авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |

«Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой ...»

-- [ Страница 6 ] --

В некоторых случаях (см. результаты) определяли отношение фаг/клетки. Для это го приготовляли суспензию псевдолизогенной ассоциации (ПА) в физиологическом растворе, фаг высевали в разведениях на газон штамма-хозяина до отдельных бляшек, а клетки шпате лем до получения отдельных колоний Для получения субклонов бактерий из ПА клетки отмывали от экзогенного фага с по мощью инактивирующего свободные вирусные частицы экстракта чая (de Sigueira et al. 2006).

Вирицидный экстракт готовили следующим образом: 10 г листьев чая заливали 100 мл кипя щей стерильной воды, настаивали в сухожаровом шкафу при 100°С в плотно закрытом флако не 30 мин, фильтровали через бумажный, а затем через мембранный фильтр, с порами 0,44 мкм или автоклавировали. Экстракт хранили при +4°С.

Получение отдельные бляшек бактериофагов производилось методом посева двой ным слоем на питательную среду. Получение газонов также производилось с помощью метода «двойного слоя», только без добавление бактериофага.

Пассирование ассоциаций с помощью стерильных зубочисток или стерильных гемато критных капилляров, путем перекалывания с одной чашки Петри с агаром на другие, с твердой средой или преформированным газоном.

ПЦР и анализ его результатов ПЦР ставили в объеме 20 мкл, на амплификаторе BioRad 1852000. Для детекции фага использовали праймеры на ген 50 (g50D 5 GCCCATGCGTATTCACAA и g50R 5 CCATAGC g50D 50D D 50R R GTGTGTTACCGA).

Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 1 %-ном агарозном геле с добавлением 0,1% раствора бромистого этидия. Просматривали гели на трансиллюминаторе при длине волны 254 н.м. или 312, в зависимости от концентрации материала.

Получение псевдолизогенных асоциаций.

Фаг G7C был рассеян до отдельных бляшек. Из некоторых, случайно выбранных бля 7C C шек с помощью стерильной зубочистки, на чашку с твердым агаром, были перенесено содер жимое бляшек. На чашке наблюдался рост бактерий.

Эти культуры переносили на чашки с газоном исходного штамма. Если в популяции наблюдался бактериофаг, то на газоне вокруг места посева образовывалась зона лизиса.

Одна итерация называлась поколением. Всего было протестировано 53 ассоциаций (ПА) в 12 поколениях.

Результаты.

В каждом поколении учитывалось количество ПА, выделяющих детектируемый фаг.



Из 53 ПА к четвертому поколению большинство прекратило выделять фага, но шесть ПА продолжали выделять фага вплоть до 15 поколения (Рис. 1) Бактериофаги в медицине и ветеринарии Рис.1. Изменение количества ассоциаций, выделяющих фаг, в череде поколений при тестировании на газонах E.col 4s и 4sAs (информацию об этом штамме см. ниже) Были проанализированы свойства субклонов бактерий из пяти ПА, которые сохраняли способность выделять фага к 12 поколению. Определили их чувствительность к исходному фагу G7C.

Было обнаружено, что не смотря на активное выделение фага, субклоны ПА из поко лений с высокими номерами (6-7) не чувствительны с исходному фагу.

При рассеве суспензии исходного штамма E.coli 4s на фаговый агар, содержащий фаг G7C было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчивые клетки с частотой око 7C C ло 10-4 (что значительно выше обычной частоты фагоустойчивых мутантов). Этот дериват мы обозначили 4sR. В отличии от штамма 4s, 4sR оказался чувствителен к фагу МРС600.

Тестирование субклонов ПА обнаружило, что практически все они чувствительны к МРС600 и при этом часто выделяют фага на своих собственных газонах, а на газонах исходно го штамма-хозяина фага не выделяют. При дальнейшем исследовании было обнаружено что:

-Все субклоны ПА чувствительны к фагу MPC -Несмотря на вирицидную обработку суспензии перед посевом, некоторые субклоны содержат ассоциированный с ними фаг - Все субклоны способны расти на фаговом агаре с G7C - В 7 пассаже появляются субклоны, на которых фаг G7C способен образовывать мел 7CC кие бляшки. В 8 пассаже такие субклоны преобладают, что, однако, не сопровождается увели чением титра фага, детектируемого на газоне штамма 4s.

Таким образом, при образовании и развитии ПА изменяются и фаги и клетки. Для дальнейшего исследования этого являения мы выбрали такой субклон, на котором растет фаг, содержащийся в ПА (далее –phi 8810), но не растет исходный фаг G7C. Этот штамм мы назва phi 7C.

C.

.

ли 4sAs Производные этого штамма, резистентные к фагу phi8810 (а равно и к исходному фагу G7C) были называны 4sAR. Мы исследовали эффективность посева (относительно штаммов, на которых получены соответствующие лизаты) фагов G7C и phi8810 и MPC600 на газонах штаммов E.coli 4s, 4sAs, 4sR и 4sAR. (Табл. 1).

Бактериофаги в медицине и ветеринарии ЭП, бактериофаги Штаммы G7C Phi8810 MPC 4s 1,0 10-5 4sAS 10 1,0 1, - 4sR 0 Л 1, 4sAR 0 0 1, С600 0 0 1, Табл. 1. Эффективность посева (ЭП) бактериофагов на различных штаммах E.col относительно штаммов, использованых для приготовления соответствующих ли.col col затов. Л – зона лизиса наблюдается при нанесении на газон капли концентрированного лизата, но при разведении фага отдельных бляшек не образуется.

Анализ морфологии фагов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии показал, что фаг phi8810 морфологически неотличим от исходного фага G7C. Это подтверж 8810 7C.

C.

.

дается также данными ПЦР. Таким образом, фаг phi 8810 не является контаминантом, но пред ставляет собой дериват фага G7C с измененным спектром хозяев. Исследование профилей белков этих фагов с помощью ДСН-ПААГ электрофореза также не выявило между ними раз личий.





Морфология клеток различных дериватов E.coli 4s, полученных в этой работе, также не различалась (по данным световой микросокпии), однако исходный штамм 4s и штамм 4sAs обладали способностью формировать крупны агрегаты клеток, причем у 4sAs эти агрегаты иногда достигают размеров, различимых невооруженным взглядом. При этом все эти штам мы практически не образуют биопленок на поверхности пластика иммунологических плашек (данные не приведены).

Выводы.

1. Выявлен один из механизмов длительного поддержания вирулентных бактериофа гов в ПА.

2. Развитие ПА бактериофага G7C и штамма E. coli 4s сопровождается увеличением разнообразия штаммов бактерии и фага, по сравнению с исходными компонентами.

3. Этот механизм может принимать участие в формировании и поддержании высокой внутривидовой гетерогенности популяций E. coli в кишечнике лошадей.

Список литературы:

1. Golomidova A, Kulikov E, Isaeva A, Manykin A, Letarov A. The diversity of coliphages and coliforms in horse feces reveals a complex pattern of ecological interactions. // Appl Environ Microbiology. 2007. 73:5975– 2. Куликов Е.Е., Исаева А.С., Роткина А.С., Маныкин А.А. и Летаров А.В. Биоразно образие и динамика бактериофагов в фекалиях лошадей. // Микробиология. 2007. 76, 271- 3. Исаева А.С., Куликов Е.Е, Тарасян К.К., Летаров А.В. Новый метод высокоразре шающего геномного ПЦР-фингерпринтинга энтеробактерий. // Acta naturae. 2010. 2 (1), 82- 4. Kasman LM. Barriers to coliphage infection of commensal intestinal flora of laboratory mice. // Virol J. 2005 Apr 15;

2:34.

5. Kulikov E., Kropinski A.M., Golomidova A.K., Isolation and characterization of a novel indigenous intestinal N4-related coliphage vB_EcoP_G7C. // Virology. 2012. 426 (2012) 93– 6. de Siqueira RS, Dodd CE, Rees CE. Evaluation of the natural virucidal activity of teas for use in the phage amplification assay. // Int J Food Microbiol. 2006. ct 1;

111(3):259-62.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 577.152. ЭНДОЛИЗИН БАКТЕРИОФАГА Т5 КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ЭНЗИБИОТИК Микулинская Г.В., кандидат биологических наук, Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН, г. Пущино, mikulinskaya@fibkh.serpukhov.su Зимин А.А., кандидат биологических наук, zimin@ibpm.pushchino.ru Степная О.А., доктор биологических наук, О.А.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН, г.

Пущино Ключевые слова: эндолизин, бактериофаг Т5, L-аланоил-D-глутаматпептидаза, энзибиотики Был изуен спектр антибактериального действия нового эндолизина бактериофага Т5 - катионозависимой L-аланоил-D-глутаматпептидазы. оказано, то фермент специфи -аланоил-D-глутаматпептидазы.

D-глутаматпептидазы.

-глутаматпептидазы.

ески разрушает пептидогликан грамотрицательных бактерий, относящийся к типу А1.

оказано, то фермент полностью лизирует живые клетки бактерий в присутствии по лимиксина В. Это позволяет прогнозировать применение данного белка как энзибиотика на правленного действия.

Введение. Эндолизины – группа белков, кодируемых бактериофагами и разрушаю щих пептидогликан клеточной стенки бактерии на конечной стадии литического цикла раз вития фага. По типу связей, гидролизуемых в пептидогликане, эндолизины делят на 5 клас сов: 1) мурамидазы;

2) литические трансгликозилазы;

3) N-ацетил--D-глюкозаминидазы;

4) N-ацетилмурамил-L-аланинамидазы и 5) пептидазы [1,2]. В настоящее время в связи с по -ацетилмурамил-L-аланинамидазы L-аланинамидазы -аланинамидазы явлением большого числа антибиотикоустойчивых патогенов литические ферменты бактери офагов рассматриваются в качестве альтернативы антибиотикам для лечения и профилактики инфекций бактериальной природы.

