авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |

«Учебно-методический комплекс включает материалы по основным положениям биотехнологии: модельным и базовым объектам биотехнологии, области их применения, принципам ...»

-- [ Страница 6 ] --

coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки S. coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода, синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные.

Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода.

3 Получение новых вакцин.

Развитие в последние десятилетия генно-инженерных технологий совершило революцию и в деле разработки и производства новых вакцин. При помощи методов молекулярной биологии и генети ческой инженерии были идентифицированы антигенные детерми нанты многих инфекционных агентов, клонированы гены, кодиру ющие соответствующие белки и, в ряде случаев, налажено произ водство вакцин на основе белковых субъединиц этих антигенов.

Классическим примером рекомбинантной вакцины, полученной с помощью микроорганизмов, служит производство поверхностного антигена гепатита В. Вирусный ген HBsAg был встроен в дрожжевую плазмиду, в результате чего в дрожжах в больших количествах стал синтезироваться вирусный белок, который после очистки используется для инъекций в качестве эффективной вакцины против гепатита.

Десять лет назад выдвинута концепция использования трансгенных растений для производства так называемых «съедобных» вакцин (edible vaccines). Действительно, если какой либо съедобный орган растения будет синтезировать белок-антиген, обладающий сильными оральными иммуногенными свойствами, то при употреблении этих растений в пищу параллельно будет усваиваться и белок-антиген с выработкой соответствующих антител.

Получены растения табака, несущие ген, кодирующий антиген оболочки вируса гепатита В под растительным промотором.

Наличиеантигена в листьях трансгенных растений подтверждено иммуноферментным анализом. Показано сходство физико химического строения и иммунологических свойств образующегося рекомбинантного антигена и антигена сыворотки человека.

Идентификация антител, продуцируемых в растениях, показала возможность сборки двух рекомбинантных генных продуктов в одну белковую молекулу, что невозможно в прокариотических клетках.

Сборка антител происходила, когда обе цепи были синтезированы с сигнальной последовательностью. При этом, наряду с возможностью введения двух генов в одно растение, возможно также соединение индивидуальных полипептидных цепей, синтезируемых в разных трансгенных растениях, в полноценный белок при гибридизации этих двух растений. Возможно введение нескольких генов на одной плазмиде.

Трансгенные растения-продуценты аутоантигенов могут использоваться также при других аутоиммунных болезнях, таких как множественный склероз, ревматический артрит, инсулинозависимый диабет и даже отторжения при трансплантации органов. Инсулинозависимый диабет является аутоиммунным заболеванием, при котором продуцирующие инсулин клетки поджелудочной железы разрушаются собственными цитотоксичными Т-лимфоцитами. Оральное профилактическое потребление значительных количеств иммуногенных белков может привести к предохранению и значительной задержке появления симптомов аутоиммунных болезней. Однако оно возможно только при наличии значительного количества аутоантигенов. Белки инсулин и панкреатическая декарбоксилаза глютаминовой кислоты рассматриваются в качестве оральных вакцин для предотвращения инсулинозависимого диабета. Недавно ученые получили трансгенные растения картофеля, синтезирующие панкреатическую декарбоксилазу глютаминовой кислоты. При скармливании предрасположенным к диабету мышам отмечено как снижение встречаемости диабета, так и величины аутоиммунного ответа.

Приведенные выше результаты генно-инженерных разработок убедительно свидетельствуют о возможности создания «съедобных»

вакцин на основе трансгенных растений. Работы в этом направлении активно продолжаются, а идея использования растений для производства вакцин уже запатентована в США, что свидетельствует о коммерческом интересе к этим разработкам.

Еще одна важная проблема, связанная с разработкой «съедобных» вакцин – уровень экспрессии гетерологичного антигена в растениях. Поскольку при пероральном введении вакцины требуются большие количества антигена, чем при парентеральном, количество синтезируемого в растениях антигена, которое сейчас составляет не более 0,3% от общего растворимого белка, должно быть увеличено. В то же время уровень экспрессии должен быть достаточно высоким для того, чтобы вызывать иммунный ответ, но быть меньше уровня, который вызывает толерантность к антигену, как это происходит с веществами, потребляемыми с обычной пищей.

Как показывают эксперименты, уровень экспрессии гетерологичного антигена в растениях может быть увеличен путем использования тканеспецифичных промоторов и энхансеров, энхансеров транскрипции и трансляции, добавлением транспортирующих пептидов, а также путем изменения нуклеотидной последовательности соответствующих генов с использованием кодонов, предпочтительных для растений. Однако, вопрос о том, какие растения лучше использовать и в каком съедобном органе лучше экспрессировать антиген, требует дальнейших исследований, так как в различных растениях могут содержаться вещества, блокирующие или замедляющие иммунный ответ или просто токсичные для человека и животных, как, например, алкалоиды в клетках табака.

Ключевые слова и понятия инсулин актинородин сахарный диабет эритромицин -галактозидаза кластер генов ery С-пептид -лактоглобулин соматотропин «съедобные» вакцины карликовость аутоиммунные болезни пенициллин аральные вакцины ген синтетазы изопенициллина N тканеспецифические промоторы новые антибиотики предпочтительные кодоны ЛЕКЦИЯ 26. ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ 1 Получение трансгенных растений.

2 Применение методов генетической инженерии для улучшения хозяйственных свойств растений.

3 Повышение устойчивости растений к болезням и вредителям.

4 Перспективы использования трансгенных растений.

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомби нантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следова тельно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции.

Проблемы выращивания сельскохозяйственных растений связаны с перспективой ввода в них генов устойчивости к стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, генов скороспелости, а также с расширением круга культурных растений, способных к симбиотической фиксации азота и т.д. В клетках растений возможна экспрессия генов, перенесенных не только от других растений, но и от микроорганизмов и даже от животных.

Получение растений с новыми свойствами из отдельных трансформированных клеток возможно благодаря их свойству то типотентности, т.е. способности развиваться в целое растение.

Однако возможности генной инженерии растений ограничи ваются рядом причин. Во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих. Это значит, что определение и выделение искомых генов — задача очень трудная. Во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации.

1 Получение трансгенных растений.

Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки живот ных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуще ствляются главным образом благодаря специфическим структурам — векторам. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды — это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включения и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазмиды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по типу кодируемых опинов — специфических аминокислот, которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопиновая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида).

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраивает часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет ее таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, необходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens и послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды вектора, доставляющего необходимые гены в клетку.

Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах раститель ных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клетках растений. Т-область включает примерно 10% Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом — в области вирулентности — vir-области.

Т-области ограничены прямыми повторяющимися последова тельностями, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку.

Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений независимо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой культиви руются данные клетки. В связи с этим очень трудно регенерировать нормальное растение из клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостаток — большие размеры Ti-плазмиды, из-за которых затруднены какие-либо манипуляции с ней, поэтому вставить ген в плазмиду традиционными методами невозможно.

В настоящее время конструируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторный участок Т-области, а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений.

Существуют и другие бактерии (A. rhiwgenes), вызывающие уси ленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат ес тественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri плазмиды в данный момент рассматриваются как более перс пективные векторы.

В настоящее время на основе Ti-плазмид конструируются и другие типы векторов (например, промежуточный и бинарный векторы).

Благодаря появлению специфического объекта — изолированных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки, возникли методы прямого переноса генов в растение. К таким методам можно отнести:

трансформация растительных протопластов. Осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, пограничных областей Т-ДНК);

культуру протопластов на начальной стадии ее роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов;

микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток — 10-20 % независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение;

электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране;

упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами;

метод биологической баллистики. Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие частички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировка осуществляется с помощью баллистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.

2 Применение методов генетической инженерии для улучшения хозяйственных свойств растений.

В большинстве случаев запасные белки растений имеют несбалансированный для питания человека и животных аминокислотный состав. Так, запасные белки злаков — проламины — бедны лизином, триптофаном и треонином, что снижает их питательную и кормовую ценность. Улучшение аминокислотного состава белка путем традиционной селекции не дает желательных результатов, поскольку необходимые гены часто сцеплены с нежелательными признаками и наследуются вместе. Например, у мутантов кукурузы и ячменя повышение содержания лизина коррели ровало с уменьшением синтеза запасных белков и с уменьшением урожайности. Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, так как позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака.

Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов: 1) клонирование генов запасных белков;

2) изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и выявление последовательностей ДНК, определяющих данный механизм;

3) целенаправленное изменение последовательностей генов запасных белков для улучшения аминокислотного состава;

4) создание векторных конструкций, содержащих измененный ген;

5) введение модифицированных генов в растения.

В настоящее время клонированы 10 генов гордеинов ячменя, гены - и -глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. Имеются практические результаты трансформации растений. Так, введение в геном пшеницы модифицированного гена проламина привело к активному синтезу модифицированного белка, а также повлияло на состав и уровень соответствующих запасных белков. В итоге улуч шилось хлебопекарное качество пшеничной муки.

