авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

УДК 60(075)

ББК 30.16я73

С56

Авторы:

Н. А. Войнов, Т. Г. Волова,

Н. В. Зобова, С. В. Маркова, Л. А. Франк

Электронный учебно-методический комплекс по дисциплине «Современные про-

блемы и методы биотехнологии» подготовлен в рамках реализации Программы разви-

тия федерального государственного образовательного учреждения высшего профес сионального образования «Сибирский федеральный университет» (СФУ) на 2007– 2010 гг.

Рецензенты:

Красноярский краевой фонд науки;

Экспертная комиссия СФУ по подготовке учебно-методических комплексов дис циплин С56 Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс] :

лаб. практикум / Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова и др. – Электрон. дан.

(3 Мб). – Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – (Современные проблемы и методы биотехнологии : УМКД № 1323-2008 / рук. творч. коллектива Т. Г. Волова). – 1 электрон. опт. диск (DVD). – Систем. требования : Intel Pentium (или анало гичный процессор других производителей) 1 ГГц ;

512 Мб оперативной памя ти ;

50 Мб свободного дискового пространства ;

привод DVD ;

операционная система Microsoft Windows XP SP 2 / Vista (32 бит) ;

Adobe Reader 7.0 (или ана логичный продукт для чтения файлов формата pdf).

ISBN 978-5-7638-1662-4 (комплекса) ISBN 978-5-7638-1770-6 (лабораторного практикума) Номер гос. регистрации в ФГУП НТЦ «Информрегистр» 0320902481 (ком плекса) Настоящее издание является частью электронного учебно-методического ком плекса по дисциплине «Современные проблемы и методы биотехнологии», вклю чающего учебную программу дисциплины, учебное пособие, методические указания по самостоятельной работе, контрольно-измерительные материалы «Современные проблемы и методы биотехнологии. Банк тестовых заданий», наглядное пособие «Со временные проблемы и методы биотехнологии. Презентационные материалы».

Приведены теоретические сведения и изложены подробные рекомендации к веде нию лабораторных занятий по курсу «Современные проблемы и методы биотехноло гии».

Предназначен для студентов направления подготовки магистров 020200.68 «Био логия» укрупненной группы 020000 «Естественные науки».

© Сибирский федеральный университет, Рекомендовано к изданию Инновационно-методическим управлением СФУ Редактор Н. Ф. Ткачук Разработка и оформление электронного образовательного ресурса: Центр технологий элек тронного обучения Информационно-телекоммуникационного комплекса СФУ;

лаборатория по разработке мультимедийных электронных образовательных ресурсов при КрЦНИТ Содержимое ресурса охраняется законом об авторском праве. Несанкционированное копирование и использование данного про дукта запрещается. Встречающиеся названия программного обеспечения, изделий, устройств или систем могут являться зарегистрирован ными товарными знаками тех или иных фирм.

Подп. к использованию 30.11. Объем 3 Мб Красноярск: СФУ, 660041, Красноярск, пр. Свободный, Оглавление ВВЕДЕНИЕ................................................................... МОДУЛЬ 1.................................................................... МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ:

ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ.................................... Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК......................................................................... Материалы и оборудование:................................................................................. Задача 2.1.1. Выделение плазмидной ДНК......................................................... Задача 2.1.2. Анализ полученных препаратов плазмидных ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле......................................................................... Задача 2.1.3. Рестрикционный анализ полученного препарата плазмидной ДНК.................................................................................. Вопросы.................................................................................................................... Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий..................................................................................................... Материалы и оборудование:................................................................................. Задача 2.2.1. Химическая трансформация клеток E. сoli.................................... Задача 2.2.2. Трансформация клеток E. сoli электропорацией.......................... Вопросы.................................................................................................................... Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР....................................................... Материалы и оборудование:................................................................................. Занятие 1. Экстракция ДНК из образцов и постановка ПЦР............................. Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза............. Вопросы.................................................................................................................... МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ........................... Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ............................................................. Задача 1.................................................................................................................... Вопросы.................................................................................................................... Задача 2. Определение модельной эпидемической вспышки с помощью ELIZA.......................................................................................................................... Вопросы.................................................................................................................... Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ................................................................................... Материалы и оборудование:................................................................................. Занятие 1. Постановка и проведение ПЦР с данными образцами ДНК......... Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза............. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум ОГЛАВЛЕНИЕ Вопросы.................................................................................................................... МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ.................................... Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений............................................ Условия культивирования..................................................................................... Способы клонального микроразмножения........................................................ Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПО ГОРМОНАЛЬНОМУ И МИНЕРАЛЬНОМУ СОСТАВУ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ..................................................................................................... Вопросы.................................................................................................................... Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА................................... Вопросы.................................................................................................................... Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ................................................... Задание 1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля........................................................................ Задание 2. Микроразмножение картофеля черенкованием побегов.............. Вопросы.................................................................................................................... МОДУЛЬ 5.................................................................. МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ.............. Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА.................................................... Вопросы.................................................................................................................... Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ............................... Вопросы.................................................................................................................... Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОМАССЫ RALSTONIA EUTROPHA B-5786, МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ...................... Вопросы.................................................................................................................... МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ.................................................... Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ....................................................... Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум ОГЛАВЛЕНИЕ Вопросы.................................................................................................................. Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА.....

.............................................................................................. Вопросы.................................................................................................................. Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ................................................ Вопросы.................................................................................................................. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК........................ Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум ВВЕДЕНИЕ Цель лабораторного практикума, сопровождающего лекционный курс «Современные проблемы и методы биотехнологии», – обучить приемам и методам по ключевым направлениям современной биотехнологии: геномике и протемике, технике ведения клеточных культур, новейшим аналитическим приемам, ключевым задачам биоинженерии.

Цикл лабораторных работ направлен на формирование у студентов представлений о возможностях и уровне современной биотехнологии и ее методологии;

включает следующие разделы:

– Трансгенные организмы;

– Современные методы молекулярной диагностики;

– Культура растительных клеток и тканей;

– Современные методы исследования целевых продуктов биотехноло гии;

– Инженерные основы биотехнологии.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ Работы не предусмотрены.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ:

ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Цель: дать представление об основных методах конструирования трансгенных организмов, о многообразии генетически модифицированных организмов (ГМО), методах их идентификации и контроля.

Задачи:

– знакомство с основными методами конструирования трансгенных ор ганизмов;

– обучение приемам и методам, используемым при создании трансген ных организмов и их тестировании.

Объект: бактериальные клетки E. coli, дрожжевые клетки, экспресси онные плазмидные векторы, растительные трансгенные продукты.

Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Цель работы: знакомство с методами выделения и рестрикционного анализа ДНК, получение экспериментальных навыков для конструирования и анализа рекомбинантных ДНК.

Задачи: выделение плазмидной ДНК из кишечной палочки E. coli на примере плазмиды pUC18, содержащего вставку чужеродного гена, оценка качества полученного препарата с помощью электрофореза в геле агарозы, рестрикционный анализ плазмиды, определение размеров рестрикционных фрагментов ДНК.

Клонирование рекомбинантной ДНК в общепринятом объекте генно инженерных исследований – бактерии E. coli практически всегда является составной частью процесса получения трансгенного организма. Как правило, E. coli используют для сборки и проверки корректности генетической конст рукции, а также для получения препаративных количеств рекомбинаниной ДНК для последующей трансформации целевого организма в трансгенный.

При этом плазмидные векторы являются наиболее популярными для клони рования рекомбинантной ДНК.

Плазмиды – внехромосомные автономно реплицирующиеся генетиче ские элементы клетки, представляющие собой преимущественно кольцевые замкнутые молекулы ДНК.

Методы выделения плазмидной ДНК основаны на том, что бактериаль ные плазмиды находятся в кольцевой замкнутой форме и имеют небольшие размеры по сравнению с геномной ДНК. Первый этап многих методов состо ит в разрушении жесткой бактериальной клеточной стенки путем их обра Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ботки ЭДТА и лизоцимом (для грамотрицательных бактерий) с образованием сферопластов. ЭДТА, хелатируя ионы металлов, также защищает ДНК от действия катион-зависимых нуклеаз. Реакцию проводят в изотоническом растворе (при достаточно высокой концентрации сахарозы или другого ве щества) для предотвращения немедленного лизиса получаемых сферопла стов. Затем сферопласты лизируют, например, путем добавления детергента.