Эндолизины характеризуются определенным спектром антибактериального действия, не зависящим от чувствительности бактерии к антибиотикам. Спектр антибактериального действия эндолизина определяется типом фермента, составом компонентов клеточной стенки, а также конфигурацией субстрата. Избирательность действия эндолизина фага С1 на стреп тококки позволяет его использовать в качестве профилактического средства для предотвра щения колонизации этими бактериями мукозного эпителия верхних дыхательных путей [3].

Специфичность другого фагового эндолизина к B.anthras позволяет использовать его в диа гностике [4]. Лизоцим бактериофага Т4 был успешно использован для защиты картофеля от вредной бактерии Erwna arotowora [5]. Относительно фаговых эндолизинов в литературе часто употребляется термин «энзибиотики».

Целью настоящей работы стал анализ спектра антибактериального действия нового эндолизина бактериофага Т5 и исследование возможности его применения в качестве лизиру ющего агента.

Материалы и методы. С целью определения спектра антибактериального дей ствия эндолизина клетки ночной культуры бактерий убивали автоклавированием, промывали и суспендировали в реакционном буфере (50 mM Tris-HCl, pH 8.2, содержащем 0.1% Tритон X-100) до концентрации ~2108 к.о.е./мл. Реакцию начинали добавлением фермента. Литиче скую активность измеряли по уменьшению оптической плотности при 450 нм в 1-см акрило Бактериофаги в медицине и ветеринарии вых кюветах при комнатной температуре. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует убывание оптической плотности на 1 ОЕ в минуту.

С целью проверки действия эндолизина на живые клетки бактерий ночную культу ру E. coli суспендировали в реакционном буфере (50 mM Tris-HCl, pH 8.2, содержащем 0.1% Tритон X-100) до концентрации ~2108 к.о.е./мл. Один образец обрабатывали полимиксином В (конечная концентрация 40 мкг/мл), второй – чистым препаратом эндолизина (конечная кон центрация 40 мкг/мл), третий – обоими агентами в тех же концентрациях. Контролем служи ли необработанные клетки. Все образцы инкубировали сутки при 37°С, после чего отбирали аликвоты, соответствующие 107 исходных клеток, и выращивали газоном на LB-агаре в тече -агаре ние ночи.

Результаты и их обсуждение. Эндолизин бактериофага Т5 был успешно клонирован в клетках E.coli и очищен до электрофоретически гомогенного состояния [6]. Была исследова на активность эндолизина бактериофага Т5, изучены важнейшие биохимические и физические свойства фермента [7]. Фермент является Ca2+-зависимой L-аланоил-D-глутаматпептидазой, однако относится к семейству цинк-содержащих пептидаз семейства М15 клана МD [6-7]. Это первый пример L-аланоил-D-глутаматпептидазы, обнаруженной у вирулентного фага, инфи -аланоил-D-глутаматпептидазы, D-глутаматпептидазы, -глутаматпептидазы, цирующего грамотрицательную бактерию.

Для определения спектра антибактериального действия фермента была проверена его способность гидролизовать пептидогликаны различного строения. Среди бактерий, выбран ных для лизиса, были как грамположительные, так и грамотрицательные с различной струк турой пептидогликана и клеточной стенки (Таблица 1). Все препараты грамотрицательных бактерий были подвержены быстрому лизису. Среди проверенных грамположительных видов только препараты клеток B. subts были подвержены слабому лизису (скорость на четыре порядка меньше максимальной), остальные грамположительные клетки не лизировались во обще. Таким образом, было показано, что фермент специфичен к пептидогликану грамотрица тельных бактерий, который относится к одному типу - A1 - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточных стенок грамположительных бактерий.

Таблица 1. - Действие пептидазы бактериофага Т5 на гетерологичные микроор ганизмы Тип пептидогликана Относительная скорость Организм лизиса, Ед/мг белка Esherha o K-12 A1 (1.12±0.12) Petobaterum arotovorum A1 (1.01±0.15) Pseuomonas puta A1 (1.35±0.18) Proteus vugars A1 (1.19± 0.20) Proteus mrabs A1 (1.04±0.15) Baus subts A1 0.48±0. Lstera monoytogenes A1 0.016±0. Staphyoous aureus A3 0. ornebaterum xeross A1 0. Mroous uteus А2 0. Как правило, для проникновения «изнутри» клетки сквозь внутреннюю мембрану клетки-хозяина к слою пептидогликана эндолизину необходим гидрофобный белок холин, второй компонент двухбелковой системы фаголизиса клетки. Однако, эндолизины способны разрушать пептидогликан клеточной стенки и в одиночку, будучи добавленными «извне» в Бактериофаги в медицине и ветеринарии виде очищенного рекомбинантного белка. Прежде всего, это характерно для эндолизинов, специфичных к пептидогликану грамположительных бактерий. В некоторых случаях грамо трицательные микроорганизмы на определенных стадиях роста также подвержены лизису эндолизинами [5]. Однако в целом применение подобных белков против грамотрицательных микроорганизмов осложняется строением клеточной стенки последних, а именно наличием наружной плазматической мембраны.

Одним из способов пермеабилизации наружной мембраны, обеспечивающей эндоли зину доступ к субстрату – пептидогликану – и дальнейший лизис клетки, является применение антибиотиков, нарушающих мембрану [8]. В этом случае можно говорить о синергическом действии эндолизина с антибиотиком.

Мы использовали полимиксин В – пептидный антибиотик, который может связываться с фосфолипидами наружной мембраны и увеличивать ее проницаемость. На рисунке 1 видно, что полимиксин в концентрации 40 мкг/мл ингибирует рост клеток, не лизируя их (оптическая плотность не падает). Однако совместное использование эндолизина и полимиксина приводит к полному лизису клеток. При этом контрольные (ничем не обработанные) клетки и клетки, обработанные препаратом эндолизина, образуют сплошной газон.

Рис. 1. Выживаемость клеток E.coli под действием эндолизина. На рисунке пред ставлены фрагменты чашек, инкубированных с: А – очищенным эндолизином (концен трация 40 мкг/мл), В – полимиксином В (концентрация 40 мкг/мл), С – полимиксином В и эндолизином (концентрация каждого 40 мкг/мл), D – контрольные клетки.

Таким образом, можно говорить о бактериолитическом действии эндолизина на гра мотрицательные клетки, опосредованном пермеабилизацией наружной мембраны полимикси ном В.

Заключение. Исследования, проведенные в целях изучения спектра бактериолитиче Бактериофаги в медицине и ветеринарии ского действия фермента, показали, что пептидаза бактериофага Т5 специфична к клеточным стенкам грамотрицательных микроорганизмов, пептидогликан которых относится к одному типу - A1 - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточ ных стенок грамположительных бактерий. Среди грамотрицательных микрорганизмов есть и патогенные для животных и человека, а также растений (Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Shigella, Aeromonas, Vibrio cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Ser,,,,,,, ratia, Escherichia, Proteus, Providencia, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Agrobacterium tumefaciens и другие). Наличие вызываемых грамотрицательными бактериями заболеваний делает эндолизин Т5 потенциальным бактериолитическим средством довольно узкого спектра действия, особенно перспективным в случаях, когда применение антибиотиков нежелательно или неэффективно.

В качестве пермеабилизующего мембрану грам-отрицательной бактерии агента нами были использован полимиксин В. Однако, это не единственный способ пермеабилизации мем браны. Можно выделить еще несколько подходов: физические или химические методы воздей ствия на клетку –обработка ЭДТА, триполифосфатом натрия, нагрев, изменение pH, обработка ультразвуком, - а также создание химерных конструкций на основе эндолизина, слитого с до менами определенного типа или антимикробными пептидами, обеспечивающими транслока цию через наружную мембрану. Это относительно новый подход, однако известны случаи, когда создание химерных белков помогало модулировать активность эндолизинов, изменять их специфичность и направленно бороться с патогенами [1].

Библиографический список 1. Borysowski, J. Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents/ J.

Borysowski, B. Weber-Dabrowska, A. Grski // Exp. Biol. Med. (Maywood) - 2006. – v. 231. – p.

366-377.

2. Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins-current state of research and applications/ M.

J. Loessner // Curr. pin. Microbiol. – 2005. – v. 8. – p. 480-487.

3. Nelson, D. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme // D. Nelson, L. Loomis, V. A. Fischetti// Proc.

Natl.Acad. Sci. USA - 2001. – v. 98. – p. 4107-4112.

4. Schuch, R. A bacteriolytic agent that detects and kills Baus anthras/ R. Schuch, D.

Nelson, V. A. Fischetti// Nature. – 2002. – v. 418. – p. 884-889.

5. During, K. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium E.

arotovora/ K. During, P. Porsch, M. Fladung, H. Lorz // Plant J. – 1993. – v. 3. – p. 587-598.

6. Mikoulinskaia, G. V. Identification and characterization of the metal ion-dependent L-alanoyl-D-glutamate peptidase encoded by bacteriophage T5 / G. V. Mikoulinskaia, I. V. dinokova, A. A. Zimin et al. // FEBS J. – 2009. – v. 276. – p. 7329-7342.

