авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 ||

«УДК 60(075) ББК 30.16я73 С56 Авторы: Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, ...»

-- [ Страница 3 ] --

8. Наличие вакуумного контроллера, обеспечивающего задание вакуу ма в мм рт. ст. или миллибарах, автоматическое поддерживание заданного вакуума в вакуумируемой системе, индикацию заданного и реального вакуума.

9. Оборудование рассчитано на напряжение в сети 220 В, частоту 50 Гц.

Ход работы:

1. Суспензию бактериальных клеток поместить в центрифужные стака ны и уравновесить на весах. Далее уравновешенные стаканы поместить в ро тор центрифуги Avanti J-26XPI. Центрифугирование проводить в течение 20 мин при 7000 об/мин.

2. После остановки центрифуги вынуть стаканы, слить супернатант, из твердого остатка биомассы, осевшей на дно стакана, взять навеску 1 г на ана литических весах и перенести в стакан дезинтегратора.

3. Для определения содержания сухого вещества в биомассе в предва рительно взвешенный бюкс (А г) поместить 200–250 мг сырой биомассы, взвесить бюкс с сырой навеской (Б г), поставить в сушильный шкаф и сушить в течение 24 ч при температуре 105 °С.

4. После высушивания бюкс вынуть из шкафа и охладить в эксикаторе.

Охлажденный бюкс взвесить и записать навеску (В г). Затем снова поставить бюкс с высушенной биомассой в сушильный шкаф и сушить пробу в течение 0,5 ч. Процедуру охлаждения бюкса повторить и снова взвесить. Если вес Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА бюкса не изменился, то проба высохла до абсолютно сухого веса и можно рассчитать сухой вес биомассы по формуле Сухой вес = (ВА)х100/(БА) (%).

5. К сырой биомассе в стакане дезинтегратора добавить 10 мл смеси хлороформа и спирта (2:1 по объему) и обработать биомассу на дезинтегра торе IKA в течение 30 с для разрушения бактериальных клеток.

6. Затем количественно перенести разрушенную биомассу в колбу с притертой пробкой и добавить еще 10 мл смеси спирт-хлороформ, колбу за крыть и оставить на 3 ч для экстракции из биомассы полигидроксиалканоата и липидов при периодическом помешивании.

7. Отделить фильтрованием на стеклянном фильтре под вакуумом во доструйного насоса растворитель и остатки биомассы. Промыть 3 порциями хлороформа по 5 мл осадок на фильтре для полноты извлечения полимера.

Хлороформ объединить с растворителем.

8. Смесь растворителей пропустить через безводный сернокислый на трий. Для этого используется обычная воронка с ватой, на которую наносит ся слой соли.

9. Обезвоженный экстракт поместить во взвешенную коническую кол бу (А г), отогнать растворитель на роторном испарителе Rotovapor R210/V, поместить колбу с экстрагированными липидами и полимером в эксикатор на 2 ч, а затем взвесить (Б г).

10. Для отделения полимера от липидов в колбу с экстрактом налить 5 мл хлороформа. После полного растворения экстракта добавить 2 объема гексана (10 мл). В этих условиях происходит осаждение полимера в виде хлопьев, а липиды остаются растворенными в хлороформе.

11. Отделить полимер от растворителя на стеклянном фильтре, про мыть тремя (по 5 мл) порциями гексана полимер, осевший на фильтр, коли чественно собрать с фильтра полимер во взвешенный бюкс (В г), сушить в течение 2 ч в сушильном шкафу при 60 °С.

12. Перенести бюкс с полимером в эксикатор. После остывания взве сить бюкс с полимером и рассчитать содержание выделенного полимера из биомассы.

13. Для расчета содержания полимера в сухой биомассе будем учиты вать сухой вес сырой биомассы. Если сухой вес составляет 50 %, то для экс тракции полимера было взято 500 мг сухой биомассы. Далее по разности бюкса с полимером и пустого (Г-Б) находим количество выделенного поли мера. Если за 100 % принять вес сухой биомассы, то содержание полимера будет составлять (Г-Б)х100/500 (%). Таким образом определяется содержание полимера весовым методом. Выделенный полимер сохраняется для следую щих лабораторных работ.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА 14. Растворитель с липидами собрать в отдельную колбу, отогнать на роторном испарителе, липидный экстракт сохранить для следующих лабора торных работ в морозильной камере холодильника.

15. Для проверки полноты экстракции необходимо определить содер жание полимера в сухой биомассе хроматографическим методом. Для этого взвешиваем на аналитических весах 4 мг сухой биомассы, переносим навеску в колбу со шлифом, добавляем 1 мл метанола, 0,75 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл хлороформа с внутренним стандартом. В качестве внутреннего стандарта используется бензойная кислота (0,5 мг/мл). Прикре пляем колбу к обратному холодильнику, помещаем в водяную баню и прово дим метанолиз в течение 2,5 ч при температуре 90 °С. После того как колба с реакционной смесью остынет, ее снимаем и добавляем 2 мл дистиллирован ной воды. После расслоения фаз (нижняя хлороформная фаза содержит ме тиловые эфиры мономеров полимера и бензойной кислоты) записываем про бу на газовом хроматографе и рассчитываем содержание полимера в исход ной биомассе (образец хроматограммы дан на рис. 6.3).

Расчет проводится так. Sстандарт соответствует 0,5 мг, а SC4 – Х мг. Из пропорции находим Х = k·SC4·0,5/ Sстандарт, где k – коэффициент, полученный экспериментальным путем. Процентное содержание полимера находим из учета навески.

16. Оценить полноту экстракции, сравнивая результаты весового и хроматографического методов определения полимера в биомассе.

Оформляем результаты в виде табл. 6.1.

Рис. 6.3. Типичная хроматограмма полигидро ксибутирата после метано лиза. Пик, обозначенный как С4, соответствует мо номеру гидроксибутирата, внутренний стандарт – бен зойная кислота (материал кафедры биотехнологии ИФБиБ СФУ) Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Таблица 6. Сравнение весового и хроматографического методов определения содержания полимеров в биомассе бактерий Навеска, г Содержание полимера, % Полнота экстракции, % Весовой метод Хроматографический метод Вопросы 1. Каковы основные методы сбора биомассы? Дать краткую характери стику этим методам.

2. Каковы методы разрушения клеток?

3. Сколько основных этапов выделения целевого продукта?

4. Что такое экстракция?

5. Какой экстрагент подходит для выделения полигидроксиалканоатов из бактерий?

6. В чем заключается принцип весового метода определения содержа ния полимера в бактерия?

7. В чем преимущество хроматографического метода определения со держания полимера?

Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего рас пределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают следующие основные виды хроматографии:

– адсорбционную, – распределительную, – ионообменную, – эксклюзионную (молекулярно-ситовую), – осадочную.

Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью).