Томаты, после того как достигают стадии зрелости, постепенно теряют упругость, становятся мягкими и загнивают. Это происходит из-за того, что находящийся у них в межклеточном пространстве пектин расщепляется под действием фермента полигалактуроназа. В ходе создания трансгенного сорта томатов генетики использовали так называемый феномен «замолкания», который происходит в результате введения в растения дополнительной копии структурного гена. В случае с томатами была произведена вставка антисмысловой (перевернутой) конструкции гена полигалактуроназы. В результате у полученного сорта Flavr Savr фермент полигалактуроназа образуется в пониженном количестве. Вследствие этого пектин разрушается значительно медленнее и зрелые томаты продолжительное время сохраняются в хорошем состоянии.

Сходным способом были созданы и трансгенные сорта картофеля с повышенным качеством крахмала. Чем меньше в крахмале полисахарида амилозы и больше амилопектина, тем выше качества крахмала. После успешного введения в картофель дополнительной копии гена амилозы (также в антисмысловой форме) этот менее ценный полисахарид в крахмале полученных трансгенных растений практически исчез.

В последние годы проведены работы по получению трансгенных масличных растений с измененным содержанием жирных кислот. Так в сою встроили ген, кодирущий антисмысловую конструкцию фермента омега-3 десатуразы, катализирующий синтез линоленовой кислоты из линолевой. Трансгенные растения характеризовались пониженным содержанием линолевой и повышенным – ценной олеиновой кислоты.

3 Повышение устойчивости растений к болезням и вредителям.

Устойчивость растений к фитопатогенам. Наибольший урон растениям наносят грибные, бактериальные и вирусные патогены. В растении существуют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степени (в зависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Начинается синтез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и -1,3-глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых видов бактерий, разрушая их клеточные стенки.

Применение методов генетической инженерии, использующих естественные защитные механизмы, позволяет получать трансгенные растения, устойчивые к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. Так, были получены трансгенные растения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хитиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивость трансгенных растений. В растения томатов был введен ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам. Перспективны клонирование и перенос генов, кодирующих специфические белки (small antibiotic-like proteins), содержащиеся в семенах многих растений. Эти белки защищают семена в период покоя и во время прорастания от грибных и бактериальных инфекций.

Успешно закончились эксперименты по повышению устойчивости табака к фитофторе (Phytophtora parasitica) путем встройке гена, кодирующего белок бета-криптогенин под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (один из самых эффективных промоторов). Трансгенные растения показали повышенную устойчивость к ряду рас данного гриба.

Другой подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у растений табака, трансформированных геном оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ).

Устойчивость растений к гербицидам. В настоящее время в сельском хозяйстве широко используют гербициды — химические соединения, применяемые для уничтожения сорной растительности.

Гербициды широкого спектра действия могут не только уничтожать сорняки, но и угнетать рост культурных растений. В связи с этим возникает необходимость в создании растений, устойчивых к этим веществам. Существует два подхода к решению этой проблемы:

прямая селекция устойчивых к гербицидам мутантных форм растений, или мутантных клеточных штаммов (клеточная селекция), и генно-инженерный метод, который состоит во введении в растения генов гербицид-резистентности растительного или бактериального происхождения.

Благодаря использованию методов генетической инженерии были созданы новые, устойчивые к различным гербицидам сельскохо зяйственные культуры. В геном этих культур вводились мутантные гены, кодирующие синтез ферментов, на которые гербициды (атразин, биалофос, бромоксилин, имидазол) не оказывают негативного действия. Например, растения лядвенца рогатого (Lotus comiculatus) были трансформированы с помощью штамма А281/рСВЕ21. Эта бактерия содержит плазмиду со встроенным геном bar, кодирующим фермент, придающий устойчивость к гербициду биалофосу (фосфинотрицин). Трансгенные растения содержат ген bar и невосприимчивы к гербициду. Однако в тканях таких растений наблюдается накопление гербицидов, и использовать эти растения можно только в технических целях. Вместе с тем показано, что введение генов, кодирующих другие ферменты, позволяет проводить детоксикацию гербицидов, создавая, таким образом, растения, пригодные в пищу.

Изучая механизмы действия гербицидов, генетики выяснили, что чаще всего они действуют на какой либо один важный для растения фермент, прикрепляются к нему и тем самым ослабляют его работу.

Это приводит к нарушению роста и развития растений, и они погибают. Установлено, что толерантность к гербицидам обусловлена мутацией одного гена. Основной механизм устойчивости связан с изменением последовательности аминокислот в той части молекулы фермента, в которой происходит его связывание с гербицидом. В результате гербицид не узнает свою «мишень» в структуре фермента, последний сохраняет свою функциональную активность, а организм становится толерантным к действию гербицида. Описанный механизм получил название «мутация мишени» и характерен для устойчивости к таким гербицидам, как Раундап (глифосат), сульфанилтиомочевина и др.

Гербицид глифосат относится к гербицидам общего действия. Его мишенью в растении является фермент EPSPS (енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза), который играет важную роль в синтезе ароматических аминокислот. Под действием глифосата неустойчивые к нему растения из-за недостатка ароматических аминокислот погибают в течение двух недель. Необходимо подчеркнуть, что глифосат не несет опасности для животных и человека, так как его «мишень» EPSPS имеется только у растений, грибов и бактерий.

В результате генетических исследований были обнаружены бактерии, у которых из-за точковой мутации произошла замена одной аминокислоты в области фермента EPSPS, где происходит его связывание с гербицидом глифосатом. Поэтому гербицид не может дезактивировать такой мутантный фермент, и бактерии устойчивы к его действию. В настоящее время выделены гены EPSPS с мутацией мишени от бактерий рода Agrobacterium (ген cp4), Salmonella (ген sm1) и др. Например, в более чем 1000 полученных трансгенных сортах сои, устойчивых к глифосату, встроен мутантный ген cp4 от почвенной бактерии Agrobacterium tumefascens. Для доставки гена EPSPS к хлоропластам (месту синтеза ароматических аминокислот) к нему присоединен фрагмент ДНК от петунии, кодирующий небольшой транзитный пептид. Таким образом, генетически модифицированные сорта сои отличаются от обычных тем, что у них фермент EPSPS, привнесенный от гена бактерии, не связывается с гербицидом, что делает эти сорта устойчивыми к глифосату.

Хлоропластный транзитный пептид от петунии быстро разрушается в процессе переваривания и также не несет опасности для организма животных и человека.

Устойчивость растений к насекомым. Еще в 30е годы ХХ века было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтезируют специфический белок — так называемый Bt-протеин (Bt-токсин, дельта-эндотоксин) высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщепляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Необходимо отметить, что Bt-протеин, выделенный из одного определенного штамма бактерии, способен убивать только определенный тип насекомых, например, жуков, и не действует на пчел, бабочек и др.

Поэтому препараты, широко используемые в сельском и лесном хозяйстве для борьбы с различными насекомыми-вредителями в соответствии со спектром действия носят названия колептерин, лепидоцид, дендролин и др. Еще одним важным достоинством этих препаратов является их полная безопасность для здоровья как теплокровных и человека (пищеварительная система у них устроена иначе, чем у насекомых), так и для окружающей среды (высокая специфичность действия, быстро разрушаются под действием ультрафиолета, не способны накапливаться в растениях и почве, легко смываются с листьев). Однако, Bt-препараты способны защищать растения только очень короткое время и поэтому слабоэффективны.

Эта проблема была решена с помощью получения трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям.

Ген, кодирующий синтез Bt-протеина, был выделен из генома В.

thurengiensis и в ряде случаев существенно модифицирован. Затем соединен с необходимыми регуляторными элементами и с помощью векторов встроен в различные виды сельскохозяйственных растений.

Чаще всего используют выделенные из разных штаммов В.

thurengiensis Bt-гены cryIA(b) для кукурузы, cryIIIA для картофеля, cryIA(с) для хлопчатника. При создании устойчивых к насекомым вредителям сельскохозяйственных сортов генетики использовали не вирусные, а растительные промоторы. Так, в Bt-кукурузе использован промотор гена фосфоенолпируваткарбоксилазы самой же кукурузы, который обеспечивает экспрессию Bt-генов исключительно в зеленых тканях растений (листьях, стеблях). Именно благодаря этому Bt протеина нет в зрелом зерне и силосе. Для создания Bt-картофеля использован промотор фермента рибулозо-1-5 бифосфаткарбоксилазы из растения арабидопсиса. Bt-ген, регулируемый этим фоточувствительным промотором, работает на свету в тысячу раз сильнее, чем в темноте, поэтому в клубнях Bt протеина образуется в 100 раз меньше, чем в листьях. Эти данные свидетельствуют, что созданные трансгенные сорта картофеля и кукурузы не содержат в своем урожае продуктов привнесенного бактериального гена и соответственно, безопасны для человека и животных.

4 Перспективы использования трансгенных растений.

Скорость, с которой генно-инженерная биотехнология осваивает новые рубежи, потрясает. Ученые настроены чрезвычайно оптимистично. Вдохновенно обсуждают и реализуют планы применения генной инженерии для получения чудо-растений. В настоящее время уже получены трансгенные формы томатов (более 260), сои (более 200), хлопчатника (более 150), тыквенных растений (более 80), табака (более 80), а также пшеницы, риса, подсолнечника, огурцов, салата, яблонь и других (более 70). Большинство созданных трансгенных растений (или растений первого поколения) содержат гены устойчивости к насекомым-вредителям и гербицидам.

