авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 || 3 |

«УДК 60(075) ББК 30.16я73 С56 Авторы: Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, ...»

-- [ Страница 2 ] --

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Для выполнения работы используется микропланшетный денситометр Model 680 ("BioRad", США) (рис. 3.4). Прибор предназначен для измерения оптической плотности растворов в лунках микропланшет для иммунофер ментного анализа.

Рис. 3.4. Внешний вид микропланшетного денситометра Model 680 ("BioRad", США) Технические характеристики Диапазон измерений – 400–750 нм.

Фотометрический диапазон – 0,000–3,5 ОД.

Линейность – ± 1 % в диапазоне 0,000–2,000;

± 2 % в диапазоне 2,000–3,000.

Погрешность – ± 1 % или 0,01 ОД в диапазоне 0,000–3,000 на 490 нм.

К прибору прилагаются 8 оптических фильтров.

Время считывания – 6 с на одной длине волны, 10 с на двух длинах волн.

Прибор оснащен жидкокристаллическим дисплеем, имеются опции встроенного хранения стандартных кривых и графиков и интерфейс к друго му принтеру. Результаты измерений выдаются с помощью встроенного прин тера на термической ленте.

В рамках данной работы предлагается провести иммуноанализ на при сутствие модельного антигена в данных биологических образцах с помощью ELIZA. Образцам будут присвоены имена, и часть из них будет смешана с другими. Таким образом будет смоделировано распространение модельной контактной инфекции среди близкой группы людей. Это распространение Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ должно быть обнаружено по результатам проведенного анализа ELIZA. Ре портерным ферментом, используемым в работе, является пероксидаза хрена.

Материалы и оборудование:

набор реагентов для проведения анализа ELIZA Immuno Explorer Kit # 166-2400EDU (BioRad), включающий:

образец антигена («положительный контроль»);

образец первичных антител (ПА);

образец вторичных антител, меченых пероксидазой хрена (HRP) (ВА);

раствор субстрата пероксидазы (тетраметилбензидина, TMB);

10-кратный раствор фосфатного буфера и NaCl (PBS);

10 % раствор Tween20;

набор пластиковой посуды: пробирки Eppendorf (1,5 мл), наконечники для набора растворов, резервуары для промывочных растворов;

комплект автоматических пипеток, штативы;

иммунологические планшеты стандартного или стрипового типа (12-луночные);

бумажные полотенца;

микропланшетный денситометр Model 680 («BioRad»).

Ход работы:

1. Каждый студент получает образец «своей биологической жидкости».

Таблица 3. Образцы для проведения анализа ELIZA Immuno Explorer Kit # 166-2400EDU (BioRad) Пробирка Описание Обозначение Содержание Фиолетовая Положительный контоль 0,5 мл + Синяя Отрицательный контроль 0,5 мл _ Зеленая Первичные антитела 1,5 мл ПА Оранжевая Вторичные антитела 1,5 мл ВА Коричневая Субстрат для HRP 1,5 мл Суб Желтая «инфицированный» 0,75 мл Х субъект Не «инфицированный» 0,75 мл Х «Желтая»

субъект 2. Часть студентов по указанию преподавателя смешивают свой Х-образец с другим студентом – получается образец Х1. Образцы хранить при 4 °С.

3. Подписать лунки стрипа, как показано на рис. 3.5.

4. В каждую лунку внести по 50 мкл соответствующего раствора. (Ис пользуйте только свежие носики!) Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ 5. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре, затем промыть трижды.

Рис. 3. 6. Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ПА инкубировать 5 мин при комнатной температуре.

7. Промыть трижды.

8. Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ВА инкубировать 5 мин при комнатной температуре.

9. Промыть трижды.

10. Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ВА инкубировать 5 мин при комнатной температуре.

11. Наблюдать полученный результат и, заполнив таблицу, проследить распространение условной инфекции при контактах внутри замкнутой попу ляции.

Таблица 3. Результаты работы Имя студента Полученный Наличие контактов образец (+) или (-) Вопросы 1. Как иммунная система защищает организм от инфекций?

2. Почему при пересадке органов необходимо принимать иммуносу прессанты?

3. Для чего служит ELIZA?

4. Почему и как работают репортерные ферменты?

5. Зачем необходимы «положительный» и «отрицательный» контроли?

6. Зачем проводят тщательные промывки лунок после каждой стадии?

7. Если получен негативный ответ по результатам иммуноанализа, оз начает ли это на 100 % отсутствие заболевания?

8. Какой иммунотест можно купить в любой аптеке?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Цель работы: знакомство с постановкой процедуры генотипирования на основе вариабельности длины участков коротких тандемных повторов – STR, овладение навыками постановки и проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза.

На сегодня наиболее надежным методом идентификации человека яв ляется метод отпечатка ДНК (DNA profil) – молекулярно-биологический ме тод, определяющий генотип данного образца ДНК и однозначно устанавли вающий его принадлежность (или её отсутствие) данному индивидууму. Этот подход используется в судебной экспертизе, при поиске людей, массовых ка тастрофах, установление родителей и пр. Какого типа ДНК последовательно сти можно использовать для этих целей? Известно, что ДНК человека содер жит 3 миллиарда п.о., 99,5 % из которых являются общими для всех людей.

Оставшиеся 0,5 % содержат различия, и именно эти полиморфные участки используются для идентификации (генотипирования), в том числе в судебной экспертизе. По всеобщему соглашению используются некодирующие после довательности ДНК, расположенные в разных участках хромосом (локусы).

Для судебной экспертизы используются некодирующие последовательности ДНК, содержащие так называемые участки коротких тандемных повторов – STR, от английского словосочетания short tandem repeats. STR представляют собой короткие последовательности ДНК (2, 3, 4, иногда 6, 8 нуклеотидов), которые многократно повторяются в 5’3’ направлении. На рис. 3.6 показан локус, известный как ТН01, реально использующийся для генотипирования.

Его ДНК содержит 4 повтора [ТСАТ]:

Рис. 3.6. Нуклеотидная последовательность ТН01 локуса Для этого ТН01 STR локуса существуют более 20 альтернативных форм (аллелей), найденных у людей по всему миру, которые различаются ко личеством повторов [ТСАТ]. Однако у каждого человека имеется только два аллеля – один унаследован от отца, другой от матери. Для получения ДНК отпечатка исследуемый образец ДНК амплифицируют с помощью ПЦР, с использованием специфических праймеров, последовательность которых комплементарна последовательностям с обеих сторон локусов, и получают миллионы копий двух оригинальных аллелей. Эти копии содержат то же са Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ мое число STR повторов, что и исходный образец ДНК, и разделяются по размеру с помощью гель-электрофореза. Полученный набор полос является индивидуальной характеристикой индивидуума. Для дискриминации (ис ключения персоны из числа подозреваемых, например) одного локуса недос таточно. Он может определить разницу между 1000 людьми, два локуса – между 10 000, в обычной практике пользуются результатами генотипирова ния по трем-пяти локусам. На рис. 3.7 показано, как, используя генотипиро вание сразу по трем локусам (TH01 gt6-3, D3S1358 gt16-17 и FGA gt21-23), из 13 возможных лиц (обозначены звездочками) можно идентифицировать только одно.