Распределительная хроматография — на разной растворимости ком понентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесённая на твёрдый макропористый носитель) и элюенте (следует иметь в виду, что Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ при распределительном механизме разделения на перемещение зон компо нентов частичное влияние оказывает и адсорбционное взаимодействие ана лизируемых компонентов с твёрдым сорбентом).

Осадочная хроматография основана на различной способности раз деляемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе.

Ионообменная хроматография – на различии констант ионно обменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси.

Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография – на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Эксклюзионная хроматография подразделяется на гель проникающую (ГПХ), в которой элюент – неводный растворитель, и гель фильтрацию, где элюент – вода.

Последний тип хроматографии является разновидностью жидкостной хроматографии и в аппаратурном оформлении ничем не отличается от других видов жидкостной колоночной хроматографии, в том числе от высокоэффек тивной жидкостной хроматографии (ВЭЖК).

ВЭЖХ – это жидкостная колоночная хроматография, механизмы сорб ции в которой могут использоваться самые различные. По существу, ВЭЖХ – это современная форма реализации классической жидкостной колоночной хроматографии. Ниже перечислены некоторые наиболее существенные каче ственные характеристики ВЭЖК:

– высокая скорость процесса, позволившая сократить продолжитель ность разделения от нескольких часов и суток до минут;

– минимальная степень размывания хроматографических зон, что дает возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции;

– высокая степень механизации и автоматизации разделения и обра ботки информации, благодаря чему колоночная жидкостная хроматография достигла нового уровня воспроизводимости и точности.

Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров. Колонки, предназначенные для гель фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками;

при использовании таких колонок происходит разделение белков или других со единений по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы оста ются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми (рис. 6.5). В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Таким образом, при помощи ГПХ можно разделить смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход веществ из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярной массы. Так можно разделить поли пептиды, белки и другие макромолекулы. Гельпроникающая хроматография на колонке используется для очистки пестицидов, а также жирорастворимых витаминов перед их определением методом ВЖХ.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ Рис. 6.4. Принципиальная типичная схема жидкостного хроматографа: 1 – резерву ар;

2 – дегазатор;

3 – смеситель;

4 – фильтр;

5 – насос;

6 – перекрывающие краны;

7 – уст ройство для сглаживания пульсации давления;

8 – предварительная насыщающая колонка;

9 – устройство для ввода проб;

10 – хроматографические колонки;

11 – детектор;

12 – тер мостат;

13 – измеритель потока;

14 – кран;

15 – сборник фракций;

16 – регистратор Рис. 6.5. Хроматография на основе «молекулярных сит (компоненты, размеры ко торых соответствуют размерам пор или входов в поры адсорбента, задерживаются на ко лонке): а, б – две стадии процесса Основной тип сорбенты для гельпроникающей хроматографии – сти рол-ДВБ. Гельпроникающая хроматография широко используется для изуче Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ ния распределения молекулярных масс полимеров. Этот процесс можно реа лизовать на специально собранной системе высокоэффективной жидкостной хроматографии Breeze фирмы Waters (США) (рис. 6.6). Прибор комплектует ся изократическим насосом, ручным инжектором, рефрактометрическим де тектором и собственным программным обеспечением, адаптированным для пользователей, имеющих начальный опыт работы с ВЭЖХ. Гельпроникаю щая хроматография – наиболее простая технология для молекулярно массового разделения полимеров. Олигомеры, мономеры и добавки в ком плексных полимерных растворах также могут быть разделены, если молеку лярно-массовые разницы между компонентами существенны. Для характери стики полимеров разработаны специальные колонки: Styragel®, UltraStyragel™ и Shodex®, которыми снабжена хроматографическая система Breeze.

Рис. 6.6. Общий вид ВЭЖК Breeze фирмы Waters (США) Цель работы – приобретение навыков работы с жидко-жидкостной хроматографией.

Материалы и оборудование:

полигидроксибутират, выделенный из биомасса R. eutrophus B-5786;

система ВЭЖХ «Бриз» с ручным инжектором и рефрактометрическим детектором для анализа молекулярно-массовых распределений полимеров;

набор полистеролов с молекулярной массой от 50 000 до 600 000 даль тон для построения калибровочного графика.

Ход работы:

1. Приготовить 0,1 % раствор полимера в хлороформе. Для этого надо взвесить 50 мг полимера, выделенного на предыдущем занятии, перенести Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ в мерную колбу на 50 мл, добавить в колбу 10–15 мл хлороформа и после растворения полимера довести хлороформом объем до метки.

2. Таким же способом приготовить 0,1 % растворы полистерола с раз ной молекулярной массой – от 50 000 до 600 000 дальтон.

3. Приготовить элюент, в качестве которого служит обезвоженный и перегнанный хлороформ, перед использованием хлороформ дегазируется пропусканием через элюент инертного газа – гелия.

4. Включить систему Бриз и задать программу хроматографирования.

5. Ввести через ручной инжектор 10 мкл стандартного раствора и дать команду «старт» для проведения хроматографирования.

6. После завершения хроматографирования стандартов записать пробу полимера.

7. Провести расчеты хроматограмм в соответствии с заданной калиб ровкой.

8. Оформить результаты в виде графика распределения молекулярных масс полимера.

Вопросы 1. Какова история открытия хроматографии?

2. Каковы перспективы использования хроматографического метода?

3. Какие виды хроматографии различают по агрегатному состоянию элюента?

4. Каковы основные виды хроматографии в зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элю ентом и неподвижной фазой? Перечислить и охарактеризовать их.

5. В чем заключаются преимущества и достоинства ВЭЖК?

6. Какой метод используется для исследования молекулярного распре деления полигидроксиалканоатов?

Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОМАССЫ RALSTONIA EUTROPHA B-5786, МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

Цель работы: знакомство с методом газовой хроматографии и масс спектрометрии.

Газовая хроматография (ГХ) – вид хроматографии, в которой подвиж ной фазой служит газ (пар). Разделение компонентов в ГХ основано на раз личии скоростей движения и размывании концентрационных зон исследуе мых веществ, движущихся в потоке газовой фазы относительно слоя непод Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

вижной фазы, причем эти вещества распределены между обеими фазами. Газ носитель (воздух, Не, N2, Аr, СО2 и др.) должен обычно иметь небольшую вязкость и обеспечивать высокую чувствительность детектирования. Далее приводятся основные характеристики ГХ.

