авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии» _ ...»

-- [ Страница 4 ] --

Селезенка представляет собой важный лимфоэпителиальный орган, эф фективно фильтрующий кровь и удаляющий из кровотока старые эритроци ты и лейкоциты. Селезенка активно отвечает на попадающие в нее антигены, в наибольшей степени на корпускулярные. На срезах селезенки лимфоидная ткань представлена в виде шаровых скоплений белой пульпы, разбросанных среди красной пульпы заполненной эритроцитами. Т- и В- клеточные зоны селезенки анатомически разделены так же как и в лимфоузлах.

Реактивы и оборудование: анализатор изображений «ВидеоТест-Мастер Морфология», набор препаратов по гистологии, иммерсионное масло, вата, 960 спирт, гистологические атласы.

Порядок выполнения работы Рассмотрите под микроскопом следующие препараты.

13. Препарат вилочковой железы крысы (окраска гематоксилин-эозин).

При малом увеличении видна выраженная дольчатость строения и подраз деление каждой дольки на корковое (темное) и мозговое (бледное) вещество, содержащее меньшее количество лимфоидных клеток. Периферическая часть дольки с большим содержанием лимфоцитов, выглядит темнее центральной части дольки. Клетки мозгового вещества неправильной формы с розовой цитоплазмой и бледно-окрашенным ядром. Слоистые бледно-розовые струк туры в мозговом слое, образованные концентрическим наслоением клеточ ных элементов, представляют собой тельца Гассаля.

Рассмотрите при малом увеличении, зарисуйте и обозначьте: 1– соединительно-тканную капсулу;

2– дольку вилочковой железы;

3– корковое вещество;

4 – мозговое вещество.

При большом увеличении под иммерсией найдите: 1– ретикуло эпителиальные клетки;

2– лимфоциты;

3– тельца Гассаля.

14. Мазок красного костного мозга (окраска гематоксилин-эозин).

При изучении структуры костного мозга на гистологическом препарате особое внимание обратите на соотношение между участками занятыми кро ветворными элементами и стормальными клетками. Легко диагностируемой при малом увеличении клеткой, является мегакариоцит. При большом увели чении найдите на препарате миелоциты, характеризующиеся специфической зернистостью и бобовидным ядром, предшественников эритроидного ряда, зрелые форменные элементы крови, «бластные» формы.

Зарисуйте и обозначьте клетки различных кроветворных линий: 1– про эритробласт;

2– базофильный эритробласт;

3 – полихроматофильный эри ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ тробласт;

4 – оксифильный эритробласт;

5 – эритроцит;

6 – мегакариоцит;

7 – тромбоцит;

8 – миелобласт;

9 – нейтрофильный миелоцит;

10 – эози нофильнй метамиелоцит;

11 – базофильный миелоцит;

12 – нейтрофил;

– эозинофил;

14 – базофил;

15 – плазмоцит, В-лимфоцит;

16 – лимфобласт;

17 – Т-лимфоцит.

15. Срез лимфатического узла кошки (окраска гематоксилин-эозин).

При микроскопировании при малом увеличении обратите внимание на соединительнотканную капсулу, которой покрыт снаружи лимфатический узел. От капсулы вглубь отходят перегородки – трабекулы. Корковое веще ство представлено скоплениями лимфатических узлов более темного цвета, по сравнению с мозговым веществом, которое располагается глубже по на правлению к воротам органа. В мозговом веществе лимфоциты располага ются диффузно или в составе мякотных шнуров. Характерной особенностью является строго периферическое расположение лимфатических узелков, представляющих собой скопление лимфоцитов, в лимфатическом узле.

Рассмотрите препарат при малом и большом увеличении, зарисуйте и обозначьте6 1– капсулу;

2 – трабекулы;

3 – лимфатические узелки;

4– мозго вые тяжи;

5 – центр размножения;

6– тимусзависимую (паракортикальную) Т-зону;

7 – бурсазависимую В-зону.

16. Срез селезенки крысы (окраска гематоксилин-эозин).

Рассмотрите на препарате капсулу и отходящие от нее трабекулы. Обра тите внимание, по всему срезу органа разбросаны лимфатические узелки, образующие белую пульпу селезенки (в отличие от строго периферического расположения их в лимфатических узлах). Важным диагностическим призна ком является наличие в лимфатических узелках селезенки срезов мелких ар териальных сосудов – центральных артерий (расположенных эксцентрично), отсутствующих в аналогичных структурах лимфатических узлов. Периарте риальная зона лимфатических узелков является Т-зависимой, В-лимфоциты – занимают реактивный центр фолликула.

Рассмотрите препарат при малом и большом увеличении, зарисуйте и обозначьте: 1 – капсулу;

2 – трабекулы;

3 – белую пульпу;

4 – красную пуль пу;

5– лимфатический узелок;

6 – артерию лимфатического узелка в Т-зоне;

7 – В-зону узелка.

Содержание отчета Результаты работы представьте в виде зарисовок гистологических пре паратов. Рисунок должен быть подписан с указанием способа окраски. На рисунке должны быть нанесены соответствующие обозначения.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

Контрольные вопросы 1. Опишите общий план строения иммунной системы.

2. Перечислите центральные органы иммунной системы, укажите особен ности их закладки и функционирования.

3. Перечислите периферические органы иммунной системы, укажите осо бенности их закладки и функционирования.

4. Строение тимуса.

5. Инволюция вилочковой железы.

6. Каково функциональное значение тимуса в процессах кроветворения.

7. Строение и местоположение сумки Фабрициуса.

8. Развитие и строение костного мозга.

9. Закладка селезенки в онтогенезе, ее строение.

10. Строение лимфатических узлов.

11. Какие гистоморфологические изменения происходят в лимфоидной ткани при иммунизации?

12. Перечислите особенности Т- и В-лимфоцитов.

13. Онтогенез Т-лимфоцитов.

14. Онтогенез В-лимфоцитов.

15. Виды Т-лимфоцитов.

16. Виды В-лимфоцитов.

Лабораторная работа № 3. Подсчет числа лейкоцитов в камере Горяева. Определение лейкоформулы крови.

Цели работы: овладеть методами подсчета лейкоцитов в камере Горяе ва и на мазках крови;

научиться строить лейкоцитарный профиль крови и определять ядерный сдвиг.

Общие сведения по теме Морфологический состав белых кровяных телец принято выражать лей коцитарной формулой, представляющей собой процентное соотношение от дельных форм лейкоцитов, записанное по особой схеме. В норме лейкоци тарная формула слагается из соотношений таких основных ее элементов, как базофилы, эозинофилы, нейтрофилы (юные, палочкоядерные и сегментиро ванные), лимфоциты, моноциты.

Лейкоцитарную формулу определяют подсчетом в окрашенных мазках крови белых кровяных телец в количестве 100, 200 или 400. Чем больше будет подсчитано клеток, тем точнее результаты. Основными условиями достоверного составления лейкоцитарной формулы является умение иссле дователя технически правильно подготавливать, фиксировать и окрашивать ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ мазок, хорошо дифференцировать различные формы лейкоцитов. Приступая к составлению лейкоцитарной формулы, необходимо помнить, что даже в идеально подготовленных мазках лейкоциты распределяются неравномер но;

нейтрофилы, эозинофилы и базофилы обычно располагаются по краям мазка, а лимфоциты и моноциты – в его центре. В начальных частях мазка находится большее количество клеточных элементов, а в конечных – их зна чительно меньше.

При различных патологических процессах и в зависимости от их силы, глубины, характера и локализации лейкоцитарная формула может суще ственно изменяться. Все изменения лейкоцитарной формулы, по существу, сводятся главным образом к следующему: 1) к увеличению процентного содержания одних форм клеток белой крови за счет уменьшения в той или иной степени других;

2) к появлению молодых незрелых лейкоцитов;

3) к структурным изменениям самих клеток. Например, при значительном содер жании в мазке крови нейтрофилов падает число лимфоцитов, эозинофилов;

резкое увеличение эозинофилов приводит к уменьшению лимфоцитов или нейтрофилов. Появление в крови молодых форм нейтрофилов, а именно ми елоцитов, юных, а также одновременное нарастание вместе с ними и палоч коядерных обычно сопровождается уменьшением в той или иной мере числа сегментоядерных нейтрофилов.

Лейкоцитарная формула в клинической практике имеет немаловажное значение. Нейтропения при острых инфекционных заболеваниях в большин стве случаев является неблагоприятным признаком, свидетельствующим об угнетении миелопоэтической функции костного мозга, об ослаблении про цессов регенерации.

Некоторым недостатком лейкоцитарной формулы является то, что она от ражает только относительное содержание в крови тех или иных форм белых кровяных телец и не дает представления об их абсолютных числах. Вслед ствие того, что учет абсолютных цифр лейкоцитов имеет большое значение для суждения о реактивном состоянии организма, то стали определять лейко цитарный профиль. Метод составления лейкоцитарного профиля заключает ся в графической регистрации взаимоотношений между основными группа ми лейкоцитов и отражении абсолютного содержания в 1 мм3 крови каждой из этих групп.

Количество столбцов таблицы соответствует основным видам лейкоци тов, причем в каждом прямоугольнике отмечаются границы нормальных ко лебаний абсолютного количества данного вида белых кровяных телец в мм3. Рядом приводятся предельные колебания тех цифр, которые взяты за норму. Ведут подсчет как отдельных форм клеток, пользуясь методом лейко цитарной формулы, так и в счетной камере, подсчитывая общее количество Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

белых кровяных телец в 1 мм3 крови.