В настоящее время существует несколько баз данных по ДНК типированию. Одной из наиболее обширных является база данных американ ского федерального бюро расследований (организована в 1998 г.), в которой собраны данные о проходящих по криминальным делам и осужденных лиц, так называемая база CODIS (COmbined DNA Index System). В ней хранятся данные, полученные по генотипированию с использованием 13 локусов.

Рис. 3.7. Увеличение количества локусов, использованных при генотипировании, повышает вероятность идентификации индивидуума: 1 – TH01 генотип 6-3;

2 – D3S135 8 генотип 16–17;

3 – FG генотип 21- В рамках работы планируется следующий порядок операций: 1) прове дение ПЦР предложенных образцов ДНК (один из них принадлежит неиз вестному Х и получен с условного места преступления, остальные принад лежат условным подозреваемым лицам А-Г) с определенными парами прай меров;

2) разделение полученных ДНК по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза;

3) определение размеров полученных ДНК с помощью набора стандартных ДНК и сопоставление состава ДНК-фрагментов в полу ченных образцах для идентификации неизвестной ДНК.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Материалы и оборудование:

набор реагентов для проведения анализа Crime Scene Investigator PCR Basics™ Kit Catalog #166-2600EDU (BioRad), включающий:

5 образцов ДНК;

смесь для проведения ПЦР – Master mix;

набор праймеров для генотипирования по локусу BXP007;

набор маркерных аллельных ДНК;

краситель для гелей Orange G;

набор пластиковой посуды: пробирки Eppendorf (1,5 мл), пробирки для ПЦР, наконечники для набора растворов, наконечники с фильтрами;

комплект автоматических пипеток, штативы;

водяная баня;

микроцентрифуга, модель 5417R (Eppendorf, США);

термоциклер MJ MiniCycler («Био-Рад») ("Био-Рад", США);

реактивы и оборудование для проведения гель-электрофореза: горизон тальная камера с подносом для заливки геля и гребенки, генератор постоян ного тока, агароза, ТАЕ-буфер;

персональный термоциклер MJ MiniCycler ("Био-Рад", США);

центрифуга, модель 5417R (Eppendorf, США);

комплект, состоящий из горизонтальной камеры с подносом для залив ки геля Mini-Sub cell GT (Bio Rad, США) и гребенки, генератора постоянного тока PowerPac (Bio Rad, США).

Занятие 1. Постановка и проведение ПЦР с данными образцами ДНК Внимание!

Работы с генетическим материалом и при постановке ПЦР требуют специальных условий:

1. Все работы проводятся в перчатках, спецодежде (лабораторные ха латы) и очках.

2. В лаборатории нельзя есть, пить, курить, наносить косметику.

3. До и после проведения работ необходимо тщательно вымыть руки.

4. Обо всех нестандартных ситуациях необходимо немедленно уведо мить преподавателя.

Ход работы:

1. Подписать 5 пробирок для ПЦР: Х, А, Б, В, Г 2. Внести в пробирки ДНК и смесь Master mix + прамеры по табл. 3.1, при этом каждый забор производить свежим носиком с фильтром и сразу за крывать пробирки.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Таблица 3. Обозначение ДНК-матрица Master mix + прамеры Х + имя студента 20 мкл, Х-ДНК 20 мкл А + имя студента 20 мкл, А-ДНК 20 мкл Б + имя студента 20 мкл, Б-ДНК 20 мкл В + имя студента 20 мкл, В-ДНК 20 мкл Г + имя студента 20 мкл, Г-ДНК 20 мкл 3. Поместить пробирки в термоциклер и включить прибор по заданной программе (табл. 3.2).

Таблица 3. Число Шаг Функция Температура Длительность циклов Начальная Денатурация 94 °С 2 мин денатурация Амплификация Денатурация 94 °С 30 сек Отжиг 52 °С 30 сек Удлинение 72 °С 1 мин Финальное Удлинение 72 °С 10 мин удлинение Хранение* Хранение 4 °С неопределенное Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза Ход работы:

1. Приготовить аппарат для гель-электрофореза по инструкции к при бору.

2. Пробирки после ПЦР отцентрифугировать (пульс-режим).

3. В каждую пробирку внести по 10 мкл раствора красителя Orange G, пользуясь каждый раз свежим носиком и тщательно перемешивая.

4. В лунки геля поместить по 20 мкл образцов в следующем порядке (табл. 3.3).

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Таблица 3. Номер лунки Образец Набор стандартов мол. массы Х А Б В Г 5. Провести электрофорез на агарозном геле в течение 30 мин при на пряжении 100 V.

6. Окрасить гель и проанализировать полученные результаты.

Вопросы 1. Какие образцы пригодны для проведения ДНК-анализа?

2. Зачем мы использовали ПЦР?

3. Какая разница между аллелем и локусом?

4. Почему для ДНК-типирования ( в частности, в судебной экспертизе) используют ДНК некодирующих участков генома?

5. Что такое Master mix и для чего нужен каждый из её компонентов?

6. Какие стадии включает ПЦР и что происходит на каждой из них?

7. Как происходит визуализация материала после проведения гель электрофореза?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ Цель раздела: ознакомить с микроклональным размножением расте ний и направлениями его использования, объяснить механизмы процессов, протекающих при размножении в культуре тканей растений.

Задачи раздела:

– ознакомление с видами и способами выделения эксплантов для про ведения микроклонального размножения;

– освоение техники этапов и способов микроклонального размножения;

– определение роли фитогормонов в процессе микроразмножения на разных его этапах;

– управление возможностями увеличения коэффициента размножения растений.

Объект: декоративные и сельскохозяйственные растения Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения растений – кло нального микроразмножения (получение в условиях in vitro, неполовым пу тем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе ме тода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать при сущую ей тотипотентность (свойство соматических клеток растений полно стью реализовать свой генетический потенциал развития с образованием це лого организма), то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Процесс клонального микроразмножения состоит из четырех этапов:

1 – выбор растения-донора, изолирование эксплантов (ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и под держания ее жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры;

2 – собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов (или мериклонов – клон1, получен ный из меристемной культуры);

3 – укоренение размноженных побегов с по следующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости – депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2–10 оС);

4 – выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Клон – популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На 1-м этапе (введение в культуру) необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры, что осуществляется путем стерили зации растительных тканей, их тщательной промывки в стерильной дистил лированной воде и перенесения на приготовленную стерильную питательную среду. На этом этапе, как правило, используют среду, содержащую мине ральные соли по рецепту Мурасиге и Скуга (MS) (табл. 4.1), а также различ ные биологически активные вещества и стимуляторы роста: ауксины (произ водные индола, образующиеся в апикальных меристемах и стимулирующие клеточное растяжение) и цитокинины (производные 6-аминопурина, индуци рующие в присутствии ауксина деление клеток и дифференцировку стебле вых почек у каллусов, активирующие рост клеток листа) – в различных соче таниях в зависимости от объекта (работа 4.1).

Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 мес., в результате которого наблюдаются рост меристематических тканей и форми рование первичных побегов.

