авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |

«Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой ...»

-- [ Страница 5 ] --

К достоинствам метода фагового дисплея можно отнести возможность отбора кло нов-продуцентов миниантител n vtro, минуя стадию иммунизации животных, возможность получения АТ к аутоантигенам, токсинам и слабоиммуногенным соединениям, отсутствие не обходимости использования лабораторных животных и поддержания долговременных культур клеток эукариот, сокращение времени получения индивидуальных клонов до 10-14 дней по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии, относительную про стоту получения миниантител и их низкую себестоимость, возможность создания гибридных Бактериофаги в медицине и ветеринарии молекул АТ с маркерными белками.

Фаговый дисплей – молекулярная техника, которая позволяет экспрессировать чуже родные белки на поверхности фаговых частиц. Фаги, трансформированные таким образом, становятся способны не только экспрессировать и переносить чужеродные белки, но и спо собны к дальнейшей репликации чужеродной ДНК. Фаговый дисплей значительно расширяет число нуклеотидных последовательностей, которые могут быть преобразованы в популяции различных пептидов и белков, позволяя отбирать те из них, которые имеют интересующие ис следователя свойства. Первые опыты фагового дисплея включали варианты только с одним экс прессированным на поверхности фаговой частицы пептидом на фоне всей популяции белков фагов дикого типа (пептидные библиотеки) [3]. В настоящее время масштабы и возможности метода значительно увеличились. Естественные и синтетические пептиды, белки и белковые домены, а также синтетические АТ можно экспрессировать на поверхности фаговых частиц.

И для обычной гибридомы и для фаговых АТ источником материала является обшир ное разнообразие репертуара АТ млекопитающих. Фундаментальное различие в том, что для производства АТ посредством гибридомной технологии применяют иммортализацию проду цирующих АТ В-клеток, в то время как фаговый дисплей АТ использует гены, которые кодиру ют вариабельные участки АТ. V-гены млекопитающих, которые кодируют вариабельные обла сти АТ, являются источником материала для конструирования фаговых библиотек АТ. Библи отеки по существу разделяются на две категории в зависимости от того, получены эти гены из неиммунизированных животных (сингл-пот библиотеки) или животных, иммунизированных целевым АГ (постиммунные библиотеки).



В широком смысле и фаговый дисплей и АТ, полученные посредством гибридомной технологии, могут использоваться в одном диапазоне применений, например ELISA, вестерн блоттинг и иммуноцитохимия. Однако фаговый дисплей имеет некоторые преимущества в сравнении с гибридомной технологией. Одно из ограничений гибридомной технологии состо ит в том, что использование гибридомных АТ должно вестись при параметрах, приближенных к физиологическим, что может быть неудобным для некоторых исследуемых объектов. Техно логия фагового дисплея позволяет изолировать АТ с достаточной связывающей способностью при любых физиологических условиях.

Кроме иммуноанализа, миниантитела используют в иммунотерапевтической практике [4], в протеомике [5], в технологиях создания биосенсоров [6]. Обширную информацию о ме тоде и вариантах его применения можно почерпнуть в обзорах [7-12].

Работа с библиотекой сводится к тому, чтобы изначальное большое разнообразие ре комбинантных клонов уменьшить до разумного количества, которое можно детально анализи ровать. Основа процедуры скрининга – аффинная селекция (биопаннинг) и она имеет несколь ко базовых шагов (рис. 2):

1) амплификация начальной библиотеки;

2) инкубация фаговых частиц с иммобилизованным АГ;

3) отмывка и удаление несвязавшихся фаговых частиц;

4) элюция связавшихся фагов;

5) инфицирование элюированными частицами клеток-хозяев и дальнейшая их ампли фикация либо индивидуальное расселение колоний.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Рис. 2. Схема биопаннинга Раунды аффинной селекции (биопаннинга), усиливающие селектированную библио теку, повторяются, как правило, от 3 до 6 раз. В конечном счете, отбирают отдельные клоны фагов, имеющие наибольшее сродство к АГ.

Используются различные формы отбора фага, включая прямое связывание фага с АГ, присоединенным к матриксу (на колонке) или же сорбированным на чашках или иммунотъю бах (основной способ), или с АГ на поверхности клеток. Причем при получении АТ к гапте нам, последние приходится предварительно конъюгировать с белком-носителем.

В последние годы только на фармацевтическом рынке США продается более 14 анти тел, антигенсвязывающие домены которых получены методом фагового дисплея [13]. Все это объясняет факт притока крупных компаний, таких как Morphosys GmbH (Германия;

http://www.

morphosys.com);

Cambridge Antibody Technology (Великобритания;

http://www.catplc.co.uk ) и Dyax (США;

http://dyax.com ) и др., в область разработки и применения комбинаторных фаговых библиотек фрагментов антител.

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-00629-а.

Библиографический список 1. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predeter mined specificity // Nature. - 1975. - V. 256. - P. 495-497.

2. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Phage antibodies: Filamentous phage displaying antibody variable domains // Nature. - 1990. - V. 348. - P. 552-554.

3. Smith G.P. Filamentous phage fusion: Novel expression vectors that display cloned anti gens on the surface of the viron // Science. - 1985. - V. 228. - P. 1315-1317.





4. Harris W.J., Cunniugham C. Antibody therapeutics. - Berlin: Springer-Verlag, 1995, - 150 p.

5. Liu B., Marks J.D. Applying phage antibodies to proteomics: Selecting single chain Fv Бактериофаги в медицине и ветеринарии antibodies to antigens blotted on nitrocellulose // Anal. Biochem. - 2000. - V. 286. - P. 119-128.

6. Stich N., Gandhum A., Matyushin V., Raats J., Mayer C., Alguel Y., Schalkhammer T.

Phage display antibody-based proteomic device using resonanace-enhanced detection // J. Nanosci.

Nanotechnol. - 2002. - V. 2 - P. 375-381.

7. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technique // Ann. Rev. Immunol. - 1994. - V. 12. - P. 433-455.

8. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage display // Chem. Rev. - 1997. - V. 97. - P. 391-410.

9. Willats W.G.T. Phage display: Practicalities and prospects // Plant Mol. Biol. - 2002. - V.

50. - P. 837-854.

10. Clark M. V gene selection n vtro (phage libraries) – making assembled repertoires of antibody heavy and light chain variable domains // In: John Humphrey Advanced Lecture Series in Im munology: Immunology in Health and Disease / Eds. Asherson G., McMichael A.F.R.S., Nesmeyanov V. - London, Moscow, 2002.

11. Yau K.Y.F., Lee H., Hall J.C. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies // Biotechnol. Adv. - 2003. - V. 21. - P. 599-637.

12. Тикунова Н.В., Морозова В.В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофа гов: применение для отбора рекомбинантных антител // Acta Naturae. - 2009. - № 3. - С. 22-31.

13. Azzazy H., Highsmith W. Phage display technology: clinical applications and recent in novations // Clin. Biochem. - 2002. - V. 35. - P. 425-445.

ANTIBODY PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY Dykman L.A.

Key words: phage spay, fiamentous baterophage, ombnatora brares, bopannng The arte presents the urrent ata on the use of antboy phage spay n bomea researh.

УДК 619:616- БОКСЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ.

ОСНОВЫ ЭКСПЛУАТАЦИИ И ОБСЛУЖИВАНИЯ.

Ененко А.А., начальник аналитической лаборатории ЗАО «Ламинарные системы», г.Миасс Тел. +7(3513)54-47- Деятельность химических, радиологических, бактериологических и других лаборато рий связана с использованием различного рода защитного лабораторного оборудования. Тра диционным было использование активной вытяжной системы, которая, до определенного вре мени, была единственным средством удаления и контроля распространения аэрозолей агентов, образующихся в процессе работы. Однако на сегодняшний день только вытяжной вентиляции недостаточно для обеспечения безопасной работы персонала, и защиты окружающей среды.

Помимо этого остро стоит вопрос об организации области пространства с чистой воздушной Бактериофаги в медицине и ветеринарии средой, необходимой для предупреждения попадания на продукт аэрозольных загрязнений из окружающей среды.

Современный рынок защитного лабораторного оборудования представляет широкий спектр продуктов, относящихся к лабораторной безопасности, которые, однако, можно разде лить на 3 основные группы: химические вытяжные шкафы;

ламинарные укрытия (или лами нарные боксы), и боксы микробиологической безопасности.

Химические вытяжные шкафы (рис. 1, а) по сути, представляют собой улучшен ную версию вытяжных зонтов, подключаемых к активной вытяжной системе. Принцип работы шкафа заключается в удалении паров вредных веществ из рабочей камеры в жестко подклю ченную активную систему вытяжной вентиляции, с помощью направленного внутрь шкафа через рабочий проем воздушного потока. Вытяжной шкаф обеспечивает только защиту опера тора от паров и аэрозолей вредных веществ, с которыми производится работа.

а б Рис. 1. а – химический вытяжной шкаф, б – ламинарное укрытие.

Ламинарные укрытия (или ламинарные боксы) (рис. 1, б) предназначены для созда ния беспылевой абактериальной воздушной среды и применяются при оснащении отдельных рабочих мест медицинских, фармацевтических и других учреждений с высокими требовани ями к чистоте воздуха в рабочей зоне. Бокс используется при работе с препаратами и бакте риальными культурами, не представляющими угрозы здоровью оператора, когда необходима защита рабочего материала от загрязнения из окружающей среды, или работа с объектом тре бует стерильной рабочей зоны. Воздух из помещения проходит через HEPA фильтр и подается в рабочую камеру однонаправленным вертикальным ниспадающим потоком. Из рабочей зоны воздух попадает обратно в помещение. Следует отметить, что ламинарное укрытие не обеспе чивает защиты ни оператора, ни окружающей среды.