В 1904 г Арнетом было предложено учение о так называемом ядерном сдвиге (степени изменения формы ядра), на основе которого он классифици ровал лейкоциты. Вначале Арнет учитывал сдвиги ядра только в нейтрофи лах, полагая, что между возрастом и сегментацией нейтрофилов существует определенная зависимость, т. е. чем моложе клетка крови, тем меньше сег ментировано ее ядро, и наоборот. В последующем он использовал данный подход и к классификации других форм белых кровяных телец.

По мнению Шиллинга, разделившего все лейкоциты периферической крови на восемь классов (базофилы, эозинофилы, нейтрофилы – миелоци ты, юные, палочкоядерные. сегментоядерные лимфоциты и моноциты), при определении возрастных изменений нейтрофилов имеет значение не столь ко степень сегментации ядра, сколько его структурные особенности. Чем моложе нейтрофил, тем нежнее окрашивается хроматин ядра, и, наоборот, чем старше клетка, тем, интенсивнее окрашивается ее ядро. Наиболее слабо окрашиваются миелоциты, наиболее интенсивно – сегментированные ней трофилы. Подходы Арнета и Шиллинга к классификации лейкоцитов имеют ряд существенных недостатков. Одним из них является учет только возраст ных изменений ядра и почти полная недооценка изменений в цитоплазме.

В настоящее время различают три следующих вида ядерного сдвига: ре генеративный, дегенеративный и смешанный. При регенеративном отмечают сдвиг влево до палочкоядерных, до юных, до миелоцитов, а величину сдвига обозначают особым индексом по формуле (в процентах):

М+Ю+п С где М – количество миелоцитов;

Ю – количество юных;

П – количество палочкоядерных;

С – количество сегментоядерных нейтрофилов.

Увеличение числителя означает сдвиг влево, а увеличение знаменате ля – сдвиг вправо. При сильных раздражениях костного мозга и усилении функции миелопоэза индекс ядерного сдвига может доходить до единицы и больше.

Дегенеративный сдвиг характеризуется в большинстве случаев уменьше нием общего количества нейтрофилов и появлением дегенеративных изме нений (пикноз, лизис, полисегментанция и вакуолизация ядер, токсическая зернистость, вакуоли в цитоплазме). Смешанный сдвиг представляет собой сочетание первых двух и в зависимости от преобладания процессов регене рации или дегенерации обозначается как регенеративно-дегенеративный или как дегенеративно-регенеративный.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Оборудование и реактивы: микроскоп, камера Горяева, меланжер для подсчета лейкоцитов, клавишный счетчик для составления лейкоформулы, мазки крови, окрашенные по Романовскому-Гимзе, 3% раствор уксусной кислоты, 96% спирт, иммерсионное масло.

Порядок выполнения работы 1. Произведите подсчет лейкоформулы на фиксированных мазках крови.

Подсчитывать отдельные формы лейкоцитов следует по четырехпольно му методу или двухпольному методу (Филиппченко) и посредине мазка (рис.

1), пользуясь во всех случаях линией меандра (древнего орнамента).

Подсчет по четырехпольному методу состоит в том, что в четырех участ ках мазка, вблизи каждого из его углов, подсчитывают по 25 (50) лейкоцитов, передвигая препарат с помощью крестообразного столика по ломаной линии в виде буквы П в следующей последовательности: от края мазка в его глубь на 3-4 поля зрения, затем на такое же количество полей в сторону и снова по направлению к краю мазка. Закончив подсчет, выводят процентное соотно шение отдельных видов лейкоцитов (рис. 12).

Рис. 12. Подсчет лейкоцитов: А – по четырехпольному методу;

Б – по Филиппченко;

В – посредине мазка.

Подсчет по двухпольному методу Филиппченко считается более удоб ным, так как в этом случае в обоих противоположных краях мазка по всей его ширине подсчитывают по 50 (100) лейкоцитов. Данный подсчет лейкоцитов ведут поперек мазка только в середине его и до тех пор, пока не подсчитают Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

100 (200) различных форм белой крови. Каждый сосчитанный лейкоцит от мечается в определенной графе специальной сетки (табл. 8). Заполнив пер вый вертикальный столбец десятью черточками, переходят ко второму столб цу. Заполнив всю сетку таблицы, подсчитывают количество черточек по го ризонтальным рядам. При подсчете 100 лейкоцитов сумма по горизонтали будет означать процентное соотношение для каждого вида лейкоцитов. При подсчете 200 или 400 клеток процентное соотношение получают делением полученной суммы на 2 или 4.

2. Определите количества лейкоцитов крови в камере Горяева.

С помощью резиновой трубочки наберите кровь в смеситель для подсчета лейкоцитов до метки 0,5. Затем опустите меланжер в склянку с 3%-ным рас твором уксусной кислоты и, держа его под углом, заполните раствором до метки 11. Встряхните в течение 5 - 10 с и положите горизонтально.

Перед заполнением счетной камеры Горяева плотно притрите к ее боко вым полям шлифованное стекло до появления радужных колец (кольца Нью тона). Перед заполнением камеры смеситель встряхните в течение 2-3 минут.

Первые 2-3 капли удалите, а затем заполните счетную камеру, приложив ме ланжер с выступающей каплей к краю шлифованного стекла. В силу закона капиллярности жидкость заполняет пространство камеры под покровным стеклом. После заполнения камера должна постоять 2-3 минуты, чтобы эле менты крови осели на дно и их движение прекратилось. Подсчет лейкоцитов производите в 50 больших квадратах.

3. Определите лейкоцитарный профиль крови, изучив ниже изложенный пример.

Пример. Общее количество лейкоцитов в 1 мм3 крови 10 000. По лейкоци тарной формуле найдено: палочкоядерных нейтрофилов 4%, сегментоядер ных 55%, лимфоцитов 31%, моноцитов 2% и т. д.

Таким образом, абсолютное число («профиль») палочкоядерных ней 10000 = 5500 ;

трофилов будет: сегментоядерных лимфоцитов и т.д.

Полученные данные отмечают в соответствующих графах и, соединив их линией, получают графическое изображение состояния белой крови, или лейкоцитарный профиль.

Содержание отчета 3. Результаты подсчета лейкоцитов занесите в специальную сетку (табл.

1). В данной сетке дана дифференциальная запись подсчитываемых лейкоци тов на основе выше рассмотренного примера.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Таблица Сетка для дифференциальной записи подсчитываемых лейкоцитов 2. Результаты подсчета лейкоцитов в счетной камере используйте для рас чета количества форменных элементов в 1 мм3 крови в соответствии с фор мулой:

где: Х—количество форменных элементов в 1 мм3 крови;

а – количество форменных элементов в определенном количестве квадратов;

б – количество сосчитанных квадратов;

в – степень разведения крови.

Пример, в 50 больших квадратах (или 800 маленьких) сосчитано 100 лей коцитов, кровь была разведена в 20 раз. Количество лейкоцитов в 1 мм3:

3. Изобразите в виде графика лейкоцитарный профиль крови, отметив по оси Х названия лейкоцитарных элементов, а по оси У – их абсолютные зна чения. Определите тип сдвига, сделайте вывод о функциональном состоянии лейкоцитарного звена системы крови.

Контрольные вопросы 5. Назовите гистологические структуры, участвующие в иммунном ответе.

6. Основные этапы иммунного ответа.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

7. Изобразите схему антигенного стимула и специфического иммунного ответа.

8. Какие механизмы лежат в основе распознавания антигена?

9. Какие клеточные линии кооперируются в процессе антителогенеза?

10. Дайте определение иммунологической памяти.

11. Каков механизм иммунологической памяти?

12. Какие клетки являются хранителями иммунологической памяти?

13. Перечислите гормоны, выделяемые иммунной системой.

14. Назовите медиаторы, участвующие в иммунном ответе.

15. Приведите схему трех клеточного взаимодействия.

16. В чем биологический смысл двойного распознавания антигенов?

Лабораторная работа № 4. Определение активированных лимфоцитов крови Цель работы: изучить этапы приготовления и окраски мазков крови, нау читься диагностировать напряженность иммунитета по динамике размерных классов лимфоцитов в периферической крови, изучить порядок работы на атомно-силовом сканирующем зондовом микроскопе «ИнтеграВита»

Общие сведения по теме Активность лимфоцитов в крови определяют по их минимальному диа метру. Лимфоциты приобретают морфологию очень малых лимфоцитов диа метром 6,5 мкм и меньше после стимуляции антигенами циркулирующих лимфоцитов в периферических лимфоидных органах их бластной транс формации в крупные клетки с последующей серией митозов (6-10 раз), при которых объем цитоплазмы уменьшается за счет короткой интерфазы между делениями, не позволяющей восстановить исходный объем цитоплазмы. В итоге образуются клоны очень малых лимфоцитов, которые покидают лим фоидный орган и становятся доступными для анализа при взятии крови. В длительно циркулирующих лимфоцитах (дни, недели, месяцы) объем клетки восстанавливается в пределах их тканевой и видовой нормы реакции. Объ ем пролиферативного пула лимфоцитов, выделяющихся из периферических лимфоидных органов, колеблется в зависимости от антигенной нагрузки, физиологического состояния и конституциональных особенностей организ ма, влияния на него факторов внешней среды.

У здоровых доноров частота классов 6,5 мкм и меньше равняется 45,4%.

У больных неврозами на фоне абсолютного голодания частота активирован ных лимфоцитов в периферической крови снижается до 29,7% в связи с их депонированием в шоковых органах (желудочно-кишечный тракт) и частич ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ но за счет угнетения образования в периферических лимфоидных органах.