На 2-м этапе (собственно размножение, субкультивирование) необхо димо получить максимальное количество микропобегов. Как и на 1-м этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасиге и Скуга. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов – ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

Наиболее трудоемкими являются 3-й и 4-й этапы, от которых зависит успех клонального микроразмножения.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений Таблица 4. Составы наиболее употребляемых питательных сред Концентрация компонентов в среде, мг/л Составные компоненты Уайта Нича MS B5 N6 (Chu) Неорганические вещества NH4N03 - 1650 - 720 KNO3 80 1900 2500 950 СаС12х2Н20 - 440 150 - СаС12 - - - 166 MgSO4х7 H20 750 370 250 185 КН2РО4 - 170 - 68 (NH4)2SO4 - - 134 - Ca(NO3)2х4 H20 300 - - - Na2 SO4 200 - - - NaH2PO4хH20 19 - 150 - KC1 65 - - - KI 0,75 0,83 0,75 - 0, H3BO3 1,5 6,2 3 10 1, MnSO4х4 H20 5 22,3 - 25 MnSO4х H20 - - 10 - 3, ZnSO4х7 H20 3 8,6 2 10 1, NaMoO4х2 H20 - 0,25 0,25 0,25 MoO3 0,001 - - - CuS04х5H20 0,01 0,025 0,025 0,025 CoCl2х6H20 - 0,025 0,025 - Fe(SO4)3 2,5 - - - FeSO4х7 H20 - 27,8 27,8 27,8 27, Nа2ЭДТАх2 H20 - 37,3 37,3 37,3 37, Органические вещества Никотиновая кислота 0,5 0,5 1 5 0, Пиридоксин гидрохлорид 0,01 0,5 1 0,5 0, Тиамин гидрохлорид 0,01 0,1 10 0,5 Биотин - - - 0,05 Инозит - 100 100 100 Глицин 3 2 - 2 Фолиевая кислота - - - 0,5 Сахароза 20000 30000 20000 20000 pH - 5,8 5,5 - 5, Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений На 3-м этапе (укоренение), как правило, меняют основной состав сре ды: уменьшают в 2, а иногда и в 4 раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасиге и Скуга или заменяют ее средой Уайта (табл. 4.1), умень шают количество сахара до 0,5–1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования ис пользуют -индолил-3-масляную кислоту (ИМК), -нафтил-уксусную кисло ту (НУК) и чаще -индолил-уксусную ИУК. В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений – в условиях гидропоники (выращивание растений без почвы на искусственных средах с использовани ем питательного раствора). Он позволяет значительно упростить этап укоре нения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям.

Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной мате рией или добавление в питательную среду активированного угля способст вуют укоренению микропобегов.

4-й этап (адаптация к грунту). Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонально го микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки проби рочных растений – весна или начало лета. Растения с 2–5 листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно про стерилизованный при 85–90 °С в течение 1–2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1), торф, дерновую почву, перлит (измельченная горная порода вулканического происхождения) (1:1:1), торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют орхидные, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1). Приготовленным заранее почвенным суб стратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в те плицы с регулируемым температурным режимом (20–22 °С), освещенностью (не более 5 тыс. лк) и влажностью (65–90 %).

Через 20–30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения под кармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасиге и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным мине ральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизиро ванных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для ка ждого индивидуального вида растений.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений Условия культивирования Культивирование изолированных тканей растений на всех этапах про исходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты, где культивирование проводится в пробирках или других сосудах, должна со ставлять в зависимости от культуры 1000–10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.

Влажность в световой комнате должна быть 60–70 %. Более сухой воз дух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, осо бенно если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а значит, и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей – 25–26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29–30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 °С.

Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптималь ной влажности можно создать с помощью климатических камер.

Способы клонального микроразмножения Существует несколько способов клонального микроразмножения. Раз личные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, привело к созданию новых классификаций методов кло нального микроразмножения.

Исходя из предложенных в литературе путей микроразмножения рас тений, этот процесс можно осуществлять следующими четырьмя методами:

• активацией развития уже существующих в растении меристем (обра зовательная ткань растений, долго сохраняющая способность к делению и возникновению новых клеток, отличается высокой метаболической активно стью) (см. работы 4.1. и 4.3);

• индукцией возникновения адвентивных почек (развитие почек из не обычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источни ков, а не из зигот) непосредственно на тканях экспланта (см. работу 4.2);

• индукцией соматического эмбриогенеза (образование эмбриоидов – зародышеподобных структур, возникающих путем соматического эмбриоге неза в культурах клеток и тканей, напоминающего нормальный зиготический эмбриогенез);

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений • дифференциацией адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (неорганизованная, пролиферирующая масса дедифферен цированных растительных клеток).

Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем послед ний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, поскольку посадочный материал, полученный таким методом, может быть генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Основное отличие образова ния зародышей in vitro (в стекле) от in vivo (в естественных условиях) заклю чается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне заро дышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных ме ристем (недифференцированная ткань, локализованная в пределах верхушки побега или кончика корня, представляющая собой куполоподобную структу ру) стебля и корня.

Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа.

На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной ки слоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональные клетки. Для формирования эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать из состава питательной среды. Как правило, соматический эм бриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой пи тательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией.

Этот метод микроразмножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения (требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации проби рочных растений), потому что соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствую щей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать ис кусственные семена.

Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПО ГОРМОНАЛЬНОМУ И МИНЕРАЛЬНОМУ СОСТАВУ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ Цель работы: освоение приемов проведения 1-го этапа микроразмно жения в культуре изолированных тканей. Определение условий, необходи мых для проведения следующих этапов микроразмножения (формирования проростков или каллуса в культуре изолированных зародышей).

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ Культура изолированных зародышей используется в экспериментах для доращивания зародышей, обреченных на гибель в естественных услови ях: при проращивании недозрелых семян, для снятия периода их покоя, в ис следованиях по отдаленной гибридизации;

для проращивания гаплоидных (имеющих один набор хромосом) зародышей культурного ячменя и т. п.

Во многих комбинациях межвидовых и межродовых скрещиваний гибрид ные зародыши гибнут на ранних стадиях развития, поэтому их необходимо своевременно вычленять из семян и проращивать на искусственной пита тельной среде для сохранения ценных генотипов.

Зародыши эффективнее проращивать на агаризованной, а не на жидкой среде. В качестве питательных сред для зародышей используют среды MS, B5, N6 (табл. 4.1) и другие. Наиболее подходящий энергетический источник – сахароза. Для зародышей злаков и их гибридов берут концентрацию сахаро зы не менее 30 г/л. В зависимости от степени дифференцированности заро дышей используют фитогормональные и другие добавки, в качестве которых применяют цитокинины, ауксины, витамины и аминокислоты.

Материалы и оборудование:

зрелые колосья или зерна ячменя или пшеницы, замоченные в воде за 1 стуки до выполнения работы;

пробирки со стерильной питательной средой, приготовленные в ре зультате выполнения предыдущей работы 1.2;

стерильные пинцеты, скальпели;

чашки Петри;

стаканы со стерильной водой.

Ход работы:

1. Зерновки ячменя или пшеницы в обычных условиях предварительно стерилизуют спиртом в течение 2–3 мин, с зародыша снимают защитную пленку, покрывающую зерно. Необходимое для эксперимента количество зерновок одного образца помещают в марлевые упаковки, куда кладут не большие листки (1 см2) с указанием генотипа донорного растения, и скреп ляют их шпагатом.

2. В условиях бокса стерилизуют упаковки в растворе диацида (токси ческое вещество) 10 мин, потом трехкратно промывают в стаканах со сте рильной водой и переносят в чашки Петри.

3. Пинцетом и скальпелем раскрывают упаковку и раскладывают зер новки на марлю, перевернув их бороздкой вниз и, придерживая пинцетом, скальпелем рассекают (если она не удалена) оболочку и выделяют зародыш, стараясь его не повредить.

