авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

«Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой ...»

-- [ Страница 4 ] --

Исходя из потребительских качеств пищевой продукции сальмонеллез представляет большую опасность для здоровья населения. При этом необходимо иметь достоверные све дения об устойчивости возбудителя к воздействию факторов внешней среды в процессе из готовления и хранения мясной продукции. Существуют различные профилактические и кон трольные меры в отношении сальмонеллезной инфекции однако ощущается явный дефицит информации об их эффективности, особенно в сфере здравоохранения. (15, 70, 133, 134). Так в замороженном мясе сальмонеллы сохраняют свою жизнеспособность месяцами, и только через 3-4 месяца хранения при -18 -20°С их количество начинает интенсивно снижаться, од нако полной потери жизнеспособности не отмечается даже через 12 месяцев хранения. [9, 10].

Ионизирующее облучение дозой до 10 кГр подавляет рост сальмонелл, не изменяя качество продукта. Ультрафиолетовые лучи действуют бактерицидно в пределах длины волны от до 313 нм, вызывая фотохимические изменения внутриклеточных структур бактерий. Бакте рицидный эффект постоянного УФ-облучения с интенсивностью потока 0,0159 Вт/см2 при длине волны 254 нм и расстоянии 30-40 см от облучателя по отношению к сальмонеллам, со держащимся на гладкой поверхности, достигается при экспозиции 20-25 мин (19,00-23,85 Вт с/см2). [9].

Требованиями ИСО 6579:2002 (ГОСТ Р 52814), СанПин 2.3.2 1078-01 не допускается наличие сальмонелл в 25 г мяса и других видов мясного сырья (в том числе мяса птицы и мяса механической обвалки), а также прочей мясной продукции.

B настоящее время, в связи со значительной частотой выявления сальмонелл в мясе, возникает острая необходимость разработки современных методов, обеспечивающих резкое снижение опасности заражения мясного сырья и изготовленной из него продукции.

В середине прошлого века в мире было широко распространено применение кормо вых антибиотиков для снижения риска заболеваний животных и птицы, в том числе и саль монеллезом, однако в настоящее время их использование запрещено. Широкое применение в процессе переработки мяса, особенно тушек птицы для деконтаминации в отношении сальмо нелл, нашли различные химические средства. Например, хлорирование воды, используемой для промывания и охлаждения тушек. С января 2010 г. в России (а в ряде европейских стран еще раньше) было запрещено использование хлора для этих целей.

Несмотря на то, что в мировой практике для обработки поверхности мяса животных и особенно тушек птицы используется множество антимикробных препаратов, в том числе на основе органических кислот, уровень выявления сальмонелл в мясном сырье остается высо ким даже в развитых странах. Такое положение указывает на то, что даже при соблюдении на предприятиях санитарно-гигиенических требований обработка поверхности тушек птицы в процессе переработки является малоэффективной и необходимы новые подходы к решению этой проблемы.



Так, в Дании уже около 10 лет реализуется комплексная программа, охватывающая все аспекты производства мяса птицы, начиная с контроля яйца при закладке в инкубатор, выращивания и откорма птицы и завершая ее переработкой. Реализация мероприятий, пред усмотренных программой, позволила за 10 лет снизить выявление сальмонелл с 12 до l%.[8].

Имеются и другие, менее затратные, пути решения проблемы сальмонеллеза, одним Бактериофаги в медицине и ветеринарии из которых, по-нашему мнению, является использование бактериофагов.

Поисковые исследования, проведенные в ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, по из учению возможности применения бактериофагов для обработки птицы перед ее отправкой на перерабатывающее предприятие показали эффективность и перспективность такого подхода.

В ФБУН ГНЦ ПМБ созданы лабораторные образцы композиций сальмонеллезных бактериофагов и рецептурные формы препаратов на их основе, которые являются активными против Salmonella Enterts.

В состав препаратов включены литические для S. Enterts бактериофаги, выделен ные из образцов сточных вод и фекальных масс птицефабрик. Препараты бактериофагов не токсичны для лабораторных животных, что проверено путем подкожного и внутрибрюшинно го введения их беспородным белым мышам и цыплятам.

Разработан рецептурный состав препарата бактериофагов для применения в произ водстве цыплят бройлеров, предполагающий высокий уровень сохранения биологических свойств бактериофагов на стадиях приготовления препарата, а также в процессе его хранения и применения. Рецептурная форма препарата состоит из частиц стандартного коммерческого комбикорма, которые содержат на своей поверхности инкапсулированные в полимерной ма трице бактериофаги.

Эффективность фагового препарата была продемонстрирована на модели экспери ментального сальмонеллеза у бройлерных цыплят. В экспериментах использовали две группы суточных цыплят по 30 голов в каждой. Одна группа – экспериментальная: цыплята имели сво бодный доступ к кормовым гранулам, содержащим 2108 бляшко-образующих единиц (БОЕ) на 1 г, в течение 25 дней, начиная с первого дня жизни. Вторая группа – контрольная: цыплята получали обычный корм, не содержащий бактериофаги. На 2-е сутки цыплят обоих групп за ражали культурой штамма S.Enteritidis (6,9107 КОЕ, per os через специальную иглу-канюлю).

За цыплятами наблюдали в течение 25 суток.

Таблица 4 - Эффективность комплексного фагового препарата в составе корма при экспериментальной сальмонеллезной инфекции у бройлерных цыплят.

Обнаружение S. Enterts Кол-во Вес цыплят в органах цыплят (кол-во Группа цыплят голов голов) 1-й день 25-й день Селезенка Печень 1. Опыт (фаговый препарат в составе корма 2108 БОЕ/г в 30 45 г 745 г 2 теченте 25 дней) 2. Контроль 30 45 г 779 г 29 Из данных, представленных в табл. 4, следует, что в контрольной группе цыплят, не получавших фаговый препарат, инфицированность сальмонеллами составляет 96,7 % (у из 30 цыплят из внутренних органов выделяется культура S.Enterts). В то же время, в экс периментальной группе цыплят, получавших комплексный фаговый препарат в составе корма, культура S.Enterts выделена только у двух особей. В этом случае процент инфицирования сальмонеллезом составляет 6,7 %. Полученные результаты свидетельствуют об эффектив ном действии комплексного фагового препарата в составе корма для элиминации Samonea Enterts у цыплят.





Таким образом, композиция нетоксичных, литических бактериофагов активных про Бактериофаги в медицине и ветеринарии тив сальмонелл серотипа Enteritidis, используемая в качестве кормовой добавки, может быть эффективным средством для борьбы с носительством Samonea Enterts у промышленной птицы.

Библиографический список 1. Anon. 2009. Samonea Infantis – Israel: relative increased morbidity. Israel Ministry of Health, Department of Epidemiology circular, January 2009 (in Hebrew). English translation and edited at http://promedmail.org Archive Number 20090310. 2. WH Global Foodborne Infections Network Country Datbank – A resource to link Hou man and non-houman sources of Salmonella. Reference: Vleira AR et all 2009, ISVEE Conference, Durban, Sout Africa.

3. Обеспечение биологической безопасности пищевых продуктов, острые кишечные инфекции. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Россий ской Федерации в 2009 году», с. 138-145, 153-155, 309-313, 18. rospotrebnadzor.ru, 2010 г.

4. Poppe, C. 2000. Samonea infections in the domestic fowl. pp. 107 – 132. In C. Wray and A. Wray (eds). Samonea in Domestic Animals. CABI Publishing, Wallingford, xford, U.K.

5. Schmidt U. Vorkomen und Verhalten von Salmonellen in Hackfleisch von Schwein.

Fleischwirtschaft, 1988, 68 (1), s. 43-46.

6. Джеймс М. Джей, Мартин Дж., Лёсснер, Дэвид А. Гольден. Современная пищевая микробиология. М., Бином. Лаборатория знаний, 2011, с. 481.

7. Pointon A. Свод правил по гигиене мяса и мясной продукции. Доклад на междуна.

родном семинаре. М., ГНУ ВНИИМП им. В. М. Горбатова, 2011 г.

8. Walid Alaliю Распространение сальмонелл в мясе птицы в странах открытого рынка.

Международная научно-практическая конференция «Балтийский форум ветеринарной меди цины 2011», Санкт-Петербург, 2011 г.

9. Bolder, N.M. 2007. Microbial challenges of poultry meat production. Wor’s Pout. S.

J. 63:401-422.

10. FA/WH (Food and Agriculture rganization of the United Nations / World Health rganization). 2009. Samonea and ampyobater in chicken meat. Meeting Report. Microbiologi cal Risk Assessment Series 19. http://www.who.int/foodsafety/publications/micro/mra19/en/index.

html 11. NACMCF (National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods). 1997.

Generic HACCP application in broiler slaughter and processing. J. Foo Prot. 60:579-604.

12. National Chicken Council. 1992. Good Manufacturing Practices. Fresh Broiler Prod ucts. NCC, Washington, DC.

13. Костенко Ю. Г., Бутко М. П., Ковбаенко В. М., Выпегжанин А. Ф. с соавт. Руковод..,..,..,...

ство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене производства мяса и мясных продуктов.

М., 1994, РИФ «Антика», 607 с.