Основные уравнения в газовой хроматографии Коэффициент распределения – отношение концентраций исследуемого соединения в неподвижной и подвижной фазах в равновесных условиях:

cн K=. (6.3.1) cп Фазовое отношение – это отношение объемов подвижной и неподвиж ной фаз в колонке:

Vпод =. (6.3.2) Vнеп Фактор удерживания (фактор емкости) – это отношение приведен ных времен удерживания к мертвому времени:

tR k=. (6.3.3) k tм Фактор разделения – величина, характеризующая селективность раз делительной системы, равная отношению факторов удерживания или приве денных времен удерживания двух соседних пиков на хроматограмме:

K 2 t 2 /1 = =. (6.3.4) K1 t Эффективность колонки – характеристика степени размывания полос в колонке, характеризуется числом теоретических тарелок N или H.

t N = 5,545 R, (6.3.5) W 0, где W0,5 – ширина пика на половине высоты.

L, H= (6.3.6) N Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

где L –длина колонки;

N – безразмерная величина;

Н имеет размерность дли ны обычно в миллиметрах.

Разрешение Rs – это отношение расстояния между максимумами ис следуемых соседних пиков к сумме их полуширин, выраженных в одних и тех же единицах измерения:

t R2 t R Rs = 2. (6.3.6) Wb1 + Wb Связь степени разрешения с фактором разделения, фактором удержи вания k и эффективностью N:

. (6.3.7) Число тарелок, необходимое для полного разделения при Rs = 1:

, (6.3.8) при k 10 это уравнение можно упростить:

. (6.3.9) На хроматографическое разделение (на величины, R и N) влияют многие факторы: природа сорбента, длина и сечение колонки, толщина жид кой пленки на носителе или на стенках капиллярной колонки.

При небольших давлениях инертные газы-носители практически не ад сорбируются, особенно в газожидкостной хроматографии. Поэтому природа газа-носителя практически не влияет на селективность разделения, за исклю чением некоторых случаев в газоадсорбционной хроматографии при разде лении газов на активных тонкопористых адсорбентах. В большинстве случа ев на входе в колонку используют избыточное давление в пределах от 0,1 до 2 атм (в очень редких случаях выше). Изменение давления в этих пределах практически не влияет ни на селективность, ни на эффективность разделения.

Размер введенной пробы анализируемой смеси должен быть таким, чтобы не вызывать перегрузку колонки. При введении пробы больше макси мально допустимой изменяются времена удерживания. Особенно важно не перегружать капиллярную колонку, так как ее эффективность сильно падает с перегрузкой.

Развитие высокоэффективной ГХ связано прежде всего с изобретением капиллярных колонок. Первоначально капилляры выдувались из стекла.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

Хрупкость таких колонок ограничивала их использование. Появление гибких колонок из кварца с инертной поверхностью дало толчок к развитию ГХ как метода с большей эффективностью разделения по сравнению с насадочными колонками, откуда и появился термин «высокоэффективная газовая хромато графия». Разработка программного обеспечения, производство колонок на коммерческой основе привело к совершенствованию хроматографического оборудования, что существенно расширило область применения газовой хроматографии в науке и промышленности.

Схема современного газового хроматографа изображена на рис. 6.7.

Рис. 6.7. Функциональная схема газового хроматографа Для создания перепада давления через колонку хроматограф подсоеди няют к источнику со сжатым газом 1 (баллонная или лабораторная линия со сжатым газом). Через колонку поток газа-носителя должен проходить с по стоянной и определенной скоростью, поэтому на входе в колонку на линии газа-носителя устанавливают регулятор и стабилизатор расхода газа носителя 2 и измеритель расхода газа 3. Если газ-носитель загрязнен нежела тельными примесями, то в этом случае устанавливается еще фильтр 4. В со временных хроматографах используются блок подготовки газа с электрон ным заданием и управлением расходов газов. Перед входом в колонку уста навливается устройство для ввода анализируемой пробы в колонку – дозатор испаритель 5. Обычно анализируемую пробу вводят микрошприцем 8 через самозатекающее термостойкое резиновое уплотнение в дозаторе. Анализи руемая проба, введенная в дозатор, захватывается потоком газа-носителя и направляется в хроматографическую колонку 6. Детектор 11 зарегистрирует присутствие разделенных компонентов в газе-носителе. Эти сигналы в случае необходимости усиливаются (усилитель 13) и регистрируются на шкале вто ричного самопишущего прибора 14 или дисплея компьютера. Для обеспече ния стабильного режима работы детектора используется блок питания детек тора 12. Сорбируемость веществ зависит от температуры. Для исключения Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

влияния колебания температуры на результаты разделения колонку помеща ют в специальную камеру-термостат, температура которой устанавливается и поддерживается терморегулятором 9. В случае необходимости температура колонки в процессе разделения может изменяться по определенной програм ме с помощью блока программирования температуры 10. Высота или пло щадь пика пропорциональны количеству или концентрации компонента в смеси. Площадь пика может быть измерена с помощью электронного инте гратора 15 или по специальной программе.

Всего для газовой хроматографии предложено более 60 типов детекти рующих систем. Но к наиболее часто используемым относятся пламенно ионизационный детектор, детектор по теплопроводности, электронно захватный детектор, термоионный детектор, пламенно-фотометрический де тектор, фотоионизационный детектор, масс-спектрометрический детектор.

Хромато-масс-спектрометры – одни из наиболее распространенных совре менных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкост ных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предвари тельное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и измере ние их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому масс спектрометры в хроматографии большей частью имеют дело не со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями. Масс-спектрометрия (масс-спектральный анализ), метод анализа вещества путем определения массы (чаще, отношения массы к заряду m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества или уже присут ствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, на зывается масс-спектром вещества. Масс-спектрометры устанавливают моле кулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный состав, а также про странственную структуру расположения атомов.

Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, а также в биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать превращения вещества в процессе химической реакции, что существенно для установления ее механизмов. Масс-спектрометрия в сочетании с газовой хроматографией активно используется в СФУ для решения ряда биотехноло гических задач.

Для выполнения работы используется хромато-масс-спектрометр Agilent 5975Inert (Agilent, США) (рис. 6.8).

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

Рис. 6.8. Общий вид хромато-масс-спектрометра Agilent 5975Inert Технические характеристики хромато-масс спектрометра Agilent 5975Inert Хромато-масс-спектрометрическая система представляет собой сово купность самых современных технологий. Применение химически инертных материалов для изготовления источника ионизации позволяет практически полностью устранить возможность разложения и деградации термолабиль ных соединений и получать в процессе масс-спектрометрического анализа данные, максимально пригодные для идентификации по библиотекам масс спектров.

В модели Agilent 5975 Inert упрощена процедура настройки режима химической ионизации: поток газов-реактантов управляется электронными регуляторами, и настройка их оптимальных значений осуществляется в авто матическом режиме практически без участия оператора. К прибору может быть одновременно подключено два газа-реактанта, их переключение осуще ствляется при помощи программного обеспечения. Возможность использо вания источника химической ионизации для работы с ионизацией электрон ным ударом позволяет программно переключать способ ионизации во время анализа одной пробы.

