авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

СБОРНИК РАБОТ

КОНФЕРЕНЦИИ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ

«ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ»

Владивосток, 2013

Конференция молодых ученых «ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ», ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток 7–

14 ноября 2013 г. : сборник трудов. Владивосток : ДВО РАН, 2013. – 88с.

В сборнике представлены тезисы и избранные статьи устных докладов студентов,

аспирантов и молодых ученых, участников конференции молодых ученых «ВЗГЛЯД В

БУДУЩЕЕ». В рефератах отражены результаты научных работ по приоритетным направлениям химии, биологии, прикладной биологии и медицины.

Для студентов, аспирантов, научных сотрудников и специалистов в области химии и биологии.

Оргкомитет конференции молодых ученых Председатель: советник РАН, член-корр. РАН В.Е. Васьковский Члены оргкомитета: к.б.н. М.И. Кусайкин, к.х.н. Т.В. Маляренко, к.х.н. А.М. Захаренко.

Редакционная коллегия: В.Е. Васьковский, М.И. Кусайкин, А.М. Захаренко Утверждено к печати Ученым советом Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН © ТИБОХ ДВО РАН, Получение рекомбинантной активной эндо-1,3--D-глюканазы из морской бактерии Formosa algae KMM А.А. Белик*, С.Н. Ковальчук, В.А. Рассказов Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия *belik_a_a@mail.ru Бактериальные эндо-1,3--D-глюканазы принадлежат к и семействам 16 гликозидгидролаз и катализируют гидролиз гликозидных связей в -1,3-D-глюканах, которые используются бактериями как источник энергии.

На сегодняшний день выделено и охарактеризовано всего около 20 1,3--D-глюканаз из бактерий. У бактерий эндо-1,3--D-глюканазы играют роль в метаболизме клетки [1,2]. Эндо 1,3--D-глюканаза из актиномицет Streptomyces sp. S27 ингибирует рост некоторых микотоксин продуцирующих грибов и может быть использована в качестве консерванта в пищевой промышленности и для защиты растений от патогенных грибов [3]. Трансгликозилирующая способность эндо-1,3--D-глюканаз бактерий, например, Agrobacterium faecalis, широко используется для синтеза целевых олигосахаридов [4]. В силу своей высокой термостабильности, рекомбинантные 1,3-1,4--D-глюканазы 16 семейства из Bacillus subtilis и B. amyloliquefaciens широко применяются в пивоваренной промышленности [4]. Молекулярные массы 1,3--D глюканаз бактерий варьируют в широком диапазоне: от 16 до 144 кДа, однако обычно их масса находится в пределах от 30 до 50 кДа. Типичные значения рН-оптимума для них составляют от 5,5 до 6,0;





а температурный оптимум от 50 до 60 °C что в среднем на 10 °C выше, чем для глюканаз из других источников.

К сожалению, многие природные источники данных ферментов с трудом поддаются культивированию, и естественным выходом является получение их рекомбинантных аналогов в удобных экспрессионных системах;

в первую очередь, на основе E. coli.

Нами была получены генетические конструкции для экспрессии эндо-1,3--D-глюканазы из морской грамотрицательной бактерии Formosa algae KMM 3553, обитающей на талломах бурой водоросли Fucus evanescens. Данная глюканаза являются совершенно неизученным объектом, а последовательность кодирующего её гена была установлена при анализе полной последовательности бактериального генома. Методом ПЦР были получены полные и укороченные формы гена этого фермента, созданы генетические конструкции на основе плазмиды pET40(b+), трансгенные штаммы E. coli Rosetta (DE3), протестирована эндо-1,3--D глюканазная активность каждого штамма и идентифицированные штаммы с наибольшей удельной активностью. Была начата работа по выделению и очистке индивидуального белка. На сегодняшний день схема очистки включает стадии ионообменной хроматографии, афинной хроматографии и гель-фильтрации.