7. Mikoulinskaia, G. V. L-Alanoyl-D-Glutamate Peptidase (Bacteriophage T5) / G. V.

Mikoulinskaia, I. V. dinokova, A. A. Zimin,. A. Stepnaya // Handbook of Proteolytic Enzymes: III edition by Neil D. Rawlings and Guy S. Salvesen - xford: Academic Press, 2013. - p. 1407-1410.

8. Begunova, E. A. The effect of the extracellular bacteriolytic enzymes of Lysobater sp. on gram-negative bacteria / E. A. Begunova,. A. Stepnaia, I. M. Tsfasman, I. S. Kulaev // Microbiology - 2004. – v. 73. – p. 320-325.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии BACTERIOPHAGE T5 ENDOLYSIN AS A POTENTIAL ENZYBIOTIC Mikoulinskaia G.V., Zimin A.A., Stepnaya О.А.

Keywords: enoysn, baterophage T5, L-aanoy-D-gutamate peptase, enzybots The range of antbatera aton of new baterophage T5 enoysn – aton-epenent L-aanoy-D-gutamate peptase - was nvestgate. It was shown that the enzyme s spefi to the e was of the Gram-negatve mroorgansms, ontanng peptogyan of A1 type. It was shown that the enzyme ompetey yses ve batera es after poymyxn B treatment. It makes T peptase a potenta anate for the use as an enzybot of rete aton.

УДК 578.81, 578.52, 615.076. ПЦР-СИСТЕМА ТИПИРОВАНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA Мирошников К.А., кандидат биологических наук, и.о. зав. лабораторией ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, kmi@ibch.ru Сыкилинда Н.Н., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, sykilinda@mail.ru Куликов Е.Е., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского» РАН, eumenius@ gmail.com Дурманова З.В., ведущий инженер ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ тел. 7(499) 241-31-05, giskfag@rambler.ru Цыганова М.Р., аспирант ФГБУН «Институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН Дарбеева О.С., кандидат медицинских наук, главный эксперт ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ Ключевые слова: бактериофаги, Pseuomonas aerugnosa, фаготерапия, генотипи, рование, полимеразная цепная реакция В ходе данной работы разработана ЦР-тестовая система определения таксономи еской принадлежности бактериофагов P.aerugnosa в контексте возможности использова.aerugnosa aerugnosa ния фагов в терапевтиеских препаратах Введение: Для терапии синегнойных инфекций успешно применяются бактериофаги, в том числе и промышленно выпускаемые. Принципы селекции терапевтических бактерио фагов в настоящее время в основном эмпирические, и не имеется строгой описательной базы, основанной на генетических данных. Некоторые из требований, предъявляемых к бактерио фагам, используемым в составе терапевтических смесей, неразрывно связаны с изучением их генома. Знание полной последовательности генома фага позволяет проверить наличие генных Бактериофаги в медицине и ветеринарии модулей рекомбинации или транспозиции, свойственных умеренным фагам, генов факторов вирулентности или токсинов. Однако полное секвенирование геномов остается достаточно дорогой процедурой, особенно с учетом быстро меняющихся составов фаговых препаратов при адаптации их к новым штаммам патогенных микроорганизмов. В качестве более дешевой и технологичной альтернативы предложена система быстрого типирования имеющихся и e novo выделяемых бактериофагов Pseuomonas aerugnosa на основе ПЦР-анализа, и на этом основании приведение состава терапевтических смесей фагов к оптимуму по генетическому составу. Сконструированная нами система быстрого отнесения на основе ПЦР-анализа имею щихся и e novo выделяемых бактериофагов синегнойной палочки P.aerugnosa к определен ным группам позволяет определить пригодность тестируемого бактериофага к применению в составе терапевтических смесей фагов.

Результаты исследований и их обсуждение:

1. Анализ геномов бактериофагов P. aeruginosa.

На сегодняшний день в GenBank содержится более 60 полных геномов бактериофа гов P.aerugnosa, что составляет 4% всех полностью секвенированных фагов. Практически ис ключительно в состав известных фаговых коктейлей входят бактериофаги auovraes (хво статые). Имеющиеся в базе данных GenBank бактериофаги этого отряда можно подразделить следующим образом (табл.1):

Таблица 1. - Свойства групп известных бактериофагов P.aerugnosa Размер генома, Число Жизненный № Группа фагов Семейство т.п.о геномов цикл Myovrae 1 KZ-подобные 211-316 6 Литический Myovrae 2 PB1- подобные 65-66 8 Литический Poovrae 3 KMV- подобные 42-43 8 Литический Poovrae 4 N4- подобные 74 2 Литический Sphovrae 5 YuA- подобные 59-59 3 Литический Poovrae 6 LUZ24- подобные 45 2 Варьирует Sphovrae 7 D3- подобные 56-57 6 Умеренный Myovrae 8 P2- подобные 35-36 2 Умеренный Poovrae 9 119X- подобные 42-43 2 Умеренный Sphovrae 10 Лямбдоидные 43-44 2 Умеренный Sphovrae 11 F10- подобные 39-40 2 Умеренный Sphovrae 12 F116- подобные 65 1 Умеренный Sphovrae 13 транспозоны 37-39 5 Умеренный Частичное секвенирование e novo выделенных из природных источников бактерио фагов P.aerugnosa показывает, что в подавляющем большинстве случаев их можно отнести к одному из вышеописанных видов. Таким образом, можно сделать некоторые предварительные выводы по пригодности тех или иных бактериофагов для терапевтических приложений:

Бактериофаги в медицине и ветеринарии 1. Группы фагов 1-4 с достаточно высокой степенью уверенности можно тестировать в качестве составной части фаговых коктейлей.

2. Фаги из групп 5-8 можно рассматривать как кандидатные. Однако следует учиты вать генетически заложенную возможность лизогенной конверсии и проводить интенсивную проверку на проявление умеренных свойств на широком спектре штаммов.

3. Фаги групп 9-13, способные к активной интеграции-транспозиции и токсической конверсии бактерий, должны быть исключены из использования в терапевтических целях.

За исключением фагов-транспозонов группы 13, объединяемых преимущественно по типу действия, а не по формально таксономическому родству, и отчасти группы 1, имеющей широкую вариабельность геномов на нуклеотидном уровне, выделенные группы бактериофа гов сохраняют весьма высокую консервативность геномов. Основные различия геномов, опре деляющие принадлежность фага к отдельному виду, обычно находятся в высоко-вариативной области ранних генов, определяющих взаимодействия с клеточными системами хозяина, а также в генах хвостовых фибрилл и шипов, обусловливающих опознавание рецепторов на по верхности клеток-хозяев.

2. Разработка ПЦР-системы определения генетической принадлежности бактериофа гов Анализ геномов бактериофагов показывает, что наиболее консервативными внутри каждой группы являются гены, кодирующие белковые продукты, формирующие структурные компоненты частицы фагов – икосаэдрическую головку (капсид) и хвост. Во всех случаях в качестве реперных консервативных генов были использованы гены мажорных или минорных белков капсидов. Были сконструированы и оптимизированы последовательности праймеров для всех групп литических бактериофагов, и проведены ПЦР с использованием модельных фагов для определения оптимальных условий реакции.

Во всех случаях специфических праймеров к конкретным группам фагов образование единичного продукта со сходным количественным выходом наблюдалось в диапазоне темпе ратур отжига 57-64 оС и концентрации Mg2+ 0,5 – 2,0 мМ. Установленная последовательным разбавлением матрицы чувствительность ПЦР-системы соответствует концентрации бактери офага 2 пг в пробе. Таким образом, минимально определяемой с помощью ПЦР тест-системы концентрацией бактериофагов в растворе примерно является 103 частиц бактериофага в 1 мл раствора. Внесение «искусственного загрязнения» - бактериальной ДНК E.o в реакционную смесь в количестве до 200 нг заметного влияния на чувствительность реакции не оказывает.

Тестирование селектривности ПЦР-системы было проведено в отношении тех групп бакте риофагов P.aerugnosa, для которых имеются репрезентативные коллекции, включающие не менее 10 бактериофагов, принадлежащих к определенной группе. В случае KMV-подобных, РВ1-подобных и YuA-подобных фагов ПЦР тест давал положительный сигнал в случае всех бактериофагов коллекции.

3. ПЦР-проверка наличия бактериофагов в коммерческих терапевтических пре паратах.

Разработанные реакционные смеси для ПЦР-тестирования для всех основных извест ных типов литических бактериофагов, наличие которых с наибольшей вероятностью можно ожидать в промышленных терапевтических смесях фагов против псеводомонадных инфекций, были применены к промышленно производимым смесям лекарственных препаратов. Для про мышленных терапевтических смесей синегнойных бактериофагов, предоставленных ГИСК им. Тарасевича, были получены следующие результаты:

№1 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.07 KMV Бактериофаги в медицине и ветеринарии №2 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 06.08 KMV №3 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 08.08 KMV №4 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.08 KMV №5 - Бактериофаг синегнойный, ермь, 20 мл, партия 01.10 KMV+ KZ №6 - Бактериофаг синегнойный, ермь, 20 мл, партия 02.10 KMV+ KZ Таким образом, во всех смесях было установлено наличие Poovrae KMV-подобных бактериофагов, и в двух смесях – наличие Myovrae KZ – подобных фагов. Обе группы фа KZ гов принадлежат к вирулентным, допустимым к применению в терапевтических смесях.

4. Титрование терапевтических смесей на штаммах P.aeruginosa и ЭМ-анализ.