Применение технологии QuickSwap дает возможность в считанные ми нуты производить замену аналитической хроматографической колонки без выключения хромато-масс-спектрометра, проводить обратную продувку ко лонки для удаления тяжелых компонентов. Используя функцию eMethod, оператор может загружать аналитические методы, разработанные компанией Agilent для анализа тех или иных групп химических соединений, непосредст венно с интернет-сайта www.agilent.com.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

Программа выявления индивидуальных спектров позволяет находить и идентифицировать целевые соединения в сложных матрицах даже в случаях, когда эти вещества не имеют выраженного хроматографического пика.

Система управляется Химической станцией на базе современного компьютера, работающего в среде Windows XP. Управление хроматографом и детектором осуществляется посредством LAN коммуникации.

В стандартный комплект входят программы автоматической настройки, программы сбора и обработки данных, включая библиотечный поиск масс спектров и распечатки отчетов о различных форматах. Для удобства обслу живания и ухода за системой имеется комплект стандартных диагностиче ских программ. Дополнительно включены библиотеки масс-спектров NIST 05 (190 825 соединений) со структурными формулами, WiLey (621 600 со единений).

Технические характеристики масс-селективного детектора:

диапазон масс от – 1,6 до 1050 а.е.м., параметры могут быть выбраны внутри этого диапазона;

максимальная скорость сканирования составляет 10 000 а.е.м./с.

Рекомендуемая скорость сканирования составляет 800–1600 а.е.м./с, что позволяет получать два или три спектра в секунду.

Чувствительность при ионизации электронным ударом, режим скани рования – 1 пикограмм октафторнафталина при введении в 1 мкл изооктана и использовании стандартной колонки HP-5MS 0,25 мм30 м0,25 мкм дает отношение сигнал/шум не хуже 200:1 на отдельной хроматограмме по массе m/z 272. Чувствительность при ионизации электронным ударом, режим реги страции отдельных ионов – 20 фемтограмм октафторнафталина при введении в 1 мкл изооктана и использовании стандартной колонки HP-5MS 0,25 мм30 м0,25 мкм дают отношение сигнал/шум не хуже 50:1 на отдель ной хроматограмме по массе m/z 272.

Система Agilent 6890/5975 Inert работает при объемной скорости пото ка газа-носителя (гелия или водорода) до 2 мл/мин при использовании стан дартного турбомолекулярного насоса, до 4 мл/мин при использовании высо коэффективного турбомолекулярного насоса (262 л/с) и колонок с внутрен ним диаметром 0,32 мм.

Применение химически инертных материалов для изготовления источ ника ионизации позволяет практически полностью устранить возможность разложения и деградации термолабильных соединений и получать в процессе масс-спектрометрического анализа данные, максимально пригодные для идентификации по библиотекам масс-спектров.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

Цель работы: знакомство с методом газовой хроматографии и масс спектрометрии.

Материалы и оборудование:

липидный экстракт из Ralstonia eutropha B-5786;

реактивы: хлороформ, этанол, метанол, концентрированная серная ки слота, гексан, бензол, дистиллированная вода, натрия сульфат безводный;

лабораторная посуда: грушевидные колбы на 50 мл, пипетки, обратные холодильники, воронки, делительные воронки, пробки, шприц хроматогра фический на 10 мкл;

лабораторное оборудование: роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Германия), водяная баня, хромато-масс-спектрометр Agilent 5975Inert (Agilent, США).

Ход работы:

1. Приготовление метиловых эфиров ЖК:

– приготовить смесь из 10 мл метанола и 0,2 мл концентрированной серной кислоты;

– добавить в колбу к осушенным липидам 2–3 капли бензола и 0,5 мл метанольной смеси;

– нагреть водяную баню до 90 оС, подключить водяное охлаждение к обратным холодильникам, установить колбу на шлиф холодильника и помес тить нижнюю часть колбу (1/2–1/3) в воду;

– длительность метанолиза составляет1,5–2 ч, в течение этого времени необходимо наблюдать за охлаждением, температурой в бане, целостью кол бы и пр.;

– по окончании процесса снять колбу, добавить 1 мл дистилированной воды и 2 мл гексана, интенсивно встряхнуть несколько раз;

– перелить смесь в делительную воронку, добавить 5 мл дистилирован ной воды, слить из воронки нижний водный слой, повторно добавить и слить 5 мл дистилированной воды;

– верхний слой, состоящий из гексана с растворенными метиловыми эфирами ЖК, пропустить через слой Na2SO4 в грушевидную колбу, затем ис парить гексан на роторном испарителе так, как описано ниже;

– готовые метиловые эфиры ЖК хранить в морозильной камере непо средственно до проведения газовой хроматографии.

2. Выпаривание гексана:

– подключить вакуум, водяное охлаждение к роторному испарителю, отрегулировать температуру водяной бани в пределах 35–40 оС;

– поместить колбу с экстрактом на стеклянный выход-шлиф испарите ля, закрыть герметизирующий кран и включить вращение колбы;

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

– по окончании испарения растворителей из колбы выключить враще ние, открыть герметизирующий кран, снять колбу, отключить вакуум и ох лаждение.

3. Подготовка газового хроматографа к выполнению анализов:

– открыть газовую линию (гелий) и проверить ее на герметичность;

– включить хроматограф, масс-спектрометр, запустить управляющую компьютерную программу;

– дождаться прогрева вакуумного насоса, установить температурный режим всех блоков хроматографа, через 4 ч работы провести тестирование и настройку детектора с помощью программного обеспечения;

– при успешном результате тестирования прибор готов к работе.

4. Газовая хроматография метиловых эфиров ЖК:

– выбрать нужный метод проведения анализа из имеющихся, устано вить режим ввода пробы «split», то есть с делением потока газа при вводе пробы;

– заполнить данные о пробе при формировании файла, где будут хра ниться результаты анализа;

– в колбу с метиловыми эфирами с помощью микрошприца добавить 20–40 мкл гексана, смыть и сконцентрировать вещество на дне колбы, по окончании отобрать шприцем 1–3 мкл раствора;

– запустить «анализ пробы» из компьютерной программы, дождаться сигнала готовности прибора, ввести пробу в инжектор;

– процесс хроматографии происходит далее около 1 ч, за это время введенные метиловые эфиры ЖК разделяются на колонке, подаются в масс спектрометрический детектор, где производится регулярное сканирование спектров вещества, выходящего из колонки, спектры и общая ионная интен сивность записываются в соответствующий файл.

5. Идентификация пиков метиловых эфиров ЖК:

– по окончании анализа возможна работа с сформированным файлом пробы с помощью специальной программы обработки данных;

– провести идентификацию пиков на хроматограмме путем сравнения масс-спектров веществ с имеющимися в базе данных;

– рассчитать процентное содержание основных жирных кислот от их общей суммы;

– занести данные в таблицу;

– провести сравнение результатов с литературными данными.

