., Трезвова А.В. и др. Препарат на основе гриба Pleurotus 1137, для коррекции лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких.

Патент РФ на изобретение № 2435600 от 23.08. 2010 г. Бюл. № 34 от 10.12.2011 г.

20. Кирьянов Г.И., Герасименя В.П., Захаров С.В., Ташлицкий В.Н., Кинцурашвили Л.Н., Поляков В.Ю. Способ получения инцистерола.

Патент РФ на изобретение № 2477635 от 14.02.2012 г. Бюл. № 8 от 20.03.2013 г.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.