В последнее время разрабатывается проект введения в зерновые культуры группы генов nif из бактерий, способных усваивать атмосферный азот. Это позволит избавиться от необходимости вносить в почву азотные удобрения. Однако, встраивать в зерновые необходимо целый комплекс по-крайней мере из 17 бактериальных генов. Кроме того, нужно заставить «работать» все эти гены в чужеродном для них геноме (например, пшеницы), что существенно усложняет задачу.

Одним из перспективных направлений генной инженерии является создание способных растений-биореакторов, продуцировать белки, необходимые в медицине, фармакологии и др.

К достоинствам растений-биореакторов относится отсутствие необходимости в кормлении и содержании, относительная простота создания и размножения, высокая продуктивность. Кроме того, чужеродные белки не вызывают иммунных реакций у растений, чего трудно добиться у животных.

Получение лактоферрина из молока крупного рогатого скота, вследствие его низкого содержания, приводит к высокой стоимости препарата. При введении кДНК гена лактоферрина в клетки табака получен ряд каллусных тканей, синтезирующих укороченный лактоферрин, антибактериальные свойства которого были значительно сильнее антибактериальных свойств нативного лактоферрина. Концентрация этого укороченного лактоферрина в клетках табака составляла 0,6-2,5%.

Одним из новейших направлений, в котором успешно используются трансгенные растения, является фиторемедиация – очистка почв и грунтовых вод от тяжелых металлов, радионуклидов и других загрязнителей. Собственно фиторемедиация перспективна в основном для очистки почвы и воды от тяжелых металлов, но различные вредные органические соединения разлагают в основном не растения, а микроорганизмы, обитающие в их ризосфере.

Разложение органических соединений у бактерий чаще всего контролируют D-плазмиды или плазмиды деградации. Они разлагают такие соединения, как салицилат, нафталин, камфора, октан, толуол, ксилол, бифенил и т.д. D-плазмиды могут контролировать как начальные этапы разрушения органического соединения, так и полное его разложение.

Устойчивые к ртути бактерии экспрессируют ген mer A, кодирующий белок переноса и детоксикации ртути.

Модифицированную конструкцию гена mer А использовали для трансформации табака, рапса, тополя, арабидопсиса. В гидропонной культуре растения с этим геном извлекали из водной среды до 80% ионов ртути. При этом рост и метаболизм трансгенных растений не подавлялись. Устойчивость к ртути передавалась в семенных поколениях.

При интродукции трех модифицированных конструкций гена mer А в тюльпанное дерево (Liriodendron tulipifera) растения одной из полученных линий характеризовались быстрым темпом роста в присутствии опасных для контрольных растений концентраций хлорида ртути. Растения этой линии поглощали и превращали ртуть в менее токсичную элементарную форму и испаряли до 10 раз больше ионной ртути, чем контрольные.

В ходе проведенных исследований было показано, что небольшие белки млекопитающих – металлотионины, способные связывать тяжелые металлы, хорошо функционируют в растениях.

Исследователи получили трансгенные растения с встроенными генами металлотионинов (hMTI) и установили, что эти растения были более устойчивыми к кадмию, чем контрольные. Трансгенные растения с hМТII геном млекопитающих имели на 60-70% ниже концентрацию кадмия в стеблях по сравнению с контролем.

В другом успешном эксперименте симбиотическому азотфиксатору люцерны Rhizobium meliloti был встроен ряд генов, осуществляющих разложение бензина, толуина и ксилена. Следует подчеркнуть, что глубокая корневая система люцерны позволяет очищать почву, загрязненную нефтепродуктами, на глубину до 2-2. метров.

По данным Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР), потенциальный рынок биоремедиации составляет более 75 млрд долл. Ускоренное внедрение биотехнологий для защиты окружающей среды вызвано, в частности, тем, что они гораздо дешевле других технологий очистки.

Ключевые слова и понятия тотипотентность антисмысловая конструкция Agrobacteria tumefaciens ген амилозы Ti-плазмиды омега-десатураза Т-область фитопатогены vir-область хитиназы, глюконазы опины промотор 35S Ri-плазмиды мутация мишени электропорация фермент EPSPS упаковка в липосомы транзитный пептид биологическая баллистика Bt-протеин проламины, глиадины, гены cry гордеины, зеины, легумины гены nif полигалактуруназа фиторемедиация феномен «замолкания» металлотионины ЛЕКЦИЯ 27.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ Одной из проблем, с которой столкнулась генетическая инженерия, является настороженное, а иногда и негативное отношение значительной части населения к трансгенным организмам и продуктам из них. Этому способствует появление в средствах массовой информации публикаций, в которых утверждается, что трансгенная продукция вредна для человека, поскольку она может быть токсичной или содержать аллергены, а сами трансгенные растения несут угрозу для экологии и т. п.

Потенциальный риск, связанный с выращиванием генетически модифицированных растений, может проявиться, во-первых, в экологических последствиях их выращивания и, во-вторых, в качестве трансгенных продуктов. В отношении продуктов питания, получаемых на основе трансгенных растений, вызывает беспокойство возможный повышенный уровень в них токсических веществ, изменение содержания питательных веществ в худшую сторону, появление новых аллергенов.

К настоящему времени на рынок выпущено значительное количество генно-инженерных продуктов. Однако каких-либо новых неожиданных, научно доказанных рисков пока никем не установлено.

Уже с появлением первых сконструированных рекомбинантных молекул ДНК ученые и общественность потребовали разработать самые жесткие меры безопасности по использованию ДНК технологий в практических целях. Такие инструктивные материалы и законодательные акты сейчас разработаны во всех странах, где ведутся генно-инженерные исследования и создаются трансгенные сорта растений. Еще на стадии создания генетически мо дифицированных организмов осуществляется строгий контроль за тем, чтобы вносимый ген не синтезировал заведомо какой-либо токсичный или аллергенный компонент. После создания трансгенного растения, продуцируемые им продукты также изучаются в лабораторных условиях. Разработчик должен доказать, что в новом продукте содержание ранее известного токсичного компонента не превышает прежний уровень, что в нем отсутствуют новые вредные компоненты и что питательные качества продукта не снизились.

Кроме того, при выпуске на рынок генетически модифицированные продукты, так же как и любые другие полученные химическим или иным способом (фармакологические препараты, пищевые красители, консерванты, сахарозаменители.

удобрения, стимуляторы роста и т. д.), проверяются специальными службами. Они испытываются на токсичность, отсутствие канцерогенных эффектов и другие показатели. Поэтому трансгенная продукция, пройдя подобные испытания, становится не более опасной, чем любая другая. Что касается вредного влияния генети чески измененных организмов на экологию, то здесь однозначного ответа пока нет, и теоретически такая проблема существует.

Может быть рассмотрено несколько аспектов возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду:

- перенос трансгенов от культурных растений к их диким сородичам и их дальнейшее неконтролируемое распространение в живой природе;

- передача сорнякам путем гибридизации устойчивости к гербицидам, что может привести к распространению гербицидоустойчивых сорняков;

- выработка трансгенными растениями веществ, которые могут стать токсичными для организмов, не являющихся их мишенями, живущих на этих растениях или питающихся ими;

- создание новых паразитов или усиление вредности уже существующих;

- неконтролируемое распространение генов устойчивости к антибиотикам, которые используются в векторных конструкциях и вводятся в растения в качестве селективных маркеров для отбора трансформантов.

Однако результаты специальных исследований и уже более чем 10-летний опыт работы с трансгенными растениями свидетельствуют об отсутствии убедительных данных о вредном влиянии трансгенных растений на окружающую среду и здоровье человека.

Риск, связанный с ДНК-технологиями, аналогичен риску, связанному с немодифицированными организмами или модифицированными другими генетическими методами (получение отдаленных гибридов, мутантных форм и т.п.).

Исследования показывают, что экологический риск при выращивании трансгенных растений можно сравнить с риском испытания новых обычных селекционных сортов. Все соединения, которые появляются в трансгенных растениях, как правило, уже существуют в природе. Существует определенный риск переноса генов гербицидоустойчивости в сорную растительность в процессе случайного скрещивания их с гербицидоустойчивыми трансгенными растениями. Однако уже давно известно, что при длительном использовании гербицида такие сорняки могут появляться и в обычных условиях. В этом случае просто используют другой гербицид, к которому данный сорняк был чувствителен. Не лишены основания и доводы в отношении других возможных негативных эффектов трансгенных растений на природу. В принципе возможен обмен генов между сконструированными растениями и родственными им культурными и дикими видами, что в отдаленном будущем может сказаться на стабильности сложившихся экосистем. Сегодня из-за сравнительно короткого срока использования трансгенных растений мы не можем предсказать и вероятные другие отдаленные последствия, могущие негативно повлиять на окружающую среду.