У хирургических больных до общего наркоза доля активированных лимфо цитов по цитоморфометрическому показателю – 32,7%, а спустя час после наркоза – 62,8%. Полагают, что такое изменение обусловлено нарушением миграции активированных лимфоцитов и их нормального перераспределе ния между системами органов.

Оборудование и реактивы: предметные стекла, шлифовальное стекло, за буференная вода, краситель по Романовскому-Гимзе, зондовая нанолабора тория «ИнтеграВита».

Порядок выполнения работы 1. Изучите основные этапы приготовления мазков крови, приготовьте и окрасьте мазок.

Мазки крови и цитологические препараты готовят на хорошо обезжирен ных и чистых предметных стёклах с ровной поверхностью без царапин и шероховатостей.

Техника приготовления мазка. Для приготовления мазка с места разреза снимают каплю крови, прикасаясь к ней поверхностью предметного стекла или берут её углом шлифовального стекла и переносят на предметное стекло.

При работе с капилляром на предметное стекло лучше наносить небольшую каплю. Она должна быть соразмерна так, чтобы мазок помещался на стекле, не доходя 1 см до его узких концов. Если капля слишком велика, мазки полу чаются очень толстыми, неравномерными и не обрываясь, доходят до конца стекла. Если же капля мала, то мазки получаются короткими, прерываются, имеют выступы и оканчиваются длинными язычками. По возможности кровь для приготовления мазка нужно использовать сразу же после её извлечения из организма, чтобы она не утратила свои физические свойства и, прежде всего, до наступления процесса её свёртывания.

Для приготовления мазка в левую руку берут предметное стекло и зажима ют его короткие рёбра пальцами – большим и средним, затем наносят на пра вый конец стекла маленькую каплю крови. Кончиками большого и указатель ного пальцев правой руки берут шлифовальное стекло за его длинные рёбра как можно ближе к одной его сторон. Шлифовальное стекло ставят впереди капли под углом 450. Затем надавливают (надвигают) стекло на каплю до тех пор, пока она не соприкоснется с ним и не растечётся по его краю. После это го шлифованное стекло под тем же углом быстро проводят по предметному стеклу вперёд так, чтобы кровь непрерывно и равномерно тянулась за краем шлифовального стекла. Кровь не должна попадать под шлифовальное стек ло, так как это вызывает механическое разрушение её клеток. Шлифовальное Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

стекло следует отнимать от предметного стекла только на левом его конце.

При этом бугорки пальцев должны скользить по рёбрам предметного стекла, создавая равномерное движение.

Сушка мазков. Мазки следует сушить на воздухе. При медленном его вы сыхании в холодную погоду можно предварительно стёкла подогревать на горелке или крышке стерилизатора, наполненного тёплой водой, или, взяв мазок пальцами за рёбра стекла, помахать им в воздухе до исчезновения влажного блеска.

Мазок должен высыхать быстро, так как иначе клетки сморщиваются и теряют свою форму. Наибольшая сохранность клеток наблюдается при обыч ном высыхании мазка без подогрева в условиях низкой влажности, то есть высокой сухости воздушной среды. При использовании для сушки мазка сте рилизатора или горелки надо помнить, что после подогрева стёкла должны быть тёплыми, но не горячими. В противном случае, это вызовет повреж дение клеток крови. После высыхания мазка его маркируют: нумеруют и датируют с помощью карандаша или иглы. Хорошо приготовленный мазок должен занимать не более 2/3 предметного стекла, оканчиваться свободно в виде бахромки. Он должен быть уже предметного стекла и располагаться в его срединной части так, чтобы с обоих его боков были свободные поля. Вы сушенные мазки фиксируют.

Фиксация мазков. Цель фиксации мазков – закрепить клетки крови на сте кле, не изменяя их морфологии. Это необходимо для последующей окраски мазков. Фиксация основана на обезвоживании препаратов. В связи с этим лучшими фиксаторами мазков являются спирты, но можно использовать и другие вещества или растворители. Наиболее часто применяют следующие фиксаторы:

Денатурированный и 96% этиловый спирты дают много артефактов и де фектов, поэтому необходимо пользоваться абсолютным этиловым спиртом.

Для приготовления абсолютного этилового спирта в продажный (негидро лизованный) спирт добавляют порошок безводного прокалённого медного купороса.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Окраска мазков Окраску мазков проводят с целью идентификации структурных компо нентов клеток крови и костного мозга, которые позволяют отличать и прово дить подсчёт форменных элементов крови. Механизм окраски клеток точно не установлен. Согласно существующей теории клетки крови содержат в своём составе различные структуры и органеллы обладающие, кислой или щелочной реакцией. Краски, как правило, тоже содержат кислый или щелоч ной компонент. При окрашивании кислые части клеток взаимодействуют со щелочными красителями, а щелочные – с кислыми. Нуклеиновые кислоты, содержащиеся в ядрах клеток, при окрашивании щелочными компонентами красок приобретают интенсивно синюю или фиолетовую окраску. Кислые компоненты красителей окрашивают щелочные белки и органеллы цито плазмы в розовато-красный цвет.

На качество окраски мазков влияет: продолжительность и порядок окра шивания;

если используется несколько растворов красок, то стабильность их при хранении;

если применяется водный раствор, то рН среды. Поэтому для оценки красящих свойств красок готовят сразу несколько мазков крови, окрашивая их в зависимости от метода окраски в течение различного вре мени. Выбирают тот режим окрашивания, при котором получена наиболее яркая и дифференцированная окраска форменных элементов.

При промывании мазков, их докрашивании и при приготовлении краски необходимо использовать дистиллированную воду нейтральной реакции.

При хранении склянка с нейтральной водой должна быть хорошо закрыта, так как углекислота воздуха, соприкасаясь с водой, может изменять её рН.

Для устранения этого процесса рекомендуется готовить забуферную воду на основе растворов фосфорнокислых солей. Приготовленные растворы смешивают и определяют величину рН. До нейтральной её доводят путём прибавления первого или второго растворов. Наличие фосфатной буферной смеси обеспечивает буферную ёмкость раствора, т.е. стабильность величины рН при попадании в него небольших количеств кислоты или щёлочи. При готовленные растворы фосфатов хранят отдельно, лучше в тёмных склянках.

Смесь растворов при длительном хранении прорастает микроорганизмами, поэтому её рекомендуется законсервировать маленьким кристалликом тимо ла. Для буфера готовится 2 раствора:

9,5 г натрия фосфорнокислого двузамещённого безводного, или 22,7 г на трия фосфорнокислого двузамещённого 12-водного, доводится до 1000 мл дистиллированной водой;

9,07 г калия фосфорнокислого однозамещённого доводится до 1000 мл дистиллированной водой.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

В колбу на 1000 мл вносится 63 мл первого раствора и 37 мл второго и доводится до 1000 мл дистиллированной водой (рН полученного раствора должно находиться в пределах 6,8-7,2).

Растворы красителей готовят и применяют в зависимости от задач ис следования. Наиболее широко используемые в гематологии рецепты красок приведены ниже.

Окраска по Романовскому-Гимзе В работе используют продажную краску или готовят непосредственно перед началом работы. Концентрированный раствор готовят так: делают на веску 3,8 г и растворяют её в 250 мл метилового или 960 этилового спирта.

В течение нескольких дней раствор вызревает в тёмном месте. Для лучшего растворения краски его нужно часто взбалтывать. Когда краска раствориться в раствор приливают 250 мл х. ч. глицерина и, часто помешивая, оставляют в темноте на 3-5 дней. Для приготовления рабочего раствора необходимо про вести титрование концентрированного красителя. Для этого в трёх цилин драх готовят различные разведения краски из расчёта 1 капля концентриро ванного красителя на 1 мл дистиллированной воды, 2 капли на 1 мл и 3 кап ли на 1 мл. Каждым из растворов окрашивают 5-6 зафиксированных мазков крови в течение различного времени: 20, 25, 30 и 40 мин. На каждом мазке отмечают время, в течение которого он будет окрашен. Затем мазки микро скопируют и определяют разведение краски и время, при которых получена наилучшая окраска. Разведение принимается за титр данной серии краски, а время окраски – за постоянную экспозицию.

Обычно рабочий раствор готовят из расчёта 1,5-2 капли на 1 мл дистилли рованной воды (5 мл краски на 100 мл воды). Раствор краски тонкой струей осторожно наливают в стакан с водой по его стенке, всё время перемешивая.

Мазки кладут узкими рёбрами (лицевой стороной вниз) на 2 спички или сте клянные палочки в чашку Петри и наливают приготовленный раствор кра ски. Раствор краски наливают под мазок, чтобы осадок не пачкал его. Для окрашивания большого количества мазков применяют кювету, на дно кото рой кладут лист стекла, а него – узкие стеклянные плоски. На них в несколь ко рядов кладут препараты вниз мазками и с одного конца под них заливают раствор. Таким способом можно единовременно окрасить 50 и более мазков.

Важно следить, чтобы под мазки не попали пузырьки воздуха, так как его участки над ними останутся не докрашенными. Продолжительность окраски 20-30 мин, после чего мазки промывают буфером и ставят для сушки на воз духе узким ребром на доску с желобами, не касаясь препарата руками. Вы сушенный мазок на несколько секунд погружают в спирт для лучшей диф ференцировки ядра. Не смывая спирт, препарат высушивают и исследуют ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ под микроскопом. Недокрашенные препараты, а так же мазки, обработанные несвободной от кислот дистиллированной водой, имеют красный оттенок на поверхности.

При качественной окраске мазков ядра лейкоцитов должны быть окра шены в красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма в голубой. Цитоплазма ней трофилов слегка розовая или светлая с мелкой зернистостью. Зернистость эозинофилов ярко-розовая, цитоплазма моноцитов – голубовато-сероватая.