Клеточный дебрис и фрагменты бактериальной хромосомы, связанные с кле точной оболочкой, можно удалить центрифугированием или фильтрованием.

Из различных методов выделения плазмид наиболее широко использу ется метод щелочного лизиса бактерий (метод Бирнбойма – Доли) и его мо дификации, как для получения мини-препаратов, так для крупномасштабного выделения ДНК. Метод основан на том, что в щелочных условиях (~рН 12,0–12,5) происходит денатурация линейных молекул ДНК (расплете ние двойной спирали), в то время как кольцевые замкнутые молекулы не де натурируют или денатурируют незначительно и обратимо. Когда клеточный экстракт нейтрализуют при высокой концентрации соли, белки, геномная ДНК и клеточная РНК осаждаются. Происходит это, по-видимому, потому, что длинные одноцепочечные молекулы ДНК и РНК реассоциируют в высо кой соли после денатурации случайным и беспорядочным образом, образуя нерастворимую массу. Большая часть клеточной РНК осаждается вместе с белками, поскольку реакцию проводят в присутствии додецилсульфата Na (SDS). Оставшуюся клеточную РНК в препарате удаляют обработкой РНКа зой А (в основном это транспортная РНК, которая, видимо, вследствие легко сти образования внутримолекулярных двухцепочечных участков, сравни тельно легко ренатурирует и растворяется в высокой соли).

После удаления осадка центрифугированием плазмидную ДНК осаж дают из осветленного клеточного лизата этанолом или изопропанолом. Такой препарат ДНК можно использовать для многих целей, например, для рест рикционного анализа. Для многих других приложений часто необходимы бо лее чистые препараты ДНК, например, для подготовки фрагментов к клони рованию или для трансфекции – в таком случае ДНК подвергают дальнейшей очистке.

Для получения высокочистых препаратов небольших по размерам ДНК, пригодных для практически всех молекулярно-биологических прило жений, очень популярен метод очистки ДНК на колонках с фильтрами из стекла (glass), кварца (silica slurries) или силикагеля (silica-gel membrane).

DNA обратимо сорбируется на поверхность стеклянной мембраны в растворе с высокой концентрацией хаотропной соли, примеси отмываются хаотропной солью и 70 % этанолом. Затем очищенная DNA элюируется в буфере с низ кой ионной силой. Для очистки небольших количеств плазмидной ДНК или фрагментов часто используют центрифужные мини-колонки с такими сили катными фильтрами. Подобные наборы выпускаются многими фирмами.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Материалы и оборудование:

термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24, «New Brunswick»(США) для выращивания клеточных культур;

система видеодокументирования гелей «Molecular Imager Gel Doc XR»

производства «Bio-Rad» (США) с трансиллюминатором;

микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R (США) c ротором для микропробирок 1,5–2,0 мл;

оборудование для горизонтального ДНК гель-электрофореза фирмы «Bio-Rad» (США): источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply»

и «Sub-Cell GT» камеры с заливочными столиками;

лабораторный шейкер-вортекс V-1 фирмы «BioSan»;

охлаждаемый термостат, модель КВ53 фирмы «Binder» (Германия);

наборы из трех автоматических пипеток на 2–20 мкл, на 20–200 мкл и на 100–1000 мкл «Gilson»;

мерные стаканы и колбы, одноразовые пластиковые пробирки и нако нечники для пипеток;

стационарная культура E. coli, содержащая рекомбинантную плазмиду;

буферы и реагенты для выделения плазмидной ДНК;

буферы и реагенты для рестрикционного анализа ДНК;

буферы и реагенты для проведения агарозного электрофореза.

Характеристика оборудования Рис. 2.1. Внешний вид термостатируемого шейкера-инкубатора Exella E- фирмы «New Brunswick»

Термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24 «New Brunswick»

(рис. 2.1) позволяет выращивать клеточные культуры в широком диапазоне температур и в различных объемах от микробиологических пробирок Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК на 2–5 мл до крупных колб 2,8 л. Ростовая камера плотно закрывается про зрачной акриловой крышкой, что позволяет непосредственно наблюдать за выращиваемыми образцами.

Технические характеристики Диапазон температур инкубации от 7 °С выше окружающей до 60 °С.

Диапазон частот качания 50–400 раз/мин, ± 2.

Орбитальное качание 1,9 см в диаметре.

Универсальный температурный контроль обеспечивается самокоррек тирующимся микропроцессорным контролем обратной связи и герметично сконструированной ростовой камерой. Высокоскоростной вентилятор обес печивает быстрое восстановление температуры при перегреве.

Установка температуры и скорости осуществляется через контрольную панель.

Прозрачная крышка ростовой камеры позволяет непосредственно на блюдать за образцами и минимизировать количество открываний шейкера.

Крышка легко поднимается, открывая удобный доступ к образцам.

RS-232 обеспечивает регистрацию и хранение данных о состоянии прибора.

Качание шейкера автоматически отключается при открывании крышки для защиты оператора.

Система безопасности термостата выключает нагрев при превышении установленного температурного лимита для защиты растущей культуры.

Система видеодокументации «Molecular Imager Gel Doc XR» (рис. 2.2) производства «Bio-Rad» с трансиллюминатором позволяет осуществлять ряд работ по получению цифровых изображений результатов экспериментов: от рутинной документации гелей до высокочувствительной хемилюминесцент ной детекции и регистрации с высоким разрешением двумерных гелей. Сис тема имеет широкий ряд применений, в их числе детекция нуклеиновых ки слот, иммуноблоттинг, двумерный гель-электрофорез, дот-блоттинг, денси тометрия, подсчет количества колоний. Система «Molecular Imager Gel Doc XR» включает в себя темный кабинет с переключаемым держателем фильт ров на 5 штук (один желтый встроен по умолчанию), CCD видеокамеру, ис точники УФ и белого света, принтер, управляющий компьютер с программ ным обеспечением «Quantity One» для захвата и обработки изображений.

Конверсионный экран «XcitaBlue» для ДНК-имиджинга в комплекте предот вращает образцы ДНК и пользователя от УФ-облучения.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Рис. 2.2. Внешний вид системы видеодокументирования «Molecular Imager Gel Doc XR»

производства «Bio-Rad»

Технические характеристики Черно-белая 12-битная (4096 оттенков серого) CCD видеокамера с 1360х1024 мкм матрицей и разрешением 1,4 мегапиксела. Размер пиксела 4,6х4,6 мкм.

Широкий динамический ряд видеодетекции, покрывающий более трех порядков.

Видеокамера с автоматическим моторизованным увеличением 8,5–51 мм и цифровой обратной связью для воспроизводимости условий до кументирования.

Отображение на экране в реальном времени для быстрого позициони рования и фокусирования образца.

Для освещения используется проходящий УФ-свет, проходящий и от раженный белый свет.

Встроенный трансиллюминатор с переключаемым 254, 302, и 365 нм УФ-излучением. Зона трансиллюминации 25х26 см.

Пяти позиционный держатель эмиссионных фильтров с одним встро енным (желтый), возможно встраивание дополнительных четырех эмиссион ных фильтров в зависимости от потребностей.

Программное управление источниками освещения.

Программное обеспечение совместимо с Windows и MAC OS.

Размеры системы 60х36х96 см, масса 32 кг.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Рис. 2.3. Охлаждаемая микроцентрифуга 5417R c ротором для микропробирок фирмы «Eppendorf»

Микроцентрифуга «Eppendorf» 5417R c ротором для микропробирок (рис. 2.3), укомплектованная аэрозолезащищенным угловым 30-позици онным ротором для микропробирок, позволяет центрифугировать любые об разцы в микропробирках 0,2–2,0 мл на разнообразных режимах с перемен ным ускорением до 20 800 g. Характеризуется большой мощностью, малым временем разгона и остановки, большим центростремительным ускорением.

Имеет режимы медленного и быстрого замораживания, работает в диапазоне температур от –9 °С до 40 °С. Функция охлаждения позволяет быстро охлаж дать образцы до 4 °С примерно за 15 мин и постоянно поддерживать эту тем пературу в течение времени центрифугирования при максимальной скорости вращения. Возможна доукомплектация другими роторами, например, бакет ротором или ротором для стрипов.

Технические характеристики Удобная мембранная клавиатура для установки режимов центрифуги рования (параметры можно менять в процессе работы центрифуги).