Поэтому, чтобы исключить неконтролируемое использование ГИ организмов, международные организации и отдельные страны разработали ряд документов, в том числе и законодательных, направленных на предупреждение или максимальное снижение возможных неблагоприятных экологических последствий и риска для здоровья человека от использования генно-инженерных биотехнологий.

Согласно Конвенции о биологическом разнообразии, принятой в 1992 году в Рио-де-Жанейро, каждая страна, подписавшая Конвенцию, должна принимать меры в области использования биологических ресурсов с тем, чтобы свести к минимуму неблагоприятное воздействие на окружающую среду. В рамках Конвенции разработан международный протокол по биобезопасности (Картахенский протокол, 2000 год).

Страны Западной Европы, большинство стран Восточной Европы и стран СНГ уже разработали и приняли для исполнения соответствующие законодательные акты по биобезопасности, разрабатываются национальные системы биобезопасности.

В 2002 году Республика Беларусь приняла Закон о присоединении к Картахенскому протоколу, что обязывает нашу страну придерживаться положений и рекомендаций по биобезопасности, сформулированных в Протоколе. Для осуществления координации действий с международными организациями по проблемам биобезопасности Постановлением Со вета Министров Республики Беларусь еще в 1998 году при Институте генетики и цитологии НАН Беларуси создан Национальный координационный центр биобезопасности.

Ведется работа по созданию нормативной базы по биобезопасности. Подготовлен и находится на рассмотрении в парламенте проект Закона Республики Беларусь «О безопасности генно-инженерной деятельности». В нем сформулированы основные принципы биобезопасности работы с генетически модифицированными растениями и продуктами, созданными на их основе. Определены организационно-правовые основы государственного регулирования, полномочия республиканских орга нов государственного управления, порядок государственной экспертизы безопасности генетически модифицированных растений, их регистрации, высвобождения в окружающую среду, трансграничное перемещение, осуществление контроля и другие вопросы.

Все эти меры будут способствовать минимизации возможных вредных последствий от использования генно-инженерных биотехнологий, без которых человечество в 21 веке уже никак не сможет обойтись.

4 ТЕМАТИКА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ Занятие 1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Цель занятия: Дать представление об объектах биотехнологии, субстратах для их культивирования, ознакомиться с методами селекции биологических объектов, рассмотреть перспективы развития биотехнологии.

1 Микроорганизмы как основные объекты биотехнологии.

2 Селекция биотехнологических объектов.

3 Субстраты для культивирования биообъектов.

4 Сырьевые материалы и перспективы биотехнологии.

Тематика рефератов 1. Микроорганизмы как основные объекты биотехнологии (или Роль микроорганизмов как объектов биотехнологии).

2. Методы селекции биотехнологических объектов.

3. Применение химических и нефтехимических субстратов в биотехнологии.

Вопросы для самоконтроля 1. Назовите группы микроорганизмов, используемые в биотехнологии.

2. Перечислите основные этапы подбора микроорганизмов для использования в биотехнологии.

3. Почему особое внимание при подборе объектов биотехнологии уделяется мезофильным и термофильным организмам?

4. Перечислить методы селекции биотехнологических объектов 5. Какие соединения наиболее часто используются в качестве субстратов для культивирования объектов биотехнологии?

6. Назовите требования, которым должны удовлетворять субстраты, используемые в биотехнологии.

7. Что является источником природного сырья для биотехнологии?

8. Какие органические отходы используются в качестве сырья для биотехнологии?

9. Как в биотехнологии используются питательные вещества химического и нефтехимического происхождения?

4 ТЕМАТИКА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ Занятие 1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Цель занятия: дать представление об объектах биотехнологии, субстратах для их культивирования, ознакомиться с методами селекции биологических объектов, рассмотреть перспективы развития биотехнологии.

1 Микроорганизмы как основные объекты биотехнологии.

2 Селекция биотехнологических объектов.

3 Субстраты для культивирования биообъектов.

4 Сырьевые материалы и перспективы биотехнологии.

Тематика рефератов 1. Микроорганизмы как основные объекты биотехнологии (или Роль микроорганизмов как объектов биотехнологии).

2. Методы селекции биотехнологических объектов.

3. Применение химических и нефтехимических субстратов в биотехнологии.

Вопросы для самоконтроля 10. Назовите группы микроорганизмов, используемые в биотехнологии.

11. Перечислите основные этапы подбора микроорганизмов для использования в биотехнологии.

12. Почему особое внимание при подборе объектов биотехнологии уделяется мезофильным и термофильным организмам?

13. Перечислить методы селекции биотехнологических объектов.

14. Какие соединения наиболее часто используются в качестве субстратов для культивирования объектов биотехнологии?

15. Назовите требования, которым должны удовлетворять субстраты, используемые в биотехнологии.

16. Что является источником природного сырья для биотехнологии?

17. Какие органические отходы используются в качестве сырья для биотехнологии?

18. Как в биотехнологии используются питательные вещества химического и нефтехимического происхождения?

19. Назовите сырьевые материалы, наиболее широко используемые в биотехнологии?

Задание 1. Разобрать понятия: объекты биотехнологии, GRAS микроорганизмы, цианобактерии, Е. соli, термофилы, мезофиллы, ступенчатая селекция, индуцированный мутагенез, органоавтотрофы, литогетеротрофы, органогетеротрофы.

Задание 2. Обсудить перспективы развития микробиологической промышленности.

Объяснить следующие термины: генетическая Задание 3.

инженерия, селективная среда, селекция, штаммы-продуценты, биомасса, питательная среда, субстрат.

Тест 1. Выберите правильное определение биотехнологии как науки:

а) это наука о способах создания продуцентов биологически активных веществ на основе живых организмов.

б) это наука, изучающая продуценты биологически активных веществ, созданные на основе живых организмов.

в) это наука, которая изучает живые организмы и созданные на их основе биологически активные вещества.

2. В любом биотехнологическом процессе необходимо участие и взаимодействие между собой:

а) организма с организмом;

б) организма с субстратом;

в) организма с окружающей средой.

3. Назовите главное звено биотехнологического процесса:

а) биологический субстрат;

б) целевой продукт;

в) биологический объект.

4. Какие из ниже перечисленных объектов рассматриваются как основные объекты биотехнологии:

а) объекты растительного и животного происхождения;

б) микроорганизмы;

в) многокомпонентные ферментные системы клеток;

г) отдельные ферменты.

5. Назовите главный критерий, используемый при выборе биотехнологического объекта:

а) организмы должны обладать высокой скоростью роста;

б) организмы должны быть резидентными к посторонней микрофлоре;

в) способность организма синтезировать целевой продукт;

г) организмы должны обладать высокой конкурентоспособностью.

6. GRAS-микроорганизмы характеризуются:

а) патогенностью и токсичностью, не способны образовывать антибиотики;

б) патогенностью и токсичностью, способны образовывать антибиотики;

в) непатогенностью и нетоксичностью, не способны образовывать антибиотики;

г) патогенностью и нетоксичностью, способны образовывать антибиотики.

7. Синтетическая среда – это среда, в состав которой входят:

а) растительные добавки;

б) чистые химические соединения определенного состава;

в) мясной экстракт;

г) микробные добавки и химические соединения.

8. Литогетеротрофами называются:

а) организмы, использующие органические вещества как источники углерода;

б) организмы, употребляющие органические вещества как источники энергии;

в) организмы, для которых органические вещества служат и источниками энергии, и источниками углерода.

9*. Из нижеприведенных выберите критерии, которым должны удовлетворять субстраты.

а) недефицитность;

б) дешевизна;

в) природное происхождение;

г) присутствие в составе синтетических веществ.

10. Субстратом для бразильской «топливной программы»

является:

а) сахарная свекла;

б) древесина;

в) сахарный тростник;

г) кукуруза.

11. О каком из нижеприведенных веществ идет речь: «..один из самых распространенных биополимеров, составляет половину высушенной растительной массы, легко разрушается путем химического Примечание: * - тестовые задания, в которых правильных ответов может быть больше, чем один.

или ферментативного гидролиза»?

а) лигнин;

б) крахмал;

в) целлюлоза;

г) лигноцеллюлозный комплекс.

12. Меласса – это:

а) побочный продукт, образующийся при производстве сахара;

б) сыворотка, получаемая при производстве сыра;

в) побочный продукт хлебопечения.

13. Наилучшим субстратом для ферментации из компонентов нефти являются:

а) алканы с числом углеродных атомов от 2 до 10;

б) алканы с числом углеродных атомов от 10 до 20;

в) алканы с числом углеродных атомов от 20 до 30.

14*. Выберите сырьевые материалы, которые коммерчески выгодны и наиболее широко используются в биотехнологии:

а) солома;

б) метанол;

в) жом;

г) крахмал;

д) меласса;

е) молочная сыворотка;

ж) сырой сахар.

Занятие 2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И БИОТЕХНОЛОГИЯ Цель занятия: изучить роль микроорганизмов в получении пищевых продуктов, ознакомиться с производством молочных продуктов, хлебопродуктов, белковых продуктов, пищевых добавок и ингредиентов. Дать представление о бродильных производствах, рассмотреть основные стадии производства вина и пива.

1 Роль биотехнологии в получении пищевых продуктов.