4. Зародыш переносят в пробирку с питательной средой, располагая его щитком вниз.

5. Используют три варианта среды:

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ – MS;

– MS + 2,4-Д (1 мг/л) и ИУК (2 мг/л );

– B5 или N6;

6. Культуральные пробирки закрывают фольгой. На каждой пробирке отмечают дату введения и шифр вводимого в культуру генотипа. Культиви рование осуществляют при 22–25 оС, 16-часовом световом дне и освещенно сти 1000 лк.

7. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована записью в журнале после введения экспланта донорного растения в культуру, а затем при проведении наблюдений и пассажах (перенос или пересадка клеток из одной культуральной емкости в другую) на свежие питательные среды долж ны быть отражены все изменения.

8. Оформить табл. 4.2 и заполнить эту таблицу после окончания мани пуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы). Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам.

9. В табл. 4.2. после учета характеристик (заражение, нарастание кал лусной ткани или появление органогенеза (процесс дифференциации в кал лусных клетках, сопровождающийся образованием органов: корней, побегов, de novo), в процессе последующего их наблюдения внести изменения в ос тальные две графы.

Таблица 4. Наблюдение параметров роста культур изолированных тканей растений Кол-во введенных эксплантов, шт.

Вид экспланта, культуры, генотип Наличие заражения Изменения Результат Номер пробирки Вариант среды вариант 7 14 21 28 7 14 21 дата дн. дн дн. дн дн. дн. дн. дн.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ Обработка полученных результатов Разноплановость и разнообразие растительного материала, вводимого в культуру, наличие нескольких этапов культивирования и длительность на блюдений диктуют необходимость строго учета параметров культивируемых объектов. Поскольку каждый эксплант вводится в отдельную пробирку (со суд), то эта проба (пробирка) должна быть маркирована после введения экс планта в культуру, а его параметры зафиксированы в учетной записи. Затем при проведении наблюдений и при пассажах должны быть отражены все из менения объектов, произошедшие в период культивирования. Длительность наблюдений каждой пробы до следующей пересадки составляет не более че тырех недель.

При проведении экспериментальных работ по введению тканей расте ний в культуру и следующих этапов необходимо для каждого задания офор мить табл. 4.2 и заполнить эту таблицу после окончания манипуляций в ла минар-боксе (первые 4 графы) и после учета характеристик в процессе по следующего их наблюдения (остальные две графы). В графе «результат» ука зываются дата и вариант окончания данного этапа культивирования (сле дующий пассаж или удаление в связи с заражением, высадка в грунт и т. п.).

Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам.

Вопросы 1. Что показывает анализ полученных результатов?

2. Какие можно сделать выводы по влиянию гормонального состава среды на процессы регенерации в культуре зрелых зародышей?

3. Какие условия лучше использовать для проведения дальнейшего микроразмножения?

Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА Т К АНЯХ Э К СПЛ АНТ А Цель работы: дать представление о возможностях второго способа микроразмножения растений и роли фитогормонов в этом процессе. Полу чить растения-регенеранты путем прямого органогенеза у бегонии и сенпо лии – комнатной фиалки.

Метод микроклонального размножения основан на способности изоли рованных частей растения восстанавливать недостающие органы при благо приятных условиях питательной среды и таким образом регенерировать це лые растения. Практически каждая клетка может стать источником целого растения, и это можно наблюдать в культуре изолированных тканей.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых ор ганов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядо лей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10: или 100:1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или -нафтилуксусную кислоту (НУК).

Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений. Им были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичной чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев;

представите ли рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокко ли) – из сегментов гипокотиля (участок стебля проростка семенного растения ниже семядольного узла), котиледона (первый лист зародыша растения в се мени), листьев;

лук, чеснок – из ткани донца луковиц;

салат цикорный – из сегментов листовых пластинок;

петуния – из сегментов корней;

глоксиния, сенполия, стрепто-карпус, эшинапсус – из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений – из изолированных зрелых и незрелых зародышей.

Материалы и оборудование:

листья бегонии и сенполии;

гипохлорит натрия 5%;

пробирки со стерильной питательной средой – MS;

– MS с добавлением:

а) 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л;

б) 6-БАП – 2 мг/л и НУК – 0,05 мг/л:

– MS + витамины по прописи Нича (табл. 4.1) + 6-БАП – 0,4 мг/л + НУК;

– 0,1 мг/л;

стерильные пинцеты, скальпели, чашки Петри;

стаканы со стерильной водой.

Ход работы:

1. Срезают молодые, полностью развернувшиеся листья с черешками с растения, выращенного в комнатных условиях.

2. Листья дезинфицируют с помощью раствора гипохлорита натрия 5,25 % в течение 10 мин.

3. Трижды ополаскивают стерильной водой и переносят в стерильные чашки Петри.

4. Листья разрезают на фрагменты площадью 5 мм2 и пинцетом поме щают их в пробирки проксимальной (расположенной ближе к центру тела Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА или к его медианной плоскости) стороной вниз на поверхность агаризован ной среды.

5. Листья бегонии высаживают на среду MS и MS, содержащую добав ки витаминов по прописи Нича, и фитогормоны – 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л.

6. Листья сенполии на среду MS с добавлением:

а) 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л;

б) 6-БАП – 2 мг/л и НУК – 0,05 мг/л.

Культивирование осуществляют при 22–25 оС, 16-часовом световом дне и освещенности 1000 лк.

Придаточные побеги образуются без формирования каллуса прямо из экспланта примерно через 4 недели. По окончании 4–6 недель делят каждую культуру, где образовались добавочные побеги, и ее фрагменты (отдельные побеги) переносят на среду того же состава. Эту процедуру повторяют до по лучения необходимого числа побегов.

Укореняют побеги, пересаживая их каждый по отдельности на агаризо ванную среду MS, содержащую НУК – 0,1 мг/л. Укоренившиеся побеги пере саживают в почву.

Обработка полученных результатов:

1. Оформить табл. 4.2 (работа 4.1) и заполнить ее после окончания ма нипуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы). Количество строк должно со ответствовать введенным в культуру эксплантам. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована после введения экспланта (отметить его размер) в культуру.

2. По прошествии 1–2…4 недель в таблицу вносят данные об измене ниях, произошедших в пробирках (заражение, изменение цвета и размеров экспланта, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза), запол няя остальные две графы.

Вопросы 1. Каково влияние гормонального состава среды на процессы индукции возникновения адвентивных почек и развития из них побегов бегонии и сен полии? Проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

2. Какие условия лучше использовать для проведения микроразмноже ния декоративных культур?

3. Зачем нужны изменения гормонального состава среды при пересадке культур?

4. Каков возможный коэффициент микроразмножения комнатных рас тений? Рассчитайте его.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ Цель работы: ознакомить с основным способом клонального микро размножения растений и путями его использования. Провести выделение апикальных почечных меристем (недифференцированная ткань, локализо ванная в пределах верхушечной почки, представляющаяся обычно в виде блестящей куполоподобной структуры – дистальной к самому молодому лис товому примордию и размером, менее чем 0,1 мм в длину при вырезании) картофеля и осуществить введение их в культуру (задание 1). Дать представ ление о следующих этапах микроразмножения на примере микрочеренкова ния пробирочных растений картофеля (задание 2) и дальнейшей их адапта ции к грунту (задание 3).