Максимальная скорость вращения 16 400 об/мин (от 500 об/мин до максимального значения, с инкрементом 100 об/мин).

Установление показаний вращения в единицах об/мин или в единицах g.

Максимальное ускорение (rcf) около 25 000 g (в соответствии с DIN 58970), для 30-позиционного углового ротора 14 000 об/мин (20 800 g).

Быстрый разгон и торможение даже при полностью заполненном рото ре. Время разгона до максимальной скорости около 10 с, время торможения с максимальной скорости около 11 с (с 30-позиционным угловым ротором).

Режим "Soft" для более мягкого разгона и торможения.

Встроенный таймер до 99 мин с возможностью непрерывного центри фугирования.

Функция кратковременного центрифугирования с выбранной скоро стью вращения.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Все съемные элементы – роторы, крышки, адаптеры могут автоклави роваться в течение 20 мин при 121 °С.

Габариты: 31х60х25 см, масса (без ротора) 35 кг.

Потребляемая мощность 700 W, питание 230V/50-60 Hz.

Оборудование для горизонтального гель-электрофореза (рис. 2.4): ис точник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» и «Sub-Cell GT» ка меры с заливочными столиками фирмы «Bio-Rad» предназначено для прове дения горизонтального электрофореза в гелях агарозы различного размера при анализе нуклеиновых кислот. Включает в себя удобный столик для за ливки гелей, УФ-прозрачные подложки для гелей, гребенки различных фор матов для формирования лунок. Программируемый источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» способен поддерживать ток до 5000 В, 500 мА и 400 Вт, что позволяет использовать его для всех высоковольтных методов, включая низкотоковые в микроамперном диапазоне. Кроме гори зонтального ДНК-электрофореза может быть использован также в ряде дру гих методов, включая SDS-электрофорез белков, изоэлектрическое фокуси рование, ДНК-секвенирование.

Рис. 2.4. Внешний вид оборудования для гель-электрофореза ДНК фирмы «Bio-Rad»:

источник питания, заливочный столик и камеры Технические характеристики э/ф камер Размеры подложки для гелей 7х10 см для камеры «Mini-Sub Cell GT»

позволяют внедрять два ряда гребенок в гель для увеличения количества ана лизируемых образцов – от 1 до 30.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Размеры подложки для гелей 15х25 для камеры «Sub-Cell GT» позво ляют внедрять четыре ряда гребенок в гель для увеличения количества ана лизируемых образцов – от 1 до 120.

Объем электрофорезного буфера ~270 мл для камеры «Mini-Sub Cell GT» и ~1 л для камеры «Sub-Cell GT».

Технические характеристики источника питания для электрофореза «PowerPac HV Power Supply»:

Способен поддерживать постоянный ток в диапазонах 20–5000 В, 0,01–500 мА, 1–400 Вт. Возможно подключение до четырех камер одновре менно. Программируемый источник питания позволяет осуществлять много ступенчатые методы, процессы с изменяемыми параметрами, при постоян ном токе, при постоянном напряжении, при постоянной мощности или при постоянной температуре.

Лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы «BioSan» (Лат вия) предназначен для перемешивания растворов и суспензий клеток в лю бых пробирках. Имеет два режима работы – непрерывный и импульсный.

Импульсный режим включается при касании пробиркой головки вортекса.

Рис. 2.5. Внешний вид шейкера-вортекса фирмы «Биосан»

Технические характеристики Диапазон регулирования скорости 250–3000 об./мин.

Предназначен для пробирок объемом 1,5–50 мл.

Максимальный объём перемешивания 30 мл.

Питание от внешнего блока DC 12 В, 500 мA.

Масса не более 1,1 кг.

Размеры 90x150x80 мм.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Охлаждаемый термостат КВ53 фирмы «Binder» (Германия) объемом 53 л (рис. 2.6), предназначен для инкубации разнообразных образцов при различных температурах от -10 °C до 100 °C с высокой точностью.

Рис. 2.6. Термостат КВ53 фирмы «Binder» (Германия) Технические характеристики Регулируемый диапазон температур от –10 °C до 100 °C с точностью ±0,3 °С.

Микропроцессорный контроль многочисленных временных и темпера турных функций осуществляется с ЖК-дисплея с визуальной и акустической сигнализацией.

Интерфейс RS 422 для принтера или компьютера.

Мощная запатентованная система охлаждения DCT® обеспечивает на дежность поддержания температур без образования конденсата.

Не наносящий вреда окружающей среде охладитель R134a.

Абсолютная воспроизводимость условий инкубации и размножения.

Программируемая (от 0 до 100 %) принудительная конвекция (вентиля тор).

Вытяжное устройство с заслонкой для сушки.

Вспененная изоляция, не содержащая хлорфторуглеродов.

Внутренняя стеклянная дверь, две полки с возможностью установки четырех.

Многофункциональный таймер от 0 до 99 ч 59 мин.

Размеры камеры Ш x В x Г см: 40 x 40 x 33, объем 53 л.

Габариты Ш x В x Г см: 64 x 84 x 58, масса 72 кг.

Мощность 460 Вт.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Задача 2.1.1. Выделение плазмидной ДНК Ход работы:

1. Культуру E. coli, содержащую рекомбинантную плазмиду pUC18, центрифугировать 2 мин в 2 мл пробирках при 8 об/мин. Культуральную сре ду вылить, осадок осушить.

2. Ресуспендировать осадок в 100 мкл раствора 1 (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM глюкозы, РНКаза А) с лизоцимом (на кончике шпателя на 10 мл), инкубировать 5 мин при комнатной температуре.

3. Добавить 200 мкл раствора 2 (0,2 M NaOH, 1 10% SDS). Инкубиро вать с мягким перемешиванием с перевертыванием пробирки до полной про зрачности, но не более 5 мин.

4. Добавить 200 мкл 3 M NaOAc pH 4,75, смешать переворачиванием и инкубировать 5 мин, периодически помешивая.

5. Центрифугировать на максимальных оборотах 10 мин (~16 тыс.

об/мин).

6. Супернатант осторожно, не разрушая осадок, прилить к 1 мл этанола, перемешать и центрифугировать 2 мин на максимальных оборотах.

7. Осадок промыть 1 мл 70 % этанола перемешиванием на вортексе, за тем центрифугировать 2 мин на максимальных оборотах.

8. Супернатант удалить, осадок подсушить на воздухе 10 мин и раство рить в 80 мкл ТЕ (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA).

Задача 2.1.2. Анализ полученных препаратов плазмидных ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле Для оценки количества и качества ДНК, а также размеров молекул ДНК используют электрофорез в гелях агарозы (горизонтальный) или поли акриламидных гелях (вертикальный электрофорез). Молекулы ДНК визуали зируются интеркалирующими флуоресцентными красителями, например, бромистым этидием. Двуцепочечная ДНК эффективно связывает бромистый этидий и начинает ярко флуоресцировать при облучении ультрафиолетом (УФ). Результаты электрофореза документируют в проходящем УФ-свете с помощью цифровой фотокамеры или специальной системы для документи рования гелей.

Плазмидная интактная ДНК из клетки выделяется обычно в нескольких формах, которые разделяются в процессе электрофореза (рис. 2.7). В хоро шем препарате ДНК доминирует суперскрученная мономерная и димерная формы (суперспиральная плазмида), при некотором повреждении ДНК появ ляются релаксированная форма (расплетенное кольцо, к чему приводит на личие разрыва в одной из цепей), редко бывает линейная форма, образую щаяся при двуцепочечных разрывах плазмидного кольца. В препарате плаз мидной ДНК возможна небольшая примесь денатурированной ДНК, а также фракция РНК. Денатурированная форма образуется при необратимых сдви Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК гах цепей плазмидного кольца относительно друг друга в процессе денатура ции. Рестриктазы не опознают сайты на такой ДНК с нарушенной двуцепо чечной структурой и, соответственно, не расщепляют данную фракцию ДНК (рис. 2.7). Подвижность полос с формами кольцевой плазмиды зависит от ус ловий электрофореза и концентрации бромистого этидия, так как внедрение интеркалирующих красителей расплетает ДНК, изменяя ее конформацию.