2 Производство молочных продуктов.

3 Производство хлебопродуктов.

4 Бродильные производства, получение белковых продуктов, пищевых добавок и ингредиентов.

Тематика рефератов 1. Производство сыра.

2. Производство йогурта и масла.

3. Использование микроорганизмов в виноделии.

4. Изготовление пива.

5. Получение белковых продуктов и их применение в пищевой промышленности и сельском хозяйстве.

6. Производство пищевых добавок и ингредиентов (подкислители, аминокислоты, витамины, пигменты, усилители вкуса).

Вопросы для самоконтроля 1. Роль микроорганизмов в получении пищевых продуктов.

2. Что входит в состав коммерческих культур-заквасок?

3. Назовите этапы производства сыра.

4. Какие микроорганизмы используют в хлебопечении?

5. Назовите основные стадии пивоварения.

6. Назовите основные стадии производства вина.

7. Для чего в виноделии используют сернистый газ?

8. Что называется БОО, в чем заключаются его особенности?

9. Назовите официально разрешенный вид белковой пищи микробного происхождения.

Задание 1. Разобрать понятия: белок одноклеточных организмов, микопротеин, брожение, культура-закваска, ренин, бродильные производства.

Задание 2. Заполните таблицу.

Таблица 1. Сравнительные характеристики способов биотехнологического производства Маломасштабное Крупномасштабное производство производство Объем установки Стоимость продукции Тип продукции Основные направления биотехнологических исследований и разработок Стоимость научных исследований Задание 3. Обсудить причины, сдерживающие производство пищевых продуктов на основе БОО.

Объяснить следующие термины: ферментация, Задание 4.

ферментеры, витамины, аминокислоты, пигменты Тест 1. Выберите продукты, которые получают маломасштабным способом биотехнологического производства:

а) пищевые продукты;

б) белок одноклеточных организмов;

в) лекарственные препараты;

г) пищевые добавки.

2. Микопротеин – это:

а) продукт микробного белка;

б) растительный белок;

в) продукт грибного белка;

г) животный белок.

3*. Назовите микроорганизмы, которые участвуют в сквашивании молока.

а) стрептококки;

б) дрожжи;

в) молочнокислые бактерии;

г) плесневые гриб.

4. Какие вещества продуцируют бактерии, входящие в состав коммерческих культур-заквасок?

а) лимонную и молочную кислоты;

б) пропионовую кислоту и пахучие вещества;

в) молочную кислоту и пахучие вещества;

г) молочную и масленую кислоты.

5. На каком из нижеприведенных этапов производства сыра используют фермент ренин?

а) созревание;

б) створаживание молока;

в) засев молока молочнокислыми бактериями;

г) прессование в формы;

д) термообработка.

6. Каков процент содержания воды в составе мягких сыров?

а)13-34%;

б) 34-50%;

в) 50-60%;

г) 60-70%.

7. Назовите культуры бактерий, используемые в производстве сметаны и сливочного масла:

а) Streptococcus;

б) Lactobacillus;

в) Leuconostoc;

г) Propionlbacterium.

8. Какой злак является традиционным источником полисахаридов в пивоварении?

а) пшеница;

б) овес;

в) ячмень;

г) рожь.

9. Что называют солодом?

а) смесь продуктов гидролиза крахмала, полученная из проросшего ячменя;

б) водный раствор экстрактивных веществ растительного сырья, предназначенный к сбраживанию;

в) спиртовой раствор экстрактивных веществ растительного сырья.

10*. Для чего виноград до отжима окуривают сернистым газом?

а) для получения особых вкусовых качеств;

б) для подавления действия невинных дрожжей;

в) для предотвращения потемнения сока.

11. Как называется вторичное брожение, которому подвергаются первосортные вина при хранении?


а) лимонное;

б) молочнокислое;

в) спиртовое;

г) яблочно-молочнокислое.

12*. Назовите микроорганизмы, применяемые в восточной кухне для ферментации рыбы:

а) кислотообразующие бактерии;

б) плесневые грибы;

в) дрожжи.

13. Какие из нижеприведенных аминокислот получают по технологии ферментации?

а) метионин;

б) триптофан;

в) глутаминовая кислота;

г) аспарагиновая кислота.

14. Какой из нижеприведенных штаммов грибов используют в производстве микопротеина?

а) Saccharomyces cerevisiae;

б) Fusarium graminearum;

в) Botrytis cinerea.

Занятие 3. МЕДИЦИНА И БИОТЕХНОЛОГИЯ Цель занятия: дать представление о медицинской биотехнологии, ознакомиться с производством и применением антибиотиков, гормонов и ферментов. Рассмотреть свойства и применение иммобилизованных ферментов, ознакомиться с методом радиоиммунологического анализа.

1 Производство и применение антибиотиков.

2 Имуннологический анализ.

3 Производство и применение гормонов.

4 Ферменты.

Тематика рефератов 1. Производство и применение ампицилина и пеницилина.

2. Применение метода радиоиммунологического анализа в клинической медицине.

3. Производство и применение инсулина.

4. Производство и применение интерферонов и гормона роста.

5. Свойства и применение иммобилизованных ферментов.

Вопросы для самоконтроля 1. Когда зародилась медицинская биотехнология?

2. Назовите ряд проблем, связанных с применением природного пеницилина, которые удалось решить при помощи биотехнологии.

3. Назовите фазы культивирования продуцентов антибиотиков.

4. Расскажите о применении специфических опухолевых маркеров в диагностике злокачественных новообразований.

5. Как с помощью генной инженерии удалось решить проблему получения человеческого инсулина?

6. Что называют интерферонами, на какие группы они делятся?

7. Охарактеризуйте применение интерферонов.

8. Дайте определение инженерной энзимологии.

9. Назовите задачи инженерной энзимологии.

10. Какие ферменты называются иммобилизованными?

11. Назовите методы иммобилизации ферментов.

12. Каковы перспективы применения иммобилизованных ферментов?

Задание 1. Разобрать понятия: трофофаза, идиофаза, двухступенчатое культивирование, полусинтетические антибиотики, пенициллин, ампициллин, продуценты антибиотиков.

Задание 2. Заполните таблицу.

Таблица 1. Характеристика носителей иммобилизованных ферментов Носители Характеристика, примеры Органические:

1) природные 2) синтетические Неорганические Задание 3. Объяснить следующие термины: антибиотики, гормоны, гормон роста, инсулин, интерферон, иммобилизованные ферменты.

Тест 1.Медицинская биотехнология зародилась в 40-х годах с начала промышленного производства:

а) ампициллина;

б) гормона роста;

в) пенициллина;

г) инсулина.

2. Сколько фаз включает процесс культивирования продуцентов антибиотиков?

а) одну;

б) две;

в) три;

г) четыре.

3*. Назовите онкологические заболевания, диагностику которых осуществляют с помощью опухолевого маркера -фетопротеина:

а) гепатома;

б) тератома;

в) меланома;

г) лейкемия.

4. В каком году были проведены первые опыты по использованию инсулина для лечения диабета?

а) в 1915 г.;

б) в 1922 г.;

в) в 1937 г.;

г) в 1962 г.

5. В настоящее время инсулин получают:

а) из поджелудочной железы животных б) химическими способами;

в) генно-инженерными способами с помощью E. coli.

6*. Чем отличается инсулин человека от инсулина животных?

а) молекулярной массой;

б) аминокислотной последовательностью;

в) зарядом белка;

г) ничем не отличается.

7.* Назовите группы, на которые делят интерфероны:

а) лейкоцитарные интерфероны;

б) тромбоцитарные интерфероны;

в) иммунные интерфероны;

г) интерфероны фибробластов.

8. Сколько пар нуклеотидов входит в состав гена лейкоцитарного интерферона человека?

а) 320;

в) 847;

г) 514;

в) 191.

9. Чем секретируется гормон роста человека?

а) поджелудочной железой;

б) передней долей гипофиза;

в) надпочечниками.

10. Какова молекулярная масса белка соматотропина?

а) 22000;

б) 15500;

в) 10000;

г) 27700.

11. Выберите правильное определение иммобилизованных ферментов:

а) это ферменты, искусственно связанные с растворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства;

б) это ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, не сохраняющие свои каталитические свойства;

в) это ферменты, не связанные с носителем и не сохраняющие свои каталитические свойства;

г) это ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства.

12*. Назовите недостатки природных носителей иммобилизованных ферментов:

а) гидрофильность;

б) биодеградируемость;

в) полифункциональность;

г) высокая стоимость.

13*. Назовите методы иммобилизации ферментов:

а) химические;

б) биохимические;

в) биологические;

г) физические.

14. Какой из ниже приведенных ферментов используется для лечения тромбозов?

а) стрептокиназа;

б) аспарагиназа;

в) субтилизин;

г) химотрипсин.

Занятие 4. СТРУКТУРА ДНК, РНК И ЭТАПЫ РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ В КЛЕТКЕ Цель занятия: ознакомиться с составом ДНК и РНК, процессами репликации, транскрипции и трансляции на примере решения типовых задач.

1 Структура наследственного материала.

2 Реализация наследственной информации.