Наиболее востребованным типом защитного лабораторного оборудования сегодня являются боксы микробиологической безопасности. Даже среди специалистов в области инженерного обеспечения биологической безопасности существует путаница в терминах, ка сающихся БМБ. Это связанно с тем, что на сегодняшний день в РФ не существует единой согласованной системы нормативно технической документации, определяющей минимум тех нических и эксплуатационных характеристики БМБ, а также регламентирующий порядок экс Бактериофаги в медицине и ветеринарии плуатации и проведения проверок.

С 1 декабря 2011 года в силу вступил новый российский стандарт ГОСТ Р ЕН 12469 2010 «Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности», который является прямым переводом европейской нормы EN 12469-2000. Данный документ определяет технические требования, конструкцию БМБ, а так же состав, периодичность и ме тодики проверок эксплуатационных характеристик БМБ. Согласно новому стандарту отличи тельной особенностью всех боксов микробиологической безопасности является возможность работы с потенциально опасными и опасными микроорганизмами. Также стандарт разделяет все БМБ на три класса.

БМБ I класса (по ГОСТ Р ЕН 12469-2010) – это БМБ с рабоим проемом, ерез кото рый оператор может проводить манипуляции внутри бокса. Бокс должен быть сконструиро ван таким образом, то бы обеспеивать защиту оператора от выброса диспергированных контаминированных астиц, образовавшихся внутри бокса. Это достигается с помощью на правленного внутрь бокса ерез рабоий проем воздушного потока, с последующей его филь трацией и удаления из бокса.

Таким образом, БМБ I класса предназначен для обеспечения защиты оператора и окружающей среды при работе с вредными для здоровья человека агентами. Действие бокса основано на принудительном удалении опасных веществ из рабочей зоны через НЕРА фильтр и выбросе их обратно в помещение или во внешнюю вытяжную систему. При работе с двумя агентами исключается их перекрестная контаминация за счет создания восходящего потока воздуха. Схема потоков воздуха БМБ I класса приведена на рис.2,а.

а б в Рис.2. а – БМБ I класса, б – БМБ II класса, в – БМБ III класса.

БМБ II класса (по ГОСТ Р ЕН 12469-2010) – это БМБ с рабоим проемом, ерез ко торый оператор может проводить манипуляции внутри бокса. Бокс должен быть сконстру ирован таким образом, то бы оператор был защищен, риск загрязнения продукта и пере крестного загрязнения низок, а удаление возникающих загрязнений обеспеивалось с помощью профильтрованного воздушного потока, циркулирующего внутри бокса, а также с помощью фильтрации удаляемого из бокса воздуха.

Другими словами, БМБ II класса предназначен для защиты оператора и окружающей Бактериофаги в медицине и ветеринарии среды от контаминации диспергированными аэрозольными частицами, возникающими при выполнении работ с биологическими агентами и микроорганизмами внутри камеры бокса, а также для защиты рабочих агентов от внешней и перекрестной контаминации.

Принцип действия бокса основан на принудительной рециркуляции части воздуха в замкнутом объеме через НЕРА фильтр. Воздух, проходя через приточный НЕРА фильтр, очи щается от аэрогенных загрязнений и подается в рабочую зону однонаправленным нисходящим потоком, тем самым создавая в камере бокса чистую воздушную среду и предотвращая пере крестную контаминацию. Часть нагнетаемого вентилятором в камеру повышенного давления воздуха (обычно около 30%) через выпускной НЕРА фильтр выбрасывается в помещение. Из за искусственно созданного разряжения происходит подсос воздуха в рабочую камеру через рабочий проем. Благодаря этому устанавливается воздушная завеса, обеспечивающая защиту оператора, см. рис. 2,б.

Наконец БМБ III класса (по ГОСТ Р ЕН 12469-2010) – БМБ, в котором рабоая зона полностью изолирована, а оператор отделен от рабоего места физиеским барьером (т.е.

ператки механиески соединены с боксом). рофильтрованный воздух постоянно поступает в бокс, а удаляемый из БМБ воздух фильтруется для предотвращения попадания микроорга низмов в окружающую среду.

Принцип действия бокса основан на принудительной подаче очищенного воздуха в рабочую камеру с последующим удалением контаминированного воздуха через двухступен чатую систему очистки. Воздух, проходя через НЕРА фильтр, очищается от аэрогенных за грязнений и подается в рабочую зону однонаправленным нисходящим потоком. Воздух из рабочей камеры удаляется в помещение или систему вытяжной вентиляции, предварительно пройдя двухступенчатую очистку. Манипуляции с рабочим материалом осуществляются через перчатки.

Важным вопросом, касающимся БМБ, являются проверки эксплуатационных харак теристик боксов. Основными документами, обязательными для исполнения и регламентиру ющими эксплуатацию и минимум проверок БМБ при работе с микроорганизмами различных групп патогенности, являются Санитарные Правила.

СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп пато IV генности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» требуют проводить проверку скорости входящего потока и контроля целостности фильтра боксов микробиологической без опасности II класса. Безусловно, скорость входящего потока является основным фактором, определяющим защиту оператора, однако при этом методика измерения скорости входящего потока СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08 не регламентируется.

Существует распространенное заблуждение, что скорость входящего потока в боксах II класса равномерна вдоль всего рабочего проема. Это не так. Рассмотрим подробнее вопрос определения скорости входящего потока воздуха в БМБ.

В боксах I класса, как известно, рециркуляция воздуха отсутствует, т.е. весь воздух, проходящий через вентилятор, выбрасывается наружу, предварительно пройдя через НЕРА фильтр. В таких боксах входящий поток образуется из-за создания вентилятором разряжения во всем объеме камеры бокса. Вследствие этого скорость входящего потока примерно одина кова во всем сечении рабочего проема и допускает непосредственные измерения с помощью термоанемометра в плоскости рабочего проема.

В боксах II класса, в отличие от боксов I класса, изоляция оператора от продукта, а также продукта от окружающей среды осуществляется с помощью так называемой воздушной завесы. Эта завеса возникает в результате слияния потоков входящего и нисходящего воздуха Бактериофаги в медицине и ветеринарии в области рабочего проема. Входящий поток возникает как компенсация той части воздуха, которая выбрасывается из бокса в атмосферу, предварительно пройдя через выпускной НЕРА фильтр (см. рис. 2б). Оставшаяся часть воздуха продолжает циркулировать в боксе. В результа те наличия в рабочей камере бокса нисходящего потока, а также в результате конструктивных особенностей, разряжение возникает только вдоль узких зон (перфорации), расположенных в плоскости столешниц. По этой причине распределение скорости потока по высоте рабоче го проема имеет крайне неоднородный характер: наибольшая скорость потока наблюдается у нижней границы рабочего проема, наименьшая — у верхней. Прямое измерение скорости потока с помощью термоанемометра, в данном случае, может привести к неправильным ре зультатам, т.к. результат измерения сильно зависит от места расположения чувствительного элемента анемометра при измерении. Для того что бы избежать подобной неопределенности, средняя скорость входящего потока в БМБ II класса определяется как отношение объемного расхода входящего воздуха к полной площади рабочего проема, а оценка средней скорости входящего потока сводится к оценке объемного расхода воздуха. Вследствие того, что входя щий и выходящий потоки равны, оценка расхода входящего воздуха может определяться путем оценки расхода выходящего воздуха.

Рис. 3 Распределение потоков воздуха внутри БМБ II класса. 1, 2 – передняя и за дняя перфорации соответственно, 3, 4 – эпюры скоростей потоков воздуха с внутренней и наружной стороны рабочего проема (рисунок взят из книги «Чистые помещения. Про блемы, теория, практика.» под ред. А.Е.Федотова).

Помимо обеспечения защиты оператора и окружающей среды, БМБ II класса также обеспечивает защиту рабочего материала от внешней и перекрестной контаминации. Эта за щита осуществляется с помощью создания однонаправленного нисходящего потока чистого воздуха, прошедшего через приточный НЕРА фильтр. Требований к скорости нисходящего по тока СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08 не предъявляют, в то время как её величина является важным фактором, влияющим на эффективность работы бокса.

ГОСТ Р ЕН 12469-2010 в свою очередь строго регламентирует не только процедуру проверки скорости входящего потока в БМБ I и II классов, но также процедуру проверки ско рости и однородности нисходящего потока воздуха в камере бокса, методику исследования целостности НЕРА фильтра и процесс визуализации потоков, создаваемых при работе бокса.

Эти проверки формируют необходимый минимум испытаний, пройдя который бокс микробио Бактериофаги в медицине и ветеринарии логической безопасности может считаться безопасным для работы.

Характерной особенностью рекомендаций СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08, касаю щейся применения БМБ, является разделение всех БМБ II класса на типы А и В. Даная клас сификация боксов производится согласно американскому стандарту NSF/ANSI 49-2009 и по явилась в российских документах из рекомендаций ВОЗ. Новый российский стандарт ГОСТ Р ЕН 12469-2010 не производит деления боксов микробиологической безопасности на типы.

В основе разделения боксов на типы А и В лежит их разделение по доле воздуха, рециркулируемого обратно в камеру бокса и помещение установки. В большинстве БМБ II класса только часть воздуха из камеры бокса удаляется через вытяжной НЕРА фильтр. Некото рая часть воздуха, в зависимости от конструкции бокса, продолжает рециркулировать в боксе, проходя через приточный НЕРА фильтр, и подаваясь в камеру бокса. Так, например, в боксах II класса типа A2 процент рециркуляции составляет 70%, в то время как в боксах II класса типа В1 – 30%.