14. Костенко Ю. Г., Батаева Д. С., Краснова М. А., Храмов М.В. Проблема сальмонел леза при производстве мясной продукции и пути ее решения. Все о мясе, 2011, № 5, с. 50- Бактериофаги в Биотехнологии и пищевой промышленности Бактериофаги в Биотехнологии и пищевой промышленности UD 577. BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS IN METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS Doskar J., Doctor of Molecular Biology and Genetics, Professor Masaryk University, Brno, Czech Republic, doskar@sci.muni.cz Varga M., Doctor of Molecular Biology and Genetics Masaryk University, Brno, Czech Republic, m.varga@mail.muni.cz Maslanova I., Doctor of Molecular and Cell Biology Masaryk University, Brno, Czech Republic, maslanova@mail.muni.cz Pantucek R., Doctor of Molecular and Cell Biology, Associate Professor Masaryk University, Brno, Czech Republic, pantucek@sci.muni.cz Mosa M., Doctor of Chemistry IMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, mosa@imuna.cz Key words: baterophage, transuton, horzonta gene transfer, MRSA, mobe genet eements, antbot resstane, ysogeny.

Ths researh was ame at haraterzng transuton of mobe genet eements n meth n-resstant strans of Staphyoous aureus. In ths work t has been prove that baterophages effienty transferre antbot resstane an vruene genes between na S. aureus strans.

Furthermore, suessfu transuton was performe usng prophages of ysogen aboratory an na strans.

Itroducto. Staphyoous aureus is an important bacterial pathogen constituting a serious problem for human health. ne of the most noticeable features of this species is the rapid evolution leading to substantial strain variability and appearance of novel and dangerous antibiotic resistant clones [1]. This evolution is pushed forward by horizontal transfer of mobile genetic elements (MGE), such as plasmids, transposons, cassette chromosomes, pathogenicity islands and genomic islands, carrying antibiotic resistance genes and virulence factors, which provide the host bacterium with a selective advantage. The most common mechanism of horizontal gene transfer in S. aureus is apparently transduction, because there is a little evidence that transformation occurs and conjugative plasmids or transposons are not widespread in S. aureus [2]. Many transduction experiments have been conducted intending to prove the mobility of variable genetic elements with genes coding for antibiotic resistance or toxins [3, 4, 5]. Ability of bacteriophages to transduce plasmid-borne and chromosomal genes has been well documented in most staphylococcal bacteriophages of serological group B, such as 11, 80 and 80 [6, 7]. An important role in transferring MGE play also prophages.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии As the majority of clinical S. aureus strains harbour one or more prophages [8], efficient transduction can follow after prophage induction from the host strain, which was recently demonstrated in S.

aureus USA300 clone [9].

Materals ad Methods. Five clinical S. aureus strains (Jevons B, 07/759, 08/019, 08/ and 08/986) were chosen as donors of plasmids (4.4kb pT181 tetracycline resistance plasmid and 28kb penicillinase plasmid of Jevons B strain, 27kb pUSA300-HUMR-like penicillinase plasmids of 08/019, 08/629, and 08/986 strains and 31kb pUSA300-HUMR-like penicillinase plasmid of 07/759 strain). For transduction purposes with induced phage lysate, the lysogen 07/759 (JB+) was constructed by inserting JB into its chromosome as previously reported [10]. Three laboratory strains SA113, NCTC 8325-4, and RN4220 and two clinical strains 07/235 and 07/759 were used as recipients. Clinical genome-sequenced strain CL was used for propagation of transducing bacteriophages followed by detection and quantification of MGE in phage particles. Induction of prophages by UV light and transduction experiments were performed as described previously [9].

The plasmid DNA from donors and transductants was isolated using the High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) according to the manufacturers protocol with following modifications of cell lysis. Eight ml of overnight culture was washed twice in phosphate buffered saline and resuspended in 235 µl of Suspension Buffer with RNase A + 15 µl of lysostaphin (Dr. Petry Genmedics, Reutlingen, Germany) (0.5 mg/ml). Then, it was left incubating at 37 °C for 15 min. After the treatment, 250 µl of lysis buffer was added.

Bacteriophage integrase types and morphogenesis gene types corresponding to serological groups of prophages in the chromosomes of the strains were identified by multiplex PCR assay as previously reported [11].

Detection and quantification of different MGE types directly inside phage particles was performed by quantitative real-time PCR (qPCR) as described previously [12].

Results ad Dscusso. For the transduction experiments, well-characterized methicillin resistant S. aureus strains containing different types of plasmids were used as donors for transferring these plasmids to recipient strains.

Preliminary experiments resulted in successful transfer of 4.4kb pT181 tetracycline resistance plasmid and 28kb penicillinase plasmid from methicillin-resistant donor Jevons B to laboratory recipient strains SA113, NCTC 8325-4 and RN4220. The transfer was mediated by prophage JB induced by UV light from the chromosome of Jevons B strain to titre of 109 PFU/ml without the need of further propagation.

Afterwards, we focused on transferring the penicillinase and tetracycline resistance plasmids by bacteriophages 80 and JB between clinical isolates belonging to the USA300 clone. Phages were propagated on four donor strains 07/759, 08/019, 08/629, 08/986 possessing 27kb (31kb in case of 07/759) pUSA300-HUMR-like penicillinase plasmids, which were successfully transferred to clinical recipient strain 07/235. As none of the USA300 donors naturally contain any tetracycline resistance plasmid, the pT181 plasmid was transduced from the Jevons B strain by means of 80 to the strain 08/019. Subsequently, transductions of pT181 from such prepared strain were performed using 80 and JB into other strains of the USA300 clone.

In further experiments, 31kb penicillinase plasmid of lysogen 07/759 (JB+) was transferred into the strain 07/235 by prophage JB. Another donor strain used was the lysogenic transductant 07/235, pUSA300-HUMR-like (80+) containing the 80 prophage and 27 kb penicillinase plasmid of the 08/986 strain. The UV-induced 80 successfully transduced the plasmid into RN strain. This shows that if the transductant is lysogenized, the plasmid can be very effectively mobilized.

The transductants obtained were tested for the presence of transferred plasmid and their Бактериофаги в медицине и ветеринарии genetic background was characterized in detail. In all experiments, high transduction frequencies (10–5–10–6 CFU/PFU) were observed (Table 1) using phages propagated on donor strains as well as prophages induced from donors by UV light.

QPCR was employed to detect penicillinase plasmids in transducing phage particles and determine the ratio of transducing particles in phage lysates to infectious phage particles (determined as approximately 1 : 1700).

Further, phages 11, 80, 80 and 81 were propagated on S. aureus CL strain and afterwards different types of MGE were detected inside their capsids using qPCR. These were parts of SCCme (meA and rA1 genes), parts of SaPIs (Sa1nt and seb genes), parts of genomic islands (set5 and ukD-ukE genes) and genes clfB, sspA and nu localized on bacterial chromosome. Total amount of bacterial DNA in phage capsids quantified by qPCR was described as log10 of mean gene copies per 1 ng phage DNA and frequencies of phage transducing particles carrying the targeted genes were finally calculated.

Table 1. - Trasducto frequeces obtaed wth hages roagated o door stras (f80a) as well as rohages duced fro doors by UV lght (fJB).

Trasduced Trasducto Trasducg Door stra lasd Recet stra frequecy (CFU/ bacterohage (sze;

gees) PFU) 31kb;

baZ, aD 07/759 f80a 07/235 1.5 10- 27kb;

baZ, aD 08/019 f80a 07/235 9.2 10- 27kb;

baZ, aD 08/629 f80a 07/235 1.1 10- 27kb;

baZ, aD 08/986 f80a 07/235 7.9 10- 08/019, 4.4kb;

tetK f80a 07/759 4.6 10- pT 31kb;

baZ, aD 07/759 fJB 07/235 5.0 10- 27kb;

baZ, aD 08/019 fJB 07/235 1.1 10- 27kb;

baZ, aD 08/629 fJB 07/235 2.7 10- 27kb;

baZ, aD 08/986 fJB 07/235 9.0 10- 08/019, 4.4kb;

tetK pT181 fJB 07/759 2.8 10- 31kb;

baZ, aD 07/759 (JB+) JB 07/235 2.3 10- 27kb;

baZ, aD 07/235 80 RN4220 3.1 10- (80+) Cocluso. The outstanding transduction abilities of serological group B phages 80 and JB have been proved by aforementioned experiments. Moreover, the efficient transfer of antibiotic resistance plasmids within methicillin-resistant S. aureus USA300 clone shows that such plasmids can be easily disseminated in bacterial populations by transducing bacteriophages. In addition to plasmids, also other types of MGE were detected inside transducing phage particles using qPCR, such as SCCme, SaPIs and genomic islands. These findings indicate that bacteriophages play an important role in spreading the virulence and resistance determinants among bacterial strains and contribute to their evolution.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Ackowledgeet. Supported by the Technology Agency of the Czech Republic (TA01010405), by the Program TIP of MP of the Czech Republic (FR-TI4/417) and by the Internal Grant Agency (IGA) of the Ministry of Health of the Czech Republic (NT/12395-5/2011).

References 1. Harris S.R., Feil E.J., Holden M.T., Quail M.A., Nickerson E.K., Chantratita N., et a.

Evolution of MRSA during hospital transmission and intercontinental spread. // Science. – Vol. 327.

–2010.– P. 469–474.

2. Lindsay J.A. S. aureus evolution: lineages and mobile genetic elements. // Staphyoous Molecular Genetics (Lindsay J.A., ed) – Caister Academic Press, Norfolk –2008.– P. 45–69.

3. Cohen S. and Sweeney H.M. Transduction of methicillin resistance in Staphyoous aureus dependent on an unusual specificity of the recipient strain. // J. Bacteriol. – Vol. 104. –1970.– P. 1158–1167.

4. Nakaminami H., Noguchi N., Nishijima S., Kurokawa I., So H. and Sasatsu M. Transduction of the plasmid encoding antiseptic resistance gene qacB in Staphyoous aureus. // Biol. Pharm.

Bull. – Vol. 30. –2007.– P. 1412–1415.

5. Chen J. and Novick R.P. Phage-mediated intergeneric transfer of toxin genes. // Science.

– Vol. 323. –2009.– P. 139–141.