Суммарное количество плазмидной ДНК во внесенной в гель пробе оцени вают путем сопоставления интенсивности свечения полос со стандартной ДНК маркеров.

Рис. 2.7. Пример электрофореза в 1 % геле агарозы, окрашен бромистым этидием.

1 – интектная плазмида, 2 – линейная плазмида после расщепления уникальной рестрикта зой (один сайт на молекулу), 3 – маркеры молекулярного веса, длины в тысячах нуклео тидных пар. Формы интактной плазмиды: Ден – денатурированная, Сс-М – суперскручен ная мономерная, Сс-Д – суперскрученная димерная, Рел – релаксированная, линейная форма в данном препарате отсутствует Ход работы:

1. Приготовить буфер ТАЕ (40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0) для электрофореза разведением стокового раствора ТАЕх50.

2. Приготовить 1 % гель агарозы на ТАЕ-буфере путем расплавления навески агарозы в микроволновой печи. После остывания до умеренно горя чего состояния добавить бромистый этидий до 0,25 мкг/мл и залить гель в форму.

3. Нанести 1 и 2 мкл полученного препарата рядом с 1 мкл маркерной ДНК в лунки приготовленного 1 % геля агарозы. Образцы перед нанесением Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК смешивают с 1 мкл буфера для нанесения и электрофорезным буфером так, чтобы наносимый объем составил 10–15 мкл, для равномерного распределе ния ДНК по толщине геля.

4. Провести электрофорез в течение 30 мин при напряжении 100 В.

5. С помощью системы видеодокументации получить фотографию геля в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм.

6. Идентифицировать полосы плазмидной ДНК в препарате. Оценить суммарное количество плазмидной ДНК во внесенной в гель пробе путем со поставления интенсивности свечения полос полученного препарата с интен сивностью свечения стандартной ДНК. После этого пересчитать количество полученной ДНК на общий объем препарата.

7. Записать вывод о качестве и количестве полученного препарата плазмидной ДНК.

Задача 2.1.3. Рестрикционный анализ полученного препарата плазмидной ДНК Рестриктазы, или, более корректно, рестрикционные эндонуклеазы, яв ляются важнейшими инструментами создания рекомбинантных ДНК и физи ческого картирования ДНК-молекул. Рестриктазы расщепляют двухцепочеч ную ДНК внутри молекулы. При этом каждая рестриктаза узнаёт определён ный участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов (сайт узнавания) и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его (сайт расщепления). Наиболее широкое применение в генной инженерии нашли высокоспецифичные рестриктазы, узнающие палиндромные последователь ности ДНК и расщепляющие ДНК-молекулу внутри сайта узнавания. При этом могут образовываться концы цепей трех структурных типов. Если раз рыв происходит посередине сайта рестрикции, то образуются фрагменты с полностью спаренными ("тупыми") концами. Когда расщепление ДНК про исходит в стороне от середины сайта, образуются выступающие однонитевые концы, получившие название "липких", т. е. способных "слипаться" с ком плементарным концом, образующимся в противоположной цепи в результате ее разрыва. Число нуклеотидов в однонитевом концевом участке может варь ировать от одного до пяти.

Молекулы ДНК из разных источников, обработанные одной и той же высокоспецифичной рестриктазой, расщепляющей палиндромные последо вательности, будут иметь одинаковые гибридизующиеся между собой липкие концы. Наличие таких липких концов у фрагментов ДНК существенно об легчает их ковалентное сшивание специальным ферментом ДНК-лигазой (лигирование) в рекомбинантную молекулу.

Поскольку рестриктазы узнают специфические последовательности в молекуле ДНК, становится возможным физически определить местораспо Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ложение таких последовательностей, обрабатывая ДНК соответствующими рестриктазами. Физическую карту молекулы ДНК по рестрикционным сай там можно составить, анализируя длины фрагментов ДНК после расщепле ния различными рестриктазами.

Ход работы:

1. На основании физической карты плазмиды выбрать три рестриктазы для проведения расщепления полученного препарата плазмидной ДНК в двух вариантах реакции гидролиза двумя рестриктазами одновременно.

2. Для каждого из вариантов из каталога фирмы-поставщика (Сибэн зим) выбрать состав реакционной смеси, в которой одновременно активны обе из используемых рестриктаз.

3. По данным определения содержания ДНК в полученном препарате выбрать объемы пробы для рестрикционного анализа. Определить необходи мое количество единиц активности рестриктазы для полного гидролиза по лученного препарата за 30 мин и в соответствии с этим добавляемый объем фермента. Записать состав реакционной смеси.

4. Собрать реакции в двух вариантах и инкубировать 30 мин при опти мальной температуре расщепления для конкретных ферментов. В качестве отрицательного контроля ставится проба ДНК без добавления ферментов – всего 3 микропробирки.

5. Провести электрофорез гидролизованных образцов в 1 % геле агаро зы вместе с маркерными ДНК.

6. Оценить полноту расщепления пробы и размер полученных рестрик ционных фрагментов. Сопоставить полученный размер с ожидаемым соглас но физической карте плазмиды. Записать выводы.

Вопросы 1. Что представляют собой плазмиды?

2. На чем основаны методы разделения хромосомной и плазмидной ДНК в клетке?

3. Каков принцип щелочного метода выделения плазмидной ДНК?

4. На чем основано разделение макромолекул ДНК при агарозном гель электрофорезе?

5. Как можно определить размер молекул ДНК?

6. Какие формы плазмидной ДНК можно увидеть после электрофореза полученного препарата в агарозном геле?

7. Каково происхождение рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз)?

8. Каково значение открытия рестриктаз для развития методов клони рования и физического картирования ДНК?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий Цель работы: дать представление о различных методах введения чу жеродной ДНК в клетки-мишени. Получение экспериментальных навыков по созданию генетически модифицированных организмов на примере клеток E. сoli и дрожжей.

Задача работы: провести эксперимент по трансформации клеток E.

сoli и дрожжей рекомбинантным челночным вектором pPZA двумя различ ными способами – химической трансформацией и электропорацией, проде монстрировать связи ДНКРНКбелоксвойство организма.

Трансформация – применительно к доставке чужеродной ДНК в клет ку в самом общем значении термин обозначает процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении, как метод доставки ДНК, термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс по глощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдержи вают с ледяным раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шо ку при 42 °С в течение ~1 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность транс формации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добав ленной ДНК, при этом составляет примерно 105–107. Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются транс формированными, но этот недостаток компенсируется применением схем от бора, позволяющих быстро идентифицировать нужные клоны.

Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компе тентными. Доля компетентных клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно повысить, используя специальную питательную среду, условия куль тивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило, эмпирически). Часто этапом подготовки компетентных клеток идет получение сферопластов – клеток, частично или полностью (протопласты) лишенных наружной ригидной клеточной стенки. Например, только таким способом была осуществлена эффективная трансформация многих грампо ложительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некото рые методики трансформации дрожжей также включают стадии фермента тивного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК.

Одним из популярных методов введения нуклеиновых кислот в клетки мишени является электропорация – временное создание пор в бислойной Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий липидной мембране под кратким воздействием электрического поля. Это универсальный физический метод трансформации, методика которого разра ботана практически для всех типов клеток. Для многих типов клеток служит единственным способом высокоэффективной трансформации.

При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока дли тельностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации повышается до 109–1011 для малых плазмид (~3–6 тпн) и до 106 для больших (~135 тпн).

Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора ВАС. Элек тропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно боль шей напряженности (12–18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см.

Электропорация – наиболее простой, эффективный и воспроизводимый ме тод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального при бора электропоратора.

Материалы и оборудование:

термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24, «New Brunswick»

(СА) для выращивания клеточных культур (см. работу 2.1);

бокс-ламинар БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,2 производства «Ламинарные системы» (Россия), I класс защиты (рис. 2.8);

микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R (США) c ротором для микропробирок 1,5–2,0 мл (см. работу 2.1);

лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы «BioSan» (см. ра боту 2.1);

термостат модель КВ53, «Binder» (Германия) (см. работу 2.1);

универсальный электропоратор «GenePulser Xсell» фирмы «Bio-Rad»

(США) с одноразовыми кюветами для электропорации (рис. 2.9);

водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan» (рис. 2.10);

замороженные химически компетентные клетки E. coli XL1-Blue;

химически компетентные клетки метилотрофных дрожжей Pichia pas toris;

электрокомпетентные клетки дрожжей Pichia pastoris;

раствор плазмидной рекомбинантной ДНК челночного экспрессионно го вектора pPZA с блеомициновй устойчивостью, несущего вставку чуже родного гена;

реагенты для химической трансформации дрожжей Pichia pastoris c LiCl;

агар на LB среде;

антибиотик блеомицин 100 мг/мл;

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий чашки Петри;

стерильная одноразовая пластиковая посуда (наконечники, микропро бирки), шпатели для растирания культур;

пластиковые пробирки Eppendorf;

контейнер со льдом, водяная баня (42 °С), термостат (37 °С).