В БМБ II класса типа В2 рециркуляция воздуха в камеру или помещение отсутствует, т.е. 100% воздуха из рабочей камеры бокса, пройдя через НЕРА фильтр, удаляется в атмос феру через вытяжной воздуховод. Такая организация потоков более безопасна в плане работы с ПБА высокой группы патогенности, а также позволяет вести работу в боксе с небольшими дозами летучих газообразных веществ, которые не задерживаются НЕРА фильтрами. К недо статкам использования БМБ II класса типа В2 можно отнести необходимость организации по стоянного притока воздуха в помещение установки бокса для компенсации значительного количества удаляемого воздуха.

Отдельно следует остановиться на проверке целостности НЕРА фильтров и герметич ности их уплотнений. НЕРА фильтры играют ключевую роль во всех БМБ. От их качества, а также от качества их установки зависит не только чистота воздуха в камере бокса, т.е. защита продукта от внешней контаминации, но и защита окружающей среды от аэрозолей ПБА. Про верка целостности НЕРА фильтров является важным и ответственным моментом при обеспе чении биологической безопасности всего учреждения. Следует отметить, что согласно ГОСТ Р ЕН 12469-2010 все типы боксов микробиологической безопасности должны оснащаться НЕРА фильтрами класса не ниже H14 по ГОСТ Р ЕН 1822-1. При этом в СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08, регламентирующих использование БМБ в лабораториях, речь идет только о филь трах тонкой очистки (ФТО), которые, согласно ГОСТ Р 51251-99 «Фильтры очистки воздуха.

Классификация. Маркировка.», имеют существенно меньшую эффективность фильтрации по сравнению с НЕРА фильтрами, выделенными в отдельный класс.

Процедура исследования целостности с использованием микробиологических аэрозо лей для таких фильтров нецелесообразна по причине того, что средний диаметр частиц микро биологического аэрозоля существенно превышает размер частиц, на которых НЕРА и ULPA фильтры имеют наименьшую эффективность. Для оценки целостности НЕРА фильтров и ка чества их уплотнений применяются методы с использованием синтетических полидисперсных аэрозолей, например диэтилгексил себацинат (DEHS), диоктилфталат (DP) или полиальфа DP)) олифин (PA), и дискретных счетчиков частиц либо специальных фотометров аэрозолей. Ме PA),), тодики таких проверок изложены во многих мировых стандартах, например в ГОСТ Р ИСО 14644-3-2007 «Чистые помещения и связанные с ними контролируемые среды. Часть 3. Мето ды испытаний», Приложение В.6. Недостатками этих методов являются относительная слож ность предварительных расчетов и дороговизна оборудования, необходимого для проведения проверок.

Важную роль при проверке эксплуатационных характеристик играет т.н. визуализация потоков или дымовой тест. Дымовые тесты позволяют визуально оценить характер движения Бактериофаги в медицине и ветеринарии потоков воздуха, сильно подверженных внешнему влиянию, в боксе и вблизи него. К примеру, использование нагревательного оборудования внутри бокса может привести к дестабилизации однородного нисходящего потока, тем самым увеличив вероятность перекрестной контами нации. Такие нарушения потока могут быть исследованы только с помощью дымовых тестов.

Основным инструментом, с помощью которого осуществляется проверка и настройка потоков воздуха в боксах микробиологической безопасности, является термоанемометр. Раз решающая способность такого анемометра составляет 0,01 м/с, чего вполне достаточно для проверок эксплуатационных характеристик боксов. Диапазон измерения термоанемометров – от 0 до 20 м/с, а относительная погрешность не превышает 5%. Использование крыльчатых анемометров, а так же трубок Пито для измерения скоростей потоков воздуха в БМБ не допу скается в виду их недостаточной точности и разрешающей способности при работе с малыми скоростями потоков.

Использование того или иного типа оборудования предполагает применение своей уникальной методики, каждая из которых имеет свои плюсы и минусы.

Таким образом, БМБ являются первой ступенью в обеспечении инженерного контроля распространения микроорганизмов различных групп патогенности. И при правильной эксплу атации способны эффективно обеспечивать не только защиту окружающей среды, но и защиту оператора от продуктов, с которыми производится работа. Правильная эксплуатация, помимо всего прочего, подразумевает проведение периодических проверок эксплуатационных харак теристик боксов. К сожалению, действующие нормативные документы, регламентирующие эксплуатацию боксов, устарели и не содержат достаточной информации об этих проверках. В связи с этим назрела необходимость разработать дополнительные документы, в которых будут четко сформулированы состав и методики проверок боксов микробиологической безопасно сти.

Библиографический список 1. Национальный Стандарт Российской Федерации ГОСТ Р ЕН 12469-2010 «Биотех нология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности»// Стандартин форм 2010, 48с.

2. Санитарно-эпидемиологические правила. «Безопасность работы с микроорганиз мами I – II групп патогенности (опасности)»// СП 1.3.1285-03. М:. Госсанэпиднадзор России;

2003, 82с.

3. Санитарно-эпидемиологические правила. «Безопасность работы с микроорганиз мами I – II групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»// СП 1.3.2322-08. М:. Роспотребнадзор;

2008, 76с.

4. Laboratory Biosafety Manual. 3d edition. World Health rganization. Geneva;

2004. 186 p.

5. Тюрин Е.А., Иванов С.А., Маринин Л.И., Дятлов И.А., Ляпин М.Н. Боксирующие устройства, используемые при проведении работ с биологическими агентами I–II групп пато –II II генности//Проблемы особо опасных инфекций. Выпуск 4 (106). С. 23.

6. Biosafety Cabinetry: Design, Constructions, Performance, and Field Sertification. NSF/ ANSI 49 – 2009. NSF International Standard/ American National Standard. 2009. 148 p.

7. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В, редакторы. Биологическая безопасность. Термины и определения. Саратов: «Приволжское издательство»;

2006. 112 с.

MICROBIOLOGICAL SAFETY CABINETS.

OPERATION AND MAINTENANCE BASICS.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Enenko A.

Key words: baterophages, booga safety, mrobooga safety abnets, fume hoos, amnar ow hoos, LAMSYSTEMS, appaton of mrobooga safety abnets.

The present arte s onerne wth the termnoogy an entfiaton of mrobooga safety abnets, reguatory ouments whh esrbe the requrements for mrobooga safety abnets, operaton an mantenane reguatons of mrobooga safety abnets.

УДК 577. ТЕХНОЛОГИЯ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ И ЕЕ ПРИЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА Ильичев А.А., доктор биологических наук, профессор, ilyichev@vector.nsc.ru Карпенко Л.И., доктор биологических наук, доцент, karpenko@vector.nsc.ru Щербакова Н.С., научный сотрудник, тел. 8(383) 363-48-13, nadia_nsk@ngs.ru ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Техника фагового дисплея дает возможность проводить скрининг гигантских репер туаров биологических молекул при помощи конструирования библиотек, которые благодаря формату дисплея, позволяют применять чрезвычайно быструю и эффективную процедуру се лекции специфических лигандов. В 1985, Дж. Смит (Smith, 1985) впервые сообщил, что пепти Smith,, ды и полипептиды могут быть экспонированы на поверхности фаговых частиц, при встройке кодирующих последовательностей ДНК в ген поверхностного белка p3 нитчатого бактериофа га fd. Аналогичная работа на белке pP8 была выполнена в ГНЦ ВБ «Вектор» (Ильичев и др., 1989). При этом, если место встройки пептида выбрано правильно, то химерная фаговая части ца остается инфекционной и может быть размножена в подходящем бактериальном штамме.

Кроме того было показано, что фаг, несущий определенный пептид, может быть выделен из большого количества фагов дикого типа при помощи афинной селекции (Parmley & Smith, 1988). Чередование циклов селекции и размножения приводит к образованию фаговой смеси, содержащей большое количество фаговых частиц, экспонирующих тот же самый пептид.

Применение этого принципа привело к конструированию больших коллекций химер ных фагов, в которых каждый фаг экспонировал отличный от других пептид, т.е. пептидных фа говых библиотек (Scott & Smith, 1990;

Felici et al., 1991). В принципе такие пептидные реперту Scott,., ары могут служить источником лигандов практически для любых рецепторов. После изоляции фагов, несущих нужный лиганд, аминокислотная последовательность отобранных пептидов определяется секвенированием химерных капсидных генов и сравнение аминокислотного со става отобранных пептидов позволяет идентификацию консенсусной последовательности, т.е.

консервативных аминокислотных остатков, необходимых для связывания данного рецептора.

В докладе будут рассмотрены предложения технологии фагового дисплея для диагно стики и лечения инфекционных и соматических заболеваний человека. Будут доложены ре зультаты работы ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» в данном направлении.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 619:616 - СОЗДАНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ DESULFOVIBRIO DESULFURICANS И ПЕРСПЕКТИВЫ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Карамышева Н. Н., ассистент, Natali – kar@inbox.ru Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор, Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор 8(8422)55-95-47, fvm.zol@yandex.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Desufovbro esufurans, биопрепарат, бактериофаги.

Работа посвящена созданию биопрепарата на основе бактериофагов Desufovbro esufurans и определения перспектив дальнейшего использования.

Введение. Бактерии, относящиеся к роду Desufovbro, являются основными возбу дителями анаэробной коррозии металлов развивающейся в процессе их жизнедеятельности.

Создание биопрепарата на основе полученных бактериофагов и внедрение его в производство может разрешить создавшуюся проблему.