6. Dowell C.E. and Rosenblum E.D. Serology and transduction in staphylococcal phage. // J. Bacteriol. – Vol. 84. –1962.– P. 1071–1075.

7. Novick R. Properties of a cryptic high-frequency transducing phage in Staphyoous aureus. // Virology. – Vol. 33. –1967.– P. 155–166.

8. Goerke C., Pantucek R., Holtfreter S., Schulte B., Zink M., Grumann D., Broker B.M., Doskar J. and Wolz C. Diversity of prophages in dominant Staphyoous aureus clonal lineages. // J. Bacteriol. – Vol. 191. –2009.– P. 3462–3468.

9. Varga M., Kuntova L., Pantucek R., Maslanova I., Ruzickova V. and Doskar J. Efficient transfer of antibiotic resistance plasmids by transduction within methicillin-resistant Staphyoous aureus USA300 clone. // FEMS. Microbiol. Lett. – Vol. 332. –2012.– P. 146–152.

10. Borecka P., Rosypal S., Pantucek R. and Doskar J. Localization of prophages of serological group B and F on restriction fragments defined in the restriction map of Staphyoous aureus NCTC 8325. // FEMS. Microbiol. Lett. – Vol. 143. –1996.– P. 203–210.

11. Kahankova J., Pantucek R., Goerke C., Ruzickova V., Holochova P. and Doskar J.

Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphyoous aureus siphoviruses reflecting their modular genome structure. // Environ. Microbiol. – Vol. 12. –2010.– P. 2527–2538.

12. Maslanova I., Doskar J., Varga M., Kuntova L., Muzik J., Maluskova D., Ruzickova V.

and Pantucek R. Bacteriophages of Staphyoous aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCme with different frequencies. // Environ. Microbiol.

Reports. – Vol. 5. –2013.– P. 66–73. doi: 10.1111/j.1758-2229.2012.00378.x.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии UD 577. COMPARISON OF IN VITRO LYTIC ACTIVITIES OF THREE BACTERIOPHAGE PREPARATIONS STAFAL®, STAPHYLON® AND PYOBACTERIOPHAGUM LIQUIDUM AGAINST METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS Pantucek R., Doctor of Molecular Biology, Associate Professor Masaryk University, Brno, Czech Republic, pantucek@sci.muni.cz Petras P., Doctor of Chemistry National Institute of Public Health, Praha, Czech Republic, petrasi@szu.cz Doskar J., Doctor of Molecular Biology, Professor Masaryk University, Brno, Czech Republic, doskar@sci.muni.cz Ruzickova V., Doctor of Microbiology, Associate Professor Masaryk University, Brno, Czech Republic, vladkar@sci.muni.cz Bostik J., Doctor of Biology IMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, josef.bostik@sevapharma.cz Mosa M., Doctor of Chemistry IMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, mosa@imuna.cz Key words: Staphyoous aureus, MRSA, baterophage therapy, Myovrae, mutous sequene typng, phage typng, STAFAL®.

In ths work we summarze the resuts of n vtro suseptbty testng of methn-resstant S. aureus strans to baterophage preparaton STAFAL® ompare wth stran suseptbtes to Pyo Baterophagum quum, Intest Baterophagum quum an STAPHYLN® proue by Eava Bopreparetons an Eava Phages n Georga.

Itroducto. Staphyoous aureus is one of the most common gram-positive opportunistic pathogens in humans causing from minor skin to severe systemic infections. The newly acquired genes responsible for virulence and resistance to antibiotics are rapidly disseminated in the staphylococcal population and multiple-resistant S. aureus strains represent a significant medical problem. Bacteriophages with a broad host range are suitable for fighting these pathogenic bacteria as an alternative to antibiotic therapy.

STAFAL® is an antistaphylococcal phage lysate for topical application, containing highly effective virulent phage particles of Twortlikevirus genus of family Myovrae [1] with a strong and rapid lytic and polyvalent effect produced under GMP by IMUNA s.r.o. in the Czech Republic. The preparation is standardized in its efficacy according to the concentration not less than 1 x 107 of specific phage particles per 1.0 ml. STAFAL® is designed exclusively for topical application in infections caused by staphylococcal strains. It can be used both in human as well as in veterinary medicine in all forms of staphylococcal infections. It is used for the destruction of staphylococcal cells in the site of progressing infection. The preparation is administered mainly for the elimination of causative agents of staphylococcal infection in the foci of infections (e.g. purulent processes of the skin, subcutis and in skin adnex) as well as in potential reservoirs (particularly in nasopharinx, intestinal and urinary tract). STAFAL® presents a significant therapeutical agent in the complex treatment of chronic form of staphylococcal infections (purulent affections, abcesses, fistulae, infections affecting deeply located soft tissues). STAFAL® is also an important part of preventive measures in pre-operation preparation with the aim of preventing the occurrence of superponed pyogenic complications after operation Бактериофаги в медицине и ветеринарии interventions.

Materals ad Methods. Set of 120 MRSA strains was collected from hospital microbiology departments of the Czech Republic in 1999 – 2011. The MRSA strains were classified by MLST [2], spa typing [3] and SCCme typing [4] to 50 different genotypes. In addition to the commercial bacteriophage preparations, following polyvalent bacteriophages were used for susceptibility testing (their propagating strains are bracketed): K (S. aureus RN4220) [5], 812 (S. aureus CCM 4028) [6], 131 (S. aureus SA 6409) [7], U16 (S. eperms V505) [8] and SK311 (S. arnosus TM 300) [9].

Individual phage lysates were adjusted to the titer 2-3 x 107 PFU ml-1. For estimating the susceptibility of staphylococcal strains to the phages under study, the spot test on nutrient agar plates containing calcium chloride was used. The strain tested was considered to be susceptible to a given phage if confluent or semiconfluent lysis and/or plaques were observed in the spot area, and resistant if no lysis in the spot area (no zone) was detected. If a phage tested formed a turbid spot area (turbid zone), the test was repeated three times. If at least one of these repeated tests gave confluent or semiconfluent lysis in the spot area, the tested strain was considered to be susceptible to the given phage or phage mixture.

Results ad Dscusso. The estimated susceptibilities of the 120 MRSA strains to bacteriophage medications and individual phages are given in Table 1. Twelve strains were completely resistant to both the preparation and all the phages tested. These resistant strains fell to sequence types ST 45, ST 80 and ST 239 whereas the susceptible strains belonged to ST 1, ST 5, ST 8, ST 20, ST 22, ST 30, ST 36, ST 111, ST 225, ST 228 and ST 247. STAFAL® exhibited n vtro about 10% broader host-range than Pyo-Bacteriophagum liquidum or Intesti- Bacteriophagum liquidum. Interestingly STAPHYLN® had very limited host-range and only MRSA isolates belonging to Brazilian MRSA clone (ST239/spa-type t030/SCCme III) were susceptible to this medication. n the other hand this MRSA clone was resistant to STAFAL® and Pyo-Bacteriophagum liquidum.

Table 1. - Per cet of MRSA stras (=120) whch are suscetble to hage rearatos ad referece hages.

INTESTI PY BAC STA- BACTE Phage TERIPH- K 812 131 U16 SK FAL® RIPH AGUM AGUM Per cent of sus 83 73 72 60 63 69 65 ceptible strains Different restriction-modification systems in the strains of distinct ST types indicate that the insensitivity of particular strains could be caused by restriction of phage DNA. Nevertheless, in the set of strains belonging to ST 5 and ST 8 that are generally susceptible to polyvalent phages, some isolates exhibited resistance to all polyvalent phages tested. In these cases, the insensitivity may be caused by a prophage which interferes with reproduction of polyvalent phages. This phenomenon was observed after laboratory lysogenization of some strains with temperate phages of the serogroup B.

Cocluso. Ninety per cent of MRSA strains tested were susceptible to at least one preparation or polyvalent phages. Broad host-range of the preparation STAFAL® (83%) indicates that its use for treatment of MRSA infections seems promising however, the clinical efficacy must be further proved. MRSA strains resistant to all Myovrae phages tested belonged to ST 45, ST and ST 239.

Ackowledgeet. Supported by the Technology Agency of the Czech Republic (TA01010405), by the Program TIP of MP of the Czech Republic (FR-TI4/417) and by the Internal Бактериофаги в медицине и ветеринарии Grant Agency (IGA) of the Ministry of Health of the Czech Republic (NT/12395-5/2011).

References 1. Klumpp J., Lavigne R., Loessner M.J., Ackermann H.W. The SP1-related bacteriophag related es. // Arch. Virol. – Vol. 155. – 2010. – P. 1547–1561.

2. Enright M.C., Day N.P., Davies C.E., Peacock S.J., Spratt B.G. Multilocus sequence typ ing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphyoous aureus. // J. Clin. Microbiol. – Vol. 38. –2000. – P. 1008–1015.

3. Shopsin B., Gomez M., Montgomery S.., Smith D.H., Waddington M., Dodge D.E., Bost D.A., Riehman M., Naidich S., Kreiswirth B.N. Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphyoous aureus strains. // J. Clin. Microbiol. – Vol. 37.

– 1999. – P. 3559–3563.

4. Milheirio C., liveira D.C., de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphyoous aureus. // Antimicrob. Agents Chemother. – Vol.

51. – 2007. – P. 3374–7337.

5. Flaherty S., Coffey A., Edwards R., Meaney W., Fitzgerald G.F., Ross R.P. Genome of staphylococcal phage K: a new lineage of Myovrae infecting gram-positive bacteria with a low G+C content. // J. Bacteriol. – Vol. 186. – 2004. – P. 2862–2871.