Характеристика оборудования Бокс-ламинар «БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,2» производства «Ламинар ные системы» (Россия), I класс защиты, предназначен для создания беспыле вой абактериальной воздушной среды. Используется при работе с препарата ми и бактериальными культурами, не представляющими угрозы для здоровья оператора, когда необходима защита рабочего материала от окружающей среды или работа с объектом требует стерильной рабочей зоны.

Технические характеристики Габариты рабочей камеры ламинарного бокса (ШхГхВ) 1105х620х мм, внешние габариты 1170х685х1115 мм, масса 145 кг.

Две встроенные розетки.

Плоская несъемная столешница из полированной нержавеющей стали.

Шильд-панель с ЖК-экраном, индицирующим включение систем изде лия.

Таймер работы УФО рабочей камеры, счетчик наработки УФО, часы, технологический таймер.

Двухступенчатая система фильтрации (классы фильтров G4 (предвари тельная очистка), НЕРА Н14), класс чистоты воздуха рабочей зоны ламинар ного бокса по ГОСТ Р ИСО 14644-1-2002 (по частицам 0,5 мкм) 5ИСО.

Система автоматического поддержания потока воздуха со скорость воздушного потока 0,45±10 % м/с.

Производительность ламинарного бокса 800 м3/ч.

Освещенность рабочей зоны ламинарного бокса 1000 Лк.

Универсальный электропоратор «GenePulser Xсell Total System» фирмы «Bio-Rad» с одноразовыми кюветами для электропорации (рис. 2.9) является эффективной альтернативой другим способам доставки экзогенных молекул в клетку-хозяина. Универсальная система электропорации «GenePulser Xсell Total System» фирмы «Bio-Rad» с электропорационной ячейкой предназначе на для эффективного внедрения нуклеиновых кислот, белков, углеводов, кра сителей, вирусных частиц и других молекул как в прокариотические, так и в эукариотические клетки. Здесь электропорация осуществляется либо экспо ненциальным, либо квадратноволновым пульсом для подбора максимальной трансформационной эффективности. Система включает три модуля (глав ный, CE модуль для эукариот и РС-модуль для прокариот) и электропораци онную ячейку «Shockpod». В комплекте ряд предустановленных оптимизи рованных протоколов для большинства широко используемых типов клеток.

Установленные протоколы разработаны с возможностью их оптимизации и Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий создания новых протоколов для повышения эффективности трансфекции и увеличения жизнеспособности любых типов клеток.

Рис. 2.8. Внешний вид ламинара «БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,2»

производства «Ламинарные системы» (Россия), I класс защиты Рис. 2.9. Внешний вид универсального электропоратора «GenePulser Xсell Total System»фирмы «Bio-Rad» с электропорационной ячейкой «Shockpod»

Технические характеристики Электропорация проводится в одноразовых кюветах 0,1 мм, 0,2 мм и 0,4 мм.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий Форма пульсовой волны – экпоненциальная или квадратная с изменяе мым напряжением 10–3000 В.

Электрическая емкость в диапазоне 10–500 В – 25–3275 мкФ с 25 мкФ инкрементом, в диапазоне 500–3000 В – 10, 25 и 50 мкФ.

Длительность квадратно-волнового пульса: в диапазоне 10–500 В – продолжительность 0,05–10 мс с 0,05 мс инкрементом, продолжительность 10–100 мс с 1 мс инкрементом, 1–10 пульсов с 0,1–10 с интервалом. В диапа зоне 500–3000 В – продолжительность 0,05–5 мс с 0,05 мс инкрементом, 1–2 пульса с интервалом минимум 5 с.

Сопротивление образца – 20 минимум при 10–2500 В, 600 мини мум при 2500–3000 В.

Удобный цифровой интерфейс с интуитивно программируемым кон тролем всех параметров. Встроенные оптимизированные протоколы и созда ваемые заново модифицируемые протоколы для специфических задач для получения лучшей доставки молекул в клетки.

Хранение и вызов параметров пульса для последних 100 эксперимен тов.

Водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan» предназначена для проведения химических, фармацевтических, медицинских и биологических исследований. Модель WB-4MS обеспечивает повышенную стабилизацию температуры (до 0,1 °С) за счет работы встроенной магнитной мешалки.

Рис.. 2.10. Водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan»

Технические характеристики Диапазон регулировки температуры +25–100 °C с 0,1 °C точностью, цифровая установка, ЖК-дисплей.

Регулировка оборотов магнитной мешалки в диапазоне 300–1000 об/мин.

Емкость ванны из нержавеющей стали 4 л, габариты 350x175x250 мм, масса не более 3,6 кг.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий Потребляемая мощность не более 600 Вт.

Задача 2.2.1. Химическая трансформация клеток E. сoli Ход работы:

1. Подписать две пластиковые пробирки +ДНК и –ДНК.

2. В ламинарном боксе стерильно отобрать по 50 мкл суспензии компе тентных клеток в трансформационном буфере в каждую пробирку. Помес тить пробирки в ледяную баню.

3. В пробирку +ДНК внести 1 мкл раствора плазмидной ДНК. В про бирку –ДНК внести такое же количество буфера без ДНК. Выдержать обе смеси на льду 20 мин.

4. Расплавить агар в микроволновой печи и залить чашки с анти биотиком и без него. Конечная концентрация блеомицина для клеток E. сoli 25 мкг/мл, для дрожжевых клеток 100 мкг/мл.

5. Высушить залитые агаром чашки под UV-облучением в ламинарном боксе.

6. Провести процедуру теплового шока. Для этого обе пробирки помес тить в водяную баню (42 °С) на 25 с (строго!), после чего быстро перенести их опять на лед. Выдержать 2–3 мин.

7. Пробирки вынуть изо льда, добавить по 250 мкл свежей LB-среды (стерильно!) и инкубировать при 37 °С в течение 30 мин.

8. Высеять полученные клетки на соответствующие чашки с агаром.

Для этого отобрать по 100 мкл клеточной суспензии и перенести ее на по верхность агара. Растереть стерильной стеклянной петлей досуха, закрыть чашки, перевернуть и поместить в термостат (37 °С) на ночь.

9. Проанализировать полученные результаты. Сравните количество вы росших колоний на чашках с антибиотиком и без.


10. Определите эффективность трансформации по формуле.

Эфф. трансф. = число колоний на чашке / кол-во ДНК на чашку (мкг).

Задача 2.2.2. Трансформация клеток E. сoli электропорацией Ход работы:

1. Подписать две пластиковые пробирки +ДНК и –ДНК.

2. В ламинарном боксе стерильно отобрать по 80 мкл суспензии элек трокомпетентных клеток в воде в каждую пробирку. Поместить пробирки в ледяную баню.

3. В пробирку +ДНК внести 1 мкл раствора плазмидной ДНК в воде.

В пробирку –ДНК внести такое же количество буфера без ДНК. Перемешать.

4. Перенести смесь клеток с ДНК в электропорационную кювету 0,1 мм.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий 5. Провести процедуру электропорации при 1800 кВ пульсе согласно инструкции к прибору.

6. Сразу же добавить к клеткам SOC-среду и поместить их в термостат на 30 мин при 37 °С, лучше с перемешиванием.

7. Высеять полученные клетки на соответствующие чашки с агаром.

Для этого отобрать по 100 мкл клеточной суспензии и перенести ее на по верхность агара. Растереть стерильной стеклянной петлей досуха, закрыть чашки, перевернуть и поместить в термостат (37 °С) на ночь.

9. Проанализировать полученные результаты. Сравнить количество вы росших колоний на чашках с антибиотиком и без.