Материалы и методы исследований. Штамм Desufovbro esufurans subsp. e-.

sufurans (Bejernk 1895) Kuyver et van Ne 1936 VKM B-1799 полученный из музея ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН Московская обл., г. Пущино, а также 9 штаммов бактерий, выделенных из объектов окружающей среды, типирование которых позволило отнести их к роду Desufov bro, бактериофаги Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48 – УГСХА.

Работа выполнена на базе научно-исследовательского инновационного центра микро биологии и биотехнологии УГСХА.

Результаты исследований и их обсуждение.

Результаты исследования способности бактериофагов специфически лизировать бак териальные клетки использована нами при конструировании диагностического биопрепара та. Для этого на основе выделенных бактериофагов необходимо было изучить следующие их биологические свойства: спектр литической активности;

специфичность действия;

морфоло гию негативных колоний;

чувствительность к воздействию хлороформа.Изучение биологиче ских свойств выделенных бактериофагов проводили по методам, предложенным М. Адамсом (1973), Д.М. Гольдфарбом (1961), И.М. Габриловичем (1973), Е.П. Розановой (1978), С.Н. Зо лотухиным (2007).

При определении активности фага по методу Аппельмана в 11 пробирок равного диа метра наливают по 9 мл жидкой среды Постгейта В. В первую пробирку вносили 1мл изучае мого фага, тщательно перемешивали содержимое флакона и новой пипеткой переносили 1 мл смеси в следующую пробирку до получения полного ряда десятикратных разведений. Затем во все пробирки, начиная с последнего разведения, вносили по 0,2 мл индикаторной культуры D.

esufurans, выращенной на жидкой среде Постгейта В. Пробирки инкубировали при 30°С и просматривали на наличие просветления среды и обесцвечивания черного придонного осадка в опытных пробирках и роста культуры в контрольных пробах. Учет результатов был начат через 24 часа. Среда оставалась прозрачной, а осадок поменял цвет с черного на белый в про бирках с разведениями 10-8 и 10-9, что указывало на отсутствие роста индикаторной культуры бактерий штамма Desufovbro esufurans subsp. esufurans (Bejernk 1895) Kuyver et van Ne 1936 VKM B-1799 (таблица 1).

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 1 – Литическая активность фагов D. esufurans по Аппельману № п/п Название фага Литическая активность по Аппельману 1 Ddu 48-УГСХА 10- 2 Ddr 57-УГСХА 10- Морфологию негативных колоний бактериофагов изучали с помощью метода агаро вых слоев по Грациа. В пробирку с 2,5 мл 0,7% агаризованной средой Постгейта «В», расплав ленной и остуженным до 45 С 0,7% агаризованной средой Постгейта В вносили 0,2 мл фага в разведении 10-7 (для получения изолированных негативных колоний) и 0,2 мл двухсуточной бульонной культуры референс штамма D. esufurans VKM B-1799. Содержимое пробирки тщательно перемешивали вращением между ладонями и выливали на поверхность 2% агари зованной среды Постгейта В. После застывания агара чашки инкубировали в анаэростат при температуре 30С и атмосферном давлении «– 1 атм». Просмотр результатов осуществляли через 24-48 ч. Негативные колонии бактериофагов характеризовались следующими параме трами: Ddr 57-УГСХА. Колонии диаметром 8 мм полностью прозрачны, без зоны вторичного лизиса;

Ddu 48-УГСХА колонии диаметром 6 мм характеризуются наличием прозрачного цен тра и мутной зоной вторичного лизиса на периферии (рисунок 1).

Рисунок 1 – Негативные колонии бактериофагов Ddr 57-УГСХА Определению устойчивости бактериофагов к прогреванию проводили по следующей методике: бактериофаги разводили 1:10 в жидкой среде Постгейта «В» (рН 7,2-7,4). Затем про бирки с разведенными фагами прогревали прогревали в ультратермостате при температуре от 50°С до 80°С с интервалом 5 °С в течение 30 минут. Параллельно ставили контроль – фаги, разведенные 1:10 без прогревания. После воздействия температуры активность бактериофагов определяли по методу Грациа. Учет результатов проводили по истечению 24 часов при темпе ратуре 30°С.

В результате исследований устойчивости бактериофагов к прогреванию было уста новлено, что прогревание фагов Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48 – УГСХА при температуре 55-60 °С не оказало влияния на содержание активных корпускул фага в 1 мл. Дальнейшее повышение температуры приводило к снижению активности фага. При прогревании фага температурой С количество негативных колоний насчитывалось 5х109 корпускул фага. Прогревание выше Бактериофаги в медицине и ветеринарии 75 С полностью инактивировало исследуемый бактериофаг. Результаты представлены в та блице 2.

Таблица 2 – Изменение титра бактериофагов при увеличении температуры куль тивирования.

Температура, С Титр бактериофага Ddr 57-УГСХА Титр бактериофага Ddu 48 -УГСХА 55 3х109 2х 60 3х10 2х 65 5х108 4х 70 5х10 4х 75 5х108 4х 80 - Контроль фага 3х10 2х Полученные данные свидетельствуют об устойчивости фагов к воздействию темпера туры до 75 С. При температуре от 76С фаги Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48 – УГСХА теряли свою активность и полностью погибали при температуре выше 80С.

Определение чувствительности бактериофага и бактерий проводили путем обработки фаговой суспензии хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Контро лем служила пробирка с бактериофагом, необработанным хлороформом. После воздействия хлороформа активность бактериофага определяли по методу Грациа. Бактериофаг Ddr 57 – УГСХА проявил выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут, а бактериофаг Ddu 48 – УГСХА в течение 20 минут (таблица 3).

Таблица 3 – Устойчивость выделенных фагов к воздействию хлороформа.

Количество активных корпускул фага в 1 мл Кон Обработка Обработка Обработка Обработка Обработ № Фаг троль 10 мин. 15 мин. 20 мин. 30 мин. ка 40 мин.

1 Ddr 57-УГСХА 3х109 3х109 3х109 3х109 - 3х 2 Ddu 48УГСХА 2х10 2х10 2х10 - - 2х 9 9 Полученный фаголизат проверяли на стерильность путем посева на среду Постгей та «В» для выявления сульфатвосстанавливающих бактерий. Исследования показали, что об работка фаголизата хлороформом с последующим центрифугированием освобождает его от бактериальных клеток при сохранении активного фага. Для проверки активности фаголизата суточную культуру сульфатвосстанавливающих бактерий высевали на жидкую среду Постгей та «В» с дрожжевым экстрактом и на 12 ч помещали в термостат при 30°С. Затем в культуру бактерий, находящуюся в ранней экспоненциальной фазе роста, вносили фаголизат в количе стве 1 мл на 9 мл культуры и дополнительно инкубировали в течение 12 ч. Через 12 ч делали высев на агаризованную среду Постгейта «В». Чётко выраженные негативные пятна появля лись через 24 ч.

Спектр литической активности является характерной особенностью штаммов фага, и его используют для их идентификации. Определение спектра литической активности прово дили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (С. Н. Золотухин, 2007). Для изучения спектра литической активности двух селекционированных фагов (Ddu 48 – УГСХА, Ddr 57 – УГСХА), были использованы 1 референс штамм и 9 полевых штаммов D. esufur.

cans.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии На поверхность агаризованной среды Постгейта «В» в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли 24-х часовой бульонной культуры исследуемых микроорганиз мов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки оставили при комнатной температуре для подсушивания на 15-20 минут. На поверхность засе янной среды по секторам наносили бактериофаг, а затем инкубировали в анаэробных условиях при температуре 30 °С, оценку результатов проводили через 24-48 ч. Результаты опытов по казали, что штамм фага Ddr 57 – УГСХА, лизировал 8 из имеющихся у нас 10 штаммов (80%), фаг Ddu 48 – УГСХА лизировал 6 из 10 штаммов (60%) (таблица 4).

Таблица 4 – Спектр литической активности фагов по отношению к штаммам № Название фага Количество испытан- Количество лизируе- Процент лизируемых п/п ных штаммов мых штаммов штаммов 1 Ddr 57-УГСХА 10 8 80% 2 Ddr 57-УГСХА 10 8 80% 3 Ddu 48 - УГ- 10 6 60% СХА 4 Ddu 48 -УГСХА 10 6 60% Видовая специфичность фагов используется в практике для дифференциации бакте рий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, сродством их к рецепторам лизируе мых бактерий.

Определение видовой специфичности изучаемых бактериофагов (Ddu 48 – УГСХА, Ddr 57 – УГСХА) проводили путём нанесения фага на газон культуры. На поверхность в чашках Пе три пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли 24-х часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем.

Чашки оставляли при комнатной температуре для подсушивания на 15-20 минут. На поверхность засеянной среды пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили бактериофаги Ddu 48 – УГСХА, Ddr 57 – УГСХА и наклоняли, чтобы капли стекли, а затем инкубировали в анаэростате при температуре 30 °С. Оценку результатов проводили через 24-48 часа. Выбор ви дового состава бактерий, для проверки специфичности фага, обусловлен способностью данных бактерий к анаэробному типу дыхания.

В результате изучения специфичности бактериофагов по отношению к представите лям других родов и видов бактерий: – установили строгую специфичность фагов. Опыт по определению специфичности бактериофагов (Ddr 57 – УГСХА, Ddu 48 – УГСХА) показал, что оба бактериофага строго специфичны по отношению к D. esufurans и не лизируют другие виды и роды бактерий (таблица 5).

Таблица 5 – Специфичность, выделенных бактериофагов № п/п Вид бактерий Ddr 57-УГСХА Ddu 48 -УГСХА Desufovbro esufurans 1 + + Desufovbro sufosmutans 2 – – Desufovbro ggas 3 – – Desufovbro spp.