6. Pantucek R., Rosypalova A., Doskar J., Kailerova J., Ruzickova V., Borecka P., Snopkova S., Horvath R., Gtz F., Rosypal S. The polyvalent staphylococcal phage phi 812: its host-range mu tants and related phages. // Virology – Vol. 246. – 1998. – P. 241–252.

7. Pulverer G., Pillich J., Kocur M. Two new bacteriophages active against pathogenic staph ylococci. // Zentralbl. Bakteriol. Parasit. Infekt. Hyg. I. rig. – Vol. 201– 1966. – P. 321-325.

8. Schumacher-Perdreau F., Pulverer G., Schleifer K.H. The phage adsorption test: a simple method for differentiation between staphylococci and micrococci. // J. Infect. Dis. – Vol. 138. – 1978.

– P. 392-395.

9. Gtz F., Popp F., Schleifer K.H. Isolation and characterization of a virulent bacteriophage from Staphyoous arnosus. // FEMS Microbiol. Lett. – Vol. 23. – 1984. – P. 303-307.

УДК 578.81:579. СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ПИТАНИЯ «ФУДФАГ»

В ПРОФИЛАКТИКЕ ПИЩЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ Алешкин А.В.*, доктор биологических наук,, (495)452-18-16, ava@gabri.ru Воложанцев Н.В.**, кандидат биологических наук, nikvol@obolensk.org Светоч Э.А.**, доктор ветеринарных наук, профессор, Афанасьев С.С.*, доктор медицинских наук, профессор, info@gabrich.com Веревкин В.В.**, кандидат биологических наук, info@obolensk.org Васильев Д.А.***, доктор биологических наук, профессор, dav_ul@mail.ru Золотухин С.Н.***, доктор биологических наук, профессор, Киселева И.А.*, irina6804@mail.ru *ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора **ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора, *** ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина»

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Ключевые слова: бактериофаги, пищевые инфекции, фагосодержащие пробиотие ские пищевые добавки.

Опасность инфицирования людей пищевой продукцией, контаминированной сальмонел лами, шигеллами, эшерихиями, листериями, стафилококками и другими патогенными микроор ганизмами, остается резвыайно высокой, особенно при употреблении продуктов быстрого приготовления. Осуществлен поиск и выделение бактериофагов, активных против данных бак терий, изуены их фенотипиеские и молекулярно-генетиеские свойства, проведена оценка без опасности и эффективности применения у лабораторных животных и еловека.

Введение. Микробиологическая безопасность пищи в ХХI веке остается ведущей проблемой гигиены питания. Появление новых технологий хранения на холоду, упаковки в пленку, минимальной переработки охлажденного сырья, длительная транспортировка, а также не соблюдение элементарной гигиены работниками пищеблоков, увеличивают возможность накопления в пище возбудителей пищевых инфекций из ряда сальмонелл, эшерихий, шигелл, кампилобактера, листерий, стафилококка и т.д. Применение антибиотиков в пищевой отрасли не решает эту проблему, снижая уровень экологической чистоты продукции и провоцируя по явление новой категории патогенов – штаммов условно-патогенных бактерий, резистентных к антибиотикам.

Используя накопленный мировой опыт, данные отечественных микробиологов, успеш но трудившихся в направлении изучения бактериофагов, а также действуя в рамках решения Ученого Совета Роспотребнадзора от 21 июня 2011 года, логично предложить бактериофаги для создания нового для России класса специализированных пищевых продуктов диетическо го (профилактического) питания, использование которых позволит снизить риск возникнове ния спорадических случаев и эпидемических вспышек пищевых инфекций.

Материалы и методы исследований. Используя коллекцию патогенных микроор ганизмов, а также штаммы бактерий, выделенные от пациентов КДЦ, отобраны 7 производ ственно-перспективных бактериофагов. С помощью микробиологических, биохимических, биотехнологических и молекулярно-генетических методов исследованы их биологические свойства, отработана технология культивирования, подтверждена безопасность и эффектив ность полученного специализированного продукта диетического (профилактического) пита ния (СП «ФУДФАГ») на лабораторных животных и в программе медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения (Рис. 1).

Результаты исследований и их обсуждение. В ходе исследований нами были вы делены из разных источников, изучены и отобраны 7 бактериофагов, активных в отношении S.aureus, E.coli 0157:H7, E.coli О104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocyto.aureus,.coli aureus, coli, H7,.coli 7, coli H4,.enteritidis,.typhimurium,.infantis,.

4, enteritidis, typhimurium, infantis,,,, genes, которые и составили основу СП «ФУДФАГ». Вирулентные фаги отбирались на основа, нии их биологических, биохимических и молекулярно-генетических свойств. Индикаторные штаммы бактерий, на которых культивировались бактериофаги, проверялись на отсутствие профага индукцией митомицином С. Штаммы бактериофагов в титре от 1010 до 1013 БОЭ/мл получали выращиванием на плотных питательных средах в матрасах с последующей стери лизующей фильтрацией и освобождением от эндотоксина на хромотографической колонке. В таблице 1 представлена полная характеристика отобранных штаммов.

Выделение и селекция 7 вирулентных штаммов бактериофагов по спектру их специфиче ской литической активности против S.aureus, E.coli 0157:H7, E.coli 0104:H4, S.enteritidis, S.typhimurium, S.infantis, L. monocytogenes Бактериофаги в медицине и ветеринарии Подтверждение отсутствия умеренных фагов, интегрированных в бактериальные клетки, на которых культивируются отобранные штаммы бактериофагов, с помощью теста с митоми цином С Получение бактериофагов на плотной питательной среде, стерилизующая фильтрация и уда ление эндотоксина из полученных фаголизатов методом аффинной хроматографии Подтверждение отсутствия генов, кодирующих токсины и других нежелательных генов в геноме отобранных фагов (с помощью ПЦР со специфическими праймерами), ПДРФ анализ для определения приблизительного размера геномов и последующего полногеномного сик венса фаговых ДНК Подтверждение отсутствия стафилококковых, листериозных и шига-подобных токсинов (ИФА) в полученных фаголизатах Проверка стабильности бактериофагов при 4±2 оС в течение года Создание готовой формы – специализированного пищевого продукта диетического (профилактического) питания Оценка безопасности и эффективности конечного продукта на животных (острая токсич ность, хроническая токсичность, фармакокинетика, специфическая эффективность) Оценка безопасности и эффективности специализированного пищевого продукта диетиче ского (профилактического) питания в рамках программы медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения Процедура регистрации специализированного пищевого продукта диетического (профилактического) питания Рисунок 1. План исследований (создания фагового коктейля).

Все штаммы бактериофагов специфичны, т.е. лизируют исключительно культуры па тогенных энтеробактерий, не подавляют рост производственных пробиотических штаммов бифидобактерий, лактобацилл, E.coli M-17 и нормальной микрофлоры, выделенной от 100 па.coli - coli циентов КДЦ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского».

В ходе работы был проведен ПДРФ анализ всех 7 штаммов. Это позволило нам полу чить ориентировочный размер фагового генома каждого штамма и процентное содержание нуклеотидов в составе ДНК как подготовительный этап для дальнейшего полногеномного сек венирования (рис.2).

С помощью ИФА тест-систем подтверждено отсутствие экзотоксинов в коктейле стерильных фаголизатов. Соответствие нашего продукта стандартам Европейской комиссии, контролирующей безопасность пищевых продуктов (EFSA), по содержанию эндотоксина под тверждено ЛАЛ-тестом.

Оценку безопасности продукта проводили в опытах по изучению острой и хрониче ской токсичности на лабораторных животных. В результате проведенных экспериментов было показано, что при всех возможных способах введения исследуемого продукта признаков ин Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 1. - Характеристика штаммов бактериофагов, входящих в СП «ФУД ФАГ».

Наименова СH1 ECD7 V32 SE40 ST11 SI3 Lm ние фага Бактериаль E. coli E. coli S. enteri- S. typhimu- L. monocy ный штамм- S. aureus S. infantis 104:H4 157:H7 tidis rium togenes хозяин Сточные Фекалии Окружаю- Фекалии Клини- Фекалии воды ко- Фекалии крупного Источник щая среда, овец, ческий кур, Мо- ровника, кур, Ка- рогатого выделения Москов- Астрахан материал, сковская Москов- лужская скота, Мо ская об- ская об фага Челябинск область ская об- область сковская ласть ласть ласть область 100/ E. coli Спектр ли- 104:H тической ак- 104:H E. coli 100/S. 92/ L.

тивности 157:H7 85/ S. ente- 64/ S. in 92/MRSA 157:H7 typhi- mu- mo-nocy (% лизиса/ и др., ritidis fantis 157:H- rium togenes 70/Sh.

штамм бак sonnei и терий) flexneri ПЦР типирование Нет rfb, Нет rfb, известных Нет Нет LL stx1, stx2, stx1, stx2, Нет stxA Нет stxA Нет stxA токсин-ко- -токсина токсина eae и fliC eae и fliC дирующих генов Максималь ный титр на штамме-хо- 1010 1010 1010 1013 1010 1012 зяине (БОЕ/ мл) токсикации у мышей и морских свинок не наблюдалось.

Также на модели лабораторных животных были проведены фармакокинетические ис следования фагосодержащего продукта. Мы определяли количество вирусных частиц в фе калиях животных в различные промежутки времени после однократного внутрижедудочного введения коктейля бактериофагов. Через 9 часов после введения продукта сальмонеллезные фаги обнаруживаются в экскрементах мышей в наибольшей концентрации. В меньшем коли честве в мышиных экскрементах определялись листериозный, эшерихиозный (EcD7) и стафи лококковый фаги. В дальнейшем, количество специфических вирусных частиц снижалось и к 48 часам в мышиных фекалиях оставались только незначительные количества сальмонеллез ных фагов (табл. 2).