Нейтральная и кислая среда красок окрашивает эритроциты в розовый, а ще лочная – в голубоватые цвета. Синие тона мазков указывают на кислотность воды. Перекрашенные мазки можно частично восстановить, прополоскав их в этиловом спирте.

2. Определите размеры лимфоцитов.

Для определения размеров лимфоцитов рекомендуется использовать на номикроскоп «Интегра Вита». Для этого изучите порядок и правила работы на микроскопе, используя руководство пользователя (Руководство пользова теля ИнтегроВита, НТ-МДТ, 2006). Получите сканы лимфоцитов, используя метод постоянной силы АСМ.

Режим «Сканирование образцом».

Включение прибора.

8. Включить компьютер: на бесперебойнике включить большую кноп ку, загорится зеленая лапочка.

9. Открыть тумбочку, включить системный блок (выше термоконтролера).

10. Включить кнопку на мониторе.

11. Запустить программу при помощи ярлыка Nova.

12. Включить прибор тумблера на передней панели СЗМ-контролера. По завершении инциализации прибора появиться квадратик – прибор го тов к работе;

– не включен контролер;

– не установлена интерфейсная плата, либо не исправлен контролер.

Прибор необходимо прогреть в течение 40 минут.

13. Открутить винт сзади микроскопа, отклонить тубус назад.

14. Включить свет и монитор (SHOTT – система наведения лазера).

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

15. Разблокировать антивибрационный столик, нажать кнопку POWER, а затем Е.

16. Загрузка калибровочных параметров:

В главном меню выбрать Setting – Calibrations – Load calibrations.

В результате откроется окно со списком par. файлов, содержащихся в пап ке PARFIELS, из этого списка выбрать файл 10017_dry.par, щелкнуть open.

«Конфигурация сканирование образцом»

7. Установка зондового датчика.

8. Настройка оптической системы.

9. Центрирование сканера.

10. Установка образца.

11. Установка измерительной головки.

Изучите основные части прибора «Интегра Вита» (рис. 9).

Рис. 9. ИНТЕГРА Вита 1 – базовый блок;

2 – инвертированный оптический микроскоп Olympus IX-71;

3 – система видеонаблюдения;

4 – измерительная головка;

5 – виброизолирующий стол ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Для установки зондового датчика выполнить действия:

отжать пружину держателя зондового датчика;

взять зондовый датчик из коробки пинцетом, с учетом того, что рабочая грань чипа с кантиливером при постановке будет обращена к вам. Не пово рачивать чип, т.к. зондовые датчики лежат остриями вверх;

Поместить датчик пинцетом на рабочее место и зафиксировать пружиной.

Настройка оптической системы включает в себя наведение лазерного луча на кантилевер.

Задача процедуры состоит в том, чтобы навести лазерное пятно на кон чик кантилевера. Настройка лазера производится в результате перемещения кантилевера относительно неподвижного луча (реально луч неподвижен, перемещается кантилевер). Включение и выключение лазера производится кнопкой, расположенной справа на панели основных параметров. При запу ске программы управления лазер запускается автоматически.

Для настройки системы регистрации предназначена вкладка AMING, от крывается кнопкой, на панели основных операций.

Панель настройки системы регистраций состоит из расположенного сле ва индикатора лазерного пятна относительно секций фотодиода и таблицы, в которой отображаются текущие значения сигналов фотодиода. Отображения величины соответствуют следующим сигналам:

DFL – разностный сигнал между верхней и нижней половинами фото диода, LF – разностный сигнал между левой и правой половинами фотодиода, LASER – суммарному сигналу, поступающему со всех четырех секций фотодиода и соответственно пропорциональному интенсивности лазерного излучения, отраженного от кантилевера.

Наведение лазерного луча на кантилевер 2. Попытайтесь определить, где находится лазерное пятно. Воспользуй тесь наблюдением изображения прошедшего лазерного луча на экране. Для этого возьмите измерительную головку и приподнимите ее примерно на 10 15 см над листом бумаги, используя его в качестве экрана.

3. Вращением винта 2 (рис. 13) добейтесь появления неискаженного ла зерного пятна.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

Рис. 13. Измерительная головка 1, 2 – винты позиционирования лазера;

3, 4 – винты позиционирования фотодиода 4. Вращая винт 2, перемещайте луч перпендикулярно переднему краю чипа 1 – 2 до тех пор, пока лазерное пятно не исказится.

5. Вращая винт 1, перемещайте луч параллельно переднему краю чипа.

Возможны два варианта:

1. лазерное пятно движется по краю держателя (2 – 3), в этом случае при падении на чип оно пропадает;

2. лазерное пятно движется по краю чипа (4 – 5), в этом случае при по падании на кантиливер возникает интерференционная картина. Лазерный луч находится у основания кантиливера. Перемещайте его по направлению к кончику кантилевера. Лазерный луч наведен на кантилевер.

6. При исчезновении пятна вращайте винт 2, перемещая лазерный луч к торну чипа (3 – 4) до тех пор, пока не появится лазерное пятно. Теперь лазер ный луч находится на краю чипа (положение 4).

7. Вращая винт 1, перемещайте луч по переднему краю чипа до появ ления интерференционной картины. Лазерный луч находится у основания кантилевера.

8. Переместите лазерный луч по направлению к кончику кантиливера, вращая винты 1, 2.

Точная настройка системы регистрации 1) Вращая винт позиционирования фотодиода добейтесь чтобы световое пятно на индикаторе оказалось в центре индикатора. При этом значения сиг налов DFL и LF должны быть близки к нулю.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ 2) Проверьте, чтобы лазерный луч действительно попадал на кантили вер. Признаком этого является то, что при вращении винта 1, а также винта сначала в одну сторону, затем в другую, значения сигнала LASER уменьша ются.

3) Вращая винты позиционирования лазера 1 и 2, чуть-чуть перемещая луч относительно кантиливера, настройтесь на максимальное значение сум марного сигнала фотодиода (LASER). Значение сигнала LASER должно на ходиться в диапазоне 20 – 50 нА.

4) После повторяйте подстройку положения фотодиода, поскольку луч может сместиться.

Установка образца Конфигурация сканирование образцом позволяет исследовать образцы со следующими параметрами: диаметр – 40 мм, высота до 15 мм, вес до 100 г.

Установка измерительной головки Расстояние между зондом и поверхностью образца после установки из мерительной головки должно быть не менее 1-2 мм. Если расстояние менее 1-2 мм опустите образец, вращая ручку подвода. Установите передние опоры измерительной головки, не опуская заднюю опору, затем опустите заднюю опору.

Предварительный подвод 4. Глядя сбоку и вращая ручку подвода против часовой стрелки, подведи те образец к зонду на расстоянии 0,5 – 1 мм.

5. Глядя сверху, убедитесь, что зонд находится в нужном месте отно сительно образца. Глядя сбоку, убедитесь, что зонд не заденет ничего при последующем подводе. Проверьте настройку системы регистрации изгибов канитилевера при помощи индикатора фотодиода и при необходимости про изведите подстройку.

МЕТОД ПОСТОЯННОЙ СИЛЫ 1. Подготовка к измерениям. Исходное состояние:

3.2. Программа управления запущена.

3.3. Прибор включен.

3.4. Зондовый датчик установлен, и система регистрации отклонения кантилевера настроена.

3.5. Образец установлен.

3.6. Измерительная головка установлена.

3.7. Образцец подведен к зонду на расстоянии 0,5 – 1 мм.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

2. Основные операции при работе с использованием методов контактной микроскопии:

3.8. Выбор конфигурации.

3.9. Установка начального уровня сигнала DFL.

3.10. Подвод образца к зонду.

3.11. Установка рабочего уровня коэффициента усиления цепи обратной связи.

3.12. Установка параметров сканирования.

3.13. Сканирование.

Выбор конфигурации Выбрать Contacn на панели основных параметров.

Установка начального уровня сигнала DFL Величина начального уровня DFL, соответствующая свободному состоя нию кантилевера определяется тем, как фотоприемник установлен относи тельного отраженного от кантилевера луча. Нулевое значение сигнала DFL соответствует тому, что лазерное пятно находится посередине между верх ней и нижней половинами фотодиода и площадь пятна одинаково распреде лена между ними.

Величину начального уровня сигнала DFL можно регулировать при помо щи винта 4 в результате механического перемещения фотодиода в поперечном направлении относительного лазерного луча, отраженного от кантилевера.

Процедура регулирования уровня сигнала DFL 22. перейдите на вкладку Aming на панели операций;

23. наблюдая за уровнем сигнала на индикаторе, установите при помо щи винта 4 начальный уровень сигнала. DFL равен 0 ±0,1.

Подвод образца к зонду 6. перейти на вкладку Approach на панели;

7. включите режим автоматической установки параметра Auto SetPoint, нажав кнопку;

8. запустите процедуру подвода, щелкнув на кнопке Landing. В результате выполнения этой процедуры:

9. замкнется цепь обратной связи, и Z-секция сканера выдвинется на мак симальную величину, что отобразится на индикаторе выдвижения сканера, который находится в нижнем левом углу главного окна программы. Степень выдвижения сканера характеризуется длиной цветной полосы индикатора выдвижения сканера ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ 4. будет автоматически установлено значение параметра SetPoint на две единицы больше начального значения сигнала DFL (SetPoint = DFL+2) 5. включается шаговый двигатель, выполняющий подвод образца к зонду.