Активация развития уже существующих в растении меристем – это ос новной метод клонального микроразмножения растений. Главное направле ние его использования – получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала, путем введения в культуру меристемных тканей апексов (верхушка побега и корня, состоящая из первичной меристемы, обеспечивающей формирование всех частей и первичных тканей побега) и пазушных почек органов стеблевого происхождения.

Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематиче ских тканях растений впервые высказано Чуигом в 1938 и Уайтом в 1943 гг.

Начиная с 1950-х гг. были предприняты первые успешные опыты по получе нию свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстрорастущих молодых органов, особенно в моло дых недифференцированных тканях, где концентра ция вируса может снижаться вплоть до полного от сутствия. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время.

Строение точки роста растений имеет свою специфику: дистальная ее часть, представленная апи кальной меристемой, которая состоит из конуса на растания, а также одного или двух листовых зачатков Рис. 4.1. Схема (примордий – первый, первичный зачаточный лист) мест формирования (рис. 4.1). У разных растений средний диаметр растительных мери до 200 мкм, высота от 20 до 150 мкм. В более низких стем на побеге: 1 – верхушечные, 2 – бо- слоях дифференцирующиеся клетки меристемы обра ковые, 3 – промежу- зуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

точные Известно, что успех клонального микрораз Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ множения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, за канчивающийся получением целого нормального пробирочного растения. С другой стороны, чем больше размер выделяемого экспланта, тем больше ве роятность присутствия в нем вируса. Вместе с тем зона, свободная от виру сов, различна для вирусов и зависит также от вида и сорта растения. В коле оптиле (влагалищный, первый лист злаков, в отличие от настоящих, не имеет листовой пластинки и представляет собой замкнутую трубку, в которую за ключены листовые зачатки и конус нарастания) злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм.

Наиболее часто в нашей стране метод оздоровления посадочного материала в культуре изолированных тканей растений используется для кар тофеля.

Установлена неодинаковая эффективность при оздоровлении различ ных сортов картофеля от вирусов и даже штаммов одного вируса. Меристе мы большего размера свободны от вируса скручивания листьев картофеля, Y и A-вирусов, наименьшего – от M, X и S-вирусов. Оздоровить картофель от последних наиболее трудно.

В числе многочисленных болезней картофеля особое место занимают вирусные, вироидные и микоплазменные. Большинство из них способно пе редаваться через клубни, которые в случае заражения становятся резервато рами инфекции. Кроме того, эти болезни обладают способностью быстро распространяться. В результате сорт постепенно теряет свою первоначаль ную продуктивность и вырождается.

Продление жизни и длительное сохранение репродуктивных качеств сорта достигаются за счет хорошо налаженного семеноводства или поддер живающей селекции, суть которой сводится к сохранению репродуктивных качеств сорта в системе элитного семеноводства, а также ежегодном произ водстве элиты в необходимом объеме. Качество этой элиты обеспечивается проведением семеноводства на безвирусной основе с применением биотех нологических методов. Их регулярное применение обеспечивает повышение урожайности картофеля в 2 раза.

Задание 1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля Культура изолированных апикальных меристем используется для по лучения свободного от вирусов посадочного материала и для его микрокло нального размножения. Апикальная меристема обычно совершенно свободна от вирусов и представляет собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мк) и шириной 0,25 мм. Это минимальный размер меристемы, при котором морфогенетическая способность еще сохраняется. Поскольку меристему бывает трудно вычленить без повреждений, часто ее отделяют с двумя листовыми примордиями (апексы размером 100–250 мкм, рис. 4.1).

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ Для повышения эффективности оздоровления картофеля применяют сочета ние метода верхушечной меристемы с термо- или химиотерапией. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибиру ют их развитие. Выращенные из апикальных меристем безвирусные растения могут быть размножены и высажены в теплицы для получения безвирусных клубней. Для ускоренного размножения оздоровленного материала используются также клубни, образовавшиеся на безвирусных растениях в пробирках.

Материалы и оборудование:

клубни картофеля;

бинокулярная лупа;

скальпели (или лезвия), зажатые в держателе с удлиненной ручкой;

препаровальные иглы;

пенициллиновые флаконы со стерильной питательной средой MS, со держащей кинетин (0,5 мг/л) и активированный уголь и др.;

стаканы со стерильной дистиллированной водой;

чашки Петри, скальпели, пинцеты.

Ход работы:

Подготовка ростков клубней для вычленения меристем заключается в их проверке на исходную зараженность вирусами, поверхностном обеззара живании от грибных и бактериальных инфекций. Клубни картофеля хранят при температуре 4–6 °С, затем проращивают на свету до образования ростков 2–3 см длины при 20–22 °С.

1. Клубень картофеля промыть в проточной воде, отделить ростки.

2. Ростки упаковать в марлевые салфетки, опустить в раствор 0,1 % диацида на 3-5 мин., затем не менее трех раз промыть стерильной водой, опустить в стерильную чашку Петри, добавив туда воды для предотвращения высыхания эксплантов. Работы по вычленению проводят в ламинар-боксе.

3. Перед вычленением с помощью препаровальной иглы под биноку лярным микроскопом с верхушки ростка удалить покровные листочки, по следовательно обнажая боковые и верхушечные меристемы с примордиаль ными листочками.

4. Меристему (рис. 4.1), включающую кусочек ткани размером 100–250 мк без листовых зачатков (примордиев), вычленить иглой, зажатой в цанговый держатель. Для этого можно использовать и специальную заточен ную дисцизионную (разовую иглу от шприца) иглу или кусочек лезвия, зажа тый в цанговый держатель. Эту операцию лучше проводить под бинокуляр ным микроскопом с 24-кратным увеличением с масштабной сеткой. Вычле нить можно как верхушечную, так и боковые меристемы – точки роста. Каж дую операцию проводят отдельным простерилизованным инструментом.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ 5. После вычленения меристему на острие иглы перенести на поверх ность питательной среды в пробирку или пенициллиновый флакон и закрыть ее фольгой.

6. Штативы с пробирками или поднос с флаконами поместить в свето вую комнату.

7. Дальнейшее культивирование проводить в световой комнате на стел лажах.

Обработка полученных результатов:

1. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована после введе ния экспланта в культуру, а затем при проведении наблюдений и пассажах на свежие питательные среды должны быть отражены все изменения. Оформить табл. 4.2 и заполнить ее после окончания манипуляций в ламинар-боксе (пер вые 4 графы). Количество строк соответствует введенным в культуру экс плантам.

2. В табл. 4.2 после учета характеристик (заражение, нарастание кал лусной ткани или появление органогенеза) в процессе последующего их на блюдения внести изменения в остальные две графы.

а б в Рис. 4.2. Этапы развития апикальной меристемы картофеля на питательной среде, содержащей активированный уголь: а – меристема после ведения в культуру;

б – начало развития адвентивных почек;

в – формирование адвентивных побегов (фото Н.В. Зобовой) В течение периода регенерации (морфогенетический ответ на стимул, который приводит к образованию органов, зародышей или целых растений) разросшуюся ткань меристемы пересаживают на новую порцию той же сре ды для дальнейшего развития адвентивных почек. Образовавшиеся пророст ки пересаживают на новую по составу среду. Растения-регенеранты, содер жащие до пяти междоузлий, используют для черенкования (задание 2).