Для исключения вероятности возникновения побочных эффектов по влиянию бакте риофагов на нормальную микрофлору кишечника in vivo (на модели беспородных белых мы шей) определяли изменение количества основных представителей микробиоценоза толстого кишечника на фоне 10 дневного внутрижелодучного введения фагового коктейля. Разработан ная рецептура не влияет на нормальную микрофлору кишечника мышей.

Изучение специфической антибактериальной эффективности фагового продукта про Бактериофаги в медицине и ветеринарии Рисунок 2. Рестрикционный анализ ДНК штаммов бактериофагов, входящих в СП «ФУДФАГ».

водили на модели экспериментальной сальмонеллёзной инфекций у беспородных белых мы шей, которых заражали штаммом S.enteritidis 92 Rifr. Оценивали как профилактическую, так и лечебную схемы введения коктейля бактериофагов. Введение препарата через 48 часов после заражения животных в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/сут. продливало их жизнь до 9,6 дня, про тив 8 в контрольной группе. При профилактическом режиме использования фагового коктейля (введение за 24 часа до заражения и далее в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/сут.) выжило 30 % мышей, средний срок гибели павших мышей составил 11,4 дня. Бактериологический анализ органов и фекалий выживших животных на 14 сутки после окончания терапии подтвердил % санацию.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Оценку специфической антибактериальной эффективности специализированного пи щевого продукта диетического (профилактического) питания на основе бактериофагов про водили также в рамках программы медицинской реабилитации у лиц с хроническими забо леваниями органов пищеварения. Типовая программа реабилитации включала: дието-, фито-, бальнео-, кинезотерапию, тренинги, гастрошколы и т.д. При бактериологическом исследова нии фекалий у пациентов были выявлены Staphylococcus aureus, энтеропатогенная Escherichia coli, грибы рода Candida и другие представители условно-патогенной микрофлоры, типичные для дисбиотического состояния кишечника. 30 пациентам основной группы дополнительно к типовой программе реабилитации был назначен фаговый коктейль по 50 мл 3 раза в день во время еды, курсом 10 дней. 16 пациентам группы сравнения реабилитация осуществлялась в рамках типовой программы. Включение в программу медицинской реабилитации фагового коктейля позволило на 33% снизить количество пациентов с дисбактериозом кишечника вто рой и третьей степени, а у 37% пациентов основной группы добиться полной нормализации показателей микробиоценоза за счет элиминации Staphylococcus aureus и энтеропатогенной Escherichia coli (рис. 3).

Таблица 2. - Динамика персистенции фагов в кишечнике мышей после однократ ного внутрижелудочного введения фагового коктейля (lg БОЭ/г).

Титр фагов в экскрементах, Название Титр фага в препарате, Сmax, Tmax, Т0, lg (БОЭ/г) 12 24 48 БОЭ/г фага БОЭ/мл ч ч 0 3ч 6ч 9ч ч ч ч Lm1 0,510 4,5 9 0 0 4,0 4,5 3,8 0 ЕсD7 1,110 0 1,6 5,7 5,9 5,3 3,0 0 5,9 9 SI3 0,310 0 2,9 7,7 8,1 6,2 4,1 2,3 8,1 9 ST 1,0106 0 2,9 7,2 8,0 6,4 5,3 2,8 8,0 9 SE40 9,6106 0 0 2,8 7,6 7,1 5,0 3,1 7,6 9 V32 1,010 0 0 3,7 4,1 3,0 1,6 0 4,1 9 СH1 1,3106 0 н.д. 5,8 5,6 5,1 0 0 5,8 6 Рисунок 3. Динамика микробиологических показателей содержимого толстой кишки у пациентов с синдромом раздраженного кишечника и запором на фоне медицин ской программы реабилитации.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии В настоящее время нормативно-техническая документация на разработанный коктейль бактериофагов в форме специализированного пищевого продукта диетического (профилакти ческого) питания успешно прошла санитарно-эпидемиологическую экспертизу в НИИ пита ния РАМН. Федеральной службой Роспотребнадзора выдано свидетельство о государственной регистрации на СП «ФУДФАГ» № RU.77.77.19.004.Е.001234.02.13 от 20.02.2013 года.

Заключение. Сконструированный специализированный пищевой продукт диетиче ского (профилактического) питания на основе бактериофагов безопасен для человека и жи вотных и может применяться в качестве средства профилактического фагирования декретиро ванных контингентов работников предприятий различных отраслей с целью снижения риска развития спорадических случаев и вспышек пищевых инфекций.

PROBIOTIC DIETARY SUPPLIMENT «FOODPHAGE» IN PROPHYLAXIS AGAINST FOOD-BORNE INFECTION Aleshkin A.V., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Afanas’ev S.S., Verevkin V.V., Vasil’ev D.A., Zolotukhin S.N., Kiseleva I.A.

Key words: baterophages, foo-borne nfetons, phage-base probot etary suppement.

The rsk of nfeton ause by the foo prouts ontamnate wth Samonea, Shgea, Esherha, Lstera, Staphyoo s very hgh. Baterophages, atve aganst the above mentone batera, were sought an snge out. Ther phenotyp an moeuar genet features were stue as we as safety an effieny for ab anmas an humans.

УДК 619:616 - ТЕХНОЛОГИЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA И ПЕРСПЕРТИВЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Васильева Ю.Б., кандидат ветеринарных наук, доцент, vet_yulua@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, dav_ul@mail.ru Семанина Е.Н., научный сотрудник НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: диагностика бордетеллёза, РНФ, Boretea bronhsepta, фаговые биопрепараты.

В статье приводятся данные по разработке схемы индикации Boretea bronhsep ta в объектах ветеринарного надзора при помощи реакции нарастания титра фага с ис пользованием нового диагностиеского биопрепарата. редставлены результаты разработ ки технологиеских параметров изготовления активного и специфиеского биопрепарата на основе бордетеллёзных фагов.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии В настоящее время бордетеллез является широко распространенным заболеванием животных во многих странах мира [5].

В нашей стране статистические данные по распространению, методам выявления и ликвидации данной инфекции у животных крайне недостаточны.

Boretea bronhsepta является возбудителем хронических и асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахеобронхита) животных. Бордетеллёзом болеют соба ки, лошади, свиньи, обезьяны, козы, лисы, кролики, кошки, хорьки, хомяки, крысы, морские свинки, птицы в любом возрасте, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. [7].

Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства).

Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, со держащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продук тивности животных, обусловливают необходимость выявления B. bronhsepta и проведение противоэпизоотических мероприятий. В связи с этим актуальным является разработка мето дов индикации и идентификации B. Bronhsepta. Особо актуализирует поиск и разработку современных экспрессных высокочувствительных и специфичных средств и методов диагно стики тот факт, что В. bronhsepta может вызывать патологию дыхательных путей у человека [6].

Отсутствие недорогих высокоточных методов диагностики бордетеллёза значительно затрудняет получение исчерпывающей эпизоотологической и эпидемиологической информа ции.

В отечественной ветеринарной практике фагодиагностика бордетеллёза не изучена и, несомненно, представляет научный и практический интерес.

Вследствие этого целью нашей работы явилась разработка диагностического биопре парата для индикации и идентификации возбудителя бордетеллёза.

Для достижения поставленной цели мы поставили перед собой следующие задачи:

1. Подобрать оптимальный набор бактериофагов и сконструировать на их основе но вый биопрепарат для диагностики бордетеллёза.

2. Разработать схему идентификации B. bronhsepta с помощью бактериофагов.

3. Разработать биотехнологические параметры изготовления диагностического био препарата.

4. Разработать схему ускоренной индикации B. bronhsepta в объектах ветеринарно го надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.

Материалы и методы исследований. Объектами исследований явились 5 референс штаммов B. bronhsepta № 1, № 7, № 214, № 22067, № 8344;

48 штаммов B. bronhsep.

ta, выделенных от животных с клиническими проявлениями респираторных заболеваний;

штаммов фагов B. bronhsepta.

В работе использовали мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среда Эндо, ка зеиново-угольный агар, бордетелл-агар, кровяной агар, среда Борде-Жангу, среды Гисса, био химические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, агар-агар, на трий хлорид, мочевина, перекись водорода, желатин, среда УГСХА BBR 57.

Работу проводили согласно общепринятым микробиологическим методам выделения и идентификации бактерий и фагов. Постановку РНФ для индикации B. bronhsepta в объ ектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Голь дфарбом [1,2,3,4,8].

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе работы по подбору фа гов для диагностического биопрепарата нами была разработана схема выделения профагов из культуры B. Bronhsepta методом облучения УФЛ. Выделенные по данной схеме восемь фагов пассировали для повышения их литической активности и в дальнейшем проводили се лекцию по морфологическим признакам.

Проведённая селекция выделенных фагов позволила отобрать для дальнейшего ис пользования в разработке биопрепарата бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА, лизирующие 92,5% изученных культур, обладающие высокой литической активностью по Ап пельману 10-7 – 10-8, по Грациа 3,1 х 108 – 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл.

Далее приступили к разработке технологических параметров изготовления и контроля диагностического фагового биопрепарата. Бордетеллёзные индикаторные бактериофаги полу чали путем культивирования в мясопептонном бульоне с B. bronhsepta. В качестве индика торной культуры использовали штамм B. bronhsepta № 8344, обладающий характерными для своего вида морфологическими, биохимическими и культуральными свойствами.

Для повышения активности бактериофагов проводили пассажи. Опытным путем опре деляли оптимальное соотношение времени пассажа по литической активности фагов.

Установлено, что оптимальное время контакта культуры с фагами B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА составляет 7 часов. Этот режим мы использовали в дальнейших исследова.br.

br.

.

ниях.