В процессе подвода следить за изменениями DFL. Через 10-30- секунд при правильной настройке параметров подвода, подвод закончится и произойдет следующее:

7. сигнал DFL увеличится до значения параметров SetPoint, цепь обрат ной связи будет поддерживать Z-сканер в положении, при котором сигнал DFL равен SetPoint, причем это положение сканера будет соответствовать примерно половине диапазона выдвижения сканера 8. длина линии индикатора уменьшится и займет некоторое промежуточ ное положение 9. шаговый двигатель отключится 10. увеличение сигнала DFL до значения параметра SetPoint будет отобра жается на зависимости DFL(t) на программе осциллографа 11. в журнале появится сообщение «»Approach Done Выбор и установка параметров SetPoint вручную Чтобы вручную установить значение параметра SetPoint:

3. Отключите режим автоматической установки параметра Auto SetPoint (кнопка отжата);

4. Введите значение параметра SetPoint в поле ввода, расположенном на панели основных параметров. В качестве начального параметра SetPoint рав ным сумме сигналов DFLплюс примерно (5-10%) от значения сигнала Laser (SetPoint = DFL+(0,05-0,01)*Laser).

При выборе оптимального значения параметра SetPoint необходимо иметь в виду следующее:

– разность между величиной SetPoint и начальным уровнем сигнала DFL определяет величину взаимодействия острия зонда и поверхности образца.

Чем больше разность между величинами SetPoint и начальным уровнем сиг нала DFL, тем больше величина изгиба кантилевера, тем с большей силой взаимодействует острие зонда и поверхность образца. Таким образом, меняя величину параметра SetPoint относительно начального уровня сигнала DFL можно изменять и устанавливать определенный уровень силы взаимодей ствия между зондом и поверхностью образца.

если установить слишком большую разницу между величиной Set Point и начальным уровнем DFL, что соответствует значительной силе при жима острия кантилевера и поверхности образца, то при сканировании это может привести к разрушению, как зонда, так и исследуемой поверхности;

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

при слишком малой величине разницы между SetPoint и начальным уровнем DFL, что соответствует режиму работы в условиях поддержания не большой по величине силе прижима острия кантилевера к поверхности об разца, работа системы обратной связи может оказаться неустойчивой;

величина параметра SetPoint не может быть меньше величины на чального уровня сигнала DFL и больше величины сигнала Laser.

Установка рабочего уровня коэффициента усиления цепи обратной связи Чем больше величина коэффициента усиления (параметр FBGain), тем выше скорость обработки петли обратной связи. Однако, при достаточно большой величина коэффициента усиления (назовем ее пороговой), режим работы цепи обратной связи становится неустойчивым и начинается генера ция. Появляется значительная величина сигнала DFL. Для устойчивой рабо ты рекомендуется устанавливать уровень коэффициента усиления не более 0,5-0,7 от уровня порогового значения, при котором начинается генерация.

Регулировка коэффициента усиления производится в поле ввода FBGain.

Для установки рабочего уровня коэффициента усиления цепи обратной связи, надо:

1) щелкнуть дважды на поле вводе FBGain на панели основных параме тров, в результате появится ползунок;

2) увеличивая величину FBGain, следите за уровнем сигнала DFL при по мощи программного осциллографа;

3) определите значение параметра FBGain, при котором начинается гене рация. Начало генерации регистрируется по появлению значительной пере менной составляющей сигнала DFL;

4) уменьшая параметр FBGain, установите в качестве рабочей величины значение 0,5-0,7 от значения коэффициента усиления FBGain, при котором начинается генерация сигнала DFL.

Если после уменьшения параметра FBGain до значения 0,3 и ниже устра нить генерацию не удалось, то выполняются следующие действия:

– разомкните цепь обратной связи (кнопка отжата);

– уменьшите сигнал Mag на 20-50%, изменяя коэффициент усиления син хронного усилителя (параметр Gain) и предусилителя (параметр Preamplier);

– увеличьте напряжение генератора (параметр Amplitude), доводя значе ние сигнала Mag до 20-25 (если при сканировании образца надо использо вать маленькую амплитуду колебаний кантилевера, то установите сигнал Mag менее 20);

– замкните цепь обратной связи (кнопка нажата). Если генерация исчезла, переходите к следующей операции, в противном случае все повторите сначала.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Установка параметров сканирования Перейдите на вкладку Scan (кнопка на панели основных операций).

В верхней части вкладки Scan находится панель управления сканированием.

Выбор АСМ метода На панели управления в списке Mode выберите метод Contact Topography (Contact Force).

Задание площади сканирования Изменение площади сканирования:

1) включите операцию изменение размера и выбора области, на панели отображения 2D-данных сканирования;

2) при помощи мыши измените размер и положение области сканиро вания;

3) проверьте, что в пределах выбранной области сканирования зонд всюду достает до поверхности и нигде не врезается в нее. Для этого, нажав левую клавишу мыши и удерживая ее, перемещайте курсор в пределах выбранной области сканирования. Его перемещение отражает реальное перемещение зонда относительно поверхности образца. Степень выдвижения пьезоскане ра контролируйте по индикатору в нижней части окна.

Установка размера сканированного изображения, числа точек, шага сканирования Число точек по осям Х и Y (Point Number), размер сканированного изо бражения (параметр Scan Size) и шаг сканирования (Step Size) задаются при помощи кнопки со сигналом выбора параметра.

Установка скорости сканирования Выбор оптимального значения скорости сканирования зависит от свойств поверхности исследуемого объекта, размера области сканирования, внеш них условий. Поверхность с гладким рельефом можно сканировать с более высокой скоростью, чем с неровным рельефом поверхности. Первоначально рекомендуется установить частоту сканирования строк (параметр Frequency) в пределах 0,5-2 Гц.

Сканирование Для запуска сканирования щелкните на кнопке Run, расположенной на панели управления вкладки Scan. Начнется построчное сканирование по верхности образца в области 2D-данных. На панели управления вкладки Scan некоторые кнопки исчезнут, и появиться ряд новых кнопок: Pause, Re Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

start, Stop. Если по какой-то причине необходимо прекратить сканирование, надо щелкнуть на Stop или нажать Escabe.

Изменение параметров в процессе сканирования. В процессе сканирова ния можно вычесть наклон, используя кнопку Subtract. По умолчанию она находится в состоянии None. Если щелкнуть по этой кнопке и выбрать из списка Plane, то будет выполнено вычитание в плоскости.

Настройка параметров в процессе сканирования. Параметры Frequency, FBGain, SetPoint можно изменять в процессе сканирования, от них зависит качество изображения. Для подстройки параметров сканирования имеется кнопка Pause. При нажатии этой кнопки, развертка по медленной оси оста навливается, сканирование вдоль быстрой оси продолжается и происходит вдоль одной и той же линии. Этот режим используется для подбора опти мальных параметров. При отключении кнопки сканирование продолжается с той же скоростью. Кнопка Restart осуществляет повторный запуск сканиро вания. После Pause нажать Restart.

Сохранение полученных данных 25. В главном меню выберите File – Save;

26. в открытом диалоговом окне выберите каталог, в котором хранятся данные С:\Program Files\NT-MDT\Nova;

27. введите название6 файла с расширением *mdt.

Завершение измерений 1) Разомните цепь обратной связи (кнопка отжата);

2) отведите образец от зонда, для этого выполните следующие действия:

– перейдите на вкладку Approach;

– щелкните дважды на поле ввода Moving для Backward на панели управ ления вкладки Approach. С помощью появившегося ползунка установите ве личину 2-3- мм;

– чтобы отвести образец от зонда, щелкните на кнопке для Backward.

Получите сканы 10 лимфоцитов, измерьте их размеры (рис.10).

Содержание отчета Данные по измерению размеров лимфоцитов представьте в виде таблицы.

По результатам измерений постройте график распределения лимфоцитов по их диаметру. По оси абсцисс откладывают величины диаметров в микронах, а по оси ординат – процент лимфоцитов соответствующей величины.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Рис. 10. Скан лимфоцита крысы, полученный в зондовой нанолаборатории «Интегра Вита» (Скоркина М.Ю., Чернявских С.Д., 2008).

Контрольные вопросы Опишите механизмы активации Т-хелперов.

В чем смысл аутокринной активации различных субпопуляций Т-хелперов? Какие цитокины они вырабатывают?

Опишите механизмы активации Т-киллеров.

Дайте характеристику функциональным субпопуляциям Т-киллеров.

Какие цитокины продуцируют Т-лимфоциты.

Дайте определения понятиям иммунологическая супрессия и иммуно логическая толерантность.

Опишите механизмы супрессии и толерантности.

Перечислите основные медиаторы и гормоны иммунной системы.

Дайте общую характеристику и классификацию цитокинам.

Опишите биологические эффекты основных классов цитокинов.

Лабораторная работа № 5. Пересадка донорской кожи у амфибий Цель работы: освоить методы пересадки донорской кожи;

изучить реак ции трансплантационного иммунитета.

Общие сведения по теме Существуют две проблемы трансплантации:

3) Технический аспект – включает консервацию и подготовку транс плантат, а также выбор оптимальных хирургических методов, позволяющих быстро восстановить функцию пересаженного органа;

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

4) Иммунологический аспект – связан с подбором донора.

С точки зрения иммунологии различают следующие виды транспланта ции: 1) аутотрансплантация, при которой трансплантат переносят с одного участка на другой в пределах одного организма. Аутотрансплантаты исполь зуют для замены поврежденных или утраченных тканей, таких как кожа, кости или хрящ. При этом иммунная реакция на трансплантат отсутствует;

2) алло(гомо)трансплантация – это пересадка органов и тканей между орга низмами одного и того же вида. При этом донор и реципиент не являются генетически идентичными. Успех трансплантации зависит от степени их ги стосовместимости;

3) ксено(гетеро)трансплантация – это пересадка органов в пределах двух разных видов.