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ Вопросы 1. Зачем в питательную среду при культивировании картофеля добав ляется активированный уголь?

2. Какие выводы можно сделать, проанализировав полученные резуль таты культивирования меристем?

3. Какие условия лучше использовать для проведения дальнейшего микроразмножения картофеля?

Задание 2. Микроразмножение картофеля черенкованием побегов Клональное размножение оздоровленного картофеля решает вторую не менее важную задачу – получение оздоровленного исходного материала в количествах, достаточных для включения его в семеноводческую работу.

Одним из наиболее распространенных способов ускоренного размножения картофеля является черенкование в пробирочной культуре. Главное требова ние к питательной среде – обеспечение высокого коэффициента размноже ния, то есть максимального выхода растений из микрочеренков в минималь ные сроки.

Этому требованию в наибольшей степени отвечает среда с минераль ной основой по Мурасиге – Скуга с добавлением кинетина (0,04 мг/л), ИУК (1,0 мг/л) и феруловой кислоты (0,02 мг/л). Суть метода сводится к следую щему, растение извлекают пинцетом из пробирки и разрезают на микроче ренки, содержащие участок стебля 1,0–1,5 см с одним междоузлием (рис. 4.3, а). Черенки высаживаются на питательную среду (рис. 4.3, б). Раз множение основано на подавлении апикального доминирования (подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной поч ки) и активации путем удаления верхушечного побега пазушных меристем, из которых при помещении на питательную среду развивается побег (рис. 4.3, в).


Растения-регенеранты, полученные в культуре тканей, должны быть подвергнуты анализу на наличие вирусной инфекции. Контроль растений регенерантов проводят с помощью нескольких методов.

Электронно-микроскопический анализ основан на визуальном выявле нии вирусов. Для приготовления препаратов при первом и последующих че ренкованиях из нижней части растения отбирают один черенок с хорошо раз витым листом. Чтобы получить достоверные результаты, необходимо при последовательных черенкованиях провести трехкратную диагностику по 2–4 препарата каждый раз.

Биологический метод основан на определении инфекционных свойств вирусов с помощью растений-индикаторов, реагирующих определенными симптомами на тот или иной вирус.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ а б в Рис. 4.3. Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием: а – микропобег – объект черенкования (линиями отмечены места разрезов при черенковании);

б – микрочеренок на питательной среде;

в – развитие растения картофеля из черенка (фото Н.В. Зобовой) Хорошие результаты дает использование для контроля зараженности растений наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на использовании антител, меченых ферментом. За рубежом этот метод известен как ЭЛИЗА-тест. В качестве фермента обычно исполь зуют щелочную фосфатазу с субстратом – n-нитрофенилфосфатом, а также пероксидазу хрена с 5-аминосалициловой кислотой или ортофенилдиамином в качестве субстратов.

Материалы и оборудование:

пробирочные растения картофеля (сформированные в результате вы полнения задания 1);

пробирки с модифицированной питательной стерильной средой MS с добавлением кинетина – 0,04 мг/л, ИУК – 1,0 мг/л;

стерильные скальпели и чашки Петри.

Ход работы:

1. Выросшие в пробирках растения картофеля с 5–6 листочками пере нести из световой комнаты в бокс.

2. Пробирочное растение картофеля вынуть пинцетом из пробирки и поместить его в чашку Петри, разрезать на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой), часть стебля над листом при этом должна быть в 2–3 раза Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ меньше, чем часть ниже листа. Необходимо соблюдать строгую стериль ность.

3. Черенки перенести на свежую питательную среду в пробирки, заглу бив нижнюю часть стебля в среду.

4. Закрыть пробирки фольгой, поставить в штатив и перенести в свето вую комнату.

Черенкование проводят с интервалом 14–21 день.

Вопросы 1. Сколько черенков можно получить из клубней одного растения кар тофеля за три месяца?

2. С помощью каких процедур увеличивается эффективность оздоров ления растений в культуре апикальных меристем?

3. Какие способы микроразмножения растений используются при по лучении безвирусного посадочного материала картофеля?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ Работы не предусмотрены.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Цель: знакомство с основными подходами получения целевых продук тов биотехнологии, их анализа современными методами жидко-жидкостной хроматрграфии и хромато-масс-спектрометрии.

Задачи:

– общая характеристика выделения и очистки целевых продуктов био технологии и освоение метода экстракции на примере биоразрушаемых по лимеров;

– освоение метода гель-проникающей жидко-жидкостной хроматогра фии на основе высокоэффективной хроматографической системы Breeze фирмы Waters (США);

– освоение метода хромато-масс-спектрометрии на примере анализа жирных кислот бактерий с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 5975Inert (Agilent, США).

Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших про мышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехноло гического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на два большие группы: производство биомассы и получение продуктов ме таболизма.

Стадия получения конечного целевого продукта в биотехнологии су щественно различается в зависимости от природы продукта и его локализа ции. Если продукт находится в культуральной жидкости, то он, как правило, образует очень разбавленные растворы и суспензии, содержащие, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разде лять смеси веществ очень близкой природы, поэтому необходимо использо вать методы, позволяющие провести разделение, например, тот или иной вид хроматографии. Если целевой продукт локализуется в клетке, то нужно ис пользовать более сложный подход к его извлечению из клетки.

Заключительная стадия биотехнологического производства – приго товление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продук тов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представля ют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности пре паратов промышленной биотехнологии.

Независимо от локализации целевого продукта на первом этапе его очистки проводят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию.

Иногда сепарации предшествует специальная обработка – изменение рН, на гревание, добавление коагулянтов белков или флокуллянтов для более эф Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ фективного отделения биомассы и стабилизации продукта. Существует не сколько способов сепарации.

Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток про дуцента (например, интерферонов, гормонов), вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы);

обычно для этого применя ются механические, химические или комбинированные методы.

К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразву ком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание заморо женной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замора живание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким сниже нием давления). Физические способы разрушения клеток более экономич ные, чем химические и химико-ферментативные. В то же время этим спосо бам дезинтеграции клеток присуща неизбирательность: обработка может влиять на качество получаемого продукта.

Химические и химико-ферментативные методы более избирательны.

Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты или других детергентов, клетки дрожжей – зимолиазой улитки или ферментами грибов, актиномице тов. Можно использовать автолиз клеток при лимитировании по определен ному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагом.

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок.

Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. Од нако применяют более высокоскоростное центрифугирование или фильтры с меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехно логических процессах клеточные стенки отбрасывают как балласт, но воз можно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целе вого продукта.

Для идентификации структуры и степени чистоты биотехнологическо го продукта применяют различные методы, среди которых наиболее значи мыми сегодня являются хроматография и масс-спектрометрия.

Хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия оказались столь значимы для всех естественных наук, что Фе дерация европейских химических обществ приводит имя Цвета наряду с че тырьмя другими русскими именами (Ломоносов, Менделеев, Бутлеров и Се менов) в числе ста выдающихся химиков прошлого.

В настоящее время хроматография представляет собой:

самый распространенный и совершенный метод разделения смесей ато мов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц;

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей;

самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения;

препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде;

мощную отрасль научного приборостроения.

Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматогра фией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографиче ских капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены бо лее 1000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти;


двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биоло гических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электро фореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе "Геном человека".