Далее определили оптимальные количественные параметры соотношения фаговых корпускул и клеток бактерий B. Bronhsepta. Результаты проведенных исследований показа ли, что литическая активность бордетеллёзных фагов при разных соотношениях индикаторной культуры и фага была одинаково высокая и соответствовала 1,3 х 107 – 3,1 х 108 фаговых корпу скул в 1,0 см3. Оптимальное соотношение количества фагов B.br. – 7 УГСХА, B.br. – 1 УГСХА и культуры составляет 1:2, литическая активность фагов при этом составляет 2,1 х 108, 4,3 х активных корпускул в 1 мл соответственно.

Затем подобрали оптимальный температурный режим культивирования бактериофа гов B. Bronhsepta. Литическая активность фага B.br. – 1 УГСХА по методу Аппельмана при температуре 25 С, 37 С и 42 С составила 10-6,10-7 и 10-6;

по методу Грациа – 1,3 х 107, 3,1 х и 1,1 х 107, соответственно. Титр фага B.br. – 7 УГСХА составил по методу Аппельмана 10-7, 10 -8 и 10-7– при 25 С, 37 С и 42 С;

по методу Грациа 1,4 х 108, 4,3 х 109 и 2,6 х 108 активных корпускул в 1 мл соответственно.

На основании полученных данных можно сделать вывод: оптимальным для культиви рования фагов B. bronhsepta является температура 37 С.

Мы также изучили вопрос изменения литической активности бактериофагов с истече нием времени для изыскания оптимальных условий хранения и кратности пересева производ ственных штаммов, установления срока годности фаговых препаратов. Селекционированные бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА хранились во флаконах, при температуре 4С в виде лизатов бульонных культур, без консерванта. Литическую активность определяли по истечении 3, 6, 9 и 12 месяцев. Анализируя результаты проведенных исследований, можно сделать вывод, что по истечении 12 месяцев бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА не изменили своей литической активности и могут использоваться в качестве диагностическо го биопрепарата в течении данного срока.

Мы провели контроль бактериофагов. Из полученного объема отбирали пробу каждо го фага по 50 мл для определения чистоты физических свойств, титра фага по отношению к индикаторной культуре, спектра литической активности и специфичности.

Индикаторные фаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА не содержали посторонних Бактериофаги в медицине и ветеринарии примесей, фаголизаты были прозрачными, светло-желтого цвета, на питательных средах с по севами рост бактериальной микрофлоры и грибов отсутствовал, литическую активность инди каторных бактериофагов B.br. – 7 УГСХА и B.br. – 1 УГСХА определяли методами Аппельма.br.

br.

..br.

br.

.

на и Грациа (литическая активность индикаторных фагов составила от 10-7 по методу Аппель мана и от 3,1 х 108 до 4,3 х 109 по Грациа), спектр литического действия фага B.br. – 7 УГСХА составил 81,1%, фага B.br. – 1 УГСХА – 47,2% из числа изучаемых штаммов, совместный спектр лизиса гомологичных бактерий составил 92,5%. По результатам изучения специфично сти установлено, что индикаторные бордетеллёзные фаги являются неактивными в отношении штаммов других видов, родов.

Получив положительные результаты контроля, фаголизаты B.br. – 1 УГСХА и B.br. – УГСХА разлили по 5,0 мл в стерильные флаконы и герметично закрыли. На флаконы наклеили этикетки с указанием наименования фага, его литической активности и даты упаковки.

Следующим этапом научной работы явилась разработка оптимальных условий по становки реакции нарастания титра фага. Первоначально мы определили количественный показатель РНФ. Установили, что результат реакции является положительным (увеличение количества корпускул фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. 7 УГСХА более чем в 5 раз) в пробах при контаминации мясопептонного бульона бактериями B. bronhsepta в концентрации микробных клеток в 1 мл.

Затем определили оптимальное время постановки РНФ. В исследованиях использова ли воду, смывы с глотки, фекалии, контаминированные бактериями B. bronhsepta в концен трации 105, 104, 103, 102, 101 м.к. в 1 мл.

Опыты по изучению чувствительности реакции в зависимости от времени контакта исследуемого материала с фагом показали, что РНФ с 7-часовой экспозицией материала с фа гами B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА позволяет провести индикацию бактерий вида B.

bronhsepta в концентрации 104 м.к./мл за 19 часов.

В результате исследований установлено, что метод РНФ с предварительным подращи ванием исследуемого материала в течение 7 часов позволяет обнаружить бактерии B. bronh.

septa в количестве 10 м.к./мл, время проведения исследований составляет 26 часов.

Далее изучили возможность использования РНФ для выявления B. bronhsepta у до машних животных и в объектах внешней среды.

Пробы физиологического раствора в объеме 5 мл вносили в колбы, содержащие по мл МПБ, и контаминировали B. bronhsepta в концентрации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований нами установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации микробных клеток бордетелл в 1 мл физиологического раствора. Время исследований соста вило 26 часов.

У собак и кошек брали смыв физиологическим раствором с глотки, в объеме 5 мл.

Вносили в колбы, содержащие по 50 мл МПБ и контаминировали B. bronhsepta в концен трации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 103 микроб ных клеток бордетелл в 1 мл исследуемых смывов с глотки собак и кошек. Исследование со ставило 26 часов.

Пробы фекалий весом 5 г вносили в стерильные колбы, содержащие по 50 мл МПБ и контаминировали B. bronhsepta в концентрации от 101 до 105 м.к./мл.

По результатам проведенных исследований установлено, что увеличение титра фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 104 микроб Бактериофаги в медицине и ветеринарии ных клеток бордетелл в 1 г фекалий. Чувствительность реакции снизилась до этого уровня из-за обильного обсеменения фекалий посторонней микрофлорой, что повлияло на условия оптимального взаимодействия фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА с B. bronhsepta.

Мы провели повторное исследование исходных проб фекалий с увеличением времени экспозиции материала с фагом до 16 часов, это позволило повысить чувствительность РНФ до 103 м.к./мл, без выделения чистой культуры, при наличии посторонней микрофлоры.

Заключение. Таким образом, нами разработаны технологические параметры изготов ления и контроля диагностического биопрепарата «B.br. – 11 УГСХА» на основе выделенных и изученных фагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА и параметры постановки реакции на.br.

br.

..br.

br.

.

растания титра фага для ускоренной индикации B. bronhsepta в объектах внешней среды.

Метод РНФ с использованием биопрепарата «B.br. – 11 УГСХА» позволяет обнаружить ука B.br.

.br.

br.

.

занные бактерии в концентрации от 10 м.к. в 1 мл исследуемого материала за 26 часов.

Разработанный нами диагностический биопрепарат «B.br. – 11 УГСХА» рекомендует B.br.

.br.

br.

.

ся для индикации и идентификации В. bronhsepta.

Библиографический список 1. Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 1961. – 521 с.

2. Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Никишина Н.М. Учебно-методическое пособие по методам общей бактериологии. -Ульяновск, 1998. – 151 с.

3. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.

4. Тимаков В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // М., 1962. – С. 65-71.

5. Baker D.G. Natural pathogens of laboratory animals: their effects on research / D.G.

Baker // ASM Press, Washington, D.C. - 2003.

6. Bjornstad.N. Evolution and emergence of Bordetella in humans /.N. Bjornstad, E.T.

Harvill // Trends Microbiol. – 2005. – N 13. – Р. 355-359.

7. Yuk M.H. Modulation of host immune responses, induction of apoptosis and inhibition of NF-кВ activation by the Boretea type III secretion system / M.H. Yuk, E.Т. Harvill, P.A. Cotter, J.F.

Miller // Mol. Micmbiol. – 2000. - №35. – Р.991-1004.

8. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора/ Д.А. Васильев [и др.] // Вест ник УГСХА. – 2012. - №3(19) – С. 69- THE TECHNOLOGY OF CONSTRUCTION OF DIAGNOSTIC BIOLOGICAL PREPARATION ON THE BASIS OF BACTERIOPHAGES BORDETELLA BRONCHISEPTICA AND THE PROSPECTS FOR ITS USE Vasileva Y.B., Vasilev D.А., Semanina Е.N.

Кey words: agnosts of boreteoss, Boretea bronhsepta, phage bopreparatons.

The arte presents the ata on the eaboraton of the sheme natng Boretea bronh septa n the objets of veternary surveane wth the hep of reaton of rse of ttre of the phage wth the use of new agnost preparaton. The resuts of eveopment of tehnooga parameters of manufature of atve an spefi booga preparaton on the bass of boreteoss phages are presente.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К РАЗМЕЩЕНИЮ, УСТРОЙСТВУ, ОБОРУДОВАНИЮ, КОНТРОЛЮ И ЭКСПЛУАТАЦИИ АСЕПТИЧЕСКИХ И КОНТРОЛИРУЕМЫХ ОБЪЕКТОВ.В.Т.Ч. И ПРИ РАБОТАХ С БАКТЕРИОФАГАМИ.

Григорьев В.В., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Селькова Е.П.

ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского -Практическое отсутствие надлежащих нормативно правовых актов по размещению, устройству, оборудованию, контролю и эксплуатации асептических и контролируемых объ ектов (далее по тексту – АКО), в том числе и группы риска Г II для работ с бактериофагами.

- В России не существует аттестованных согласно утвержденному «Положению 2003) лабораторных животных, питомников и экспериментально-биологических клиник (вивариев) - Высоко эффективные фильтры (Н14) Шкафы-боксы биологической безопасности с ламинарным потоком не проходят ежегодный контроль своей защитной эффективности, в. т.ч.


отсутствуют требования к помещениям, в которых установлены выше указанные шкафы-бок сы.