Отторжение с клинической точки зрения бывает: сверхострое – на опера ционном столе;

острое – в течение первых месяцев после пересадки;

отсро ченное – через несколько лет после пересадки.

Иммунный ответ организма на трансплантат детально изучен на модели пересадки кожного лоскута. В зависимости от того, произведена ли пере садка сенсибилизированному или несенсибилизированному реципиенту, различают первичный и вторичный иммунный ответ. Одна из особых форм вторичного ответа – феномен «белый трансплантат».

При аллогенной трансплантации на кожном трансплантате в течение 1- дней в лоскуте аллогенной кожи устанавливается сосудистое кровообраще ние с подлежащими тканями реципиента, лоскут сливается краями с кожей хозяина. Первые 4-5 дней не наблюдается признаков отторжения. К 6-7 дню аллотрансплантат становится отечным. Появляются признаки прекращения кровотока в сосудах, развивается застой, большое число мононуклеарных клеток (лимфоцитов) выходит из кровеносных сосудов в дерму трансплан тата. Трансплантат резко отекает, становится твердым, изменяется его цвет, эпидермис и волосяные фолликулы подвергаются дегенеративным измене ниям с полной деструкцией эпителия на 10-11-й день.

Вторичный трансплантат от того же донора отторгается быстрее (без латентного периода). Более быстрое отторжение вторичного трансплантат называется second set-реакцией. Ускоренное отторжение при second set реакции связано с тем, что начальная васкуляризация трансплантата быстро сменяется тромбозом сосудов и некрозами. Наиболее выраженной формой second set-реакции является форма отторжения по типу белого трансплантат – white graft. В этом случае трансплантат не васкуляризуется, не гранулирует – остается тонким и белым. Процессы деструкции развиваются сразу после пересадки.

Механизм клеточного взаимодействия при отторжении трансплантата рассмотрим на примере реакций клеточно-опосредованного лимфолизи ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ са (MCL). Различия по D- локусу главного комплекса гистосовместимо сти способствуют проявлению Т-клеточной пролиферации, а несовмести мость клеток по А-, В или С- обуславливает цитотоксическое влияние этих клеток-киллеров на клетки-мишени. Такая ситуация возникает при пере садке аллогенного трансплантата. При первичной стимуляции вследствие различий по антигенам HLA-D формируют Т-хелперы, которые могут акти вировать Т-киллеры, усиливая цитотоксические реакции, и стимулировать В-клетки к продукции антител. Первичная стимуляция приводит к активации Т-супрессоров. При этом возможен блокирующий эффект антител к HLA-A, B, C антигенам.

Оборудование и реактивы: ванночка для лягушек, ножницы, пинцет, пре паровальные иглы, предметные стекла, миллиметровая бумага, забуференый физиологический раствор, спирт-эфир, вата, бинт.

Порядок выполнения работы 1. Выполните процедуры подготовки донорской кожи.

Животное-донора наркотизируют, помещая в банку, содержащую смесь спирт-эфира на 5-10 мин. Вырезают у него на животе участок кожи (сред ний размер трансплантанта 3х3 мм). При работе с донорской кожей следует избегать ее повреждений пинцетом, так как в противном случае на транс плантате могут образоваться очаги неспецифической аутодеструкции. Кожу переносят на предметное стекло в каплю холодного забуференного физио логического раствора, затем расправляют её. Предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу и кусочки кожи нарезают на фрагменты нужного размера.

2. Произведите необходимые манипуляции с животным-хозяином.

На коже спины наркотизированного животного делают разрез длиной 4- мм и немедленно вставляют в него трансплантат так, чтобы края разреза со шлись над пересаженной кожей. Это облегчает доступ к трансплантату через 48 ч, когда кожу хозяина срезают, чтобы обнажить белую кожу донора. К это му моменту кожа должна прочно прирасти. Васкуаляризация трансплантата обычно происходит через 3-5 дней после пересадки.

Содержание отчета Чтобы точно установить момент отторжения необходимо ежедневное на блюдение. Наблюдение должно осуществляться в течение первых 14 суток.

Результаты наблюдения занесите в таблицу.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

Оценка состояния трансплантата Состояние трансплантатов оценивают, рассматривая под лупой и прощу пывая иглой. Наблюдаемые изменения классифицируют следующим обра зом:

+++ – трансплантат прочно прирос к тканям хозяина;

++ – трансплантат приподнят;

(++) – трансплантат приподнят и некротизирован;

+ – трансплантат частично отторгнут;

(+) – трансплантат частично отторгнут и некротизирован;

– трансплантат полностью отторгнут.

Сроком отторжения трансплантата считают промежуток времени между пересадкой и полным отторжением.

Контрольные вопросы 3. Перечислите виды трансплантации.

4. Назовите факторы, влияющие на реакции трансплантационного имму нитета.

5. В чем сущность первичного иммунного ответа на трансплантат?

6. В каком случае развивается вторичный тип иммунного ответа на транс плантат?

7. Какова клиническая картина феномена «белый трансплантат»? Иммун ные реакции какого типа играют в нем важную роль?

8. Опишите реакции клеточного иммунитета в ответ на трансплантат.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ 9. Каковы феномены реакции гуморального типа при трансплантации?

10. Какую реакцию организма называют «трансплантат против хозяина»

(РТПХ)? В каких случаях она проявляется?

11. Каковы пути преодоления РТПХ?

12. Охарактеризуйте стадии РТПХ.

13. Какие патогенетические формы РТПХ существуют?

14. Какие группы осложнений сопутствуют трансплантации?

15. Как называется механизм адаптации к трансплантату? Какие факторы лежат в его основе?

16. Каково биологическое значение комплекса гистосовместимости при трансплантации?

17. Где локализован главный комплекс гистосовместимости у человека и мышей?

18. Отсутствие какого класса антигенов комплекса HLA обусловливает “синдром голых лимфоцитов”?

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОРГАНИЗАЦИИ СЕМИНАРОВ И ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ Семинар № 1. Методы иммунологических исследований Формат семинара – обсуждение докладов и рефератов Вопросы к семинару 3) История развития иммунологии:

а) основоположники иммунологии, их основные работы;

б) развитие иммунологии в первой половине XX века. Нобелевские лау реаты;

в) развитие иммунологии в России. Нобелевские лауреаты.

4) Методы иммунологических исследований:

а) методы оценки гуморального иммунитета:

• Реакции преципитации в растворах и геле;

• Иммуноэлектрофорез и его разновидности;

• Реакции агглютинации;

• Иммунофлюоресценция;

• Метод моноклональных антител.

б) методы оценки нарушений клеточного иммунитета:

6) Реакция бласттрансформации лимфоцитов in vitro (РБТЛ);

7) Реакция торможения миграции макрофагов (РТММ);

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

8) Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ).

в) клонирование клеток и животных;

г) клонирование генов. Полимеразная цепная реакция;

д) направленный мутагенез (генетический нокаут).

Методические рекомендации по проведению семинара При подготовке к семинару необходимо проработать рекомендуемую литературу, законспектировать основные положения и моменты, раскры вающие сущность изложенных вопросов. В ходе проработки литературного материала обратить особое внимание на то, что все существующие имму нологические методы исследования призваны качественно и количественно определять состояние антигенного гомеостаза, его сохранность или характер отклонений. Иммунологические методы подразделяют на 3 группы: 1. мето ды оценки гуморального иммунитета;

2. методы оценки клеточного иммуни тета, 3. кожные пробы.

Методы оценки гуморального иммунитета подразделяются на 3 уровня:

методы первого уровня основаны на доказательстве взаимодействия в систе ме антиген-антитело. Положительные реакции свидетельствуют о специфич ности реакций. Выделяют 3 типа реакций:

– тест коньюгации – при этом маркируют одни из реагентов, результаты оценивают по связыванию с другими реагентами на основании физических или химических свойств коньюганта (прямая иммунофлюоресценция, им мунопероксидазный метод, ауторадиография);

– тесты, основанные на изменении свойств одного из реагентов (напри мер, изменения флюоресценции, электрического потенциала, вязкости рас твора, синтез соединений с более высокой молекулярной массой, изменение ферментной активности антигенов);

– тесты, основанные на отделении комплекса антиген- антитело, от не связанных реагентов с помощью техники высаливания, преципитации, ис пользования специфических антител или адгезии на клеточной поверхности к ним относят большинство радио- и иммуноферментных методов.

Докладчикам следует изучить методику выполнения каждого из указан ных методов и обратить особое внимание на применение его в конкретных ситуациях иммунологического анализа.

Литература 10. Иммунологические методы / под ред. Х. Фримеля. – М.: Мир, 1979.

– 518 с.

11. Иммунологические методы исследования/ Под ред. И. Лефковитса, ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Б. Пернаса. – М.: Мир, 1988. – 530 с.

12. Клиническая иммуногенетика и аллергология / Под ред. Л. Йегера в 3-х томах. – М.: Медицина, 1190. – Т. 1. – С. 68-92.

13. Методы изучения in vitro клеточного иммунитета / под ред. Б. Блума, Ф. Глейда. – М.: Медицина, 1974. – 303 с.

14. Петров, Р.В. Иммунологические материалы клеточного гомеостаза / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов // Гомеостаз. – М.: Наука, 1976. – С. 191-233.

15. Петров, Р.В. Основы иммунитета и иммунная биотехнология / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов // Вестник РАМН. – 2000. – № 11. – С. 18-21.