4 – – ostrum perfrngens 5 – – Fusobaterum nueatum 6 – – Latobaus spp.

7 – – Baus ereus 8 – – Примечание – «–»– отсутствие лизиса, «+»– наличие лизиса культуры.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Заключение. Таким образом, проведённые исследования по изучению биологических свойств бактериофагов Ddr 57 – УГСХА, Ddu 48 – УГСХА показали, что полученные фаги отвечают все технологическим параметрам для изготовления биопрепарата с целью профи лактики коррозии металлов.

Библиографический список 1. Bodily H., Updyke E.L., Mason J.. (ed). Diagnostis procedures for bacterial, mycotis and parasitis infections, 5 th ed., American Public Health Association, Inc., New York, 2007.

2. Back A.E., berhoter T.R., J.Clin Microbiol, 7, 312-313 (2008).

3. У.Хейс «Генетика бактерий и бактериофагов» М.1965г.

УДК 579. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ Климовский А.Б., кандидат физико-математических наук, начальник управления, администрация города Ульяновска тел. 8 (9510) 95-16-58, andrew@klimovsky.ru Викторов Д.А., кандидат биологических наук, Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор Тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: бактериофаги, биопрепараты, практиеское применение, класси фикация, схема.

В работе предлагается принцип классификации практиеского применения препара тов на основе бактериофагов по трем основаниям, каждое из которых имеет несколько зна ений.

Актуальность темы Одним из ведущих направлений современной микробиологии и биотехнологии явля ются исследования бактериофагов. Это связано с всё больше возрастающим интересом к бак териофагам с точки зрения их практического применения в целях диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний в различных отраслях медицины, сельского хозяйства и промышленности [1, 2, 3].

Однако, несмотря на то, что в большинстве случаев перспективы разработки и приме нения препаратов на основе бактериофагов предопределяются их конкретными потребитель скими свойствами, обуславливающими их безопасность, высокую эффективность, дешевизну и простоту в применении, остаётся актуальной проблема выявления новых сфер их практиче ского применения, решение которой позволит рассмотреть инновационные направления даль нейшего развития биотехнологий, основанных на использовании бактериофагов.

Авторами предлагается принцип классификации применения бактериофагов по трем основаниям – цель применения (для чего применяется), объект применения (на ком (чем) при Бактериофаги в медицине и ветеринарии меняется), направленность применения (для какой части (процесса) объекта применяется).

Если представить каждое основание, как ось (измерение), а значение основания координа той, то все применения бактериофагов можно представить, как отдельные ячейки трехмерного куба.

направленность цель объект Для сокращения обозначений основание классификации обозначим первой буквой:

цель – Ц, объект – О, направленность – Н. По каждой оси (основанию) предлагается опреде лить несколько (координат) разделов, обозначаемых цифрой:

1-я ось – Цели (1) – профилактика (предупреждение, предотвращение);

(2) – диагностика (выявление);

(3) – лечение (устранение) 2-я ось – Направления (1) – внутреннее состояние (здоровье, пригодность);

(2) – внешнее состояние (внешность, поверхность) (3) – потребление (питание);

(4) – выделение (отходы) 3-я ось – Объекты (1) – люди;

(2) – животные (включая птиц, рыб, насекомых);

(3) – растения;

(4) – неживые объекты (здания, оборудование) Схему, базирующуюся на данном способе классификации, можно графически изобра зить или в виде куба, состоящего из – 3 х 4 х 4 = 48 ячеек (элементов), или на плоскости в виде таблицы 4 х 12 = 48 ячеек.

В результате, каждая из ячеек (элементов) на пересечении значений трёх осей (осно ваний) соответствует конкретному назначению биопрепарата, в частности:

Н1О1 – медицина (здоровье людей), Н1О2 – ветеринария (здоровье животных), Н2О1 – косметика (внешность людей), Н3О1 – пищевая промышленность (питание людей), Н3О2 – производство кормов (питание животных), Н3О3 – производство удобрений (питание растений), Н3О4 – покрытия (внешность объектов), и т.д.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Или по трем основаниям, например:

Ц1Н1О1 – для профилактики здоровья людей, Ц2Н1О2 – для диагностики состояния животных, Ц3Н3О1 – для обеззараживания пищи людей, Ц1Н2О2 – для предотвращения заражения (защиты) кожи животных, Ц3Н2О4 – для обеззараживания поверхности зданий (оборудования), Ц2Н4О4 – для выявления зараженности отходов производства, и т.д.

Предлагаемая классификация удобна тем, что, используя её графическое изображе ние, можно «распределить» по сферам применения бактериофагов любую относящуюся к ис пользованию бактериофагов информацию, например:

- научные (исследовательские) группы, занимающиеся бактериофагами в произ водственном или научном учреждении;

- бактериафаги;

- организации-исследователи фагов;

- производители фагов;

- потребители фагов;

- и т.п.

Кроме указанной развернутой классификации, авторами предлагается упрощенная (свернутая) классификация по двум основаниям (критериям):

1. Первый критерий – цель применения препаратов на основе бактериофагов:

1.1. Индикация, идентификация бактерий 1.2. Мониторинг бактериальных агентов 1.3. Деконтаминация 2. Второй критерий – объекты, на которые направлено использование препаратов на основе бактериофагов:

2.1. Люди 2.2. Животные (включая птиц, рыб, насекомых) 2.3. Растения 2.4. Пищевые продукты 2.5. Неживые объекты Графически данный способ классификации представляет собой таблицу 3 х 5 ячеек, каждая из которых определяет отдельную отрасль (группу отраслей) применения препаратов на основе бактериофагов:

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Цели (1) – индикация, иден (2) – мониторинг (3) – деконтаминация тификация Диагностика бактери- Мониторинг бактери- Лечение и профилак (1) – люди альных заболеваний альных заболеваний тика бактериальных человека человека заболеваний человека (2) – животные Лечение и профилак Диагностика бактери- Мониторинг бактери (включая птиц, тика бактериальных альных заболеваний альных заболеваний рыб, насеко- заболеваний живот животных животных мых) ных Диагностика бакте- Мониторинг бакте- Лечение и профилак (3) – растения риальных поражений риальных поражений тика бактериальных растений растений поражений растений Деконтаминация (са (А) Выявление воз- (А) Мониторинг воз нация) пищевых про Объекты будителей бактериаль- будителей бактериаль дуктов:

ной порчи пищевых ной порчи пищевых (4) – пищевые (А) от возбудителей продуктов;

продуктов;

продукты бактериальной порчи;

(Б) Выявление воз- (Б) Мониторинг воз (Б) от возбудителей будителей пищевых будителей пищевых пищевых токсикоин токсикоинфекций токсикоинфекций фекций Выявление патоген- Мониторинг патоген ных бактерий на про- ных бактерий на про Деконтаминация (са изводстве, в медицин- изводстве, в медицин (5) – неживые нация) помещений, ских учреждениях, ских учреждениях, объекты оборудования, инвен учреждениях обще- учреждениях обще таря и пр.

ственного питания и ственного питания и пр. пр.

Библиографический список 1. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 1961. – 225 с.

2. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Су лаквелидзе;

пер. с англ.: коллектив пер.;

науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 636 с.

3. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:

Урожай. – 1978. – С. 41-88.

CLASSIFICATION OF PRACTICAL APPLICATION OF BIOLOGICAL PRODUCTS OF BACTERIOPHAGE-BASED Klimovsky A.B., Viktors D.A., Vasilyev D.A.

Keywords: baterophages, boogs, prata appaton, the assfiaton sheme.

Ths paper proposes a prata appaton of the prnpe of assfiaton of rugs base on baterophages on three grouns, eah of whh has severa meanngs.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 578.81:579. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ LISTERIA MONOCYTOGENES Ковалева Е.Н., кандидат биологических наук, доцент тел. 8(8422) 55-95-47, elkov@pochta.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Сульдина Е.В., аспирант, ekaterina-suldina@rambler.ru Имамов М.А., аспирант, caerax@gmail.com ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Lstera monoytogenes, бактериофаг, пищевое сырье, контамина, ция.

В статье рассматриваются аспекты контаминации пищевого сырья и продуктов бактериями вида Lstera monoytogenes. В каестве инактивирующего средства предложены бактериофаги и представлена методика их выделения с помощью индуцирующих факторов из лизогенных культур. Определены некоторые биологиеские свойства полуенного изолята.

Начиная с середины 80-х гг. годов XX столетия листериозу людей стали уделять все большее внимание. Это обусловлено лавинообразным появлением вспышек листериоза, свя занных с употреблением пищевых продуктов контаминированных листериями. Ухудшает си туацию и то, что болезнь протекает очень тяжело, как у новорожденных, их матерей, так и у пожилых людей [3, 4, 5, 9]. Продукты питания могут быть контаминированы листериями из-за некачественного пищевого сырья, используемого в процессе приготовления пищи. В первую очередь вызывают опасение те продукты, которые употребляются в необработанном виде – охлажденные свежие салаты, овощи, фрукты [7, 9].

Тем самым актуальна проблема профилактики инфицирования листериями пищево го сырья и продуктов питания, возникает необходимость своевременной детекции указанных бактерий. Бактериофаги являются простым и надежным инструментом для реализации данной цели [4, 5, 7, 8].

Цели и задачи исследования Целью работы является разработка схемы выделения бактериофага L.monoytogenes методом индукции из лизогенных культур и изучение некоторых биологических свойств полу ченного изолята.

Для достижения поставленной цели необходимо подобрать оптимальные параметры воздействия индуцирующих факторов на бактериальную клетку и взаимодействия бактери альных клеток и фаговых корпускул, определить рациональный метод очищения фаголизата.