- Высоко эффективные фильтры, установленные вентиляционных системах, обслу живающие асептические и контролируемые (группа риска Г II), в лучшем случае, проходят упрощённый контроль на их целостность по заниженной концентрации исходного фонового тестового аэрозоля(5х106 ач0,3). Защитная эффективность указанных фильтров не проводится, из-за отсутствия нормативных требований, т.е. 0,5х109ач0,3) - Не проводится аттестация рабочих мест помещений АКО по времени деконтамина ции их воздушной среды и определению застойных (невентилируемых) зон.

- Существующей нормативной документации не предусмотрен контроль воздуха про ницания ограждающих строительных конструкций (далее по тексту – ОСК) помещений АКО и расчёт их прочности при возникновении нештатной ситуации на одной из вентиляционных систем, обслуживающих помещения АКО.

- Отсутствие мониторингового экспресс контроля микробиологической контаминации воздушной среды помещений АКО приводит к непредсказуемым последствиям в фармацевти ческом производстве, в родовспомогательных и операционных боксах и.т.д.

В настоящее время специалистами МНИИЭМ им.Г.Н. Габричевского Роспотребнадзо ра разработаны и направлены на утверждение Главному Врачу России ряд нормативно право вых актов санитарно- гигиенических требований, обеспечивающих решение перечисленных выше проблем.

До утверждения выше указанных актов, согласно Федеральному закону от 27 декабря 2002 г. №184-ФЗ «О техническом регулировании» и Уставу Института МИИИЭМ им, Г.Н. Га бричевского Роспотребнадзора специалистами Института разработаны и размещены в Интер нет следующие стандарты организации добровольного применения:

1. СТОР 2.2.1.0001-11 «Гигиенические требования к размещению, устройству, обору дованию, контролю и эксплуатации асептических и контролируемых объектов.

2. МУ СТОР 2.2.1.0002-11 «Контроль защитной эффективности шкафов-боксов с ла минарным потоком воздуха класса биологической безопасности и их боксовых помещений»

3. МУ СТОР 2.2.1.0003-11 «Контроль защитной эффективности высоко эффективных фильтров, установленных вентиляционных системах, обслуживающих помещения АКО.

4. МУ СТОР 2.2.1.0004- Бактериофаги в медицине и ветеринарии 5. МУ СТОР 2.2.1.0005- 6. МУ СТОР 2.2.1.0006- 7. МУ СТОР 2.2.1.0007- Уровень выше указанных разработок и методик подтвержден в настоящее время ря дом публикаций в ФИПС РОСПАТЕНТА и защищён его патентами.

УДК 577. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМБИНАТОРНЫХ ФАГОВЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЦЕЛЫМ КЛЕТКАМ Дыкман Л.А., доктор биологических наук, с.н.с., dykman@ibppm.sgu.ru Староверов С.А., доктор биологических наук, staroverov@ibppm.sgu.ru Щеголев C.Ю., доктор химических наук, профессор, su@ibppm.sgu.ru Богатырев В.А., доктор биологических наук, с.н.с., bog@ibppm.sgu.ru Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Ключевые слова: фаговый дисплей, биопаннинг, биоимиджинг, Azosprum brasense редставлены данные об использовании фагового дисплея для полуения антител к целым клеткам и применении фаговых мини-антител для детекции клеток.

Введение. Традиционно биологическими компонентами, используемыми для спец ифической детекции клеток, являются поликлональные и моноклональные антитела (АТ), ко торые широко применяются в производстве диагностических тест-систем. В последнее время для решения подобных задач в молекулярной биологии стали использоваться генно-инженер ные технологии клонирования узнающих фрагментов – гипервариабельных участков имму ноглобулинов, которые являются более дешевыми и могут конкурировать по селективности с гибридомными технологиям. К такому методу относится технология фагового дисплея, соз данная Джорджем Смитом [1]. Впервые возможность получения одноцепочечных последова тельностей, составленных из вариабельных доменов АТ, в составе гибридного белка оболочки фага, была продемонстрирована Мак Кафферти с соавт. [2]. В дальнейшем были сконструи рованы библиотеки, в которых комбинации легких и тяжелых цепей АТ продуцировались в составе фагового белка в виде мини-АТ – одноцепочечных АТ, гетеродимеров или отдельных растворимых молекул.

В настоящее время в литературе встречается достаточное количество данных о при менении АТ, полученных методом фагового дисплея. В основном они используются в иммуно анализе и иммунотерапии, например, для выявления и лечения гепатоклеточной карциномы, лимфатической лейкемии, меланомы и рака груди. Фрагменты scFv являются ценным инстру ментом в иммунотерапии рака и могут быть использованы как «внутриклеточные АТ», из за уменьшения их размера по сравнению с Fab фрагментами. С помощью техники фагового дисплея могут быть получены разнообразные производные для векторной генной терапии, а также для создания специфически-направленных лекарственных средств. Помимо этого воз можно применение мини-АТ в протеомике, в технологиях создания биосенсоров [3].

Кроме того, АТ, полученные с помощью технологии фагового дисплея, успешно ис Бактериофаги в медицине и ветеринарии пользуются для идентификации бактерий [4]. При этом чаще всего, для получения АТ исполь зуют изолированные бактериальные антигены (АГ). Имеются лишь отдельные работы, кото рые описывают получение АТ к целым бактериальным клеткам, в частности, стрептококкам [5]. На наш взгляд, изучение возможности получения мини-АТ на целые клетки (животные и бактериальные) представляет значительный интерес. Этому вопросу посвящено наше иссле дование.

Материалы и методы исследований. В распоряжении Лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН имеются две библиотеки АТ: овечья комбинаторная фаговая библиотека, любез но предоставленная профессором университета г. Абердина У. Харрисом [6], и комбинаторная фагмидная библиотека scFv мыши, сконструированная в Филиале института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН [7]. Процедуру биопаннинга проводили согласно [6].

Результаты исследований и их обсуждение.

Биоимиджинг опухолевых клеток с использованием фаговых антител и наноча стиц золота.

Целью данного этапа работы являлось получение мини-АТ на мембранные структуры опухолевых клеток, синтез конъюгатов мини-АТ с золотыми нанооболочками (НО) и примене ние данных нанокомплексов для мечения опухолевых клеток.

В качестве АГ использовали целые клетки линии СПЭВ. СПЭВ – клеточная линия почек эмбриона свиньи;

морфология – эпителиоподобная, способ культивирования – моно слойный. На поверхности экспонированы опухолевые АГ лейковирусов (Мезон–Пфайфер-по добных) и онкорнавирусов А и С.

Мини-АТ на клетки СПЭВ были получены из овечьей комбинаторной фаговой библи отеки. Для получения мини-АТ было проведено 3 раунда селекции, полученные специфичные фаги были проверены методом дот-анализа. В качестве вторичной метки использовали кроли чьи антифаговые АТ, меченные золотыми НО.

На первом шаге клетки СПЭВ инкубировали с мини-АТ. Затем меченые фаговыми АТ (опыт) и немеченые (контроль) клетки инкубировали с конъюгатами золотых НО с кро личьими антифаговыми АТ. Конъюгаты золотых НО с антифаговыми АТ биоспецифически связывались лишь с клетками, на поверхности которых присутствовали мини-АТ, а в случае «контроля» биоспецифического мечения не происходило.

Фотографии клеток СПЭВ, меченых НО, были получены методом темнопольной ми кроскопии. Данный метод позволяет регистрировать только рассеянный свет от исследуемого объекта, что делает его очень удобным для визуализации клеток, меченных ЗНЧ. Фотографии получали с помощью микроскопа Leica DM 2500, оборудованного цветной ПЗС-камерой, с ис пользованием объектива 40. Все изображения меченых и контрольных клеток получали при одинаковых условиях освещения.

На рис. 1a,б приведены темнопольные снимки исходных клеток СПЭВ и золотых НО на ядрах из двуокиси кремния, соответственно. НО интенсивно рассеивают свет и выглядят на фотографиях как цветные пятна с диаметром около 1 мкм. Стоит отметить, что реальный размер НО гораздо меньше (около 140 нм). Как можно заметить, на снимках исходных клеток СПЭВ (рис. 1а) подобные цветные пятна не встречаются.

На рис. 1в,г приведены темнопольные фотографии клеток СПЭВ, которые инкубиро вали только с конъюгатами НО с антифаговыми АТ (в), а также клеток СПЭВ, которые сначала инкубировали с мини-АТ и затем с конъюгатами НО (г). На темнопольных изображениях от четливо видна разница между специфически (мини-АТ + конъюгат), неспецифически (только конъюгат НО с антифаговыми АТ) мечеными и немечеными клетками.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии (a) (б) (в) (г) Рис. 1. Темнопольные изображения исходных клеток СПЭВ (a), золотых НО на ядрах из двуокиси кремния (б), исходных клеток СПЭВ, инкубированных с конъюгатами золотых НО (негативный контроль, в), и клеток СПЭВ, которые инкубировали с мини АТ и затем с конъюгатами золотых НО (г). На вставке показан увеличенный фрагмент, на котором отчетливо видно рассеяние от адсорбированных золотых НО.

Получение мини-антител к поверхностным антигенам Azospirillum brasilense Sp245 и их использование для детекции микробных клеток Значительный интерес, на наш взгляд, представляет изучение возможности получе ния мини-АТ на азотфиксирующие бактерии рода Azosprum, участвующие в ассоциативных взаимоотношениях с растениями, для решения вопросов быстрой идентификации бактерий в окружающей среде. В связи с этим, основная задача данного этапа наших исследований заклю чалась в получении фаговых АТ на АГ клеточной поверхности типового штамма A. brasense Sp245 с использованием овечьей фаговой библиотеки, а также изучение возможности их при менения при анализе поверхностных АГ клеточных структур и детекции клеток с помощью микроскопических методов.