Принимая во внимание широкий штаммовый диапазон действия терапевтических смесей (больше, чем для каждого из известных индивидуальных бактериофагов), деклариро ванное наличие в смесях нескольких типов фагов, и ограничение ПЦР-системы по чувстви тельности (уверенное определение фагов в концентрации 103 бое), мы провели титрование терапевтических смесей для оценки количества негативных колоний (НК) различной морфо логии. По результатам эксперимента в препаратах 1-4 достоверно подтверждается подавляю щее количественное преимущество KMV-подобных фагов, что соответствует результатам ис ходного ПЦР-теста. Были проведены ПЦР-тесты с материалом, взятым из индивидуальных НК. Было еще раз подтверждено наличие KMV-подобных фагов во всех смесях и установлено наличие KZ-подобных фагов в смесях №5 и 6. Поскольку титрование смесей в большин KZ-подобных стве случаев давало несколько типов НК (бляшек) на газоне клеток P.aerugnosa, была про ведена ЭМ-визуализация бактериофагов, входящих в состав смесей. Наблюдения подтвердили наличие во всех смесях бактериофагов семейства Poovrae, относящихся к группе KMV подобных, и крупных Myovrae бактериофагов, относящихся к группе KZ- подобных, в материале препаратов 5 и 6.

Помимо этого, как в материале терапевтических смесей, так и в материале нега тивных колоний наблюдалось небольшое количество бактериофагов более мелких Myovrae и небольших Sphovrae бактериофагов, причем в материале некоторых негативных колоний были выше и концентрация примесных бактериофагов, и их разнообразие. ПЦР-сигнала до полнительно обнаруженные бактериофаги не дают, то есть либо их концентрация составляет величину ниже предела детекции ПЦР-системы, либо эти фаги относятся к группам, на геном которых детекционная система не разрабатывалась. Мы предположили следующие причины присутствия неидентифицированных бактериофагов в терапевтических смесях:

1. Поскольку состав образцов фаговых препаратов, из которых составляется терапев тическая смесь, охарактеризован недостаточно, возможно, что в образцах содержатся фаги не скольких видов. Такие фаги менее активны, и их влияние на общую активность препарата невелико. Однако так как это тоже псевдомонадные фаги, в культуре ферментации они также размножаются. Вероятно, на некоторых штаммах активность таких минорных фагов возрас тает, и в материале бляшек их пропорция более заметна.

2. Все известные геномы штаммов P.aerugnosa содержат в своем составе груп пы генов, идентифицируемые как профаги, т.е. лизогены, захваченные в ходе эволюции. В литературе обсуждается возможность активации профагов как одного из ответов бактерий на массовую инфекцию бактериофагами. Генетика умеренных фагов, а тем более профагов P.aerugnosa изучена плохо, поэтому детекции таких вторичных фагов системой ПЦР не про исходит.

Оба этих эффекта требуют дальнейшего углубленного изучения, однако следует заметить, что и доля таких «вторичных» фагов, и их активность значительно ниже, чем лити Бактериофаги в медицине и ветеринарии ческих KMV- и KZ-подобных фагов, составляющих основное содержание терапевтических смесей.

Заключение: На основе обобщенных геномных данных создана унифицированная ПЦР-система, которая позволяет определять групповую принадлежность бактериофагов P. ae rugnosa, выделенных e novo и находящихся в плохо охарактеризованных коллекциях без про ведения длительных культуральных работ, электронной микроскопии и полной расшифровки последовательностей геномов. Определение таксономической принадлежности бактериофа гов P.aerugnosa позволяет оценить возможность использования этих фагов в терапевтических препаратах PCR SYSTEM FOR GENOTYPING OF THERAPEUTIC PSEUDOMONAS AERUGINOSA BACTERIOPHAGES Miroshnikov K.A., Sykilinda N.N., Kulikov E.E., Durmanova Z.V., Tsyganova M.R., Darbeeva O.S.

Keywords: baterophages, Pseuomonas aerugnosa, phage therapy, genotypng, poymerase han reaton The goa of the present work s the esgn of PR-testng system rete for taxonom etermnaton of P.aerugnosa baterophages for use n therapeut preparatons.

УДК 619: РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ УСКОРЕННОЙ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI О157 C ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА Молофеева Н.И., кандидат биологических наук, доцент Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, fvm.zol@yandex.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: индикация, бактерии, бактериофаги, реакция нарастания титра фага.

Работа посвящена разработке технологиеских параметров по ускоренной иденти фикации бактерий рода Esherha o О157 с помощью реакции нарастания титра фага.

Введение. Escherichia coli являются распространенными возбудителями инфекцион ных заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных и человека [5, 6].

В научной литературе имеется большое число сообщений о заболевании людей, про текающих в тяжелой форме, вызванных Е. coli сероваром 157, который образует шигоподоб 157, Бактериофаги в медицине и ветеринарии ный вероцитотоксин [5, 7]. Вспышки этой инфекции, зарегистрированы во многих странах Северной и Южной Америки, Австралии, Европы, Азии, Африки и в нашей стране. Эшерихии серогруппы О157 вызывают у молодняка животных диарею, геморрагический энтероколит и отечную болезнь у поросят [6]. Так как основным резервуаром инфекции является крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, реже лошади, олени, птица, то особенно опасны для людей пищевые продукты, полученные от этих животных [8], а также растительные продукты, вы ращенные на полях, куда мог вывозиться, необеззараженный навоз, от животных-носителей этотого серовара эшерихий. По данным J. Tuttle (1999) в ноябре 1992 года - феврале 1993 года наблюдалась вспышка (более 700 случаев) на Западе США, вызванная Esherha coli О157, связанная с гамбургерами, приготавливаемых в ресторанах. Исследования показали, что для заражения человека достаточна инфицирующая доза не превышающая 700 бактерий.

В последнее время совершенствованию методов лабораторной диагностике инфек ций, вызываемых Esherha coli О157 уделяется большое внимание. Современные методы иммунодиагностики (ПЦР и ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и явля ются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов, делает их пока недоступными для большинства лабораторий. В лабораторной практике для ускоренного обнаружения микроорганизмов в патологическом ма териале и объектах внешней среды, а также для их быстрого типирования, предложены инди каторные бактериофаги [2, 3, 4]. Методы фагодиагностики просты в постановке, специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.

Цель и задачи исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации E.o серогруппы О157 с помощью реакции нарастания титра фагов (РНФ). В связи с этим при выполнении работы решались следующие задачи: выделить и изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее диапазон, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хло роформу) селекционированных изолятов, активные в отношении штаммов Е. o 157 и раз работать схему ускоренной индикации бактерий E.o О157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

Материалы и методы исследований Штаммы. В работе использованы гомологичные - 6 штаммов E. coli 157, так и ге терологичные - 67 штаммов E.o, в том числе 12 штаммов получены из лаборатории ООИ центра санэпиднадзора Ульяновской обл, 56 штаммов E.o выделены нами из хозяйств Мо сковской, Ульяновской и Самарской области. Помимо этого, при определении специфично сти бактериофагов использовались 71 штамм других видов бактерий – представители родов:

Proteus, Citrobacter, Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, полученные из музея кафедры. Они обладали типичными для данных культур биологическими свойствами. Объектами исследования явились фаги E coli 157, выделенные нами из объектов внешней среды хозяйств Ульяновской и Самарской областей.

Питательные среды и реактивы. Мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА);

полужидкий агар, пептонная вода.

Приборы и оборудование. Термостаты ТС-80М-2;

микроскопы МБИ-3, лупа биноку лярная МБС-9, ультратермостаты УТ-15У4,2;

вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия), центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3;

аппарат ультрафиолетового облучателя крови «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8-1;

холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0;

2,0;

5,0 см3, чашки Петри, пробирки, стандарты мутно сти на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток.

Методы. При работе с бактериями все посевы инкубировались при температуре 37°С Бактериофаги в медицине и ветеринарии в течение 24-48 часов, а при работе с бактериофагами в течение 16-20 часов. Методические указания «по методам выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E coli 157:Н7», МУК 4.2.992-00. Исследования фагов проводили общепринятыми методами Грация [1].

Результаты исследований и их обсуждение Для выполнения цели исследований необходимо было первоначально выделить и из учить искомый бактериофаг, поэтому первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги E.o О157 из имеющихся у нас штаммов бактерий E.o О157. Используя стро гую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к патогенным штаммам E.o О157 мы разработали схему выделения и ускоренной идентификации этих микроорганизмов При разработке оптимальных условий постановки РНФ необходимо прежде всего:

а) иметь биопрепарат из штаммов бактериофагов, обладающих строгой специфичностью и наибольшим совместным спектром литической активности;

в) определить количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение;

с) определить оптимальное время, обеспечивающее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Нами было установлено, что спектр активности бактериофагов Е-61 и Е-67 УГСХА равен 100%, они обладают высокой литической активностью по Аппельману 10-7 и по Грациа от 1,5х109 до 3,2х109, а также высо кой температурной устойчивостью до 800 С и проявили 100 % устойчивость к воздействию хлороформа в течение 40 минут.

Для определения параметров постановки РНФ и разработки количественного пока зателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методу, предложенному Гольдфарбом [3]. Проведены эксперименты с использованием МПБ контаминированного часовыми референс культурами E.o О157 штамм РЛ для фага Е-61 УГСХА и E.o О штамм №51659 для фага Е-67 УГСХА различным числом (от 101 до 1х105 м.к./мл). В качестве контроля использовали интактный МПБ.

Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подс чтывали число негативных колоний фага, выросших на питательной среде в опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Оценку РНФ проводили согласно таблицы 1. В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывали и вычитали из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках. Разницу сравнивали с контролем. При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной культуры) реакция не учитывалась. РНФ, оцененная как со мнительная, не имела диагностического значения.

Таблица 1. - Показатели увеличения титра фага в РНФ Увеличение количества частиц бактериофага в опытной по от Оценка результатов ношению к его контролю Увеличение до 2.5 раз Отрицательная Увеличение до 5 раз Сомнительная Увеличение в 5 и более раз Положительная В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага.

По результатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контамнации МПБ E.o О157 в концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 мл МПБ.

Для установления оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное Бактериофаги в медицине и ветеринарии взаимодействие фага с бактериями, необходимо было провести эксперименты на тест- объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индика торной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентра ция бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест объекта использовали МПБ, оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров:

в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37°С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при тем пературе 37°С;

в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10, 16 и 24 часов при температуре 37 С.

Для изучение чувствительности РНФ в зависимости от времени подращивания МПБ контаминировали бактериями E.o О157 в контаминации 101-105м.к/м и инкубировали в тер мостате при температуре 37°С в течение 5, 16 и 24 часов. Результаты исследования представ лены в таблице 2.

Таблица 2. - Чуствительность РНФ в зависимости от времени подращивания ис следуемого материала, контаминированного E.o О Минимальное количество Время, затраченное на Варианты эшерихий, обнаруживаемое с проведение исследований (в исследований помощью часах) № Длительность подращивания п.п. РНФ РНФ исследуемого бак. метод бак. метод материала часы МПБ МПБ МПБ МПБ 5 10 10 22 3 Е-61 16 102 н.о 32 н.о 24 102 н.о 40 н.о 5 103 104 22 Е-67 16 10 н.о 32 н.о 24 102 н.о 40 н.о Установлено, что при подращивании материала в течение 5-ти часов позволяет обна ружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл. При подращивании исследу емого материала в течение 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет об наружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследования затрачивается часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихий обнаружить не удавалось.

При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается, также позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов.

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный E.o О157 штаммами РЛ и №51659 от 101 до105 м.к./мл не подращивали, а увеличивали время контакта материала с фагом до 10, 16, 24 часов. Результаты представлены в таблице 3.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 3 - Чуствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования ис следуемого материала с фагом Е-61 УГСХА Минимальное количество Время, затраченное на Варианты эшерихий, обнаруживаемое проведение исследований (в исследований с помощью часах) № Длительность п.п. подращивания РНФ бак. метод РНФ бак. метод исследуемого материала часы МПБ МПБ МПБ МПБ 10 10 10 22 3 Е-61 16 102 н.о 32 н.о 24 102 н.о 40 н.о 10 103 104 22 Е-67 16 10 н.о 32 н.о 24 102 н.о 40 н.о По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкуби рования исследуемого материала с фагом установлено, что увеличение времени до 10-ти часов позволяет обнаружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл. При инкубиро вании исследуемого материала с фагом в течение 16 часов чувствительность реакции повы шается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследо вания затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихий обна ружить не удавалось. При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к./мл.. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов. Бактериологическим методом E.o О157 удавалось обнаружить в концентрации 104 м.к./мл, на проведение иссле дования затрачивается 96 часов.

На основании наших данных, считаем, что наиболее эффективными являются режи мы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 16-18 часов, поэтому данный режим используем в дальнейших иссле дованиях, хотя наиболее эффективным по чувствительности является инкубирование исследу емого материала с фагом в течение 16 часов на которое затрачивается до 32 часов.

Библиографический список 1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с англ.)//М., 1961.-521 С.

2. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят.

// Ветеринария. № 3, 1967, с. 69-71.

3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// М.: Медгиз., 1961, -297С.

4. Ляшенко Е.А., Золотухин С.Н.. Васильев Д.А. Разработка и применение фагово го биопрепарата для диагностики клебсиеллезной инфекции // Вестник ветеринарии, Том 59, Ставрополь, 2011 с. 90-92.

5. Покровский В.И., Полоцкий Ю.Е., Ющук Н.Д., Бондаренко В.М. // Журн. микро биол., № 4, 1989, с. 80-87.

6. Тугаринов О.А., М.К.Пирожков, Ю.А.Малахов Сборник научных трудов.

//М.:ВГНКИ, Т.62, 2001, с. 68-75.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии 7. Ратинер Ю.А., Канарейкина С.К., Бондаренко В.М. // Журнал микробиологии., № 5, 1976, с. 117-121.

8. Armstrong G.L., Hollingsworth J., Morris J.G. Persistence of Eschericia coli 157:H7 in dairy cattle and the dairu farm environment. // Epidemiol. Rev., V. 18, 1996, р. 29 - 51.

9. Tuttle J., Gomez T., Doyle M.P., Wells J.G., Zhao T., Tauxe P.V., Griffin P.M. Enterohem orrhagic Escherichia coli. // Epidemiol.fnd Infec., - V. 122, №2, 1999, р.185-192.

THE DEVELOPMENT OF PARAMETERS OF THE ACCELERATED IDENTIFICATION OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI О157 WITH THE HELP OF THE REACTION OF RISE OF TITRE OF THE PHAGE Моlofeeva N.I., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Кey words: entfiaton, batera, baterophages, the reaton of rse of ttre of the phage.

The work s evote to the eveopment of tehnooga parameters on the aeerate entfiaton of batera of the genus Esherha o О157 wth the hep of the reaton of rse of ttre of the phage.

УДК 619: ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ АЭРОМОНАД В РЫБНОЙ ПРОДУКЦИИ Насибуллин И.Р., соискатель,, nir72@mail.ru Горшков И.Г., научный сотрудник, i.o.gun@mail.ru Куклина Н.Г., научный сотрудник, ul_nk@mail.ru Викторов Д.А., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, viktorov_da@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор Тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Нафеев А.А., доктор медицинских наук, nafeev@mail.ru Ключевые слова: Aeromonas, бактериофаги, биопрепарат, индикация, реакция на, растания титра фага.

Авторами выделены бактериофаги бактерий вида Aermonas hyropha, исследованы их основные биологиеские свойства и разработан диагностиеский биопрепарат. На основе созданного биопрепарата предложен новый метод индикации Aeromonas hyropha с приме нением реакции нарастания титра фага.

Введение. Бактерии рода Aeromonas широко распространены в окружающей среде и известны как возбудители аэромоноза – инфекционного заболевания многих видов рыб и других гидробионтов. Аэромоноз встречается повсеместно и наносит значительный экономи ческий ущерб рыбоводческим хозяйствам. Контаминированная аэромонадами рыбная продук Бактериофаги в медицине и ветеринарии ция представляет собой источник серьезных заболеваний человека и животных.

При возникновении в хозяйстве аэромоноза на него накладывают карантин, выпол няют ветеринарно-санитарные и рыбоводно-мелиоративные мероприятия согласно действу ющей инструкции [3, 4]. Для лечения аэромоноза рыб в хозяйствах применяют антибиотики широкого спектра действия и другие антисептические средства. Согласно инструкции активно применяются такие препараты как: дибиомицин, бацилихин, ветдипасфен, кронолактон, фура золидон, хлорная и гашенная известь. Все эти препараты накапливаются в тканях рыб и других гидробионтов и попадают в дальнейшем в пищевое сырье и продукцию.

Применение этих препаратов приводит к уничтожению полезной сапрофитной микро флоры водоемов, микрофлоры кишечника рыб и гидробионтов, появлению антибиотикорези стентных бактерий. Меры профилактики согласно инструкции требуют от хозяйств проведения ряда сложных и затратных мероприятий, связанных с дезинфекцией бассейнов и инвентаря, созданием оптимальных зоогигиенических, гидрологических и гидрохимических условий [3].

Диагноз на аэромоноз устанавливают на основании эпизоотологических данных, кли нических признаков болезни, патологоанатомических изменений, а также результатов бакте риологического исследования [4].

Индикация и идентификация аэромонад является трудоемким и длительным (до часов) процессом. Типирование до рода Aeromonas требует применения сложных и дорогосто ящих сред и проведения ряда узких тестов, что обуславливает недостоверность исследования.

Внутривидовая идентификация из-за незначительных различий между видами сложна и может служить причиной ошибок.

В связи с этим возникла необходимость использования новых методов индикации бактерий рода Aeromonas, обладающих следующими критериями: кратчайшие сроки исследо вания, простота в применении, высокая чувствительность и специфичность. Для этих целей нами разработан биопрепарат на основе выделенного и изученного бактериофага Ф43-УГСХА и параметры его применения в схеме реакции нарастания титра фага (РНФ).

Материалы и методы исследования.

В качестве исходного материала при выделении бактериофагов были использованы 103 пробы воды водоемов Ульяновской области. В качестве индикаторной культуры исполь зовали референс-штамм A.h.-43, полученный из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульновской ГСХА им. П.А. Столыпина.

Посевы инкубировали при температуре 35 С в течение 24-48 часов. Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам Д.М. Гольдфарба (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловича(1973), С.Н. Золотухина (2007), Д.А. Викторова (2011). Для полу чения негативных колоний бактериофагов использовали метод агаровых слоев по Грация. По вышение литической активности проводили пассированием на индикаторной культуре. Ли тическую активность определяли методами Аппельмана и Грации. Для определения спектра литической активности применяли референс-штамм и выделенные нами ранее 14 полевых штаммов. Для определения специфичности использовали штаммы бактерий других родов:

Proteus, Morganea, Kebssea, Baus, trobater, Yersna, Pseuomonas, полученные из му зея кафедры. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами. Реакцию нарас тания титра фага проводили по методам В.Д. Тимакова, Д.М. Гольдфарба и В.Я. Ганюшкина.