10. Определить эффективность трансформации аналогично п. 10 задачи 2.1.1 и сравнить ее с полученной для химически компетентных клеток.

Вопросы 1. Что такое генетическая трансформация?

2. Что такое компетентные клетки? Как вы себе представляете процесс проникновения плазмидной ДНК внутрь клеток в момент температурного шока?

3. Каков процесс проникновения молекул рекомбинантной ДНК внутрь клеток в процессе электропорации?

4. Почему для проведения генетических модификаций чаще всего ис пользуют клетки E. coli? Какие еще организмы используются в биотехноло гии?

5. Какова эффективность проведенной вами трансформации? От чего она зависит?

Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Цель работы: знакомство с постановкой определения генетически мо дифицированных ороганизмов (ГМО), процедурами выделения ДНК из пи щевых продуктов, проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анали за продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза.

Задачи: определить присутствие генетически модифицированного рас тительного сырья в образцах пищевых продуктов.

Достижения современной биотехнологии позволили вывеcти новые сорта сельскохозяйственных культур с полезными свойствами: устойчиво стью к вредителям и грибковым заражениям, повышенной пищевой ценно стью, повышенной урожайностью, засухоустойчивостью и пр. – с помощью генетических манипуляций, т. е. введением в геном растения генов, обеспе Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР чивающих соответствующий признак или модификацией существующих.

В обществе существуют как сторонники, так и противники генно модифицированных культур. Первые указывают на полезные свойства, кото рые позволяют интенсифицировать сельское хозяйство, избежать использо вания гербицидов, получать более высокие урожаи и т. п. Вторые опасаются проявлений аллергических реакций на такие продукты, снижения природного биоразнообразия, утечки трансгенов в дикую природу и других неопределен ных отдаленных во времени последствий.

В настоящее время не обнаружено однозначных доказательств, что ге нетически модифицированные продукты способны принести вред человеку.

Хотя выгода от применения ГМ-растений очевидна, существует много про тивников трансгенных растений, убежденных в их опасности и использую щих в своих аргументах невозможность ученых дать полную гарантию безо пасности подобных продуктов. В каждой стране мира вопрос об использова нии трансгенных растений решается по-разному местными законодателями.

Примерно в 30 странах мира действует правило, согласно которому упаковка продуктов, при изготовлении которых использовались достижения генной инженерии, должна содержать информацию об этом, чтобы потреби тели самостоятельно делали свой выбор. Однако во многих случаях, например, когда соя используется при производстве мясных полуфабрикатов, производители не сообщают об этом покупателям.

С 1 июня 2004 г. в Российской Федерации установлен новый допусти мый порог наличия таких примесей – 0,9 %, который требуется количествен но точно детектировать и указывать на упаковке.

Генетически модифицированные продукты абсолютно ничем не отли чаются по внешнему виду от своих природных аналогов. Установить генети ческую модификацию проще всего методами генетического анализа, а имен но методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Если просто наличие ГМ-примесей (принцип да-нет) можно установить обычной ПЦР, то для ко личественной оценки примесей требуется более сложный метод ПЦР в ре альном времени (real time PCR). Последний получает все более широкое рас пространение, поскольку законодательство требует количественной марки ровки присуствия ГМ-примесей в пищевых продуктах.

ПЦР-анализ основан на поиске последовательностей, общих для боль шинства генно-модифированных организмов. На рис. 2.11 схематически по казано, как с помощью ПЦР проводится определение ГМО.

При этом используют специфические праймеры, которые комплемен тарны характерным участкам в геноме ГМО. Дело в том, что генетики ис пользуют практически одни и те же регуляторные участки (промотор и тер минатор транскрипции) для контроля экспрессии вставленного гена.

Для получения ГМ-растений используют, как правило, 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV), который присутствует во всех из вестных и выращиваемых в промышленных масштабах ГМО и ДНК NOS терминатора T1 плазмиды почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, который также присутствует во многих промышленно выращиваемых Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР ГМ-растениях. В данной работе используются праймеры, комплементарные именно этим последовательностям. Размеры ДНК, которые при этом синте зируются, – 200 тыс. п.о. Чтобы проконтролировать, что экстрагированная из тестового образца ДНК содержит гены растительных белков, в работе преду смотрена контрольная ПЦР с «растительным» праймером к гену хлоропласта PSII. Размер синтезируемого при этом фрагмента – 455 тыс. п.о.

Рис. 2.11. Определение наличия ГМО в продуктах с помощью ПЦР:

М – маркеры молекулярных весов Материалы и оборудование:

набор реагентов для проведения анализа GMO-Investiator kit #166 2500EDU (BioRad), включающий сертифицированный контрольный ГМО отрицательный образец;

контрольный ГМО-положительный образец;

смесь для проведения ПЦР – Master mix;

смесь ГМО праймеров;

смесь Plant PSII праймеров;

набор маркерных ДНК;

краситель для гелей Orange G;

сорбент, хелатирующий ионы Mg2+ (InstaGene™ matrix);

образец продукта для исследования;

набор пластиковой посуды: микропробирки 1,5 мл, пробирки для ПЦР 0.2 мл, наконечники для набора растворов, наконечники с фильтрами;

комплект автоматических пипеток, штативы;

ПЦР-бокс для стерильных работ с УФ-рециркулятором производства «BioSan»;

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R c ротором для мик ропробирок 1,5–2,0 мл (см. работу 2.1);

лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы BioSan (см. рабо ту 2.1);

градиентный термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот «MJ Mini» фирмы "Био-Рад" (США);

градиентная реал-тайм ПЦР система «Chromo4» фирмы "Био-Рад" (США) для проведения ПЦР в реальном времени;

оборудование для горизонтального гель-электорфореза ДНК: источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» и «Sub-Cell GT» камеры с за ливочными столиками «Bio-Rad» (США) (см. работу 2.1);

водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan» (см. работу 2.2);

система видеодокументирования гелей «Molecular Imager Gel Doc XR»

производства «Bio-Rad» (США) с трансиллюминатором (см. работу 2.1).

Характеристика оборудования ПЦР-бокс для стерильных работ с УФ-рециркулятором UVC/T-AR «Biosan» (рис. 2.12), оборудованный открытой УФ-лампой и УФ-проточным рециркулятором, предназначен для стерильных работ, а также работ, чувст вительных к РНК- и ДНК-контаминациям, напрмер, постановка реакций ам плификации. Закрытый проточный УФ-рециркулятор позволяет осуществ лять не только прямую УФ-обработку рабочей поверхности бокса, но также постоянную УФ-обработку воздушного пространства бокса, что рекоменду ется при работе с опасными инфекционными и вирусными материалами.

Рис. 2.12. Внешний вид ПЦР-бокса для стерильных работ с УФ-рециркулятором фирмы «BioSan»

Технические характеристики Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Освещение и обеззараживание: 1 лампа дневного света 15Вт и УФ лампа 25 Вт без озона, УФ-рециркулятор, состоящий из УФ-лампы 25 Вт, вентилятора и антипылевого фильтра, заключенных в специальный корпус для защиты рабочей поверхности во время работы.


Длительный срок службы УФ ламп до 8000 часов.

Автоматическое выключение УФ-ламп в случае открытия передней дверцы.

Цифровой таймер на 1 мин – 24 часа/постоянно.

Масса не более 26 кг, внешние размеры 690x515x555 мм.

Низкий уровень шума и энергопотребления.

Градиентный термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот «MJ MiniCycler» фирмы "Био-Рад" (рис. 2.13) является компактным персо нальным 48-луночным прибором для амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР). Технология температурного градиента позволяет одновременно инку бировать образцы при 8 различных температурах, что делает возможным оп тимизацию условий ПЦР за одну реакцию для достижения максимальной эффективности реакции и точности количественного определения. Блок для образцов размером 6х8 может вмещать до 48 0,2 мл пробирок, стрипы, 48-луночные планшеты и до 12 0,5 мл пробирок:

Рис. 2.13. Внешний вид градиентного термоциклера «MJ Mini» фирмы "Био-Рад" Технические характеристики Вмещаемое количество образцов: 48х0,2 мл пробирки, 0,2 мл 48-луночные планшеты, 6х8 0,2 мл стрипы или 12х0,5 мл пробирки.