Теоретически рассчитанная молекулярная масса исследуемой эндо-1,3--D-глюканазы составляет 59,85 кДа;

значение изоэлектрической точки - 4,34. Оптимум pH составляет 5,5;

температурный оптимум - 45°C. Фермент стабилен при хранении при темературах до 30 °C, при 40 °C полная инактивация происходит за 3 часа. При концентрациях NaCl 0,5 и 2,0 моль/л активность составила, соответственно, 93 и 62 процента от исходной.

Литература:

1. Gueguen Y, Voorhorst WG, van der Oost J, de Vos WM. Molecular and biochemical characterization of an endo-beta-1,3- glucanase of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. J Biol Chem. 1997 Dec 12;

272(50):31258-64.

2. Fuchs KP, Zverlov VV, Velikodvorskaya GA, Lottspeich F, Schwarz WH. Lic16A of Clostridium thermocellum, a non-cellulosomal, highly complex endo-beta-1,3-glucanase bound to the outer cell surface.

Microbiology. 2003 Apr;

149(Pt 4):1021-31.

3. Shi P, Yao G, Yang P, Li N, Luo H, Bai Y, Wang Y, Yao B. Cloning, characterization, and antifungal activity of an endo-1,3-beta-D-glucanase from Streptomyces sp. S27. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Feb;

85(5):1483 90. doi: 10.1007/s00253-009-2187-1. Epub 2009 Aug 21.

4. Planas A. Bacterial 1,3-1,4-beta-glucanases: structure, function and protein engineering. Biochim Biophys Acta. 2000 Dec 29;

1543(2):361-382. Review.

Ревизия структуры исландохинона, выделенного из лишайника Cetraria islandica К.Л. Борисова, Д.Н. Пелагеев Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия E-mail: borisovaksenia@mail.ru В 1997 году появилось сообщение о выделении из лишайника Cetraria islandica гидроксилированного бихинона, названного исландохиноном Первоначально для [1].





исландохинона было предложено строение 1, однако позднее оно было пересмотрено в пользу структуры 2 [2]. Вместе с тем, остались некоторые сомнения относительно вновь предложенной структуры 2, связанные со спектральными особенностями (1Н ЯМР, ИК-спектры) природного продукта.

Основываясь на накопленных спектральных данных, можно заключить, что исландохинон является одним из четырех изомерных диоксобензо[a]тетрацентетраонов 3а,a' и 4a,a'.

OH O OH O OH HO HO O O HO OH O.

OH OH OH O O Et Et OH O Et OH O Et 1 O HO OH O OH OH OH OH O O O O OH O Me OH O OH O Me OH O OH OH 4 HO O HO O HO HO O O O O O O 13a 13a 7a 7a O OH O OH O OH O OH OH OH OH O Me Me OH O OH O OH O Me Me Me Me 4a 4a' 3a 3a' Для выбора одной из четырех структур потребовалось синтезировать диметиловый эфир исландохинона 5а, который был получен окислительной димеризацией кристазарина 6а под действием PbO2 в кипящей уксусной кислоте.

OMe O OH O OH O OH MeO OH MeO O O 13a 7a O OH Et Me OH O OH O Me 5a 6a Структура полученного продукта 5а была подтверждена методом РСА. Анализ спектров Н ЯМР исландохинона и его диметилового эфира 5а показал, что характеристичными сигналами в их спектрах являются сигналы протонов этильных радикалов при С-6 и С-7а. Это позволило заключить, что предложенная для исландохинона ранее структура 2 является маловероятной и должна быть пересмотрена в пользу структуры 3а.

Литература:

[1] L.S. Stepanenko, O.E. Krivoshchekova, P.S. Dmitrenok and O.B. Maximov, Phytochemistry. 1997, 46, 565-568.

[2] A.Ya. Tchizhova, T.Yu. Kochergina, V.Ph. Anufriev, V.A. Denisenko and V.P. Glazunov, Russ. Chem.Bull. Int.

Ed. 1999, 48, 938-943.