Вопросы 1. В чем заключается принцип действия газовой хроматографии, како вы основные функциональные блоки газового хроматографа?

2. В чем заключается принцип метода масс-спектрометрии?

3. Для чего необходимо образование метиловых эфиров жирных кислот перед выполнением газохроматографического анализа?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ.

4. Как происходит формирование и запись масс-спектров веществ в де текторе прибора, каковы основные блоки масс-спектрометрического детек тора квадрупольного типа?

5. Какую информацию о структуре молекулы ЖК можно получить с помощью масс спектрометрии?

6. Какие ЖК являются наиболее распространенными у бактерий?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Цель: ознакомление с основными принципами, используемыми при конструировании и эксплуатации оборудования биотехнологических про цессов Задачи:

ознакомление с принципами составления материально-энергетического баланса процессов микробного роста и синтеза продуктов;

определение и расчет массообменных характеристик ферментационно го оборудования;

определение величины и роли межфазной поверхности в системе газ жидкость в ферментерах различных конструкций.

Аппаратурное оформление технологических процессов производства продуктов биотехнологии и, прежде всего, микробиологического синтеза весьма разнообразно и во многом специфично. Специфические требования к оборудованию биотехнологической промышленности связаны с санитарно гигиеническими вопросами и предотвращением контаминации, что имеет решающее значение при проектировании. В этой связи одним из основных требований к оборудованию микробиологического производства является его герметичность. Применение герметичных аппаратов, особенно для стадии культивирования биологических объектов, – важное условие качественного проведения процесса и получения стандартного продукта с высоким выхо дом. Большое значение имеет правильный выбор материала, из которого из готовлено оборудование, поскольку компоненты материала могут оказывать как активирующее, так и ингибирующее действие на биосинтез биологически активных веществ. Еще одним важным требованием к оборудованию для биотехнологии является необходимость обеспечения высокой производи тельности. Чем больше производительность аппарата, тем меньше требуется сложных автоматических приборов контроля и регулирования параметров процесса, запорной аппаратуры, трубопроводов и др. Оборудование должно быть рассчитано на проведение непрерывных процессов, поскольку это соз дает возможность интенсифицировать и автоматизировать биотехнологиче ские процессы.

Важной особенностью биотехнологии является проведение основной технологической стадии (стадии ферментации) в водной среде, при постоян ном перемешивании и вибрации, а также меняющихся параметрах (рН, тем пературы, ионной силы среды и др.). Эти обстоятельства предопределяют схожесть процессов приготовления питательных сред для микроорганизмов, проведения биосинтеза и выделения целевых продуктов и обуславливают создание универсальных установок, позволяющих осуществлять без серьез ной переналадки большое количество процессов, производящих ценные про Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ дукты. Биотехнологическая установка (ферментер, биореактор) состоит из стандартных модулей, реализующих типовые операции. Их конкурентоспо собность по сравнению с установками, проектируемыми конкретно для за данного технологического процесса, определяется тем, что в них заранее за ложена возможность быстрой замены технологий в широком диапазоне в за висимости от меняющихся потребностей рынка. Это сокращает вынужден ный простой установки и связанные с ним нерациональные накладные рас ходы. Использование модульного принципа в биоинженерии позволяет до биться высокой степени заводской готовности оборудования и снижает за траты на его изготовление и монтаж. Модульный принцип также предусмат ривает разработку и использование типовых алгоритмов и программ опти мального управления оборудованием, модулей с использованием микропро цессоров, а также пакета программ, оптимального для управления выбран ными технологическими процессами. Использование возобновляемого сырья с одновременным производством ценных, например кормовых, препаратов существенно снижает себестоимость получаемого продукта, что также по вышает конкурентоспособность модульных линий, а их малая мощность об легчает обеспечение ее экологической безопасности. Кроме того, предлагае мое сырье и процесс его подготовки предусматривают полную утилизацию твердых отходов, концентрирование и использование стоков, и возврат кон денсата от их упаривания в технологический процесс. Модульные линии имеют определенные перспективы для выхода на международный рынок, по скольку есть достаточное количество средних и малых стран, испытывающих потребность в препаратах, но не имеющих достаточных средств для создания крупных предприятий. Однотипность модулей позволяет объединять их в се ти, в которых отдельные функции линии могут быть сосредоточены в спе циализированных подразделениях.

Важнейшей задачей биотехнологического производства является полу чение максимального выхода целевого продукта. Для достижения этой цели процесс ферментации должен проходить в оптимальных условиях, которые создаются с помощью ферментационного оборудования и той инфраструкту ры, которая обеспечивает его функционирование. В этой связи на первый план выдвигаются задачи, связанные с устранением заражения культуры по сторонней микрофлорой и обеспечения качественного управления процессом культивирования. Заражение культуры микроорганизмов или клеток посто ронней микрофлорой приводит к прямым экономическим потерям, причем в ряде случаев очень значительным. Поэтому при выборе ферментационного оборудования в первую очередь обращают внимание на надежность обеспе чения асептики процесса культивирования. Другое важное требование отно сится к процессу стерилизации питательной среды. Питательная среда не должна быть «перегрета» при тепловой стерилизации, что приводит к дест рукции таких ее компонентов, как витамины и аминокислоты, а результатом этого становится замедление роста культуры и падение продуктивности.


Стерилизация питательной среды должна проводиться в автоматическом ре жиме. Практика показывает, что ошибки оператора являются главной причи Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ной отсутствия стерильности питательной среды. Процессы, протекающие при ферментации, требуют непрерывного управления.

Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ Цель работы: экспериментально подтвердить закономерность между тепловыделением клеточной популяции и ее потреблением кислорода.

Точное измерение количества метаболического тепла связано с серьез ными техническими трудностями. Имеет место противоречие между требо ванием контролируемости условий роста и специфическими требованиями корректности калориметрических измерений. При культивировании помимо метаболического тепла генерируется тепло техническое, связанное с аэраци ей, перемешиванием и теплопотерями. Сам процесс калориметрии измерения требует законченности переходных процессов по тепловым потокам в объек те и окружающем его оборудовании. Таким образом, чем лучше проба подго товлена к калориметрическим измерениям, тем больше условия в клетках от личаются от истинных, поскольку наблюдается лимит как по газовому, так и органическому субстратам. Более перспективны в этом плане измерения, проводимые не с образцами, а с целым ферментером. Но в этом случае точ ность измерения меньше, чем при измерении тепла химических реакций.

В этой связи более целесообразно использовать аналогию между выделением культурой тепла и потреблением ею кислорода. Такой зависимостью является среднее значение коэффициента пропорциональности Q0 = 103,68 кДж/экв RO, которое справедливо на протяжении всего жизнен ного цикла клеток и вне зависимости от их возраста.