3 Свойства генетического кода.

Тематика рефератов 1. ДНК - материальный носитель наследственности.

2. Репликация ДНК и передача генетической информации.

3. Рибонуклеиновые кислоты (и-РНК, т-РНК, р-РНК), особенности строения и роль в биосинтезе белка.

Вопросы для самоконтроля 1. Что такое молекулярная генетика?

2. Строение ДНК и РНК.

3. Что такое гены?

4. Что такое репликация и какой принцип лежит в основе данного процесса?

5. Каким образом и где осуществляются процессы транскрипции и трансляции?

6. Как можно охарактеризовать генетический код?

7. Что такое стоп-кодоны?

Задание 1. Разобрать понятия: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), рибонуклеиновая кислота (РНК), информационная РНК (и РНК), транспортная РНК (т-РНК), биосинтез белка, генетический код, вырожденность кода.

Задание 2. Решите следующие задачи 1. Фрагмент одной цепи ДНК имеет следующий состав:

5’– АААТТЦЦГГГ–3’.

ДОСТРОЙТЕ ВТОРУЮ ЦЕПЬ.

2. Одна из цепочек молекулы ДНК имеет такую последовательность нуклеотидов: 5’–ТЦГАТТТАЦГ–3’.

Какую последовательность нуклеотидов имеет вторая цепочка той же молекулы?

3. Укажите порядок нуклеотидов в цепочке ДНК, образующейся путем самокопирования цепочки: 5’–ААТЦГЦТГАТ–3’.

Напишите последовательность нуклеотидов ДНК 4.

дополнительно к следующей: 5’–ТАГГЦТААТАГЦ–3’.

5. Участок цепи молекулы ДНК имеет такую последовательность нуклеотидов: 5’–АТЦАТАГЦЦГ–3’.

Какое строение будет иметь двухцепочечный участок молекулы ДНК?

6. Одна из цепей ДНК с последовательностью нуклеотидов 3’– АТТГЦТЦАА–5’ используется в качестве матрицы для синтеза и РНК. Какую последовательность нуклеотидов будет иметь и-РНК?

7. Выпишите последовательность оснований в и-РНК, образованной на цепи ДНК с такой последовательностью:

3’–ТТЦГАГТАЦЦАТ–5’.

8. Определите последовательность нуклеотидов участка молекулы и-РНК, которая образовалась на участке гена с последовательностью нуклеотидов:

3’–ЦАЦГАТЦЦТТЦТ–5’.

9. Фрагмент одной из цепей ДНК имеет следующую последовательность нуклеотидов:

3’–АААГАТЦАЦТАТТЦТГТТАЦТА–5’.

Напишите строение молекулы и-РНК, образующейся в процессе транскрипции на этом участке молекулы ДНК.

10. Образовавшийся участок молекулы и-РНК имеет следующий состав кодонов:

5’–ГЦГ-АЦА-УУУ-УЦГ-ЦГУ-АГУ-АГА-АУУ–3’.

Определите, какие коды ДНК будут кодировать эту и-РНК и в какой последовательности они будут располагаться?

11. Определите аминокислотный состав полипептида, который кодируется и-РНК следующего состава: 5’-ЦЦУЦЦЦЦЦАЦЦГ–3’.

12. Участок молекулы и-РНК имеет следующее строение:

5’–АГУАГАУУЦУУУ–3’.

В каком порядке расположатся аминокислоты в соответствующем участке белка, синтезируемого на этой РНК как на матрице?

13. Участок гена, кодирующего белок, состоит из последовательно расположенных нуклеотидов:

3’–ААЦГАЦТАТЦАЦТАТАЦЦААЦГАА–5’.

Определите состав и последовательность аминокислот в полипептидной цепи, закодированной в этом участке гена.

14. Участок гена, кодирующего одну из полипептидных цепей гемоглобина, состоит из кодов следующего состава:

3’–ГАЦЦАТГАА–5’.

Определите состав и последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

15. В систему для искусственного синтеза белка ввели т-РНК, имеющие антикодоны: ЦГА, УУА, АЦА, ЦЦА. Определите, какие аминокислоты смогут участвовать в биосинтезе белка?

16. Фрагмент молекулы адренокортикотропного гормона человека, вырабатываемого передней долей гипофиза, имеет структуру: – серин – тирозин – серин – метионин –. Определите перечень антикодонов в т-РНК, участвующих в биосинтезе фрагмента АКТГ.

17. Часть молекулы белка имеет такую последовательность аминокислот: – лизин – треонин – глицин – валин – аргинин –. Какие т-РНК (с какими антикодонами) участвуют в синтезе этого белка?

18. Участок гена имеет следующее строение:

3’–ЦГЦТЦААААТЦГ–5’.

Укажите строение соответствующего участка того белка, информация о котором содержится в данном гене. Как отразится на строении белка удаление из гена первого нуклеотида?


19. Определите порядок следования друг за другом аминокислот в участке молекулы белка, если известно, что он кодируется такой последовательностью нуклеотидов ДНК:

3’–ТГЦГТТТАТГЦГ–5’.

Как изменится ответ, если химическим путем из молекулы ДНК будет удален шестой нуклеотид?

20. Назовите последовательные мономеры участка молекулы белка, который синтезируется на основе информации, “записанной” в молекуле ДНК таким порядком нуклеотидов:

3’–ЦЦЦАААААГАТА–5’.

Как отразится на строении белка удаление из молекулы ДНК второго нуклеотида?

21. Какая последовательность аминокислот кодируется такой последовательностью нуклеотидов ДНК:

3’–АГТГТГААЦЦАГ–5’.

И какой станет последовательность аминокислот, если между третьим и четвертым нуклеотидами вставить тимин?

22. С какой последовательности аминокислот начинается белок, если он закодирован такой последовательностью нуклеотидов:

3’–ЦЦЦАТГГЦЦГГТ–5’.

А каким станет начало цепочки аминокислот синтезируемого белка, если под влиянием облучения четвертый нуклеотид окажется выбитым из молекулы ДНК?

23. Участок цепи белка вируса табачной мозаики состоит из следующих аминокислот: – серин – глицин – серин – изолейцин – треонин – пролин – серин –. В результате воздействия на и-РНК азотистой кислотой цитозин РНК превращается в гуанин.

Определите изменения в строении белка вируса после воздействия на и-РНК азотистой кислотой.

24. Какими последовательностями нуклеотидов информационной РНК кодируется следующая последовательность аминокислот белка:

– треонин – триптофан – тирозин – валин –?

25. Используя таблицу генетического кода, напишите участок ДНК, в котором закодирована информация о следующей последовательности аминокислот в белке: – аргинин – триптофан – тирозин – гистидин – фенилаланин –.

26. Начало цепи одного гистона имеет следующую аминокислотную последовательность: – аланин – аргинин – треонин – лизин –. Какова возможная структура начальных фрагментов и-РНК и двухцепочечной ДНК?

27. Первые 10 аминокислот в цепи В инсулина: фенилаланин – валин – аспарагиновая кислота – глутамин – гистидин – лейцин – цистеин – глицин – серин – гистидин –.

Определите структуру участка ДНК, кодирующего эту часть цепи инсулина.

28. Начальный участок цепи А инсулина представлен следующими пятью аминокислотами: – глицин – изолейцин – валин – глутамин – глутамин –. Определите структуру участка ДНК, кодирующего эту часть цепи инсулина.

29. Какой последовательностью нуклеотидов ДНК кодируется участок белка, если он имеет следующее строение: – аргинин – пролин – лейцин – валин – аргинин – ?

Задание 3. Объяснить следующие термины: ген, нуклеотид, репликация, транскрипция, рибосома, полисома, трансляция, триплет, кодон, стоп-кодон.

Тест Ниже приведены 5 правильных ответов для 10 первых задач (1 – 10). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. 3’- ТТТААГГЦЦЦ-5’.

–. 3’-ТТАГЦГАЦТА-5’.

–. 5’- АТЦАТАГЦЦГ-3’.

3’- ТАГТАТЦГГЦ-5’.

–. 3’-ААГЦУЦАУГГУА-5’.

–. 5’-УУУЦУАГУГАУААГАЦААУГАУ-3’.

–. 5’-ГУУЦУГУАУАГЦААУГА-3’ Тест Ниже приведены 5 правильных ответов для 10 задач (11 –20).

Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. Пролин – пролин – пролин – пролин.

–. Лейцин – лейцин – изолейцин – валин – изолейцин – триптофан– лейцин – лейцин.

–. Аланин, аспарагин, цистеин, глицин.

–. Один из вариантов решения: УУУ, УГА, ЦЦА, ЦАА, ГЦА.

–. После удаления из ДНК шестого нуклеотида аминокислоты в молекуле белка имеют следующий порядок: треонин – глутамин – тирозин.

–. Один из вариантов решения: АУУ, ГАУ, ЦАГ, ААА, ГЦА, ГАЦ.

Тест Ниже приведены 5 правильных ответов для 9 последних задач ( – 29). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. После вставки тимина белок имеет вид: серин – треонин – лейцин – глицин.