Диапазон применения хроматографических методов огромен: от анали за атмосферы планет Солнечной системы до полного анализа содержимого одной живой клетки. Исключительную роль хроматография играет в химиче ской, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно-бумажной и многих других отраслях промышленности, прежде всего в технологическом контро ле и поддержании оптимального режима производства, в контроле исходного сырья и качества готовой продукции, анализе газовых и водных сбросов про изводства.

В биотехнологии хроматография является основным процессом выде ления вирусов гриппа, энцефалита, бешенства и ящура, очистки вакцин, про мышленного производства инсулина, других белков и полипептидов. На промышленную основу поставлено хроматографическое выделение фуллере нов, сапонинов, интерлейкина-2 человека, гистонов, плазмид, ДНК, антибио тиков и многих других ценнейших природных и синтезируемых веществ.

Масс-спектрометрия – это физико-химический метод измерения отно шения массы ионов к их заряду. Приборы, которые используются в этом ме тоде, называются масс-спектрометрами или масс-спектрометрическими де текторами, которые имеют дело с материальным веществом, состоящим, как известно, из мельчайших частиц – молекул и атомов. Масс-спектрометры ус танавливают молекулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный со став, а также пространственную структуру расположения атомов.

Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, а также в биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать превращения вещества в процессе химической реакции, что важно для уста Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ новления ее механизмов. Существенное отличие масс-спектрометрии от дру гих аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптиче ские, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами (например, такие методы как ИК-, УФ-, КР- и ЯМР), а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества и, в отличие от вышеуказанных методов, является деструктивным методом анализа, то есть из образующихся при разрушении молекулы ионов исходная молекула регенерироваться не может. Метод масс-спектрометрии основан на ионизации молекул, разделении ионов в газовой фазе, которое происходит в зависимости от соотношения их массы и заряда, и регистрации разделенных ионов.

В данном разделе лабораторных работ будут использованы новейшие приборы Центра коллективного пользования СФУ, а также оборудование, расположенное на кафедрах и лабораториях Института фундаментальной биологии и биотехнологии.

Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Завершающая стадия биотехнологического процесса – выделение целе вого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от лока лизации продукта и его химической природы. Если продукт находится в культуральной жидкости, то он, как правило, образует очень разбавленные растворы и суспензии, содержащие, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близ кой природы, поэтому необходимо использовать методы, позволяющие про вести разделение, например, тот или иной вид хроматографии. Если целевой продукт локализуется в клетке, то необходимо использовать более сложный подход к его извлечению из клетки.

Независимо от локализации целевого продукта, на первом этапе его очистки проводят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию.

Существует несколько способов сепарации.

1. Флотация – разделение мелких частиц и выделение капель дисперс ной фазы из эмульсий. Этот метод основан на различной смачиваемости час тиц жидкостью и на их избирательном прилипании к поверхности раздела.

Основные виды флотации – пенная, масляная и пленочная. Наибольшее рас пространение в биотехнологии получила пенная флотация, которая заключа ется в следующем: культуральную жидкость с биомассой микроорганизмов непрерывно вспенивают воздухом, подаваемым снизу вверх под давлением.

Клетки и их агломераты «прилипают» к пузырькам тонкодиспергированного воздуха и всплывают вместе с ними, собираясь в специальном отстойнике.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Этот метод идеален для дрожжей, которые имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы фло тацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах.

2. Фильтрация. В этом методе используется принцип задержки биомас сы на пористой фильтрующей перегородке. В настоящее время используются разные фильтры: барабанные, дисковые, ленточные, тарелочные, карусель ные вакуум-фильтры, фильтры-прессы различной конструкции, мембранные фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток, однако при этом эффективность фильтрации практически не снижается, так как по мере про хождения жидкости диаметр капиллярных каналов сужается из-за прилипа ния частиц к стенкам. По мере утолщения слоя биомассы на фильтре ско рость протока жидкости падает. Для фильтров непрерывного действия, рас считанных на длительное действие, предусматривают системы автоматиче ского удаления слоя биомассы, забивающего поры. Биомассу сдувают с по верхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. Та кой способ удаления биомассы характерен для барабанного вакуум-фильтра.

Существуют также фильтры, предназначенные для однократного или многократного периодического использования. Среди них выделяют мем бранные фильтры, через которые возможно проводить фильтрацию очень разбавленных растворов. Однако проблемой использования таких фильтров является их закупорка клетками, белками, коллоидными частицами. Приемы сдувания или срезания для этих фильтров не приемлемы, так как они быстро разрушаются. Один из путей преодоления этих проблем – покрытие мембран гидрофильным слоем. В настоящее время создана целая отрасль по произ водству мембранных фильтров и существуют огромное количество фирм, ко торые поставляют фильтры для всех задач биотехнологии.

3. Центрифугирование. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется две фракции:

биомасса (твердая) и культуральная жидкость. Центрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем вышеперечисленные методы сепа рации. Поэтому оно оправдывает себя, если, во-первых, суспензия фильтру ется медленно, во-вторых, необходимо максимально освободить культураль ную жидкость от частиц, в-третьих, нужно наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодический режим. Центрифугирование и фильтрация могут проходить одновременно, этот процесс реализован в фильтрационных центрифугах. Наиболее перспек тивны для осаждения центрифуги-сепараторы, в которых биомасса осаждает ся на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельча той вставки.

Следующим этапом получение целевого продукта является разрушение клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химиче ским и химико-ферментативным методами. К физическим методам дезинте грации относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпрессия (сжа тие с последующим резким снижением давления). Физические способы раз рушения клеток более экономичные, чем химические и химико ферментативные. В то же время этим способам дезинтеграции клеток прису ща неизбирательность: обработка может влиять на качество получаемого продукта. Химические и химико-ферментативные методы более избиратель ны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами.

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок.

Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. Од нако применяют более высокоскоростное центрифугирование или фильтры с меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехно логических процессов клеточные стенки отбрасывают как балласт, но воз можно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целе вого продукта.

Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомоге ната разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или ад сорбции. В данной работе для выделения целевого продукта будет использо ван метод экстракции органическим растворителем.

Экстракция – это процесс избирательного извлечения одного или не скольких растворимых компонентов из твердых тел или растворов с помо щью жидкого растворителя – экстрагента. Различают твердо-жидкостную и жидко-жидкостную типы экстракции. При твердо-жидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую;

при жидко-жидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Жидко-жидкостную экстракцию органическими раство рителями часто применяют для извлечения из культуральной среды антибио тиков, витаминов, каротиноидов, липидов. Витамин В12 экстрагируют фено лом, высокоспецифичным экстрагентом является бензиловый спирт. Такие фосфолипиды, как фосфатидилэтанол и фосфатидилхолин, извлекаются хло роформом.

Эффективность экстракции может быть повышена за счет повторной экстракцией свежим экстрагентом, выбором оптимального растворителя, на греванием экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкости, пониже нием давления в аппарате для экстракции. Во многих случаях процесс нагре вания может быть губительным для целевого продукта. Для предотвращения этого используется криоэкстракция, которая осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находящимися при комнатной темпе ратуре в газообразном состоянии. Для экстракции неполярных соединений используют жидкий пропан или бутан. При последующем осторожном на гревании до 0 °С растворитель улетучивается и остается продукт в чистом виде.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Экстракция хлороформом используется при выделении из бактериаль ной биомассы полигидроксиалканоатов (ПГА), представляющих собой поли эфиры 3-гидроксиалкановых кислот с разной длиной цепи.