Метаболическое тепловыделение согласно [1] включает rН = rSHSRO - µ HВRO- rPHPRO, где rН – удельная скорость тепла в расчете на 1 экв. RO;

HSRO, HВRO, HPRO – энтальпии RO в субстрате, биомассе и продуктах.

При HSRO = HВRO = HPRO = HORO уравнение имеет вид rН = HORO.

Степень точности последнего выражения тем больше, чем ближе друг к другу величины энтальпии, то есть когда образуется меньше продуктов мета болизма, и чем больше редоксонов субстрата уходит на кислород.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ Показанная пропорциональность между тепловыделением и дыханием при аэробном росте имеет место при росте на любом органическом субстра те, так как конструктивный обмен протекает приблизительно на постоянном энергетическом уровне, а дыхательный обмен опускает редоксоны со стан дартного уровня, имеющего место в органических соединениях до нуля.

Поэтому в случае аэробного роста в отсутствие большого количества продуктов метаболизма целесообразнее тепловыделение клетками измерять через скорость потребления кислорода.

В этой связи тепло Q, которое получила культуральная жидкость за время отключения системы термостатирования, можно представить в виде баланса Q = Qб + Qм - Qп, где Qб – тепло, выделяемое клетками, Дж/c;

Qм – тепло, выделяемое перемешивающим устройством при постоянной мощности, Дж/c;

Qп – потери тепла в окружающую среду, Дж/c.

Тепло, выделяемое в окружающую среду, Qп определяется эксперимен тально с использованием стандартного нагревателя при калибровке в пита тельной среде без клеток. Аналогично тепло, выделяемое перемешивающими устройствами, также определяется опытным путем. Например, тепло выде ляемое турбинной мешалкой биореактора BioFlo110 при 1200 об/мин и диа метре мешалки 80 мм, составляет 18–20 Дж/c. Тепло в рабочем объеме био реактора Q определяется на основании начальной и конечной температуры среды достигаемо за время отключения системы термостатирования.

Таким образом, из теплового баланса определяется скорость тепловы деления клеток, Дж/ч, а при помощи газоанализаторов скорость потребления кислорода G02, моль O2/ч. После чего величина скорости потребления кисло рода переводится в экв.редоксонов в час из расчета 4 экв. RO/моль O2. На основании полученных данных определяется отношение скорости тепловы деления к скорости дыхания Qб /G02. кДж/экв.RO, которое составляет [1] 103,7 кДж/экв.RO.

Материалы и оборудование:

культура штамма R. eutrophus B-5786;

раствор базового фосфатного буфера для среды;

стерильные растворы микроэлементов, железа лимонно-кислого, суль фата магния и хлористого аммония;

установка для гетеротрофного культивирования, включающая тепло изолированный биореактор с турбинной мешалкой BioFlo110 и устройство для термостабилизации подаваемого воздуха и насыщения его водяным па ром;

газоанализатор для измерения концентрации кислорода;

термометр Beckmann (точность 0,01 oC).

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ Ход работы:

1. Определить потери тепла в окружающую среду;

2. Определить тепло, выделяемое перемешивающим устройством;

3. Определить тепло, выделяемое клетками;

4. Провести статистическую обработку экспериментальных данных и рассчитать отношение Qб /G02, кДж/экв.RO.

5. Сравнить полученные значения с известными в литературе данными и сделать выводы.

Вопросы 1. Какие методы измерения тепловыделения микроорганизмов вы зна ет?

2. Какова связь редоксона с количеством потребленного киcлорода?

3. В каком виде представляют тепловой баланс биореактора?

Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА Цель работы: приобретение навыков определения величины коэффи циента массоотдачи в газожидкостном биореакторе.

Перенос газового субстрата (кислорода) через жидкость характеризует ся общеизвестным уравнением dc = a(c * c ), GO 2 = d где GO2 – скорость сорбции (переноса), растворенного O2 (моль O2/лс);

– поверхностный коэффициент массоотдачи (переноса), м/c;

v = a – объемный коэффициент массоотдачи, с-1:

a – межфазная поверхность контакта, м2 /м3;

c* – равновесная концентрация O2 в жидкости, моль O2/л;

c – текущая концентрация кислорода в жидкости, моль O2/л.

Коэффициент массопереноса рассматривают как масштабный пара метр, необходимый для поддержания функционирования биореактора и по лучения наибольшей продуктивности процесса.

Наилучшую сходимость расчетных значений v с опытными в лабора торных биореакторах дает уравнение типа [2] Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ 0, nd d =0,33 м п Sc 0,5 ( Dж / d п ), где dп – средний диаметр пузырьков газа, м;

– коэффициент кинематической вязкости жидкости, м2/c;

– поверхностный коэффициент массоотдачи, м/с;

Sh – критерий Шервуда;

Sc – критерий Шмидта.

Изменение концентрации растворенного газа в культуре с учетом его потребления клетками и поступления его из газовой фазы представляют в виде dc/d = a(c* c) qx, где q – удельная скорость потребления газа биомассой, кг О2/(кгч);

x – концентрация биомассы, кг/м3.

В стационарном состоянии dc/d = 0, и тогда a(c* c) = qx.

При равенстве количества газа, поступающего из газовой фазы в жид кость и потребляемого микроорганизмами, имеем c = c* qx/(a).


Если O2 выполняет роль лимитирующего субстрата, можно записать уравнение Михаэлиса – Ментена в виде с q = q мак, Ko + c где q – удельная скорость поглощения O2, отнесенная к весу сухих клеток, ммоль O2/г клеток ч;

максимальная скорость поглощения кислорода, qмак – ммоль O2/г клеток ч;

Ko – константа.

Так, например, согласно [3] удельная скорость потребления компонен тов газовой смеси (CO2, O2, H2) растущей и аккумулирующей полимеркуль Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ турой Ralstonia eutropha при периодическом культивировании на первой ста дии составляет для водорода 0,036–0,04, кислорода 0,17–0,18, диоксида угле рода 0,11–0,14 кг/(кг ч). На стадии накопления ПГА в безазотной среде ско рость потребления газа существенно уменьшается, что обусловлено сниже нием роста клеток. При этом экономический коэффициент культуры в сред нем на первом этапе культивирования составляет: по H2 – 1,5 кг АСБ /кг;

O2 – 0,34;

CO2 – 0,48, на втором этапе, соответственно, 0,9;

0,2;

0,4. Среди микро организмов существуют значительные различия в потребности O2.

Для определения скорости поглощения кислорода используются в ос новном четыре метода: динамический;

сульфитный;

прямое измерение и тео ретический расчет, учитывающий рост биомассы.

Динамический метод осуществляется в периодической ферментации путем измерения скорости снижения концентрации газа в жидкости после прекращения аэрации и построения линейной зависимости, величины снижения концентрации кислорода от времени. Угол наклона построенной прямой линии определяет обратную величину объемного коэффициента мас соотдачи – 1/v.