–. После воздействия азотистой кислотой цепь белка будет иметь следующее строение: цистеин – глутаминовая кислота – серин – изолейцин – глицин – серин. Это один из вариантов ответа.

–. Один из вариантов ответа: 3’- ГЦААЦЦАТАГТАААА-5’ 5’- ЦГТ ТГГ ТАТЦАТТТТ-3’.

–. Один из возможных вариантов решения:

3’-АААЦААЦТАГ Т ТГТАГАААЦАЦЦАТЦАГТА-5’ 5’-Т Т ТГТГ ГАТЦААЦАТЦТТ ТГТГ Г ТАГТ ЦАТ-3’ –. Один из вариантов решения: 3’-ГЦАГГАГААЦААГЦГ-5’ 5’-ЦГТЦЦТЦТTГ Т ТЦГЦ-3’ Тест Ниже приведены 5 правильных ответов для 10 первых задач(1 – 10). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. 3’-АГЦТАААТГЦ-5’.

–. 3’-АТЦЦГАТТАТЦГ-5’.

–. 3’-УААЦГАГУУУ-5’.

–. 3’-ГУГЦУАГГААГА-5’.

–. 3’-ЦГЦТГТААААГЦГЦАТЦАТЦТТАА-5’.

–. 3’-АУУЦУГУАУАГЦААУГА-5’ Тест Ниже приведены 5 правильных ответов для 10 следующих задач (11 –20). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. Серин – аргинин – фенилаланин – фенилаланин.

–. Лейцин – валин – лейцин.

–. Один из возможных вариантов ответа: АГА, АУА, АГГ, УАЦ.

–. После удаления из гена первого нуклеотида белок имеет вид:

аргинин – валин – лейцин.

–. При удалении из молекулы ДНК второго нуклеотида строение белка таково: глицин – фенилаланин – серин.

–. Один из возможных вариантов ответа: АГУ, ГУА, ГГГ, УАЦ.

Тест Ниже приведены 4 правильных ответа для 9 последних задач ( –29). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. После облучения начало цепочки белка: глицин – треонин – глицин.

–. Один из возможных вариантов решения: АЦУ-УГГ-УАУ-ГУУ.

–. Один из вариантов решения:

и-РНК: 5’-ГЦУ АГА АЦУ ААА-3’ ДНК : 3’-ЦГА ТЦТ Т ГА ТТТ -5’ 5’-ГЦТ АГА АЦТ ААА-3’.

–. Один из возможных вариантов решения:

3’-ЦЦА ТАА ЦАА ГТТ ГТЦ-5’ 5’-Г ГТ АТТ ГТТ ЦАА ЦАГ-3’ –. Один из возможных вариантов решения: ГЦУ-УГА-УАУ-ГГУ.

Тест 1. Что такое ген?

а) участок молекулы РНК, несущий информацию об одной полипептидной цепи;

б) участок молекулы ДНК, несущий информацию об одной полипептидной цепи;

в) участок молекулы ДНК, несущий информацию о двух полипептидных цепочках.

2. Что является единицей генетической или наследственной информации?

а) аминокислота;

б) белок;

в) ген.

3. Сколько различных аминокислот входит в состав белков?

а) 10;

б) 20;

в) 30;

г) 27.

4*. Выберите нуклеотиды, входящие в состав молекулы РНК.

а) аденин;

б) цитозин;

в) урацил;

г) тимин;

д) гуанин.

5*. Назовите компоненты нуклеотидов ДНК:

а) аминокислота;

б) рибоза;

в) дезоксирибоза;

г) остаток азотной кислоты;

д) азотистое основание;

е) остаток фосфорной кислоты.

6. Чему равен коэффициент специфичности ДНК у животных?

а) варьирует от 0,45 до 2,57;

б) варьирует от 0,54 до 0,81;

в) варьирует от 0,58 до 0,81.

7. Что называется репликацией?

а) синтез полипептидной цепи белков по матрице и-РНК;

б) процесс удвоения молекулы ДНК;

в) процесс считывания информации и-РНК с ДНК.

8. Какой тип РНК участвует в процессе транскрипции?

а) т-РНК;

б) и-РНК;

в) р-РНК.

9. Где протекает процесс трансляции?

а) в ядре;

б) на рибосомах;

в) на АГ.

10. Какой кодон называется инициирующим?

а) кодон, с которого начинается синтез полипептидной цепи;

б) кодон, определяющий вторую аминокислоту в полипептидной цепи;

в) кодон, терминирующий синтез белка.

11*. Из нижеприведенных выберите стоп-кодоны:

а) УАА;

б) ААГ;

в) АУГ;

г) ГАА;

д) УГА;

е) УАГ.

12. Сколько аминокислот кодируется только одним кодоном?

а) 1;

б) 2;

в) 3;

г) 5;

д) 7.

13*. Из нижеприведенных назовите аминокислоты, которые кодируются шестью триплетами:

а) серин;

б) лейцин;

в) пролин;

г) аргенин;

д) треонин.

14. Какой связью связаны между собой в цепи ДНК нуклеотиды?

а) металлической;

б) водородной;

в) фосфодиэфирной;

г) пептидной.

Занятие 5. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ (РЕСТРИКТАЗЫ I, II ТИПОВ), ДНК-ЛИГАЗЫ Цель занятия: ознакомиться с ферментами рестрикции и способами получения гибридной ДНК от различных организмов, освоить методы гибридизации ДНК на примере решения типовых задач.

1 Принцип действия и функция рестриктаз.

Тематика рефератов 1. История открытия рестриктаз.

2. Характеристика рестриктаз I и II типов.

3. Принцип действия и функция ДНК-лигаз.

Вопросы для самоконтроля 1. Какую функцию выполняют лигазы?

2. Что такое распознаваемые участки?

3. Приведите примеры известных вам рестриктаз.

4. Каким образом осуществляет разрезание фермент рестрикции EcoRI?

5. Что такое конструирование гибридных (рекомбинантных) ДНК?

Задание 1. Разобрать понятия: ферменты рестрикции, распознаваемые участки, липкие концы, ровные (тупые) концы, EcoRI, Sma I, Hind III, конструирование ДНК.

Задание 2. Решите предлагаемые задачи:

1. Имеется последовательность из 27 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава:

5`- ЦТГААТТАГГАТЦЦАГГЦААТАГТГТГ -3` 3`-ГАЦТТААТЦЦТАГГТЦЦГТТАТЦАЦАЦ-5` Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК?

2. Имеется последовательность из 24 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава:

5`-ТЦАГААТГЦТГГЦЦААГТАЦТТАГ-3` 3`-АГТЦТТАЦГАЦЦГГТТЦАТГААТЦ-5` Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК?

3. Ниже приведены две последовательности одноцепочечных молекул ДНК. Какую из них в двухцепочечной форме могут разрезать известные вам рестриктазы?

а) 5`-АЦТЦЦАГААТТЦАЦТЦЦГ-3` б) 5`-ГЦЦТЦАТТЦГААГЦЦТГА-3` 4. Ниже приведены три последовательности одноцепочечных молекул ДНК. Какую из них в двухцепочечной форме могут разрезать известные вам рестриктазы?

а) 5`-ТАГГЦТААГЦТТАЦЦГАТ-3` б) 5`-ЦГААТАТТТЦЦГГАТГАА-3` в) 5`-АГГТЦЦТТАТЦЦГАТААТТ-3` Рестрикционный фермент Hpa II разрезает ДНК по 5.

последовательности ЦЦГГ. Какова средняя длина фрагментов разрезанной ДНК?

6. Рестрикционный фермент EcoRI разрезает ДНК по последовательности ГААТТЦ. Насколько часто этот фермент будет разрезать двухцепочечную ДНК?

7. Если последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК распределяется случайным образом, то какова будет средняя длина фрагмента при разрезании ДНК рестриктазами, узнающими последовательность из восьми нуклеотидов?

8. Гаплоидный геном человека содержит около нуклеотидных пар ДНК. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено при разрезании человеческой ДНК рестрикционным ферментом NotI, узнающим октамерную последовательность ГЦГГ- ЦЦГЦ?

9. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено при разрезании человеческой ДНК рестикционным ферментом Sma I?

10. Гаплоидный геном дрожжевого грибка Saccharomyces cerevisiae, состоящий из одной хромосомы, содержит около 13,5 нуклеотидных пар ДНК. Если вы порежете эту ДНК ферментом EcoRI, то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

11. Гаплоидный геном Saccharomyces cerevisiae (13,5 106 н. п.) разрезали ферментом HaeIII. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

12. Геном кишечной палочки Escherichia coli, представляющий собой одну кольцевую хромосому, содержит около 4,7 106 н. п. Его разрезали ферментом HaeIII. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

13. Геном Drosophila melanogaster, состоящий из четырёх хромосом, содержит около 108 нуклеотидных пар ДНК. Если вы порежете эту ДНК ферментом EcoRI, то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено?

14. Ниже приведены последовательности двух фрагментов ДНК, выделенных из организмов разных видов.