Результаты исследований.

Препарат бактериофага Ф-43 УГСХА обладает всеми необходимыми для проведения РНФ свойствами: титр бактериофага 2 х 10-8, спектр литической активности 86,7 %, строгая специфичность по отношению к бактерии A. hyropha.

В результате серии исследований была разработана схема постановки РНФ с исполь Бактериофаги в медицине и ветеринарии зованием биопрепарата бактериофага Ф-43 УГСХА, представленная на рисунке № 1.

Рисунок № 1. Схема реакции нарастания титра фага для индикации Aeromonas hyropha.

Исследуемый материал весом 5 г растирается в фарфоровой ступке и вносится в кол бы, содержащие по 50 мл питательного бульона (МПБ). Содержимое колб культивируется в течении 5 часов при 28 С для предварительного подращивания бактерий. На каждую иссле дуемую пробу отводится три пробирки: №1- предназначена для опытной пробы, №2- является контролем на свободный фаг, №3- контроль титра индикаторного фага. Исследуемый материал разливается по 9 мл в пробирки №1 и №2, пробирки №3 содержат 9 мл МПБ. В пробирки №1 и №3 добавляется по 1 мл бактериофага Ф43- УГСХА в рабочем разведении (титр бактериофага 104), а пробирки №2-1 мл МПБ. Все пробы инкубируются в термостате при температуре 28 С 7 часов. Параллельно ставится контроль стерильности сред. После инкубации из пробирок бе рутся пробы по 0.25 мл, вносятся в пробирки с 4,5 мл МПБ и обрабатываются фильтрованием через бактериальные фильтры или хлороформом 1:10 в течении 20 минут. Далее содержимое пробирок исследуется методом агаровых слоев по Грации. Чашки инкубируют 12 часов при 28 С.

Реакция считается положительной при нарастании титра фага в 5 и более раз.

Заключение.

Таким образом, разработанная схема РНФ с использованием биопрепарата бактери офага Ф-43 УГСХА позволяет проводить индикацию Aeromonas hyropha в различных объ ектах количестве от 103 м.к./мл в течении 24 часов.

Метод РНФ с использованием биопрепарата бактериофага Ф-43 УГСХА имеет ряд су щественных преимуществ: время на исследование сокращается до 24 часов, реакция обладает Бактериофаги в медицине и ветеринарии высокой чувствительностью, высокой специфичностью, не требует выделения культуры чи стой культуры возбудителя, не требует дорогостоящего оборудования и материалов, методика достаточно проста.

Все перечисленное позволяет судить о высокой экономической эффективности метода РНФ в сравнении с существующими методами индикации аэромонад [2].

Библиографический список 1. Викторов, Д.А. Разработка методов диагностики, лечения и профилактики псевдо моноза рыб с использованием биопрепарата на основе бактериофагов / Д.А. Викторов, О.А.

Тен, И.И. Богданов // Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии: Материалы III-й Международной научно-практической конференции моло -й дых учёных Молодёжь и наука XXI века, Ульяновск, 2010. – Т. 3. – С. 6-8.

2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги и их применение в ветеринарии.- Ульяновск, 1988, с.45.

3. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб, Минсельхоз прод России, Департамент ветеринарии, 1998.

4. Методические указания по лабораторной диагностике аэроманоза карпов, Госагро пром СССР, М.,1986.

APPLICATION OF THE METHOD OF REACTION OF RISE OF TITRE OF PHAGE TO DISPLAY AEROMONADS IN FISH PRODUCTS Nasibullin I.R., Gorshkov I.G., Кukna N.G., Vktorov D.А., Vasev D.А., Nafeev A.A.

Key words: Aeromonas, baterophages, booga prout, naton, response phage tter rse.

The authors entfie baterophages of batera spees Aermonas hyropha, nvestgate ther bas booga propertes an eveope agnost bopreparaton. n the bass of reate preparaton a new metho of naton of Aeromonas hyropha wth the use of the reaton of rse of ttre of the phage was suggeste.

УДК 619:616- ПОЛУЧЕНИЕ СУХИХ ЛЕЧЕБНЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПОНЕНТОВ КОММЕРЧЕСКИХ КОРМОВ Перелыгин В.В., кандидат биологических наук, снс, тел. 8 (4967) 36-00-27, Perelygin@obolensk.org Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор, ГНЦ ПМБ, тел. 8(4967) 36-00-79, Svetoch@obolensk.org Похиленко В.Д., доктор технических наук, Веревкин В.О. кандидат медицинских наук, Воложанцев Н.В. кандидат биологических наук, nikvol@obolensk.org Бактериофаги в медицине и ветеринарии ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора Ключевые слова: Бактериофаги, обезвоживание, инкапсулирование, компоненты кормов, леебный препарат, энтеробактерии.

Работа посвящена биотехнологии приготовления сухих леебных препаратов бакте риофагов на основе компонентов коммереских кормов для леения и профилактики заболева ний, вызванных патогенными энтеробактериями. олуенные композиции фагов и препараты леебных кормов были исследованы на лабораторных животных и птице при разлиных усло виях введения, в том исле и при предъявлении ерез корм. Во всех слуаях полуены положи тельные результаты, однознано свидетельствующие о высокой эффективности композиции специфиеских бактериофагов (SG-3, SG-6, 11 и F62), а также (V7811, V7817), инкорпориро SG-3, -6, -3, 62), V7811, 7817), 7811, ванных в состав сухих кормов, для леения и профилактики сальмонеллезной и эшерихиозной инфекций у животных и птицы Введение. Одним из основных источников кишечных заболеваний человека являются продукты питания, в том числе продукты птицеводства (мясо и яйцо), инфицированные пато генными микроорганизмами, особенно представителями родов Samonea и Esherha.

Использование антибиотиков для борьбы с кишечными инфекциями в настоящее вре мя не рационально по причине высокой вероятности спонтанного появления антибиотико резистентных патогенов бактериальной природы. В качестве альтернативы антибиотикам в последние годы активно рассматриваются бактериофаги - вирусы, специфически лизирующие бактериальные клетки патогенных микроорганизмов [1, 2].

Бактериофаги могли бы способствовать получению экологически чистых продуктов птицеводства, если бы существовали малозатратные и масштабируемые технологии приготов ления препаратов бактериофагов.

Для достижения высокого уровня сохраняемости биологических свойств бактериофа гов на технологических стадиях получения препарата и в процессе его хранения и применения требуется использовать недорогие, но эффективные защитные соединения.

Бактериофаги, должны быть также защищены от действия клеточных и гуморальных факторов иммунитета, литических секретов и ферментов внутренней (полостной) среды орга низма. Высока вероятность, что защита бактериофагов может быть достигнута при инкапсули ровании или иммобилизации фаговых частиц на различных носителях, включая природные и синтетические полимеры органической природы. Например, для обработки поверхности кож ных покровов успешно использовали бактериофаги, защищенные органическими полимера ми, такими как карбоксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, хитозан [1,2]. Цель иссле дования - разработать доступную технологию приготовления сухих препаратов бактериофагов с использованием природных компонентов, традиционно входящих в состав кормов.

Материалы и методы исследований. Из основ науки ангидробиоинженерии [3] сле дует, что для обратимой консервации микроорганизмов, включая бактериофаги и вирусы, из них следует удалить приемлемым способом избыток влаги.

Для обезвоживания бактериофагов был использован контактно-сорбционный метод высушивания [4,5], который по своей сути близок к методу «L-высушивания». В качестве по L-высушивания».

-высушивания».

глотителей влаги применены высушенные растительная мука или соевый протеин, мелкие или крупные фракции стандартного корма для животных и птицы. Такого рода сухие вещества после смешивания в определенном соотношении с фаговой суспензией связывают основную массу воды. Сорбированная вода затем удаляется другим способом, обеспечивая кондиции готового продукта по остаточной влажности (8-10%). Сухие препараты, содержащие жизне Бактериофаги в медицине и ветеринарии способные бактериофаги, используются как добавки к корму, либо непосредственно в виде корма, что определяется дозой бактериофагов в соответствии с установками по профилактике и лечению.

Другим способом обезвоживания является сублимационное высушивание на лабо раторных установках в соответствии с выбранными режимами. Подобранное сочетание за щитных соединений позволяет получить после высушивания до 50% жизнеспособных бак териофаговых частиц. Лиофилизированные препараты хорошо диспергируются в воде, они пригодны для инъекционного введения, для выпаивания, а также могут использоваться для аэрозольной обработки животных и птицы.

Методика сублимационного высушивания была использована для получения препа ратов с высокой концентрацией бактериофагов. Способ лиофилизации, однако, не всегда при годен для сушки бактериофагов из-за отсутствия достоверных данных об оптимальном уровне остаточной влажности в сухих препаратах различных бактериофагов.


В качестве защитных соединений применены протеины (соевый белок), растительная мука, органические полимеры (декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон), а также известные природные соединения, которые часто используются в виде кормовых доба вок. Эти соединения обволакивают частицы бактериофагов и защищают их от действия внеш них неблагоприятных факторов, а также при действии кислот в желудочно-кишечном тракте животного или птицы.

Бактериофаги, лизирующие бактерии Samonea Enterts, Samonea Typhmurum, Samonea Heeberg, Samonea Ganarum-puorum, Samonea hoerae sus, Esherha coli, были выделены из фекальных масс птицы и сточных вод убойных цехов птицефабрик. В качестве лечебного фагового препарата использовали смесь очищенных специфических анти сальмонеллезных бактериофагов (SG-3, SG-6, F62, С11 и BМ), которая была включена в состав гранул (частиц) приготовленного корма.