Сульфитный метод заключается в том, что в присутствии 10-3 молей Со2+ или Сu2+ сульфит натрия окисляет растворенный кислород. Затраченный сульфит определяют путем добавки раствора йода, а остаточный йод титру ют Na-тиосульфатом. Однако метод не дает представления о динамике обес печения жидкости кислородом, а характеризует только условия аэрации.

Определение скорости переноса кислорода можно реализовать по из мерению микробного роста в аэробных услових [4]:

A С= B, Y s где С – потребление кислорода, моль O2/г сухих клеток;

A – количество кислорода, необходимое клеткам для окисления 1 г суб страта до CO2, H2O, NH3;

B – количество кислорода, необходимое для окисления 1 г сухой био массы в CO2, H2O, NH3;

Ys – экономический коэффициент, г биомассы/ г субстрата.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ Величина А определяется в результате теоретических расчетов окисле ния субстрата и В = 400 – 590 мл O2/ г сухих клеток – опытная величина.

Для определения общего количества кислорода, которое требуется культуре за 1 ч, необходимо знать удельную скорость роста µ, ч-1;

коэффи циент Yo, г клеток/ г O2:

K N = µx, Y o где N – общее количество кислорода, необходимое культуре за 1 ч;

K – корректирующий фактор, молей O2/г O2.

Для определения Yo используют следующее уравнение:

N H 2C + H / 2 O O C = 16 + +, 1600 600 933 Y YM o s где C, H, O – число атомов углерода, водорода и кислорода в субстрате;

С, H,O, N проценты углерода, водорода, кислорода и азота в био массе;

M – молекулярный вес субстрата.

Расчет объемных значений коэффициента массоотдачи при физической сорбции обычно проводят по опытным данным, полученным при насыщении дистиллированной воды кислородом из воздуха, по уравнению c = ln c * /, v A где с – концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м3;

с* – равновесная концентрация кислорода в жидкости, кг/м3;

А – коэффициент, определяемый из начальных условий;

– время насыщения, с;

v – объемный коэффициент массоотдачи, с-1.

Величина коэффициента A определяется из начальных условий (с = сн):

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ ( ), c н A = 1 /e с* где сн – начальная концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м3.

При приготовлении рабочей смеси жидкость обескислороживается пу тем пропускания через нее азота либо за счет создания в аппарате вакуума с последующей дегазацией.

Материалы и оборудование:

культура штамма R. eutrophus B-5786;

стерильный раствор базового фосфатного буфера для среды;

стерильные растворы микроэлементов, железа лимонно-кислого, суль фата магния и хлористого аммония;

установка для гетеротрофного культивирования, включающая биореак тор с турбинной мешалкой BioFlo110;

газоанализатор для измерения концентрации кислорода.

Ход работы:

1. Определить концентрацию биомассы в рабочем объеме биореактора.

2. Установить удельную скорость поглощения O2.

3. Используя полученные экспериментальные данные, провести расчет объемного коэффициента массоотдачи.

4. Определить продуктивность биореактора по биомассе.

Вопросы 1. Каковы способы определения коэффициента массоотдачи в биореакторе?

2. Как выразить связь объемного и поверхностного коэффициента мас сопередачи?

3. Какой биореактор наиболее эффективен с позиции массопереноса?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ Цель работы: определение газосодержания, диаметра пузырьков газа и межфазной поверхности в аппаратах с мешалкой и в пленочном.

Величина межфазной поверхности позволяет оценить массообменные параметры биореактора и осуществлять переход от поверхностного коэффи циента массоотдачи к объемному.

Если в объеме Vр, заполненном газожидкостной смесью, имеется n га зовых пузырьков осредненного диаметра dп, то их поверхность составит F = dп2n, а их объем Vг = dп3n/6, отсюда можно записать Vг = Fdп/6.

Поделив левую и правую части последнего выражения на Vр, получим = Vг/ Vр = Fd/Vр6. Из этого следует, что удельная межфазная поверхность контакта фаз (поверхность газовых пузырьков в 1 м3 смеси) F а= =, Vp d п где а – удельная межфазная поверхность контакта, м2/м3;

– газосодержание.

Доля газа в объеме жидкости обычно определяется так:

= (Vгж Vж)/Vгж, где Vгж – объем газожидкостной смеси в биореакторе, м3;

Vж – объем жидкости в биореакторе, м3.

Среднеповерхностный диаметр пузырьков газа ni d i d=, ni п Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ N – количество пузырьков, шт.;

d – диаметр пузырька, м.

В лабораторных биореакторах с мешалками величина газосодержания рассчитывается из соотношения 0,25 c µ N (1 ) n m H = K 0,8 uг.

V D Для лопастной мешалки при N(1– )/V 10 (кВт/м3) : K = 0,8;

n = 0,5;

m = 0,62;

с = 0. Для турбинной мешалки при N(1– )/V 10: K = 0,65;

n = 0,5;

m = 0,6;

c = – 0,65, при N(1– )/V 10: K = 0,17;

n = 0,1;

m = 0,2;

c = – 0,65.

Среднеповерхностный диаметр пузырьков газа в рассматриваемых ап паратах при N(1 – )/V 10 в биореакторе с лопастной мешалкой составляет 5–6 мм, для турбинной мешалки – 3–4 мм. Наилучшую сходимость экспери ментальных значений диаметра пузырька газа с расcчетными дает зависи мость типа [5] 0, d п = 0,8.

( N / V ) 0, 0, Удельная межфазная поверхность рассчитывается N 0,4 0, 0, uг V a = 1, 44 uп, 0, где – газосодержание;

N – мощность на перемешивание, Вт;

V – рабочий объем биореактора, м3;

H – уровень жидкости в аппарате, м;

D – внутренний диаметр корпуса аппарата, м;

uг – среднерасходная скорость воздуха, м/c;

– плотность суспензии, кг/м3;

µ – коэффициент динамической вязкости суспензии, Пас;

– поверхностное натяжение жидкости, Н/м.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ Данные по межфазной поверхности в пленочном биореакторе пред ставлены в работе [6].

Материалы и оборудование:

биореактор с турбинной мешалкой BioFlo110;

трубчатая насадка пленочного биореактора;

система отбора газожидкостной смеси и уровня жидкости в аппарате;

термометр Beckmann (точность 0,01 oC);

цифровой фотоаппарат.

Ход работы:

1. Определить газосодержание в биореакторах.

2. Определить при помощи фотографирования диаметр пузырьков в культуре.

3. Рассчитать удельную межфазную поверхность.

4. Провести анализ и сделать выводы.

Вопросы 1. Каково назначение межфазной поверхности при масштабировании биореакторов?

2. Какие способы определения газосодержания вы знаете?

3. Какие расчетные зависимости используются для определения гидро динамических параметров в биореакторе с мешалкой?