Материалы и методы В работе использовали тест-штамм бактерий вида L.monoytogenes 766, индикатор ный референс-штамм 9-127 (I серотип) из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизо I отологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.

Выделение и изучение биологических свойств фага проводили по методам, предло женным Н.А. Капыриной [1], M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski [6], Э.Каттер, А. Сулаквелидзе [2], C.P. Sword, M.J. Pickett [10].

Результаты исследований В качестве тест-штамма для оптимизации параметров индукции использова Бактериофаги в медицине и ветеринарии ли вирулентный штамм L.monoytogenes – 766, индикаторным служил референс-штамм L.monoytogenes 9-127. В качестве индуцирующего агента использовали ультрафиолетовые лучи (УФ-лучи), источником которых служила ртутно-кварцевая лампа, дающая не менее 90 % излучаемой энергии в виде УФ-лучей с длиной волны 254 нм.

Облучению подвергали 4-х часовую бульонную культуру тест-штамма L.monoytogenes – 766, выращенную при 28°С. Перед облучением бактерии разводили в слабощелочном фос фатном буфере (pH-7,6) в отношении 1:100. Разведенную бактериальную взвесь выливали в чашку Петри с таким расчетом, чтобы толщина облучаемого слоя не превышала 2 мм. Чашки с культурой помещали на расстоянии 40 см от источника излучения и облучали с экспозицией (с) – 20;

30;

40;

60. Для более равномерного воздействия УФ-лучей на бактериальные клетки чашки во время облучения периодически покачивали.

После облучения 50 мкл культуры вносили в мясопептонный бульон комнатной тем пературы. Облученные листериозные культуры инкубировали при 28°С в течение 16 часов, после чего полученные лизаты пропускали через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, выдерживали сутки при комнатной температуре, а затем исследовали на присутствие в них бактериофага. Во время облучения, с целью предохранения обработанных культур от фотореактивации, все манипуляции проводили в затемненном помещении [1, 10].

Выявление индуцированных фагов проводили методом «стекающей капли» с индика торным штаммом L.monoytogenes 9-127. Учет результатов осуществляли после 24-х часового инкубирования в термостате при 28°С. Присутствие бактериофага, определяли по наличию прозрачной «дорожки», хорошо видимой на матовом фоне роста бактерий (рис. 1).

Морфологию негативных колоний фага изучали при посевах методом агаровых слоев.

Для этого в пробирку с расплавленным и остуженным до 46 – 48°С 0,7 % мясопептонным ага ром вносили 1 мл фага и 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры L.monoytogenes.

Содержимое пробирки тщательно перемешивали и выливали на поверхность 1,5 % мясопеп тонного агара. После застывания агара чашки помещали в термостат.

Учет производили через 12 – 18 часов инкубации при температуре 28°С. Негативные колонии оценивали по размеру, характеру края, прозрачности, наличию вторичного роста и характеру роста культур вокруг колоний.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Рис. 1 – Дорожки лизиса на сплошном бактериальном газоне индикаторной куль туры L.monoytogenes 9- Негативные колонии, образуемые изучаемым листериозным бактериофагом, были округлой формы с ровными краями в диаметре от 0,7 до 1 мм, непрозрачные, с зоной вторич ного роста.

Выводы. В результате проведенных исследований выделен бактериофаг бактерий вида L.monoytogenes. Экспериментально установлено, что для выделения листериозного бак териофага методом индукции из лизогенных культур наилучшим образом подходит жидкая слабощелочная среда, время экспозиции – 30 с, расстояние до источника излучения – 40 см.

Негативные колонии изучаемого бактериофага мелкие, округлые, непрозрачные, с зоной вто ричного роста.

Библиографический список 1. Капырина, Н.А. Изучение листериозного бактериофага и использование его для идентификации возбудителя болезни / Н.А. Капырина // Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Покров, 1973. – 22 с.

2. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Су лаквелидзе;

пер. с англ.: коллектив пер.;

науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 636 с.

3. Листерии и листериоз / И.А. Бакулов, Д.А. Васильев, Д.В. Колбасов [и др.] // моно графия. – Ульяновск, УГСХА, 2008. – 168 с.

4. Bacteriophage P100 for control of Lstera monoytogenes in foods: genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study, and application / R.M. Carlton [et al.] / Regulatory Toxi cology and Pharmacology. – 2005. – 43. – P. 301 – 312.

5. Biocontrol of Lstera monoytogenes on fresh-cut produce by treatment with lytic bac teriophages and a bacteriocin / B. Leverentz [et al.] // Appl. and Environ. Microbiol. – 2003. – 69, N Бактериофаги в медицине и ветеринарии 8. – P. 4519 – 4526.

6. Clokie, M.R.J. Bacteriophages: methods and protocols, volume 1: isolation, characteriza tion, and interactions / M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski. – 2009, Humana Press. – 301 p.

7. Guenther, S. Bacteriophage biocontrol of Lstera monoytogenes on soft ripened white mold and red-smear cheeses / S. Guenther, M.J. Loessner // Bacteriophage: Landes Bioscience. – 2011. – P. 94 – 100.

8. Loessner, M.J. Bacteriophage typing of Lstera species / M.J. Loessner, M. Busse // Appl.

and Environ. Microbiol. – 1990. – 56, N 6. – P. 1912 – 1918.

9. McLauchlin, J. Aspects of the epidemiology of human Lstera monoytogenes infections in Britain 1967 – 1984;

the use of serotyping and phage typing / J. McLauchlin, A. Audurier, A.G.

Taylor // J. Med. Microbiol. – 1986. – 22. – P. 367 – 377.

10. Sword, C.P. The isolation and characterization of bacteriophages from Lstera monoy togenes / C.P. Sword, M.J. Pickett // J. gen. Microbial. – 1961. – 25, N 2. – P. 241 – 248.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF BACTERIOPHAGES LISTERIA MONOCYTOGENES Kovaleva E.N., Vasiliev D.A., Suldina E.V., Imamov M.A.

Keywords: Lstera monoytogenes, the baterophage, foo raw materas, ontamnaton.

The paper susses aspets of ontamnaton of foo prouts an raw materas baterum Lstera monoytogenes. As a means of natvatng phages an suggeste the tehnque of ther seeton by nung fators of the ysogen utures. Ientfie some of the booga propertes of the soate.

УДК 578.81:579. РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭНТЕРОКОККОВЫХ ФАГОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ENTEROCOCCUS FAECALIS Ковалева Е.Н., кандидат биологических наук, доцент, elkov@pochta.ru Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, fvm.zol@yandex.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, dav_ul@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: биопрепарат, бактериофаг, E.faeas, детекция.

В статье рассматриваются технологиеские параметры (время пассажа, множе ственность инфекции) создания биопрепарата на основе выделенных и изуенных энтерокок ковых бактериофагов с целью детекции бактерий вида E.faeas.

Энтерококки в настоящее время являются одними из самых часто встречающихся возбудителей нозокомиальных инфекций. Тем не менее, наибольшую опасность вызывает не столько широкая распространенность этих микроорганизмов, сколько их устойчивость к боль шому спектру антибактериальных препаратов [1, 5, 6]. Поскольку из биологического материа Бактериофаги в медицине и ветеринарии ла чаще всего выделяют Enteroous faeas, то в большинстве случаев приходиться иденти фицировать именно этот вид [1, 7].

Благодаря специфичности действия бактериофаги используются как для определения видовой принадлежности микроорганизмов, так и для детекции бактерий в объектах внешней среды [2, 3, 7].

Целью работы является разработка технологических параметров изготовления и кон троля биопрепарата энтерококковых бактериофагов для детекции бактерий вида E.faeas.

Материалы и методы В работе использовали 2 энтерококковых бактериофага и референс-штамм бактерий вида E.faeas - № 189 и из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.

Изучение биологических свойств фага проводили по методам, предложенным С.Н.

Золотухиным [2], Э.Каттер, А. Сулаквелидзе [3].

Результаты исследований На основании полученных данных были отобраны два изолята энтерококковых фагов EF – 4 и EF – 5 для конструирования биопрепарата [4].

Опытным путем определяли оптимальное соотношение между временем пассажа и активностью фагов. Для этого в пробирки с 4,5 мл мясопептонного бульона добавляли по 0, мл индикаторной культуры и 0,2 мл изучаемого бактериофага. Параллельно ставили контроль:

мясопептонный бульон, засеянный индикаторной культурой без фага. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 4, 6, 8, 10 или 12 часов. После наступления лизиса пробирки с фагами обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10. Литическую активность полученных фаголизатов исследовали методами Аппельмана и Грациа (табл. 1).

Таблица 1 – Зависимость активности фагов от времени пассажа Литическая активность Время Фаги Вариант пассажа, часов по методу Аппельмана по методу Грациа 1 4 10-9 2 х 2 6 10-10 2 х EF – 4 3 8 10-9 4 х 4 10 10-9 3 х 5 12 10-9 3 х 1 4 10-8 7 х 2 6 10-10 1 х EF – 5 3 8 10-10 1 х 4 10 10-9 3 х 5 12 10-9 2 х Установлено, что оптимальное время пассажа при температуре 37°С для фагов EF – и EF – 5 составляет 6 часов.


Опытным путем определяли, при каком варианте множественности инфекции про исходит максимальное увеличение титра бактериофага в лизате. Оптимальное соотношение между количеством фага и культуры составляет 1:3, активность при этом от 4 х 109 до 1 х по методу Грациа (табл. 2).