Основные структуры ПГА представлены следующим образом:

n = 1 R = водород – поли (3-гидроксипропионат), R = метил – поли (3-гидроксибутират), R = этил – поли (3-гидроксивалерат), R = пропил – поли (3-гидроксигексаноат), R = пентил – поли (3-гидроксиоктаноат), R = нонил – поли (3-гидроксидодеканоат), n = 2 R = водород – поли (4-гидроксибутират), n = 3 R = водород – поли (5-гидроксивалерат).

Полимер хорошо растворяется в хлорсодержащих органических рас творителях, таких как хлороформ, трихлорметан, трихлорэтан, но не раство ряется в спиртах, ацетоне, гексане, воде. Эти свойства полимера используют ся при его отделении от липидов после извлечения из бактериальных клеток.

Существует несколько подходов для извлечения ПГА из клеток. Сы рую биомассу, собранную центрифугированием, заливают 20 объемами хло роформа и оставляют на 15–20 часов в ёмкости при комнатной температуре при периодическом перемешивании. Далее разделяют биомассу и хлороформ с полимером в делительной воронке, нижний слой хлороформа собирают, а остаток биомассы еще трижды экстрагируют хлороформом для усиления полноты экстракции. Объединенные хлороформные экстракты полимера и липидов концентрируют, добавляют двойной объем спирта или гексана. Вы павший в осадок полимер отделяют от смеси растворителей. Второй подход, используемый в лабораторных условиях, заключается в следующем: предва рительно лиофилизированная биомасса закладывается в патрон аппарата Со кслет, и полимер экстрагируется хлороформом в течение нескольких часов.

Третий подход выделения полимера заключается в удалении из биомассы неполимерных компонентов и получении гранул полимера. Для этого обычно обрабатывают биомассу детергентами, такими как додецилсульфат натрия, ЭДТА или лизирующими ферментами. Такое извлечение особенно эффек тивно для выделения полимера из клеток с высоким его содержанием. Одна ко чаще всего гранулы полимера, выделенные после химической или фер ментативной обработки биомассы, загрязнены остатками бактериальных кле ток и требуется дополнительная экстракция полимера и его осаждение.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Наиболее перспективными для биотехнологического производства биоразрушаемых полимеров ПГА являются водородокисляющие бактерии, группа грамотрицательных аэробных бактерий, способных накапливать по лимер более 90 % на сухое вещество.

Водородные бактерии широко распространены в природе. Они харак теризуются способностью к росту как на минеральном субстрате за счет энергодающей реакции окисления водорода и использования углекислоты в качестве конструктивного субстрата, так и на различных органических со единениях. Специфика хемолитотрофии на водороде заключается в функ ционировании в клетках водородактивирующей системы. Активацию водо рода и передачу электронов в ЦПЭ производит гидрогеназный ферментный комплекс по реакции: Н2 2Н+ + 2e. Продукты катаболизма – АТФ и вос становительные эквиваленты в виде НАДН потребляются главным образом при ассимиляции углекислоты в восстановительном пентозофосфатном цик ле и на путях синтеза аминокислот. Среди ранних продуктов фиксации угле кислоты – фосфоглицериновая кислота и первично синтезируемые амино кислоты (глутаминовая, аспарагиновая, аланин), служащие субстратом для синтеза всех остальных аминокислот. В качестве запасных соединений бак терии накапливают полимеры гидроксипроизводных жирных кислот и поли фосфаты. Рост и направленность биохимической программы синтеза клеточ ных макромолекул у водородных бактерий определяются условиями внеш ней среды, а также концентрацией биогенных элементов, рН и температуры среды.

Цель работы: знакомство с основными методами получения целевого продукта биотехнологии – биоразрушаемого полигидроксиалканоата.

Материалы и оборудование:

суспензия бактерий Ralstonia eutropha B-5786, выращенных в условиях лимита по азоту;

высокоскоростная центрифуга Avanti J-26XPI (Beckman Int., США);

аналитические весы;

диспергатор IKA (Германия);

делительная воронка объемом 1–2 л;

роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Германия);

водяная баня;

обратный холодильник;

хлороформ;

спирт этиловый;

гексан;

серная кислота;

безводный сернокислый натрий;

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА воронки;

колбы со шлифом;

бюксы;

водоструйный насос;

высокоскоростная центрифуга Avanti J-26XPI (Beckman Int., США);

роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Швейцария).

Характеристика оборудования Для осаждения биомассы бактерий используется высокоскоростная центрифуга (рис. 6.1), позволяющая центрифугировать большие объемы (до 6 л) бактериальной суспензии при 6000 об/мин в условиях пониженной температуры.

Рис. 6.1. Высокоскоростная напольная центрифуга с охлаждением Avanti J-26XPI Beckman Coulter Int.S.A., США Технические характеристики центрифуги Размеры: 865х876х711 мм.

Максимальная скорость вращения 26 000 об/мин.

Максимальное ускорение 82 000 g.

Максимальная вместимость ротора – 6 л.

Контроль скорости: ±10 об/мин.

Объем центрифужных пробирок от 1,5 до 1000 мл.

Система охлаждения камеры: экологически безопасный хладоагент.

Устанавливаемый температурный режим камеры: от –10 0С до 40 0С.

Контроль температуры камеры ±2 0С.

Контроль дисбаланса ±2,5 % при загрузке в противоположные позиции.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Тип двигателя: вентильно-индукторный.

Программы, устанавливаемые пользователем: 30 программ (двухэтап ные).

Установка времени: до 180 мин.

Динамическое определение ротора: автоматическое.

Набор роторов.

Ротор на 8 стаканов – 8 x 50 мл, 26000 об/мин, 81770 g.

Ротор на 6 пробирок: 6х1000мл, 8000 об/мин, 15910 g.

Для отгонки растворителей после экстракции полимера используется роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Швейцария) высокой произ водительности (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Швейцария) Технические характеристики Роторный испаритель позволяет проводить операции по упариванию растворов термолабильных веществ в органических и водных растворителях в условиях, предотвращающих их разложение, в том числе в вакууме с воз можностью автоматической регулировки уровня вакуума, подачи инертных газов в систему, улавливания растворителей и работы без использования ло Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА вушек жидкого азота, а также проведение сопутствующих операций, включая сушку твердых веществ, перекристаллизации и т. п.

1. Возможность использования отгонных колб объемами от 50 мл до 4 л с массой колбы с растворителем до 3 кг ( в случае опытных нарабо ток).

2. Возможность запитки отгонной колбы без остановки операции от гонки (в случае опытных наработок).

3. Наличие электромеханического подъемника отгонной колбы.

4. Скорость вращения отгонной колбы, регулируемая в пределах от 0 до 280 об/мин.

5. Нагревательная баня с цифровым дисплеем индикации заданной и реальной температуры с регуляцией температуры в пределах от комнатной до 180 0С.

6. Вакуумное уплотнение, устойчивое к органическим растворителям и агрессивным средам.

7. Наличие инертного к агрессивным средам и растворителям безмас ляного вакуумного насоса, обеспечивающего производительность до 30 л/мин и вакуум до 7 мм рт. ст., обеспечивающего легкую очистку кла панов, оснащенного ловушкой между роторным испарителем и насосом и ло вушкой для остаточных количеств растворителей, устанавливаемой за насо сом.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.