Ферменты гликозид гидролазы, как инструменты синтеза новых биологически активных добавок А.М. Захаренко1,2, М.И. Кусайкин, А.С. Сильченко1, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия Дальневосточный федеральный университет, Россия Ферменты широко используются в биотехнологических процессах, таких как гидролиз, региоселективный синтез, гликозилирование гидрофобных соединений, с целью получения гидрофильных, энзиматическое отбеливание и т.д. Ферменты так же очень распространены в фармацевтической промышленности, в индустрии производства сыра, в технологии получения пива, вин, фруктовых соков и многого другого. На сегодняшний день доля рынка продаж ферментов превышает 1 биллион долларов. Однако в этой связи, недостаточно внимания уделяется ферментам из морских объектов, хотя они обладают рядом уникальных свойств, которые могут быть востребованы [1].

Морские ферменты углеводного обмена были изначально определены как гидролазы, однако потом было показано, что они катализируют три конкурентные реакции: гидролиза, трансгликозилирования и глюканозилтрансферазную реакцию [2,3]. Было показано, что энзиматическое трансформирование природных полисахаридов как фукоиданы, (таких альгинаты, карагинаны, хитозаны, ламинораны и другие) может усиливать их биологическую активность [4,5]. Использование этих ферментов для создания гликоконьюгатов с различной структурой необходимо для решения важных задач в биотехнологии, фармакологии и в углеводной химии.

Исследование выполнено при поддержке ДВФУ, грант 13-06-0603-м_а.

1. Sova V.V.;

Pesentseva M.S.;

Zakharenko A.M.;

Kovalchuk S.N.;

Zvyagintseva T.N. Glycosidases of Marine Organisms// Biokhim. 2013, 78(7), 962-976.

2. Zvyagintseva T.N;

Elyakova L.A.;

and Isakov V.V. The enzymic transformations of laminarans in 1,3;

1,6-beta-D glucans with immunostimulatory activity// Russ. J. Bioorg. Chem. 1995, 21(3), 218-225.

3. Chertkov K.S., Davidova S.A., Nesterova T.A. Zvyagintseva T.N., Elyakova L.A. The effectiveness of the polysaccharide translam as a means of early treatment of acute radiation sickness// Radiation Biology, Radioecology.

1999, 39, 572-577.

4. Zvyagintseva T.N, Sova V.V., Bakunina I.Yu., Sundukova E.V., Ermakova S.P., Elyakova L.A. Marine organisms as a source of bioactive polysaccharides. Polysaccharide hydrolases with unique specificity and inhibitor// Chem. for sust. develop. 1977, 1(6), 417-426.

5. Silchenko A.S.;

Kusaykin M.I.;

Kurilenko V.V.;

Zakharenko A.M.;

Isakov V.V.;

Zaporozhets T.S.;

Gazha A.K.;

Zvyagintseva T.N. Hydrolysis of Fucoidan by Fucoidanase Isolated from the Marine Bacterium, Formosa algae// Mar. Drugs. 2013, 11, 2413-2430.

Антивирусная и иммуномодулирующая активность каррагинанов и их олигосахаридов А.А. Калитник, А.О. Бянкина, В.П. Нагорская, А.В. Реунов, В.Н. Давыдова, И.М. Ермак Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия e-mail: kalitnik85@mail.ru Каррагинаны представляют собой сульфатированные галактаны, содержащие D-галактозу и ее производные, остатки которых соединены регулярно чередующимися -(1-4) и -(1-3) гликозидными связями. Внутри группы каррагинанов существует разнообразие полисахаридов, которое обусловлено тем, что 4-О-замещенный остаток может быть как галактозой, так и ее 3,6 ангидропроизводным, гидроксильные группы могут быть сульфатированы. Каррагинаны обладают широким спектром биологической активности, в том числе антивирусной, противоопухолевой, иммуномодулирующей. Фармакологические свойства каррагинанов определяются как особенностями химической структуры полисахарида, так и его молекулярной массой, а также сильно зависят от дозы и способа введения полисахарида. Для корректной оценки биологических свойств каррагинанов, а также выбора наиболее перспективных из них для применения в качестве биопрепаратов и новых лекарственных средств необходимо получение образцов с заданными физико-химическими свойствами с помощью различных модификаций, включая деполимеризацию полисахаридов различными методами.