Требования для получения зачета по семинару – четкое и грамотное изложение представляемого доклада;

– оформление излагаемого материала в электронном виде – составление опорных схем по основным процедурам проведения того или иного иммунологического анализа.


Пример, принцип метода обогащения клеточной суспензии В-лимфоцитами с помощью Т-розеткообразования (рис.13).

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

Рис. 13. Принципиальная схема метода Т-розеткообразования Контрольные вопросы • Какие клетки крови способны к розеткообразованию при проведении тестов на оценку гуморального иммунитета?

• В каких случаях применяют метод двойной двухмерной диффузии? В чем его сущность?

• Опишите последовательность проведения реакции бласттрансформа ции лимфоцитов in vitro. Для каких целей она предназначена?

• Какими антигенами может быть вызван феномен Артюса у человека?

• Какую реакцию проводят для доказательства присутствия в сыворотке «неполных» антител? В чем ее сущность?

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Семинар № 2. Главный комплекс гистосовместимости, его роль при трансплантации тканей Формат семинара – задачный семинар Список проблемных ситуаций 4. При проведении экспериментов по изучению механизмов клеточной толерантности, экспериментаторы столкнулись со следующим явлением: в тех случаях, когда антиген активно захватывался макрофагами, индуциро вать толерантность не удавалось, напротив, слабое участие макрофагов в поглощении антигена обеспечивает развитие толерантности. С чем связано наблюдаемое явление?

5. Объясните, почему в инбредных линиях мышей гибриды первого по коления не отторгают трансплантаты обеих родительских линий, но в тоже время каждая из родительских линий отторгает трансплантат от гибрида.

Почему в популяции людей для ребенка антигенночужеродными являются ткани матери и отца?

6. Чем можно объяснить механизм наведения толерантности от матери к потомству, когда многорожавшие самки мышей при пересадке сохраняют кожный аллотрансплантант иногда пожизненно?

7. При пересадке чужеродной ткани кожного лоскута в организме реци пиента возникают защитные реакции, приводящие к гибели трансплантата.

Какие клетки участвуют в реакции отторжения? Каков механизм отторжения кожного лоскута?

Методические рекомендации по проведению семинара Для проведения семинара рекомендуется организация работы студентов по парам. Студентам предлагается самостоятельно изучить рекомендуемую литературу к семинару по указанной теме. В ходе проведения семинара каж дой из пар предлагается рассмотреть проблемную ситуацию, определить воз можные пути выхода из поставленной ситуации. Составить опорные схемы и подробные конспекты ответов на поставленные задачи.

Литература, рекомендуемая для подготовки к семинару Брондз, А.Г. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом рас познавании / А.Г. Брондз. – М.: Наука, 1987. – 471 с.

Зарецкая, Ю.М. Клиническая иммуногенетика / Ю.М. Зарецкая. – М.: Медицина, 1983. – 208 с.

Зимушко, Е.И. Клиническая иммунология. Руководство для врачей / Е.И. Зимушко, Е.С. Белозеров, Ю.А. Митин. – СПб.: Питер, 2001. – 576 с.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

Ляшенко, В.А. Механизмы активации иммунокомпетентных клеток / В.А. Ляшенко, В.А. Дроженников, И.И. Молотковская. – М.: Медицина, 1988.

– 240 с.

Татишвили, Н.И. Молекулярные и клеточные аспекты иммунного распознавания / Н.И. Татишвили, В.В. Меунория, Т.С. Соселия. – Тбилиси:

Мецнереба, 1988. – 226 с.

Фримель, Х. Основы иммунологии / Х. Фримель, Й. Брок. – М.: Мир, 1986. – 254 с.

Требования для получения зачета по семинару Защита в устной форме составленных конспектов ответов и демонстра ция схем.

Контрольные вопросы Сравните генетические карты главного комплекса гистосовместимо сти мыши и человека, укажите сходства и различия.

Какие функции выполняет главный комплекс гистосовместимости при развитии иммунологических реакций?

Зарисуйте схемы строения продуктов главного комплекса гистосовме стимости I и II классов. Сравните их, и сделайте выводы о природе, антиге нов, которые могут быть связаны этими белками.

Опишите механизм присоединения антигенов к продуктам МНС I и II классов.

Сравните механизмы активации субпопуляций Т-лимфоцитов при рас познавании комплексов антиген-пептид и МНС I класса, антиген-пептид и МНС II класса.

Семинар № 3. Аллергические реакции организма Формат семинара – дискуссионный семинар Список тематических блоков 9) Классификация аллергенов.

10) Механизм реакций сенсебилизации 11) Механизм развития аллергических реакций.

12) Формы аллергических реакций.

13) Лекарственная аллергия.

14) Пищевая аллергия.

15) Аллергия, вызванная насекомыми.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Методические рекомендации по проведению семинара Все участники семинара самостоятельно готовятся к обсуждению постав ленных вопросов. Семинар проводится в форме дискуссии, в ходе которой каждый из участников высказывает свою точку зрения по поводу того или иного обсуждаемого вопроса. Итог подводит преподаватель, обращая внима ние на основные закономерности в развитии аллергических реакции, и делая акцент на участии различных типов клеток и каскадных эффектов цитоки нов, вырабатываемых в ходе развития этих реакций.

Требования для получения зачета по семинару Зачет по семинару студенты получаю на основании самостоятельно вы полненных конспектов обозначенных вопросов семинара.

Контрольные вопросы 5. Опишите механизм реакций гиперчувствительности немедленного типа.

6. Опишите механизм реакций гиперчувствительности замедленного типа.

7. Дайте классификацию аллергическим реакциям.

8. В чем состоит отличие сенсибилизации от анафилоксии.

9. Какие вещества относят к аллергенам, дайте их классификацию.

Практическое занятие №1. Определение титра «естественных» анти бактериальных антител Цели и задачи: выработать умения по определению титра «естественны»

в сыворотке крови;

обучить студентов правилам работы в лаборатории и приготовлениям основных реагентов и разведений сыворотки.

Порядок выполнения работы 1. Исследуемые пробы сыворотки прогреть при 560 С в течение 30 мин с целью инактивации комплемента.

2. Приготовить ряд последовательных разведений исследуемой сыворот ки. В лунки иммунологического планшета внести по 50 мкл исследуемых разведений антисыворотки и 50 мкл бактериальной взвеси в концентрации 1·109 клеток/мл в контроле к антигену добавить 50 мкл физраствора.

3. Результаты учитывать через сутки. Определить титр естественных ан тител. Интенсивность агглютинации оценить по четырехплюсовой системе:

• полная агглютинация – надосадочная жидкость прозрачная, характер ный осадок выражен (++++), • почти полная агглютинация – слабая опалесценция надосадка, осадок выражен (+++), Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

• слабая агглютинация – небольшой осадок, надосадочная жидкость не прозрачная, но светлее, чем в контроле (++), • следы агглютинации – осадок едва заметен, надосадок непрозрачный (+), • отсутствие агглютинации – характерного осадка нет, как и в контро ле сыворотки (-). Контроль антигена, который дает отрицательную реакцию, представляет собой слегка мутную жидкость, в центре пробирки на дне ком пактный осадок (пуговка).

При выполнении работы необходимо учитывать, что сыворотка пери ферической крови здорового человека содержит антитела ко многим есте ственным и искусственным антигенам. К «естественным» антителам отно сят антибактериальные антитела, изогемагглютинины, гетероагглютинины, антистрептолизин. Существует строгая корреляция между уровнем «есте ственных» антител и исходом инфекционно-воспалительного процесса.

Инкубация последовательных разведений исследуемой сыворотки с бакте риальными клетками позволяет определить титр «естественных» антибакте риальных антител.

Титр – величина обратная наибольшему разведению антисыворотки, при котором наблюдается регистрируемая преципитация.

Контрольные вопросы 6. Опишите феномены взаимодействия между антителами и антигенами.

7. Какими терминами описывается сила химической связи между анти геном и антителом?

8. Антитела какого класса вырабатываются в ответ на тимуснезависимые антигены?

9. Каково строение молекул иммуноглобулинов?

10. При каких условиях изменяется иммунологическая специфичность антигенов?

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ДЕЛОВЫХ ИГР Деловая игра-зачет по теме «Механизмы реакции гиперчувствительности немедленного и замедленного типов»

Цель игры - контроль и обобщение знаний по теме «Эффекторные меха низмы иммунного ответа», повышение уровня мотивации к обучению, раз витие навыков применения полученных знаний в новой ситуации, развитие логического мышления, формирование навыков публичного выступления.

ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ Вопросы, которые могли бы составить предмет проблемной ситуации Механизмы реализации иммунного ответа, строение и функционирование Т- и В-клеточных систем иммунитета, цитотоксические свойства Т-клеток и антител, состояния сенсибилизации и аллергии, клетки участницы реакций гиперчувствительности немедленного и замедленного типов.

Роли участников игры:

Участники игры разделяются на три группы:

Группа А Группа В Эксперты рассматривает меха- рассматривает механизмы оценивает правиль низмы реакций ги- реакции гиперчувствитель- ность полученных перчувствительности ности замедленного типа ответов немедленного типа Правила игры:

1. Каждой группе предлагается схема, в которой отсутствуют определен ные звенья в развитии состояний гиперчувствительности. Каждая из групп должна будет дополнить не достающие звенья.

2. На основе полученных картинок участники каждой группы должны будут придумать по 5 тестов закрытого и открытого типов соответственно.

Тесты и ответы к ним они должны представить экспертной комиссии для оценки корректности их постановки и правильности ответов. Тесты закры того типа могут содержать задания множественного выбора, расположение в правильной последовательности, либо восстановления соответствия между утверждениями. Тесты открытого типа задания с ограничением на ответы.