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Большой практикум по биотехнологии : учеб. пособие / Т. Г. Волова, И. В. Кожевников, Л. А. Франк [и др.]. – Красноярск : Краснояр. гос.

ун-т, 2005. – 128 с.

2. Винаров, А. Ю. Ферментационные аппараты для процессов микро биологического синтеза / А. Ю. Винаров, Л. С. Гордеев, А. А. Кухаренко, В. И. Панфилов ;

под ред. В. А. Быкова. – М. : ДеЛи Принт, 2005. – 278 с.

3. Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Изд-во СО РАН. – 1999. – 252 с.

4. Волова, Т. Г. Полиоксиалканоаты – биоразрушаемые полимеры для медицины / Т. Г. Волова, В. И. Севастьянов, Е. И. Шишацкая. – Новоси бирск : Наука, 2003.

5. Войнов, Н. А. Пленочные биореакторы / Н. А. Войнов, Е. В. Сугак, Н. А. Николаев, С. М. Воронин. – Красноярск : Изд-во «Боргес», 2001. – 252 с.

6. Войнов, Н. А. Пленочные трубчатые газо-жидкостные реакторы / Н. А. Войнов, Н. А. Николаев. – Казань : Отечество, 2007. – 271 с.

7. Высоцкий, Е. С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских ки шечнополостных / Е. С. Высоцкий, С. В. Маркова, Л. А. Франк // Молеку лярная биология. – 2006. – С. 40, 404–417.

8. Гладков, Е. А. Биотехнологические методы получения растений, ус тойчивых к тяжелым металлам. Оценка комплексной фитотоксичности тяже лых металлов и получение растений, обладающих комплексной устойчиво стью // Биотехнология / Е. А. Гладков, О. В. Гладкова. – 2007. – № 1. – С. 81–85.

9. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002.

10. Другов, Ю. С. Газохроматографическая идентификация загрязне ний воздуха, воды, почвы и биосред / Ю. С. Другов, И. Г. Зенкевич, А. А. Ро дин. – М. : Бином, 2005. –752 с.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 11. Егорова, Т. А. Основы биотехнологии / под ред. Т. А. Егоровой, С. М. Клуновой, Е. А. Живухиной. – М. : Академия, 2003. – 208 с.

12. Жимулев, И. В. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. В. Жимулев. – 3-е изд. – Новосибирск : Сибирское университетское изда тельство. – 2006. – 479 с.

13. Зобова, Н. В. Использование биотехнологических методов в повы шении соле- и кислотоустойчивости ярового ячменя / Н. В. Зобова, Е. Н. Ко нышева. – Новосибирск : СО Россельхозакадемия, 2007. – 124 с.

14. Использование биотехнологических методов в генетико селекционных исследованиях плодовых и ягодных культур / Н. И. Савельев, В. М. Тюленев, Н. В. Солоновых [и др.]. // Сельскохозяйственная биология, 2003. – № 30. – С. 51–63.

15. Квеситадзе, Г. И. Введение в биотехнологию / Г. И. Квеситадзе, А. М. Безбородов / РАН. Ин-т биохимии им. А. Н. Баха. – М. : Наука, 2002. – 283 с.

16. Клонирование ДНК (методы) /под ред. Д. Гловера. – М. : Мир, 1988.

17. Максимов, Г. В. Теоретические и практические аспекты использо вания биотехнологии и генной инженерии / Г. В. Максимов. – М. : Вузовская книга, 2004.

18. Минкевич, И. Г. Материально-энергетический баланс и кинетика роста микроорганизмов / И. Г. Минкевич. – Москва – Ижевск : НИЦ «Регу лярная и хаотическая динамика» ;

институт компьютерных исследований, 2005. – 352 с.

19. Отто, М. Современные методы аналитической химии / М. Отто. – М. : Техносфера, 2003. – Т. 1. – 412 с.

20. Отто, М. Современные методы аналитической химии / М. Отто. – М. : Техносфера, 2003. – Т. 2. – 281 с.

21. Очерки экологической биофизики / под ред. Т. Г. Воловой. – Ново сибирск : Изд-во СО РАН, 2003.

22. Першина, Л. А. Основные методы культивирования in vitro в био технологии растений : учеб. пособие / Л. А. Першина. – 2-е изд., перераб. и доп. – Новосибирск : Новосиб. гос. ун-т, 2005. – 142 с.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 23. Репин, С. В. Медицинская клеточная биология / С. В. Репин, Г. Т. Сухих. – М., 1998.

24. Сазыкин, Ю. О. Биотехнология / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева. – М. : Академия, 2006. – 256 с.

25. Сельскохозяйственная биотехнология : учеб. / под ред. В. С. Шеве лухи. – М. : Высш. шк., 2003. – 469 с.

26. Современные проблемы и методы биотехнологии : учеб. пособие / Н. А. Войнов и [др.]. – Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – c. – (Современные проблемы и методы биотехнологии : УМКД № 1323-2008 / рук. творч. кол лектива Т. Г. Волова).

27.Сычев, С. Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии Миллихром : учеб. пособие / С. Н. Сычев, К. С. Сычев, В. А. Гаврилина. – Орел, 2002. – 258 с.

28. Суриков, В. Т. Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плаз мой. Образование ионов / В. Т. Суриков. – Екатеринбург : УрО РАН, 2006. – 276 с.

29. Торчилин, В. П. Иммобилизованные ферменты в медицине / В. П. Торчилин. – М. : ВНТИЦ, 1998. – 198 с.

30. Трансгенные растения для фармакологии / Е. Б. Рукавцова, Я. И.

Бурьянов, Н. Я. Шульга, В. А. Быков // Вопросы биологической, медицин ской и фармацевтической химии. – 2006. – № 2. – С. 3–12.

31. Штильман, М. И. Полимеры медико-биологического назначения / М. И. Штильман. – М. : ИКЦ «Академкнига», 2006. – 399 с.

32. Boehm R. Bioproduction of therapeutic proteins in the 21st century and the role of plants and plant cells as production platforms.Ann.NY Acad. Sci, 2002, V.1102(1), P.121-134.

33. www.biotechnolog.ru 34. Bajji M. Bertin P., Lutts S., Kinet J-M. Evaluation of drought-resistance related traits in durum wheat somaclonal lines selected in vitro // Australian Jour nal of Experimental Agriculture. – 2004. – V. 44. – Р. 27–35.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 35. Birsin M. A., zgen M. A. Comparison of callus induction and plant re generation from different embryo explants of triticale (x Triticosecale Wittmack) Cellular & Molecular Biology Letters Volume 9, (2004). Р. 353 – 361.

36. Lutts S., Almansouri M., Kinet J.-M. Salinity and water stress have con trasting effects on the relationship between growth and cell viability during and af ter stress exposure in durum wheat callusPlant Science 167 (2004) 9–18.

Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум

Pages:     | 1 | 2 ||
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.