Бактериофаги размножали на культуре чувствительных бактерий S.Еnterts в жид кой питательной среде. Концентрацию бактериофагов определяли при титровании препаратов на культуре тех же бактерий и выражали в бляшко-образующих единицах (БОЕ). Титры исход ных фаговых препаратов находились в пределах 11012 - 11014 БОЕ.

Результаты и их обсуждение. В процессе разработки технологии получения сухих препаратов проведено изучение выживаемости фагов в гранулах комбикорма с использовани ем бактериофага Г-1, специфичного в отношении S.Enterts, взятого в концентрации БОЕ/мл.

Препараты бактериофагов при использовании компонентов кормов, получали мето дом экструзии с последующим дроблением до достижения оптимального размера частиц (2- мм). Инструментальный контроль уровня остаточной влажности осуществляли как в процессе обезвоживания, так и при закладке бактериофаговых препаратов на хранение для последую щего использования.

Обезвоживание фаговой суспензии проводили в смесителе контактно-сорбционным способом с использованием комбинаций различных носителей.

Проведенные исследования показали, что контактно-сорбционное высушивание су спензии бактериофагов на комбинациях носителей в целом дает неплохие результаты. Выжи ваемость бактериофагов в зависимости от варианта композиции составляла от 4,3 до 17, 3%, что сравнимо с результатами, получаемыми в таких условиях для клеток бактерий [6]. Низкая выживаемость фага при использовании сорбента - Ti2 объясняется пересушиванием матери ала (о.в. 0,79%), что необходимо учитывать при создании сухих бактериофаговых препаратов.

Уровень инактивации бактериофагов в процессе хранения был оценен после исследо Бактериофаги в медицине и ветеринарии вания герметично укупоренных кормовых препаратов, находившихся при температуре от 2 до 8 °С в течение 60 дней. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. - Сохранение жизнеспособности бактериофагов при хранении Вес про- Титр фага в препарате, БОЕ Выживае № Препарат бы, мость до хранения через 60 дней мг % 1 Фаг + соевая мука 50 2,9108 4,4108 Фаг + ПВП + соевая 2 50 2,1108 5,0108 мука Фаг + смесь 3 корм: соевая мука 108 2,0108 2,7108 (1:1)* Фаг + смесь 4 корм: соевая мука 104 1,7108 3,9108 (1:1)** * - выдавлено ерез “фильеры”, гранулы высушены в токе горяего воздуха.

** - выдавлено ерез “фильеры”, гранулы высушены на окиси алюминия.

Из приведенных в таблице 1 результатов следует, что бактериофаги, инкорпорирован ные в гранулы соевого комбикорма, способны сохранять жизнеспособность, и практически не инактивируются в течение 60 дней при температуре от 2 до 8 °С.

Комплексные препараты бактериофагов, подтвердившие стабильность при длитель ном хранении, были использованы для лечения экспериментальных сальмонеллезной инфек ции и колисептицемии у белых мышей и бройлерных цыплят.

Для моделирования сальмонеллезной инфекции у цыплят был выбран штамм S.Enterts 92, вирулентные свойства которого изучены ранее на белых мышах. При заража ющей дозе 1,2107 ж.м.к. оказались инфицированными сальмонеллами 66,6 % цыплят. Исходя из этих данных, для заражения цыплят выбрана доза около 1108 ж.м.к.

В опытах на белых мышах установлено, что лечение экспериментального сальмонел леза путем выпаивания им суспензии бактериофагов является не эффективным, в то время как скармливание фагов с гранулами корма позволяет вылечить 40-50% зараженных животных.

В опытах на бройлерных цыплятах, взятых в количестве 60 особей, все цыплята по лучили на второй день жизни per os около 6,9х107 клеток S.Enterts 92. Контрольная группа лечения не получала, а опытная имела свободный доступ к кормовым гранулам, содержащим 2 х108 БОЕ/г фаговых частиц, в течение последующих 25 дней. По окончании эксперимента в нелеченной (контрольной группе) культура сальмонелл обнаружена у 30 особей в селезенке и у 19 - в печени, в то время как в группе, потреблявшей бактериофаг в составе корма, были по ражены только 2 особи (селезенка) и одна (печень).

Полученные результаты свидетельствуют об эффективном действии фагового препа рата, предъявленного в составе лечебного корма, для профилактики сальмонеллеза у цыплят.

Заключение. В результате проведенных исследований разработаны лечебные формы бактериофаговых препаратов, пригодные для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц на основе компонентов коммерческих кормов:

Сухой лиофилизированный концентрат бактериофагов (1010-1011 БОЕ/г) во флаконах и ампулах, пригодный для приготовления жидких и инкапсулированных сухих препаратов ле чебно-профилактического направления.

Сухая гранулированная лечебная добавка, содержащая бактериофаги (108-109 БОЕ/г) Бактериофаги в медицине и ветеринарии для использования с комбикормом. Готовый комбикорм, содержаший иммобилизованные бак териофаги в дозировке (106-107 БОЕ/г), достаточен для профилактического и лечебного дей ствия. Срок хранения препаратов лечебных кормов не менее 6 месяцев, препаратов, лиофили зированных в герметично укупоренных флаконах, - не менее одного года при 2-10 °С.

Библиографический список 1. Stanford K, McAllister TA, Niu YD et al. ral delivery systems for encapsulated bacterio phages targeted at Escherichia coli 157:H7 in feedlot cattle // J Food Prot. 2010 Jul;

73(7):1304-12.

2. Ghanbari Hossein A., Averback Paul. Composition containing bacteriophage and meth ods of using bacteriphages to treat infections// US Patent 6,121,036 September 19, 3. Crowe JH, Hoekstra FA, Crowe LM.. Anhydrobiosis //Annu Rev Physiol. 1992;

54:579 99.

4. Светоч Э.А., Перелыгин В.В., А.Н.Панин и др. Биопрепарат на основе фагов для профилактики и лечения сальмонеллеза животных //Патент РФ N 2232808, 5. Светоч Э.А., Перелыгин В.В., А.Н.Панин и др. Биопрепарат на основе фагов для профилактики и лечения колибактериоза (эшерихиоза) животных //Патент РФ N 2244747, 2004.

6. Перелыгин В.В. и др. Способ контактной сушки микроорганизмов. Описание изо бретения // патент N2067114, 1996.

OBTAINING DRY THERAPEUTIC PREPARATIONS OF BACTERIOPHAGES WITH USING THE COMPONENTS OF COMMERCIAL FODDERS Perelygin V.V., Svetoch E.A., Pokhilenko V.D., Volozhantsev N.V.

Key words: baterophages, ehyraton, enapsuaton, the omponent of foers, thera peut preparaton, enterobaterum.

Work s eate to the reaton of the botehnoogy of the preparaton of the ry thera peut preparatons of baterophages on the bass of the omponents of ommera foers for treatment an preventve mantenane of the seases of those ause by pathogen enterobatera.

The obtane ompostons of phages an the preparatons of therapeut foers were on ther bass nvestgate on aboratory anmas an br wth the vare ontons of ntrouton, nung wth the presentaton through the foer. In a ases was obtane the postve resuts, whh testfy about the hgh effieny of the omposton of spefi baterophages (SG-3, SG-6, 11 an F62), an aso (V7811, V7817) the norporate nto the omposton ry foers for the treatment an the preven tve treatment of samoneoss an esсherhoss nfetons n anmas an br Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 619: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНЫХ ФАГОВ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ ПТИЦЫ Подзорова Ю.А., ветеринарно-санитарный врач Серегин И.Г., кандидат ветеринарных наук, профессор Логинов И.А., кандидат биологических наук, доцент Московский государственный университет пищевых производств Ключевые слова: птица, переработка, вода, бактериофаги, сальмонеллы, тушки, по луфабрикаты, безопасность, токсикоинфекции.

Работа посвящена изуению возможности применения сальмонеллезных фагов при переработке птицы и производстве птиьих полуфабрикатов. В экспериментальных условиях установлено, то при использовании бактериофагов в питьевой воде для бройлеров перед убоем и добавлением в воду охлаждающих тушки анов, знаительно снижается содержание гомологиных микроорганизмов в тушках и полуфабрикатах из птицы.

Введение. Основной задачей ветеринарной службы предприятий мясной промышлен.

ности является охрана населения от болезней, общих для животных и человека, в том числе от токсикоинфекций различной этиологии. В последние годы токсикоинфекции стали представлять определенную проблему для человека, так как до сих пор они широко распространены во всех странах мира и достаточно часто у детей имеют летальный исход. Чаще всего регистрируют массовые вспышки токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии при употреблении птичьего мяса и яичных продуктов.

Сальмонеллезом заражаются все виды домашней птицы. С развитием промышленного птицеводства изменились условия содержания птицы и концентрация поголовья в помещеньях, что способствует перезаражению поголовья и увеличению сальмонеллоносительства у птицы.

При убое птицы, в партии которой имелись переболевшие или носители, происходит контаминация сальмонеллами других тушек здорового поголовья.