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 2 – Зависимость активности фагов от множественности инфекции Количество мл Активность фагов, количество Фаги Вариант активных корпускул в 1 мл Фага Культуры 1 0,2 0,2 2 х 2 0,2 0,4 3 х EF – 4 3 0,2 0,6 4 х 4 0,2 0,8 3 х 5 0,2 1,0 2 х 1 0,2 0,2 2 х 2 0,2 0,4 3 х EF – 5 3 0,2 0,6 1 х 4 0,2 0,8 2 х 5 0,2 1,0 2 х Для приготовления индикаторных фагов использовали фаголизаты EF – 4 УГСХА и EF – 5 УГСХА после 5 пассажей. В качестве индикаторной культуры для обоих бактериофагов использовали штамм E.faeas № 189.

Из полученного объема отбирали пробу каждого фага по 5 мл для определения чисто ты физических свойств, титра фага по отношению к эталонной культуре, спектра литической активности и специфичности. Исследования показали эффективность применения бактерио фагов EF – 4 и EF – 5 для детекции бактерий вида E.faeas.

Выводы Таким образом, оптимальными технологическими параметрами для изготовления биопрепарата с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида E.faeas 1:3, время инкубации при температуре 37оС – 6 часов. Для освобождения фаголизатов от жиз неспособных бактерий необходимо применение хлороформа (соотношение 1:10 в течение минут).

Библиографический список 1. Дехнич, А.В. Современные методы идентификации энтерококков / А.В. Дехнич, Р.С. Козлов, О.У. Стецюк // Антибиотики и химиотерапия. – 1996. – т. 41. – № 3. – С.32 – 39.

2. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопре паратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий / С.Н. Золотухин // Автореф. дис. … д-ра биол. наук. – Ульяновск, 2007. – 39 с.

3. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Су лаквелидзе;

пер. с англ.: коллектив пер.;

науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 636 с.

4. Ковалева, Е.Н. Биопрепарат энтерококковых бактериофагов / Е.Н. Ковалева // Ма териалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Роль молодых ученых в развитии АПК». – М., 2011. – С. 165 – 169.

5. Epidemiology of antimicrobial resistance in enterococci of animal origin / E. Hershberger [et al.] // J. of Antimicrob. Chemother. – 2005. – 55, № 1. – P. 127 – 130.

6. Genetic variation and evolution of the pathogenicity island of Enteroous faeas / Sh.M. McBride [et al.] // J. of Bacteriol. – 2009. – 191, № 10. – P. 3392 – 3402.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии 7. Identification and analysis of recombineering functions from Gram-negative and Gram positive bacteria and their phages / S. Datta [et al.] // PNAS. – 2008. – 105, № 5. – P. 1626 – 1631.

THE DEVELOPMENT OF BIOPREPARATION BASED OF THE ENTEROCOCCAL PHAGES TO DETECT ENTEROCOCCUS FAECALIS Kovaleva E.N., Zolotukhin S.N., Vasiliev D.A.

Keywords: bopreparaton, baterophage, E.faeas, eteton.

The arte eas wth the tehnooga parameters (tme of the passage, the mutpty of the nfeton) the bopreparaton base on the soaton an stuy of the enterooa baterophages wth the purpose of the etetng baterum E.faeas.

УДК 615.453.6/615.014.21/581. РАЗРАБОТКА ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСНЫХ ПОЛИВАЛЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ Ковязина Н.А., кандидат фармацевтических наук Казьянин А.В., доктор медицинских наук, профессор Николаева А.М., доктор биологических наук Функнер Е.В., кандидат медицинских наук Филиал ФГУП «НПО Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед», г.Пермь.

тел. (342)262-32-75, a.m.nikolaeva@perm.microgen.ru Ключевые слова: бактериофаг, биодоступность, капсулы, конструирование, лити еская активность, таблетки, фармакокинетика.

Статья посвящена разработке твердых лекарственных форм бактериофагов. Выяв лена высокая биодоступность оригинального состава таблеток и капсул в сравнении с жид ким препаратом. В результате проведенных исследований разработан алгоритм конструиро вания твердых лекарственных форм бактериофагов: сумма предложенных конструктивных подходов и технологиеских схем позволит расширить ассортимент отеественных, высоко эффективных, экологиески безопасных антибактериальных препаратов.

Введение. В условиях возрастания антибиотикорезистентности микроорганизмов бак териофаги начинают занимать все большее место в лечебной практике [2]. Совершенствование способов получения бактериофагов, особенно выпуск их поливалентных и комбинированных разновидностей, способствует существенному расширению диапазона их литической актив ности и стимулирует разработку разнообразных лекарственных форм. Однако, не смотря на это, традиционной формой выпуска бактериофагов остается жидкий препарат во флаконах, за исключением таблетированных фагов кишечной группы. Переход на выпуск таблетированных Бактериофаги в медицине и ветеринарии и капсулированных препаратов диктуется необходимостью стабилизации литической активно сти фагов, а также для придания препарату лучшего товарного вида, для уменьшения объемов при транспортировке и хранении препарата.

Учитывая неуклонный рост потребности рынка в жидком бактериофаге - более чем в 10 раз возросла реализация за последние 5 лет, чрезвычайно актуально расширение ассорти мента поливалентных фаговых препаратов [3].

Цель работы. Разработка твердых желудочно-резистентных лекарственных форм на основе комплексных поливалентных препаратов бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний.

Материалы и методы исследований. В работе использованы жидкие комплексные бактериофаги: 1) Секстафаг® – смесь фаголизатов бактерий Staphyoous aureus, Streptoous spp., Kebsea pneumonae, Pseuomonas aerugnosa, Eherha coli, Proteus spp., (Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный, раствор для приема внутрь, местного и наружного приме нения ФСП ЛС-001049-140212);

2) Интести-бактериофаг – смесь фаголизатов бактерий – S.

exner I, II, III, IV и VI типов и S. sonne, S. paratyph A, S. paratyph В, S. tphmurum, S.nfants, S.hoerasus, S. oranenburg, S. enterts;

Esherha o, Proteus vugars и mrabs, Strepto.hoerasus,.

hoerasus,,,. ;

,, ous spp., Staphyoous aureus, Pseuomonas aeragnosa (Интести-бактериофаг, раствор для приема внутрь и ректального введения ФСП ЛС 001999-121212). Для введения в композиции бактериофаг предварительно концентрировали в 100 раз с применением метода мембранной ультрафильтрации. Специфическую (литическую) активность бактериофагов оценивали по степени разведения исходного фага по Аппельману (отрицательная степень десятичного раз ведения от 10-2 до 10-5, вызывающая полный лизис культуры) [1]. Фармакокинетику гранулиро ванного и жидкого бактериофага изучали на белых мышах после однократного перорального введения препарата в количестве, эквивалентном 10 дозам для человека. Клинический матери ал (кровь, моча и кал), собранный до перорального введения препаратов и в течении 72 часов, разводили в питательном бульоне и обрабатывали хлороформом. Пробы наносили на газон тест-культуры соответствующего микроорганизма. По числу колоний фагов определяли вре менные промежутки обнаружения бактериофагов при их выведении. Распадаемость твердых лекарственных форм оценивали согласно ГФ ХI.

Результаты исследований и их обсуждение. Для получения высокоактивной твердой лекарственной формы, исходная субстанция (бактериофаг) должна быть: 1) адаптирована к современным возбудителям за счет ежегодного обновления фаговых рас и пополнения произ водственной коллекции свежевыделенными штаммами;

2) с литической активностью не ниже 10-5 и высокой степенью очистки – остаточный белок не более 800 мкг [6].

Изучение влияния факторов сушки и кислотоустойчивости на стабильность концен трата устанавливает наиболее лабильные и стабильные компоненты комплексного препарата.

Показывает возможность таблетирования или капсулирования предварительно высушенного концентрата в смеси наполнителей. Проведенные нами исследования показали в комплексных препаратах Секстафаг® и Интести-бактериофаг лабильность стафилококкового и стрептокок кового фага к технологическим факторам, что свидетельствовало о необходимости его пред варительной стабилизации наполнителями [4,5].

Структурирование твердой фармацевтической композиции и формирование системы доставки кишечнорастворимой фармацевтической композиции бактериофагов являются взаи мосвязанными этапами создания высокоактивной лекарственной формы. Получение твердых лекарственных форм бактериофагов покрытых кишечнорастворимой оболочкой (таблетки, гранулы, пеллеты, капсулы, микрокапсулы) усложняет технологический процесс производ ства, поэтому актуальным является создание защитных желудочно-резистентных структур Бактериофаги в медицине и ветеринарии бактериофагов за счет оптимального подбора наполнителей (создание каркаса избирательной распадаемости таблетированных фагов;

формирование носителей, обволакивающих фаги, что способствует сохранению активности после воздействия кислой среды желудочного сока) и капсулирование или таблетирование кишечнорастворимого гранулята. В результате изучения влияния вспомогательных веществ на стабильность бактериофагов, соотношение бактерио фага и наполнителей, очередности введения компонентов наполнителя в бактериофаги вида таблетирования – подобрана оптимальная композиция состава таблеток и оптимизирована тех нология таблетируемой массы [4]. Одна таблетка массой 0,17 г или капсула, содержащая 0,17 г гранул эквивалентна по объему 20 мл жидкого коммерческого фага. Оригинальность разрабо таного состава и технология желудочно-резистентных таблеток с секстафагом и сальмонеллез ным бактериофагом подтверждена патентом РФ № 2410084 «Фармацевтическая композиция на основе секстафага (Пиобактериофага поливалентного) или бактериофага сальмонеллезного и способ её получения».