3. Участники команд обмениваются составленными тестами между собой (без ключа ответов) и пытаются дать правильные ответы на вопросы пред ложенных им тестов команды соперницы.

Система оценивания деятельности участников игры:

Деятельность каждой группы оценивается экспертной комиссией. Пра вильность выполнения 1 задания каждой группой оценивается максимум балла. Корректность постановки вопросов задания 2 и правильность ответов оценивается экспертной комиссией за каждый правильный ответ +1 балл, неправильный ответ -1 балл. Правильные ответы на задание 3 оцениваются экспертной комиссией в 1 балл, неправильные 0 баллов.

Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

Дидактические карточки для проведения игры Карточка для группы А Карточка для группы В ЧАСТЬ 4.

ДИДАКТИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ РАБОТЫ ПРОФЕССОРСКО-ПРЕПОДАВАТЕЛЬСКОГО СОСТАВА Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ДИДАКТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Контрольные мероприятия в ходе изучения дисциплины целесообразно проводить после изучения каждого раздела дисциплины. Контрольные рабо ты необходимо проводить в письменном виде по вариантам (см. материалы для проведения контрольных работ), время, отведенное на выполнение ра боты должно составлять не более 45 минут. После письменной контрольной работы рекомендуется провести устный опрос, рекомендуется использовать задачи (см. задачи для проведения коллоквиумов), время, отведенное на вы полнение этой работы не должно превышать 45 минут.

Для усвоения теоретической части курса в процессе преподавания дис циплины необходимо использовать слайды, на которых выделяются общие закономерности, этапы процессов, наглядное изображение которых поможет овладеть теоретическими вопросами и решить частные проблемы.

Раздел 1. ВВЕДЕНИЕ В ДИСЦИПЛИНУ «ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ».

Коллекция слайдов используемых в лекции 1 направлена на ознакомление студентов со спецификой предмета и задачами, поставленными при изуче нии дисциплины. Рекомендуется использовать слайды 1, 2, 3 последователь но друг за другом в ходе рассмотрения 1 вопроса лекции «Иммунология как экспериментальная наука, предмет, задачи и перспективы развития». После определения основных понятий, студенты должны ознакомиться с целью и задачами дисциплины, а также знать какие компетенции будут приобретены в ходе изучения дисциплины. Слайд 4 возможно использовать при рассмо трении 2 вопроса лекции, раскрывающего основные принципы организации и функционирования иммунной системы. На слайде 4 представлены взаи мосвязи между системой естественной резистентности и специфического иммунитета. Механизмы естественной резистентности изображены на ри сунке слева, а адаптивные справа, каждый из них имеет как клеточные (ниж няя часть рисунка), так и гуморальные (сыворотка или другая биологическая жидкость;

верхняя часть рисунка) элементы. Основа естественного иммуни тета – это действие неспецифических механизмов, реагирующих на повреж дение тканей воспалительными реакциями (левая часть рисунка). Некоторые клетки (макрофаги - МФ) и гуморальные факторы (комплемент, лизоцим) об ладают ограниченной способностью узнавать и уничтожать бактерии. Мно гие клетки секретируют интерферон, который действует против вирусов, но не воздействует на другие микроорганизмы. Адаптивный иммунитете осно ван на свойствах Т- и В-лимфоцитов избирательно отвечать на антигены с образованием специфической памяти. Между системой естественной рези ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ стентности и адаптивным иммунитетом существуют тесные взаимосвязи:

антител – с комплементом и фагоцитарными клетками, Т-лимфоцитов – с макрофагами. В заключительной части лекции рекомендуется обратить вни мание студентов на слайд № 5, который содержит информацию об основной и дополнительной литературе, которую могут использовать студенты при изучении курса.

Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ.

В ходе изложения материала лекции 2, преподавателю рекомендуется ис пользовать 1 слайд и 3 эскиза. Слайд 6 целесообразно продемонстрировать и объяснить механизм связи перед рассмотрением феноменов взаимодей ствия антител и антигенов в 4 вопросе лекции. Комментируя слайд, следует указать, что процесс соединения антигена с антителом основан на взаимной комплементарности конфигураций антигенной детерминанты и антиген свя зывающего участка антитела, образованного гипервариабельными участка ми тяжелой и легкой цепи. Чем ближе это соответствие, тем интенсивнее нековалентные силы между ними (гидрофобные, электростатические и т.д.;

на рисунке слева внизу) и тем выше аффинитет (слева вверху). Связывание антигена двумя активными центрами антитела увеличивает прочность сое динения и характеризуется авидностью. Соединение антигена и антитела на зывают иммунным комплексом. В зависимости от природы и соотношения антигена и антител иммунные комплексы могут быть мелкими (раствори мыми) или крупными (преципитирующими) (справа сверху). Они удаляются фагоцитарными клетками в результате взаимодействия Fc-участка антитела с комплементом и поверхностными рецепторами фагоцитов (в центре внизу).

В некоторых случая комплексы циркулируют в крои и вызывают воспали тельное поражение органов.

Раздел 3. КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ.

Лекция 3 содержит вопросы, раскрывающие механизмы функциониро вания системы естественной резистентности. Слайд 7 необходимо исполь зовать при рассмотрении системы профессиональных фагоцитов. На слайде 7 изображены звенья ретикулоэндотелиальной системы. К ним относят ре тикулярные тканевые клетки (на рисунке справа вверху) и различные типы макрофагов, чья функция направлена на клиренс продуктов распада соб ственного организма, а также переваренных бактерий. Слайд 8 необходимо использовать при объяснении особенностей функционирования макрофагов.

На слайде показана электронная микрофотография макрофага и представле ны его функции. Слайд 9 демонстрирует стадии фагоцитоза, его необходимо использовать при рассмотрении первого вопроса лекции, раскрывающего Скоркина М.Ю., Погребняк Т.А.

механизмы этого процесса. На рисунке (вверху) изображено присоедине ние, в центре – поглощение (эндоцитоз), внизу – переваривание антигенов.

Изображенные стадии практически одинаковы у всех миелоидных клеток.

Основные различия состоят в используемых лизосомальных ферментах. На рисунке показан процесс фагоцитоза бактерий (обозначены черными палоч ками). Если бактерии имеют капсулу (на рисунке обведена контуром), то без предварительной опсонизации фагоцитоз невозможен. Слайд 10 необходимо использовать при рассмотрении 2 вопроса лекции, путей активации системы комплемента. Верхняя часть рисунка относится к сыворотке (жидкой фазе), нижняя – к поверхности клеток, где происходит каскад активации (пунктир ные линии на рисунке) и сборка компонентов комплемента. Активация ком племента может осуществляться двумя способами: классический – начина ется после связывания специфических антител класса IgG и IgM с поверх ностными антигенами (в центре слева);

альтернативный (в центре справа) – инициируется многими полисахаридами и некоторыми антителами.

При изложении теоретического материала лекции 4 необходимо исполь зовать слайд 11 как дополнение к эскизам и схематическим изображениям анатомического строения лимфоидных органов. Этот слайд целесообразно продемонстрировать после рассмотрения анатомического строения централь ных и периферических органов иммунной системы. Необходимо акцентиро вать внимание студентов на то, что лимфоидная ткань слизистых оболочке образует отдельную внутреннюю объединенную секреторную систему, в пределах которой циркулируют клетки, коммитированные к синтезу IgA или IgE. На слайде представлены: А - срез легкого, на котором видно диффуз ное скопление лимфоцитов (Л) в стенке бронха;

Б – срез тощей кишки че ловека, лимфоидные клетки располагаются в эпителии слизистой оболочки (ЭС) и собственной пластинке слизистой оболочки (СП). Флуоресцентные антитела к IgA (красная окраска) окрашивают цитоплазму плазматических клеток (ПК) в собственной пластинке и выявляют IgA в поверхностной сли зи. В – миндалины человека.На фотографии представлена лимфоидная ткань с многочисленными вторичными фолликулами (ВФ), содержащими цен тры размножения. Г – Пейеровы бляшки (ПБ) в стенке подвздошной кишки мыши. Т-клеточные области окрашены в коричневый цвет. Слайд 12 необ ходимо продемонстрировать студентам после изложения основных этапов дифференцировки Т-лимфоцитов при рассмотрении 4 вопроса лекции. На слайде 12 показаны механизмы миграции лимфоцитов. При объяснении ма териала необходимо отметить, что в нормальных условиях лимфоциты бы стро перемещаются с током крови, занимая в кровеносном сосуде централь ное положение. Чтобы прикрепиться к эндотелию, лимфоцит преодолевает увлекающую его силу кровотока. Это достигается за счет притяжения между ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ хоминг-рецепторами на поверхности лимфоцита и их лигандами на клетках сосудистой стенки. После того, как лимфоцит «зацепится», он начинает ка титься по стенке эндотелия, частично с участием селектинов, но в основном за счет связывания интегринов с их лигандами.

В лекции 5 рекомендуется использовать слайд 13 для объяснения строе ния и функционирования центрального генетического аппарата иммунной системы – главного комплекса гистосовместимости. На слайде показана схе ма строения главного комплекса гистовоместимости у мыши и человека. На рисунке обозначения генов заключены в прямоугольники, под которыми ука зано число аллелей (альтернативных вариантов) для каждого локуса.

Рассматривая теоретический материал лекции 6 необходимо использовать слайд 14 после рассмотрения основных этапов иммунного ответа в 1 вопросе.

На слайде продемонстрированы базовые механизмы реализации клеточного иммунитета. Этот вариант иммунитета проявляется в двух направлениях:



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.