Диапазон инкубационных температур 0–99 °С, точность ±0,2 °С при достижении программируемой температуры в 90 °С.

Скорость изменения температуры до 2,5 °С в секунду.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Равномерность поддерживаемых температур не более ±0,4 °С между лунками в пределах 10 с при программируемом достижении 90 °С.

Диапазон температурного градиента 35–99 °С с возможными предела ми изменений 1–16 °С.

Точность поддержания температурного градиента ±0,4 °С между лун ками одного ряда при достижении программируемой цели в конце ряда тем ператур.

Равномерность поддерживаемых градиентных температур не более ±0,4 °С между лунками одного ряда пределах 30 с при достижении целевой температуры.

ЖК-дисплей 64х128, 2 USB входа.

Память на 400 типовых программ.

Градиентная реал-тайм ПЦР система «Chromo4» фирмы "Био-Рад" (рис. 2.14) предназначена для амплификации ДНК с оценкой результатов в реальном времени для количественного определения матриц с возможностью детекции до четырех мишеней в одном образце. Оптический детектор флюо ресцентных проб «Chromo4» установлен на базе градиентного термоциклера «DNA Engine PTC-200» с встроенным 96-луночным модулем для образцов.

Система укомплектована управляющим настольным компьютером с интегрированным программным обеспечением для анализа результатов и принтером.

Рис. 2.14. Внешний вид градиентной реал-тайм ПЦР системы «Chromo4»

фирмы "Био-Рад" для количественного определения молекул нуклеиновых кислот в образцах Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Технические характеристики Вмещаемое количество образцов: 96 штук 0,2 мл пробирок, один 0,2 мл 96-луночный планшет или 12 штук 0,2 мл 8-пробирочных стрипов с объемом одного образца 10–100 мкл (20 мкл рекомендуется).

Диапазон инкубационных температур 0–105 °С, точность ±0,3 °С при достижении программируемой температуры в 90 °С.

Скорость изменения температуры до 3 °С в секунду.

Равномерность поддерживаемых температур не более ±0,4 °С между лунками в пределах 30 с при программируемом достижении 90 °С.

Диапазон температурного градиента 30–105 °С с возможными преде лами изменений 1–24 °С.

Точность поддержания температурного градиента ±0,4 °С между лун ками одного ряда при достижении программируемой цели в конце ряда тем ператур.

Равномерность поддерживаемых градиентных температур не более ±0,4 °С между лунками одного ряда в пределах 30 с при программируемом достижении 90 °С.

Диапазон возбуждения флюоресценции: канал 1 – 450–490 нм, канал 2 – 500–535 нм, канал 3 – 555–585 нм, канал 4 – 620-6500 нм.

Диапазон детекции флюоресценции: канал 1 – 515–530 нм, канал 2 – 560–580 нм, канал 3 – 610–650 нм, канал 4 – 675–730 нм.

Память на 400 типовых программ.

Масса 12,6 кг.

Занятие 1. Экстракция ДНК из образцов и постановка ПЦР Внимание!

Работы с генетическим материалом и при постановке ПЦР требуют специальных условий:

1. Все работы проводятся в перчатках, спецодежде (лабораторные ха латы).

2. В лаборатории нельзя есть, пить, курить, разговаривать над откры тыми пробирками.

3. До и после проведения работ необходимо тщательно вымыть руки.

4. Обо всех нестандартных ситуациях необходимо немедленно уведо мить преподавателя.

Ход работы:

1. Подписать две 1,5 мл микропробирки «non-ГМО» и «тест».

2. Отобрать 0,5–2,0 г «non-ГМО» образца, перенести в ступку, добавить по 5 мл дистиллированной воды на каждый грамм образца.

3. Растереть образец пестиком в течение 2 мин до получения однород ной массы.

4. Добавить еще 5 объемов воды и снова растереть массу пестиком.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР 5. В пробирку«non-ГМО» внести 500 мкл InstaGene™ matrix и 50 мкл полученной после растирания массы, закрыть пробирку.

6. Повторить п. 2–4 для приготовления тестового образца.

7. В пробирку «тест» внести 500 мкл InstaGene™ matrix и 50 мкл полу ченной после растирания тестового образца массы, закрыть пробирку.

8. Тщательно перемешать пробирки на шейкере и поместить в водяную баню на 95 °С на 5 мин.

9. Поместить пробирки в центрифугу и центрифугировать в течение 5 мин на максимальной скорости. Супернатант содержит ДНК-экстракт.

10. Пронумеровать пробирки для ПЦР 1–6. Содержимое каждой про бирки указано в табл. 2.1.

Таблица 2. № Смесь реагентов для ПЦР Master mix ДНК 20 мкл растительной Мм (зеленая) 20 мкл, «non-ГМО» образец 20 мкл ГМО Мм (красная) 20 мкл, «non-ГМО» образец 20 мкл растительной Мм (зеленая) 20 мкл, «тест» образец 20 мкл ГМО Мм (красная) 20 мкл, «тест» образец 20 мкл растительной Мм (зеленая) 20 мкл, «+ГМО» образец 20 мкл ГМО Мм (красная) 20 мкл, «+ГМО» образец 11. Поместить все пробирки на лед.

12. В каждую пробирку поместить по 20 мкл соответствующей смеси Master mix, каждый раз используя свежий наконечник.

13. Соответственно надписи внести в пробирки образцы ДНК из п. (Осторожно! Нас интересует только супернатант!) и перемешать тщательно пипетированием.

14. Включить термоциклер по заданной программе (табл. 2.2), после нагрева термоблока до температуры денатурации поставить прибор на паузу и быстро поместить в него пробирки.

Таблица 2. Число Шаг Функция Температура Длительность циклов Начальная дена- Денатурация 94 °С 2 мин турация Денатурация 94 °С 1мин Амплификация Отжиг 59 °С 1мин Синтез 72 °С 2 мин Завершающий Синтез 72 °С 10 мин синтез (элогация цепи) Хранение Хранение 4 °С неопределенное * Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза Ход работы:

1. Приготовить 1 % гель агарозы и аппарат для гель-электрофореза со гласно протоколу из работы 2.1, задача 2.1.1. Гель приготовить без бромисто го этидия.

2. Пробирки после ПЦР отцентрифугировать (пульс-режим).

3. В каждую пробирку внести по 10 мкл раствора красителя Orange G, тщательно перемешать на вортексе.

4. В лунки геля поместить по 20 мкл образцов в следующем порядке (табл. 2.3):

Таблица 2. Номер Образец лунки «non-ГМО» образец, растительный праймер «non-ГМО» образец, ГМО праймер «тест» образец, растительный праймер «тест» образец, ГМО праймер «+ГМО» образец, растительный праймер «+ГМО» образец ГМО праймер набор стандартов мол. массы 100 bp 5. Провести электрофорез на агарозном геле в течение 30 мин при на пряжении 100 В.

6. Зафиксировать результат на системе видеодокументации и проанали зировать полученные результаты. Заполнить табл. 2.4.

Таблица 2. Номер Наличие Размер Нанесенный образец полосы полос фрагментов «non-ГМО» образец, растительный прай мер «non-ГМО» образец, ГМО праймер «тест» образец, растительный праймер тест» образец, ГМО праймер «+ГМО» образец, растительный праймер «+ГМО» образец ГМО праймер стандарты мол. массы Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Вопросы 1. Какие из молекул, содержащихся клетке, могут повлиять на выделе ние ДНК?

2. На каких принципах основан метод ПЦР?

3. Зачем нужны праймеры и как выбрать их последовательность?

4. Что такое ГМО? Как вы относитесь к проблеме их распространения?

5. Возможно ли создание единой методики ПЦР с одинаковыми прай мерами для определения всех видов ГМО?

5. Какие экспериментальные условия надо соблюдать при постановке ПЦР? С чем это связано?

6. Что такое Tаg-полимераза? Что должно находиться в реакционной смеси для ее эффективной работы?

7. Как происходит разделение ДНК-фрагментов во время электро фореза?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Цель: освоение методов современной молекулярной диагностики – иммуноанализа и гибридизационного анализа, изучение возможностей и ог раничений каждого метода, соблюдение технологических требований к усло виям проведения анализа.