При подборе технологических параметров получения гранулята и изучении литиче ской активности бактериофагов в композиции установлено, что составы без высушивания не обеспечивали стабильность компонентов бактериофагов в процессе хранения. Наилучшие технологические свойства и сохранение литической активности компонентов комплексного поливалентного бактериофага в композиционной массе обеспечивало сублимационное высу шивание. Оптимизация технологических параметров таблетирования комплексных бактерио фагов установила прямое влияние массы таблетки на кислотоустойчивость – таблетки массой более 150 мг обладают большей желудочной резистентностью. Двояковыпуклая форма повы шает желудочную резистентность таблетированного бактериофага в отличие от плоскоцилин дрической и в сравнении с жидким препаратом. Изучение влияния давления прессования на активность фагов показало компрессионную устойчивость бактериофага [4,5].

Исследована биодоступность твердых лекарственных форм бактериофагов комплексных бактериофагов в таблетированной и капсулированной форме. Исследования «in vtro» показали, что в таблетированной и капсулированно форме сохранение активности комплексного бактериофага после воздействия кислой среды в 6,5 раза выше, чем в жидкой [4,5]. Таким образом, твердые лекарственные формы обладают выраженной кислотоустойчи востью в сравнении с жидким коммерческим препаратом. При исследовании фармакокинети ки гранулированного с желудочно-резистентными наполнителями и жидкого коммерческого секстафага на лабораторных животных установлено, что при пероральном введении бакте риофагов гранулят обеспечивает сохранение их литической активности в 3 раза больше, чем жидкий препарат [5]. Проведенные биофармацевтические исследования показали, что разра ботанный состав для таблетированной и капсулированной лекарственной формы комплексно го бактериофага является более эффективным, чем жидкий препарат: обеспечивает стабиль ность компонентов секстафага в соляной кислоте желудочного сока и длительную циркуляцию бактерифагов в организме человека (пролонгированность антибактериального эффекта).

Изучение влияния температуры хранения на стабильность компонентов секстафага играет немаловажную роль как для производителей медицинских иммунобиологических пре паратов, так и для всех звеньев товаро-проводящей цепи (дистрибьюторы, аптеки) и потреби телей. Исследования показали, что хранение таблеток в герметичных стеклянных флаконах или полимерных банках при пониженных температурах (5±3)°С и ниже не сопровождалось инактивацией бактериофагов. При повышенной температуре (35±1)°С значительное снижение активности препарата отмечали только через 1,5-2 недели. Установлено, что при комнатной температуре (23±3)°С допустимо хранить таблетки не более 1 месяца. При хранении разрабо танных таблетированных и капсулированных препаратов Секстафаг®, Интести-бактериофаг Бактериофаги в медицине и ветеринарии при температуре (5±3)С наблюдалось сохранение активности в течение 18 месяцев.

В результате проведенных исследований разработан представленный на рисунке алго ритм конструирования твердых лекарственных форм бактериофагов.

Рис. 1. Алгоритм разработки твердых лекарственных форм комплексных поли валентных бактериофагов.

Заключение. Таким образом, разработана рациональная методология конструирова ния твердых лекарственных форм бактериофагов: сумма предложенных конструктивных под Бактериофаги в медицине и ветеринарии ходов, технологических схем позволяет расширить ассортимент отечественных, высокоэффек тивных, экологически безопасных антибактериальных препаратов.

Библиографический список 1. Адамс, М. Бактериофаги. – [Методы изучения вирусов бактерий] – М., 1961. - 527 с.

2. Ворошилова, Н.Н Эпидемиологическая и клиническая эффективность препаратов бактериофагов при лечении и профилактике инфекционных заболеваний / Н.Н. Ворошилова, Т.Б. Казакова, Г.Г. Боговазова, Э.В. Алферова // Создание и перспективы применения медицин ских иммунобиологических препаратов: Материалы конференции. – Пермь, 2008. С. 91-94.

3. Казьянин, А.В. Бактериофаги: опыт производства и применения / А.В. Казьянин, Е.В. Орлова, М.Г. Ефимова и др., // Фармация, № 3, 2010. – С.36-37.

4. Ковязина, Н.А. Разработка состава и технологии желудочно-резистентных таблеток «Секстафаг» / Н.А. Ковязина, В.И. Решетников, Е.В. Функнер, М.Г. Ефимова // Фармация, № 7, 2008. - С.36-39.

5. Ковязина, Н.А. Характеристика свойств таблетированной лекарственной формы по ливалентных бактериофагов / Н.А. Ковязина, Е.В. Функнер, О.И. Шитова и др., // Биопрепара ты, № 2, 2010. - С.18-21.

6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты). Часть 2 – Москва.: Гриф и К. 2012.-536с.

DEVELOPMENT OF SOLID DOSAGE FORMS ON THE BASE OF COMPLEX POLYVALENT BACTERIOPHAGE PREPARATIONS Kovyazina N.A., Kazyanin A.V., Nikolaeva A.M., Funkner E.V.

Key words: baterophage, boavaabty, apsues, esgn, yt atvty, tabets, pharmaoknets.

The arte s evote to the eveopment of so osage forms of baterophages. Hgh boavaabty of the orgna omposton of the tabets an apsues as ompare wth the qu rug has been reveae. As a resut of the researhes onute the agorthm esgn of so osage forms of baterophages has been eveope: n the sum the propose onstrutve approahes an the tehnooga shemes enabe us to exten the range of omest, hgh-performane, envronmentay safe antbatera rugs.

УДК 578.232. ПСЕВДОЛИЗОГЕННЫЕ АССОЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНОГО БАКТЕРИОФАГА G7C И ШАММА-ХОЗЯИНА E. COLI 4S.

Летарова М.А., 1Стрелкова Д.А., 2Бакумова А.Д., 1Куликов Е.Е., 1, Голомидова А.К., 1Прохоров Н.С., 3Кутузова Н.М.1,2Летаров А.В.

1 – ФГБУН «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН», 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2, +7(499) 135-21- 2 – ГБОУ «Школа-Интернат Интеллектуал», 121357, г. Москва, ул.

Кременчугская, д. 13. +7(499) 445-52- 3 – ГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет»

Бактериофаги в медицине и ветеринарии г. Москва. ул. Малая пироговская д.1. стр.1. +7(499)245-03- Ключевые слова: N4-подобный бактериофаг, подовирус, псевдолизогенные ассо 4-подобный циации, Esherha coli.

В работе исследовано образование и развитие метастабильных, перевиваемых на плотных средах ассоциаций облигатно-вирулентного N4-подобного бактериофага G7 и его хозяина.

Введение.

Бактериофаги являются естественными индигенными компонентами симбиотических микробных систем человека и животных. Особенностью кишечной экосистемы лошади явля ется преобладание вирулентных бактериофагов, что относится также и к популяциям фагов E. coli, которые обнаруживаются у некоторых животных в достаточно большом титре до Б.О.Е. грамм фекалий. В то же время титры колифагов подвергаются значительным колебани ям (более 4 порядков в течение недели;

Golomidova et al. 2007, Куликов с соавт. 2007), падая в определенные периоды до весьма низких значений (при использовании любой конкретной тест-культуры для мониторинга) При этом общий титр E. coli составляет около 106 К.О.Е./ г.

Штаммовое разнообразие колиформных бактерий чрезвычайно высоко - в кишечнике одной лошади могут содержаться первые сотни различных штаммов (Golomidova et al. 2007, Исаева с соавт. 2010). Также известно (Golomidova at. all,2007), что спектр хозяев большинства кишеч ных колифагов, выделенных от лошадей, достаточно узок, вплоть до того, что хозяином может являться единственный штамм кишечной палочки. Обнаружено, что эти вирулентные бакте риофаги могут длительное время обнаруживаться в кишечнике лошади, так, например, пока зана персистенция бактериофага Lc3 у лошади в течение трех лет (Голомидова с соавт. личное сообщение). Таким образом популяции индивидуальных колифагов в экосистеме кишечника лошади часто оказываются в ситуации, когда общая плотность доступных хозяев падает ниже критической (Kasman 2005), что должно было бы приводить к элиминации этих фагов. Одним из возможных объяснений длительного существования штаммов вирулентных бактериофагов в экосистеме кишечника лошади может быть образование ими так называемых псевдолизо генных ассоциаций (ПА) с хозяевами, которые могут существовать в виде локальных (микро) колоний. В таких ПА должны создаваться следующие условия:

1.Все время существование ассоциации обеспечивается рост клеток, чувствительных к данному бактериофагу.

2. Поддерживается высокая плотность популяции E. coli, достаточная для поддержа ния фага в литическом цикле.

3. ПА должна быть стабильна.

4. ПА должна иметь способность к пролиферации.

В этой работе мы исследовали возможность формирования и свойства ПА на модели системы бактериофаг G7C – Е. сoil 4s, которая была выделена из образца фекалий лошади и детально охарактеризована, включая определение полной последовательности генома фага (Kulikov et al. 2012) Материалы и методы.

Штаммы бактерий и бактериофагов и их культивирование.

В работе использовали штамм E. coli 4s и N4 – подобный бактериофаг G7C из коллек. s 4 7C C ции лаборатории. Кроме того использовали Т5 – подобный фаг MPC600, также выделенный нами от лошадей, который обладал способностью инфицировать дериваты E. coli 4s, рези s,, Бактериофаги в медицине и ветеринарии стентные к фагу G7C, но не исходный штамм. Для культивирования фага MPC600 использо 7C, C,, вали штамм E.coli C600. Бактерии выращивали на питательной среде LB следующего состава:

триптон (Pronadisa) – 10г, дрожжевой экстракт (Pronadisa), - 5г, NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризо Pronadisa) ) Pronadisa), ), ванная среда, LBsoft содержала 0,6% агар-агара, твердый LB – 1%.

Анализ состава ПА.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |
 

Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.