5`-АААГЦТТЦТГААТЦЦГАТЦГ-3` 3`-ТТТЦГААГАЦТТАГГЦТАГЦ-5` 5`-ГТАЦТЦАГАТЦЦТАГГАТААГЦТТА-3` 3`-ЦАТГАГТЦТАГГАТЦЦТАТТЦГААТ-5` С помощью каких ферментов можно получить гибридную молекулу ДНК из этих фрагментов? Опишите последовательные этапы получения гибридной молекулы.

15. Опишите последовательные этапы получения гибридной ДНК из представленных ниже фрагментов.

5`-ТАЦТАТЦЦГГАГТАГГАТЦЦТ-3` 3`-АТГАТАГГЦЦТЦАТЦЦТАГГА-5` 5`-ЦГГАТЦЦТАГАТТЦЦАТА-3` 3`-ГЦЦТАГГАТЦТААГГТАТ-5` Задание 3. Объяснить следующие термины: рестриктазы, сайт рестрикции, ДНК-лигаза, гибридные (рекомбинантные) ДНК.

Тест Ниже приведены 4 правильных ответа для 8 задач (1–8).

Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. В приведенной ДНК имеется один участок распознавания:

ГГАТЦЦ для рестриктазы Bam I (см. таблицу на стр. 18). Поэтому ДНК может быть разрезана в одном месте с образованием двух фрагментов.

–. Рестриктаза EcoR I может разрезать фрагмент а.

–. Частота встречаемости четырехнуклеотидного фрагмента ЦЦГГ составит (1/4)4 = 1/256. Таким образом, средняя длина фрагментов ДНК при разрезании Hpa II составит 256 нуклеотидных пар.

–. Средняя длина фрагментов ДНК при разрезании рестриктазами, узнающими восьминуклеотидную последовательность, составит 65536 нуклеотидных пар.

–. Средняя длина фрагментов при разрезании рестриктазами составит 53637 нуклеотидных пар.

Тест Ниже приведены 4 правильных ответа для 7 задач (9–15).

Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. Должно получиться 732422 + 23 =732445 рестрикционных фрагментов.

–. 52734 + 1 =52735 фрагментов.

–. 24414 + 4.

–. Bam I может разрезать фрагменты с образованием липких концов, а ДНК-лигаза скрепит их в одну молекулу.

–. 52734 фрагментов.

Тест Ниже приведены 4 правильных ответа для 8 задач (1–8).

Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. ДНК может быть разрезана в одном месте рестриктазой Hae III с образованием двух фрагментов.

–. Фрагменты а и б могут быть разрезаны рестриктазами Hind III и Hpa II соответственно.

–. Средняя длина фрагментов ДНК при разрезании EcoRI составит 4096 нуклеотидных пар.

–. В результате полного расщепления человеческой ДНК рестриктазой Not I должно получиться 45776 + 23 = фрагментов.

–. Средняя длина фрагментов ДНК при разрезании EcoRI составит 2055 нуклеотидных пар.

Тест Ниже приведены 3 правильных ответа для 7 задач (9–15).

Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют.

–. 3296 + 1 = 3297 фрагментов.

–. 18359 рестрикционных фрагментов.

–. С помощью Hind III можно разрезать оба фрагмента ДНК с образованием липких концов АГЦТ. Затем при смешении фрагментов липкие концы скрепятся между собой за счет водородных связей, а окончательную сшивку в единую гибридную молекулу произведет ДНК-лигаза.

–. 22575 рестрикционных фрагментов.

Тест 1. Назовите функцию, которую выполняют ДНК-лигазы:

а) доставка чужеродной ДНК в клетку;

б) разрезание ДНК;

в) сшивание двух фрагментов ДНК с образованием полной структуры.

2. Рестриктазы действуют на:

а) одноцепочечную ДНК;

б) одноцепочечную РНК;

в) двуцепочечную ДНК.

3. Какова длина распознаваемых рестриктазами участков ДНК?

а) 2-3 пары нуклеотидов;

б) 4-8 пар нуклеотидов;

в) более 8 пар нуклеотидов.

4*. Как называется место, в котором рестриктаза разрезает ДНК?

а) сайт рестрикции;

б) сайт узнавания;

в) сайт расщепления;

г) распознаваемые участки.

5. Назовите бактерию, из которой была выделена рестриктаза EcoR I:

а) Bacillus amyloliquefaciens;

б) Escherichia coli;

в) Haemophilus haemolyticus;

д) Bacillus subtilis.

6. Рестриктазы действуют:

а) только на ДНК бактерий;

б) только на ДНК вирусов;

в) на ДНК растений и животных;

г) им безразлично, чью ДНК разрезать.

7*. Выберите рестриктазы, которые разрезают ДНК с образованием тупых концов:

а) Bam I;

б) Sma I;

в) Hae III;

г) Hind III;

д) Hpa II.

8. Назовите сайт узнавания для рестриктазы EcoR I:

а) 5`-Г-А-А-Т-Т-Ц-3` 3`-Ц-Т-Т-А-А-Г-5` б) 5`-Г- Г-А-Т-Ц-Ц-3` 3`-Ц-Ц-Т-А-Г-Г-5` в) 5`-Ц-Ц-Ц -Г-Г- Г-3` 3`-Г-Г- Г- Ц-Ц-Ц-5` г) 5`-Ц-Ц-Г-Г-3` 3`-Г-Г-Ц-Ц-5`.

9. Какая из нижеприведенных рестриктаз узнает последовательность ДНК 5`-Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-3` 3`-Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-5`?

а) Hae III;

б) Hind III;

в) Hpa II;

г) Bam I;

д) Sma I.

10. Сколько рестриктаз известно в настоящее время?

а) более 120;

б) более 300;

в) более 500;

г) около 1000.

11. Какую связь лигируют ДНК-лигазы?

а) водородную;

б) фосфодиэфирную;

в) пептидную.

12. На сколько частей рестриктаза EcoR I разрежет предлагаемую последовательность ДНК из 23 нуклеотидов:

5- ГГТТЦАГАГААТТЦАЦГТААТЦЦ-3?

3- ЦЦААГТЦТЦТТААГТГЦАТТАГГ- а) на 2 части;

б) на 3 части;

в) на 4 части;

г) не разрежет.

13. Какая из нижеприведенных рестриктаз может разрезать данную последовательность ДНК:

5 - ЦГГЦАТТГЦАТГТТАГЦЦГГТАГЦЦ- 3 -ГЦЦГТААЦГТАЦААТЦГГЦЦАТЦГГ- а) Sma I;

б) Hae III;

в) Bam I;

г) Hpa II;

д) Hind III.

14. Назовите нуклеотиды, образующие липкие концы при разрезании молекулы ДНК рестриктазой EcoR I:

а) ААТТ ТТАА б) ГААТТ ЦТТАА в) ГААТ ЦТТА г) ГААТТЦ ЦТТААГ.

Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ.

Цель занятия: ознакомиться с плазмидными, фаговыми и космидными векторами, освоить методы введения и клонирования чужеродных ДНК с помощью векторов на примере решения типовых задач, получить представление о геномных библиотеках и способах их создания на примере решения типовых задач.

1 Векторы и их применение.

2 Простейшие плазмидные векторы pSC101 и pBR322.

3 Плазмидные векторы усложненной конструкции.

4 Получение векторов с использованием фага.

5 Строение космид.

6 Создание генных библиотек и их использование.

Тематика рефератов 1. Векторы прокариот и методы их введения в клетки.

2. Плазмидные векторы и принципы клонирования в космидах.

3. Векторы на основе бактериофагов, принципы клонирования.

Вопросы для самоконтроля 1. Что такое векторы и какое применение они находят в генной инженерии?

2. Что такое плазмида?

3. Какими свойствами должны обладать плазмиды как векторы?

4. Дайте характеристику плазмидам pSC101 и pBR322.

5. Опишите строение и свойства плазмиды типа pUC.

6. Назовите виды векторов.

7. Каков недостаток плазмид как векторов?

8. Как конструируются специальные штаммы ?

9. Назовите этапы клонирования фрагмента ДНК.

10.Что называют космидами и каково их строение?

11.Что такое cos-сайты.

12. Как происходит составление геномных библиотек?

Задание 1. Разобрать понятия: маркер для селекции, реципиентный организм, трансформированные организмы, гены устойчивости, участок множественного клонирования, кольцевая молекула ДНК, чужеродная ДНК, самостоятельная репликация.

Задание 2. Решить предлагаемые задачи:

1. Ниже приведён фрагмент ДНК, можно ли встроить его в плазмиду pSC101?

5`-АГГЦЦТГААТТААГГЦААТАГТГТГААТЦА-3` 3`-ТЦЦГГАЦТТААТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТАГТ-5` 2. Ниже приведены два одноцепочечных фрагмента ДНК. Какой из них в двухцепочечном варианте можно использовать для встраивания в плазмиду pSC101?

а) 5`-ГГЦЦТГААТТЦААГЦАТАГТГТГААТТЦАА-3` б) 5`-ТЦЦГГАЦТТААТТГТТАТЦАЦАЦТТАГТ-5` 3. Кольцевая плазмида pBR322 имеет участки расщепления различными рестриктазами. Какой из ниже приведённых фрагментов двухцепочечной ДНК можно встроить в данную плазмиду?



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.