Задачи:

– ознакомить с технологическими требованиями к условиям проведе ния анализа биологических образцов;

– обучение технике экстракции генетического материала из биологиче ских образцов;

– обучение технике постановки полимеразной цепной реакции;

– освоение метода анализа продуктов ПЦР с помощью гель электрофореза;

– обучение технике постановки иммуноанализа (на примере ELIZA);

– освоение колориметрического и биолюминесцентного вариантов им муноферментного анализа.

Развитие и достижения геномики человека обеспечили новые возмож ности для развития целого ряда других научных направлений. К настоящему времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за бо лезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию, муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна, дистонию, гемофилию А и В, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, син дром хрупкости Х-хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников и др. Структуры этих генов расшифрованы и сами они клонированы. Это по зволяет проводить эффективную раннюю и даже пренатальную диагностику и лечение. Тестирование будущих родителей на высокий риск генетического заболевания теперь может проводиться для постоянно растущего числа ге нов. При этом типичным подходом является использование исследований при помощи гибридизации или ПЦР-анализа. Можно протестировать здоро вого человека из семьи, где встречался, например, кистозный фиброз, и опре делить, есть ли у него копия дефектного гена или нет. Если неблагополучно го сочетания генов избежать не удалось и оба потенциальных родителя яв ляются носителями рецессивного дефекта, они должны сами решать, риско вать ли им, чтобы иметь детей. В любом случае раннее начало профилакти ческого лечения ребенка позволит предотвратить начало заболевания или отодвинуть начало его проявления. Сегодня в практику медико генетического консультирования введены десятки систем для генодиагно стики наиболее распространенных наследственных заболеваний. Установ ленная последовательность генома поможет идентифицировать новые гены и Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ выявить среди них те, что обусловливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям.

Успехи современной медицины в огромной мере зависят от того, уда стся ли вовремя обнаружить специфические инфекционные агенты (вирусы, бактерии, паразитические микроорганизмы) или изменения в содержании важных биологически активных белков или низкомолекулярных соединений в организме. Надо ли говорить, что профилактику и лечение любого заболе вания существенно облегчает ранняя и точная диагностика. Современные ме тоды молекулярной диагностики обладают высокой специфичностью и чув ствительностью и при этом являются достаточно продуктивными, эффектив ными и недорогими для рутинного применения.

Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Задача Цель работы: знакомство с процедурой проведения твердофазного иммуноферментного анализа, демонстрация использования в качестве метки генетически слитого бифункционального химерного белка, обладающего биолюминесцентной активностью Са2+-активируемого фотопротеина обели на и иммуноглобулин-связывающей способностью белка А из Staphylococcus aureus.

Материалы и оборудование:

0,1М фосфатный буфер, содержащий 0,9 % NaCl (PBS);

1% р-р бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS;

растворы иммуноглобулинов класса G кролика, мыши и человека (RIgG, MIgG, HIgG), в PBS, 10 мкг/мл;

раствор для помывки планшетов (PBS, содержащий 0, 05 % Tween-20 и 5мМ ЭДТА);

непрозрачные планшеты для иммунологического микроанализа;

раствор химерного белка с активностью 500 мV/мл;

планшетный люминометр Luminoscan v1.30;

набор автоматических пипеток и наконечники к ним.

Микропланшетный люминометр Luminoscan v1.30 (ThermoElectron, Финляндия) (рис. 3.1). Прибор предназначен для измерения люминесцентно го сигнала от растворов в лунках микропланшет для иммуноферментного анализа.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Рис. 3.1. Внешний вид микропланшетного люминометра Luminoscan v1. (ThermoElectron, Финляндия) Технические характеристики Диапазон измерений – 270–670 нм.

Люминометрический диапазон – до 5000 относительных световых единиц.

Чувствительность – 1 фмол АТФ.

Люминометрический динамический диапазон – 9 порядков.

Прибор оснащен орбитальным шейкером, что позволяет проводить ин кубирование планшет при перешивании, скорость вращения 60–1200 rpm, диаметр – 50 мм.

Прибор позволяет производить измерения при термостатировании в температурном режиме от 25 до 37 С. Он оснащен системой впрыска реа гентов – диспенсером с объемом от 1 до 1000 мкл с разрешением 1 мкл.

Имеется возможность производить измерения как в стандартном 96 луночном микропланшете, так и других, от 6 до 384-луночных планшетах.

Для коммуникации через PC прибор укомплектован соответствующим программным обеспечением.

Наличие шейкера – орбитальный, скорость 60–1200 rpm.

Температурный режим – 25–37 С.

Наличие диспенсера – 1, 1–1000мкл, с разрешением 1 мкл.

Ход работы:

1. В лунки с координатами А2-F12 (всего 66 лунок) планшета для им муноферментного анализа внести по 100 мкл PBS.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ 2. В лунки А1,В1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов кро лика;

в лунки С1,D1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов мыши;

в лунки E1,F1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов человека (кон центрации растворов иммуноглобулинов – 5 мкг/мл).

3. В каждом ряду раститровать растворы иммуноглобулинов с шагом 2.

Последние две лунки каждого ряда оставить с PBS для контроля.

4. Для эффективной сорбции планшет выдержать при 37 °С в течение часа либо при 4 °С в течение ночи.

5. Удалить содержимое лунок и промыть их раствором для промывки трижды.

6. В каждую лунку внести по 120 мкл раствора БСА и проинкубиро вать планшет при 37 °С в течение часа.

7. Промыть планшет так, как описано в п. 5.

8. В каждую лунку внести по 100 мкл раствора химерного белка и про инкубировать планшет при комнатной температуре в течение часа.

9. Промыть планшет так, как описано в п. 5.

10. Провести измерения биолюминесценции сорбированного химерно го белка с помощью планшетного люминометра Luminoscan v1.30.

11. Построить зависимость люминесцентного сигнала от концентрации каждого из иммуноглобулинов, усредняя соответствующие сигналы и вычи тая сигнал в контрольной лунке.

Вопросы 1. На чем основан иммуноферментный анализ?

2. За счет чего происходит сорбция иммуноглобулинов? Как еще мож но проводить первичную сорбцию?

3. Для чего проводится обработка поверхности лунок раствором БСА (п.6)?

4. За счет чего происходит сорбция химерного белка? Обоснуйте ответ.

5. Как меняется величина биолюминесцентного ответа от происхожде ния иммуноглобулинов? За счет чего?

Задача 2. Определение модельной эпидемической вспышки с помощью ELIZA Цель работы: знакомство с построением и процедурой твердофазного иммуноферментного анализа, получение экспериментальных навыков для проведения аналитического исследования на базе взаимодействия антиген антитело.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Анализ биологических образцов, построенный на базе взаимодействия антиген-антитело, называется иммуноанализом. На сегодня иммуноаналити ческие системы являются наиболее широко распространенными диагности ческими инструментами. Одна из разновидностей иммуноанализа – так назы ваемая ELIZA, система названная по первым буквам английского обозначе ния: enzyme-linked immunosorbent assay (фермент-связанный твердофазный иммуноанализ). Специфичность этого анализа обусловлена высокой аффин ностью взаимодействия антиген-антитело. Наличие этого взаимодействия определяют с помощью фермента, который присоединяется к иммуноглобу лину. При добавлении к этому комплексу субстрата данного фермента разви вается реакция, продукт которой обладает определенной визуальной харак теристикой – например, окраской или свечением. По количеству продукта (интенсивности окраски или свечения) судят о количестве антигена.

На рис. 3.2 показана последовательность операций, проводимых при имму ноферментном анализе: на поверхности иммунологической лунки иммобили зуется искомый антиген и другие белки (шаг 1), затем вносится раствор пер вичного антитела к данному антигену (шаг 2), после инкубирования и про мывок вносится вторичное антитело, помеченное ферментом (шаг 3), после инкубирования и промывок в лунки вносят субстрат фермента, который при взаимодействии с ферментом дает окрашенный продукт (шаг 4). Окра шивание раствора происходит только в тех лунках, куда вносили образцы, содержащие искомый антиген (рис. 3.2–3.3).

Рис. 3.2. Последовательность операций при проведении ELIZA Рис. 3.3. Так выглядит результат ELIZA Современный рынок предлагает иммунодиагностикумы для определе ния чрезвычайно широкого спектра молекул – от инфекционных агентов до токсинов, гормонов и т. п.



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.