Такие тушки или полуфабрикаты представляют биологическую опасность для человека и могут быть причиной массовых вспышек токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии. В мясе птицы чаще всего обнаруживают S.puorum, реже - S.enterrs, S. typhmurum и др.[1, 2].Инфицирование птицы сальмонеллами обычно происходит при напольном содержании на птицефермах и при кон вейерной переработке с использованием технических средств для снятия перьев и чанов с охлажденной водой. Если в начале смены контаминация тушек сальмонеллами до снятия пера выявляется у 1,3-3,6 % убитой птицы, то после тепловой обработке и снятия пера - у 2,8-12,2%, а после охлаждения в чане с водой – 22,4-36,6 % тушек. В конце смены контаминация тушек сальмонеллами возрастает в 1,5-2 раза и более [2, 3].

В производственных условиях обеззараживание воды в чане проводят с помощью раствора хлорной извести или надуксусной кислоты. Но эти химические вещества небезопасны для человека, поэтому использование их во многих странах, в том числе и в России, ограничено.

По нашему мнению, перспективным для снижения контаминации птицы сальмонеллами может быть применение фагов к наиболее распространенным и опасным для человека сальмонеллам при подготовке птицы к убою и при охлаждении тушек в чане с водой.

Бактериофагами называют вирусы бактерий, которые имеют резко выраженные паразитические свойства, обеспечивающие возможность их размножения и сохранность в клетках гомологичных видов микроорганизмов.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Фаги специфичны и активны только для гомологичных микроорганизмов, они безвредны для животных, птицы и человека. Бактериофаги успешно применяются в медицине и ветеринарии, в пищевой и косметической промышленности. Их обычно обнаруживают в сточных водах. Фаги обладают активностью при температуре 10-42°С и способны лизировать гомологичные бактериальные клетки в разведениях до 1:10-8–1:10-12 [4, 5].

Мы изучили эффективность применения сальмонеллезных бактериофагов при подготовке бройлеров к убою и переработке на конвейерных линиях с использованием охлаждения тушек в чане с водой.

Материалы и методы. В работе использовали фаги, гомологичные S. puorum, S.enterts, S.typhmurum, S.ubn. Активность сальмонеллезных фагов определяли методом Аппельмана – последовательным разведением фагов в МПБ и культивированием на гомологичных клетках сальмонелл.

Микробиологические исследования тушек кур и полуфабрикатов из них проводили согласно ГОСТ 21237-75 «Мясо. Метод бактериологического анализа», ГОСТ 7702-23-93 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птицы. Метод выявления сальмонелл» и методических рекомендаций «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных» (1990).

На первом этапе бройлерам через рот вводили 48 – часовую культуру сальмонелл, а сальмонеллезные фаги добавляли в питьевую воду в разведении 1:10-4- 1:10-5 в течение двух суток перед убоем. Контролем служили цыплята-бройлеры, получавшие питьевую воду без бактериофагов. После убоя цыплят проводили микробиологические исследования содержимого кишечника и определили наличие сальмонелл, гомологичных и гетерологичных применяемым фагам.

На втором этапе были отобраны тушки бройлеров, свободных от сальмонелл, поверхность которых экспериментально контаминировали культурами, гомологичными фагам. Затем подопытные тушки опускали в емкость с водой, содержащей сальмонеллезные фаги в концентрации 1:10-4-1:10-5. Контролем служили тушки бройлеров, которые после контаминирования сальмонеллами опускали в воду без добавления фагов.

Микробиологическим исследованиям подвергали все подопытные и контрольные тушки бройлеров, а также полуфабрикаты из них до обработки фагами и после нее ежедневно в течение 5 суток.

Результаты исследования. Полученные результаты исследования показали, что при выпаивании сальмонеллезных фагов через 24-36 часов достигается обеззараживание содержимого кишечника от гомологичных клеток сальмонелл. Только в отдельных пробах содержимого толстого отдела кишечника были обнаружены S. puorum. В содержимом кишечника контрольных бройлеров выявляли S. puorum (28,7% проб), S.enterts (17,6%), S.

typhmurum (7,2%), S. ubn (3,7%).

При исследовании тушек бройлеров, контаминированных сальмонеллами и хранившихся при комнатной температуре (15-18С), после обработки водой с фагами число сальмонеллезных клеток на поверхности кожи через 12 часов сократилась на 32,9 - 41,2% по сравнению с контролем. Через 24 часа хранения количество гомологичных сальмонелл со кратилось на 44,7 - 46,9%. На тушках, хранившихся при 18-20°С, снижение клеток сальмо °С,, льмо нелл через 12 часов достигло 85,8% по сравнению с контролем, через 24 часа – до 89,6%, через 48 часов – до 92,2%. При дальнейшем повышении температуры хранения количество гомологичных сальмонеллезных клеток на поверхности тушек, обработанных водой с фагами, снижалось до 98,2 - 98,9%. Однако, при хранении тушек бройлеров после обработки фагами при температуре 4С число сальмонеллезных клеток сокращалось в течение 1-5 суток только на 2,8 - 4,4% по сравнению с контролем. Близкие к этому получены результаты исследования Бактериофаги в медицине и ветеринарии полуфабрикатов из подопытных и контрольных тушек бройлеров (окорочка, бедра, грудная часть, шея, крылья и др.).

Заключение. На основании полученных данных можно заключить, что сальмонеллезные фаги при выпаивании в течение двух суток в титре 1:10-4-1:10-5 через 24-36 часов ликвидирую или значительно снижают сальмонеллоносительство гомологичных культур у цыплят-бройлеров.

При убое таких бройлеров предупреждается или снижается контаминация сальмонеллами других тушек птицы данной партии.

Обработка тушек водой с сальмонеллезными фагами при хранении в остывшем состоянии снижает контаминацию поверхности гомологичными клетками сальмонелл на 32, - 98,9% по сравнению с контролем.

В зависимости от активности, сальмонеллезные фаги добавляются в питьевую воду для птицы или в чан с водой для охлаждения тушек из расчета разведения 1:10-4-1:10-5 или 1 мл фагов на 10-100 литров воды. Сальмонеллезные фаги не опасны для птицы и человека, поэтому ограничения в применении не имеют.

Библиографический список 1. Бой Кикимото Б.Б., Обеззараживание тушек птицы с помощью бактериофагов, Материалы научной конференции по вет-санэкспертизе, посвященные 100-летию Тетерника Д.М., М. 1999, 75с.

2. Бой Кикимото Б.Б., Профилактика токсикоинфекции сальмонеллезной этиологии тушек птицы с использование бактериофагов, автореферат кандидатской диссертации, М.

2001, 20с.

3. Серегин И.Г., Никитченко В.Е., Никитченко Д.В., Ветсанэкспертиза продуктов убоя животных и птицы., М.:РУДН, 2010.

4. Флерова А.Д., Серегин И.Г., Линев С.В., Новое в применении бактериофагов, Вест ник РУДН – 2008, 4-с54-57.

5. Флерова А.Д., Изучение качества и безопасности колбасных изделий при использо вании сальмонеллезных бактериофагов, автореферат кандидатской диссертации, М. 2011, 24с.

УДК 578.81:[613.292+579.674]:608. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФИЦИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПАТОГЕНАМИ И ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОНТАМИНАЦИИ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ (ПО ДАННЫМ ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ) Рубальский О.В., доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО АГМА Минздрава России, (8512) 52-35-99, rubalsky.innovation@gmail.com Алешкин А.В., доктор биологических наук, ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н.

Габричевского» Роспотребнадзора, (495) 452-07-88, ava@gabri.ru Афанасьев С.С., доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, (495) 452-18-16, afanasievss409.4@bk.ru Алешкин В.А., доктор биологических наук, профессор, ФБУН «МНИИЭМ им.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, (495) 452-18-16, info@gabrich.com Франк Н.В., ФГБОУ ВПО АГУ, +7-917-198-85-35, Po4ta_frank@yahoo.com Афанасьев М.С., доктор медицинских наук, профессор кафедры, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, +7-916-685-52-38, maxim.afanasyev78@gmail.com Караулов А.В., доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, +7 903-515-71-36, drkaraulov@mail.ru Рубальский Е.О., ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского»

Роспотребнадзора, (495) 452-18-16, e.o.rubalsky@gmail.com Рубальский М.О., ООО НПП «ВИТАФАГ», (8512) 47-87-47, vitaphage@gmail.com Ключевые слова: бактериофаги, пищевая промышленность, продукты питания, биологиески активные добавки к пище, патент, изобретение.

В настоящее время в России и за рубежом проводится активный поиск новых бакте риофагов и разработка композиций на их основе с целью использования в пищевой промыш ленности. Формируется новая ниша на рынках технологиеских вспомогательных средств и биологиески активных добавок к пище на основе бактериофагов, то приводит к необходи мости правовой охраны создаваемых объектов промышленной собственности.

Одними из первых предложили использовать бактериофаги в пищевой промышлен ности российские ученые. В 1978 году А.М. Колодкин и Ю.А. Колодкин предложили при вы работке сыров, творога одновременно с закваской вносить в молочную смесь набор штаммов стафилококкового бактериофага для подавления развития патогенных форм стафилококка [1].

В связи с нарастающей неэффективностью химических консервантов уже более 10 лет за рубежом начались разработки и выдаются патенты на изобретения в области использования бактериофагов для обработки продуктов питания [2, 3, 4].

Для обработки пищевых продуктов предлагались бактериофаги (в том числе полива лентные бактериофаги) против сальмонелл, бактериофаг против Listeria monocytogenes, коли фаг [2, 5, 6, 7, 8].

Наиболее детально композиция на основе бактериофагов, предназначенная для пре дотвращения бактериальной контаминации продуктов питания и упаковочных материалов, описана в изобретении, правообладателем которого является Ecolab Inc. (США) [9].



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |
 

Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.