Нами было проведено 3 раунда селекции мини-АТ на целые клетки A. brasense Sp и 1 раунд селекции на ЛПС и флагеллин клеток этого штамма с использованием клонов, об ладающих более высокой чувствительностью и продуктивной активностью. Титр полученных фаговых мини-АТ составил 1:8000.

Электронно-микроскопическую идентификацию взаимодействия клеток A. brasense Sp245 с мини-АТ проводили с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Carl Zeiss, Гер 245 Carl, мания). Фотографии, полученные с использованием электронной микроскопии, представлены на рис. 2. Как видно из рисунков, полученные нами фаговые мини-АТ располагаются по всей Бактериофаги в медицине и ветеринарии клеточной поверхности в случае ЛПС и, вероятно, на «обломке» жгутика в случае с флагел лином. Из данного эксперимента можно сделать вывод, что на основе мини-АТ и КЗ можно разработать тест-систему для изучения клеточной поверхности бактерий.

а б Рис. 2. Электронно-микроскопическое выявление АГ клеточной поверхности A.

brasense S245с помощью мини-АТ на ЛПС (а) и флагеллин (б).

Затем мы использовали полученные мини-АТ на целые клетки A. brasense Sp245 для идентификации азоспирилл на поверхности корня пшеницы. На рис. 3 приведена микрофото графия корневого волоска, полученная на конфокальном лазерном микроскопе TCS SP5 (Leica, Германия). Выявление бактериальных клеток проводили последовательной инкубацией пре парата корней пшеницы с азоспириллами (7 суток), мини-АТ на A. brasense Sp245 (сутки), кроличьими антифаговыми АТ (сутки) и козьими антикроличьими АТ, меченными флуорес центным красителем Alexa Fluor 594 (Invitrogen, США).

Рис. 3. Выявление клеток A. brasense S245 на поверхности корневого волоска пшеницы (конфокальная микроскопия).

Мы полагаем, что представленные в настоящем разделе результаты могут быть ис пользованы для создания теста быстрой детекции микробных клеток и оценки экспонирован ности тех или иных антигенных детерминант на клеточной поверхности бактерий [8-10].

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-00629-а.

Библиографический список 1. Smith G.P. Filamentous phage fusion: Novel expression vectors that display cloned anti gens on the surface of the virion surface // Science. – 1985. – V. 228. – P. 1315-1317.

2. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: Filamentous phage displaying antibody variable domains // Nature. – 1990. – V. 348. – P. 552-554.

3. Тикунова Н.В., Морозова В.В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов:

применение для отбора рекомбинантных антител // Acta Naturae. – 2009. – № 3. – С. 22-31.

4. Paoli G., Brewster J.D. Identification of the surface antigen recognized by a Lstera monoytogenes-specific phage-displayed antibody fragment and its presence in different physiologi Бактериофаги в медицине и ветеринарии cal conditions // J. Rapid Meth. Automat. Microbiol. – 2007. – V. 4. – P. 74-83.

5. De Greeff A., van Alphen L., Smith H.E. Selection of recombinant antibodies specific for pathogenic Streptoous sus by subtractive phage display // Infect. Immun. – 2000. – V. 68. – P.

3949-3955.

6. Charlton K.A., Moyle S., Porter A.J.R., Harris W.J. Analysis of the diversity of a sheep antibody repertoire as revealed from a bacteriophage display library // J. Immunol. – 2000. – V. 164.

– P. 6221-6229.

7. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Улитин А.Б., Маркова Е.В., Мареева Т.Ю., Бы стров Н.С., Бровко Ф.А., Несмеянов В.А. Получение мини-антител против гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека с использованием библиотеки scFv мыши // Био орг. химия. – 2002. – Т. 28. – С. 126-134.

8. Dykman L.A., Staroverov S.A., Guliy.I., Ignatov.V., Fomin A.S., Vidyasheva I.V., Karavaeva.A., Bunin V.D., Burygin G.L. Preparation of miniantibodies to Azosprum brasense Sp245 surface antigens and their use for bacterial detection // J. Immunoassay Immunochem. – 2012.

– V. 33. – P. 115-127.

9. Староверов С.А., Видяшева И.В., Фомин А.С., Василенко О.А., Малинин М.Л., Га балов К.П., Богатырев В.А., Дыкман Л.А. Разработка иммунозолотых диагностических си стем для идентификации возбудителя туберкулеза in stu // Российский ветеринарный журнал.

– 2011. – № 2. – С. 29-32.

10. Khanadeev V.A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., Ili.A., A.,.,.N., N.,.,.A., A.,.,.V., V.,.,.A., A.,., neva E.S., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Quantitative cell bioimaging using gold nanoshell conjugates and phage antibodies // J. Biophotonics. – 2011. – V. 4. – P. 74-83.

USING THE COMBINATORIAL PHAGE LIBRARY TO OBTAIN ANTIBODIES TO WHOLE CELLS Dykman L.A., Staroverov S.A., Shchyogolev S.Yu., Bogatyrev V.A.

Key words: phage spay, bopannng, bomagng, Azosprum brasense The arte presents ata on the use of phage spay tehnque to obtan the antboes to whoe es an the use of phage mn-antboes for es eteton.

УДК 577. ТЕХНОЛОГИЯ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ АНТИТЕЛ Дыкман Л.А., доктор биологических наук, с.н.с.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Тел. +7(8452)970403, E-mail dykman@ibppm.sgu.ru Ключевые слова: фаговый дисплей, нитатые бактериофаги, комбинаторные библи отеки миниантител, биопаннинг редставлены современные данные об использовании фагового дисплея антител в Бактериофаги в медицине и ветеринарии медико-биологиеских исследованиях.

Антитела (АТ) являются одним из эффекторных компонентов иммунной системы.

Высокоспецифичное, высокоаффинное взаимодействие АТ с антигенами (АГ) позволяет ис пользовать их в исследовательских, аналитических и терапевтических целях. Исторически первым источником АТ была сыворотка иммунных животных и человека. Получаемые таким образом АТ содержат набор иммуноглобулинов разных классов и подклассов, специфично уз нающих «свой» АГ. Различные АТ сыворотки узнают несколько эпитопов АГ. Таким образом, сыворотка полиспецифична, что в ряде случаев является недостатком. Дальнейшим развитием способов получения АТ явилось создание гибридомной технологии [1], которая позволяет по лучать АТ, продуцируемые одним клеточным клоном, узнающие один эпитоп и сохраняющие свои свойства во многих генерациях гибридной клетки (моноклональные АТ). К достоинствам моноклональных АТ можно отнести высокую специфичность, химическую однородность, воз можность получения в больших количествах. К недостаткам – то, что технология получения моноклональных АТ разработана для мышей и крыс и является трудноприменимой в случае АТ человека, в то время как для терапии требуются именно человеческие иммуноглобулины.

Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается преодолеть недостаток иммуногенности потенциальных АГ.

Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекуляр ного клонирования фрагментов генов АТ. Одним из таких методов является техника фагового дисплея АТ, впервые предложенная в работе [2]. Эти исследователи показали возможность по лучения одноцепочечных последовательностей, составленных из вариабельных доменов АТ, в составе гибридного белка оболочки фага. Они же продемонстрировали возможность высоко эффективной аффинной селекции клонов, несущих антигенспецифические одноцепочечные АТ (миниантитела).

Основой метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабель ные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов соединены случайным образом и пред ставлены на поверхности нитевидного бактериофага. Каждый бактериофаг, как и В-лимфоцит, экспрессирует АТ единственной специфичности. При достаточно большом размере библио теки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром АТ в организме. Фаги, несущие АГ-связывающие фрагменты АТ (scFv, Fab) нужной специфичности, могут быть ото браны на иммобилизованном АГ.

Создание фагового дисплея АТ обязательно включает следующие этапы: выделение мРНК из иммунных или интактных лимфоцитов, синтез на этой матрице вариабельных фраг ментов генов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, объединение генов легких и тяже лых цепей с помощью олигонуклеотидного линкера, клонирование этих генов в фаг, инфици рование этим вектором E. o (рис. 1). В результате таких манипуляций получают библиотеки, в которых комбинации легких и тяжелых цепей экспрессируются в составе фагового белка в виде одноцепочечных АТ, гетеродимеров или отдельных растворимых молекул.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Рис. 1. Схема конструирования фаговой библиотеки антител.

В технологии фагового дисплея чаще всего используют нелизирующие нитевидные фаги (М13, f1, fd и др.). Их вирион содержит кольцевую одноцепочечную ДНК, генетическая организация и последовательность которой известна для многих представителей данной груп пы фагов. Размер генома составляет около 6000 нуклеотидов. Капсид вирусной частицы устро ен одинаково у представителей всей группы и образован 5 структурными белками. Во всех сконструированных к настоящему времени фаговых библиотеках фрагменты АТ экспрессиру ются в составе гибридных белков на основе капсидного белка g3p. G3p является самым боль шим из структурных белков нитевидных фагов (406 аминокислотных остатков, М = 42 КДа).

Он состоит из двух доменов: С-концевой домен встраивается в вирион и играет роль в сборке полноценного вириона, а N-концевой домен выполняет функцию адсорбции на F-пилях бак терии-хозяина. Хотя для конструирования фаговых библиотек успешно использовалось вве дение целевых последовательностей по нескольким разным сайтам, минимальное влияние на инфекционность вириона оказывали вставки, отстоящие на несколько аминокислотных остат ков от N-конца белка. Лабильность конформации белка g3p и его терминальное расположение на вирионе являются благоприятными факторами для использования его в качестве основы для конструирования гибридных белков, особенно в тех случаях, когда не требуется получать большое количество копий гибридного белка в составе каждого вириона.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |
 

Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.