Получены низкомолекулярные (НМ) образцы каррагинанов с молекулярными массами (ММ) от 1,6 до 3,5 кДа методами химической деградации с использованием различных реагентов. В работе использовали образцы каррагинанов различных структурных типов: каппа каррагинан с ММ 250 кДа и каппа/бета-каррагинан с ММ 400 кДа, выделенные из дальневосточных красных водорослей Chondrus armatus ( Gigartinaceae ) и Tichocarpus crinitus соответственно. Химическую деградацию каррагинанов проводили с (Tichocarpaceae), использованием пероксида водорода (свободно-радикальная деполимеризация) и соляной кислоты (мягкий кислотный гидролиз) при 37С. Методами химического анализа и методами ЯМР- и ИК-спектроскопии установлено, что структура полученных НМ-производных соответствует структуре исходных полимеров.

Проведен сравнительный анализ антивирусной активности полученных НМ образцов каррагинанов, а также исходных полисахаридов в отношении вируса табачной мозаики.

Показано, что все образцы каррагинанов ингибируют образование локальных некрозов, индуцированных вирусом, на 20–90 %. При этом, антивирусная активность НМ образцов каррагинанов зависит от способа их получения. Так, олигосахариды каррагинанов, полученные в результате мягкого кислотного гидролиза, проявляют большую активность по сравнению с продуктами свободно-радикальной деполимеризации. Установлено, что антивирусная активность исходных полисахаридов выше активности их олигосахаридов, независимо от способа деполимеризации. Показано, что антивирусная активность каппа- и каппа/бета-каррагинанов возрастает с увеличением молекулярной массы образца. Установлено, что антивирусная активность каррагинана зависит от его структурных особенностей, более сульфатированный каппа-каррагинан обладает большей активностью по сравнению с каппа/бета-каррагинаном, что справедливо как для исходных образцов, так и для их олигосахаридов.

Иммуномодулирующая активность каппа/бета-каррагинана и его олигосахаридов была изучена по их способности влиять на синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками крови человека. Как показали результаты, НМ образцы каппа/бета-каррагинана сохраняют цитокин индуцирующую активность, стимулируя синтез как провоспалительных (ФНО-альфа), так и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10). Цитокин-индуцирующая активность каппа/бета каррагинана в отношении продукции ФНО-альфа зависит от молекулярной массы – исходный высокомолекулярный (ВМ) каррагинан имеет более высокую активность по сравнению с продуктами его деполимеризации. В отношении синтеза противовоспалительного цитокина ИЛ 10 активность олигосахаридов каппа/бета-каррагинана сравнима с активностью исходного ВМ образца.

Структура о-специфического полисахарида из морской бактерии Cellulophaga tyrosinoxydans EM 41T М.С. Кокоулин, С.В. Томшич, А.И. Калиновский, Н.А. Командрова, О.И. Недашковская Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия e-mail: maxchem@mail.ru Грамотрицательные бактерии являются важнейшим компонентом морских экосистем.

Ареалы их обитания разнообразны и охватывают прибрежные и открытые акватории океанов, глубоководные и гидротермальные впадины, грунты;

многие виды являются ассоциантами беспозвоночных, рыб, водорослей или морских трав.

Род Cellulophaga принадлежит к семейству Flavobacteriaceae, тип Bacteroidetes. В настоящее время этот род включает в себя семь валидно описанных видов: C. baltica, С.fucicola, С. lytica, С. algicola, С. pacifica, C. geojensis и С. tyrosinoxydans. Ранее были установлены структуры О-специфических полисахаридов бактерий C. baltica, С. fucicola и С. pacifica [1].

Штамм C. tyrosinoxydans EM 41T был изолирован из образца морской воды, собранного на восточном побережье острова Чеджу в Корее [2].

О-специфический полисахарид был получен путем мягкой кислотной деградации липополисахарида, выделенного из сухих бактериальных клеток водно-фенольной экстракцией, и изучен комбинацией химических методов и ЯМР спектроскопии. Моносахаридный анализ обнаружил в составе полисахарида остатки L-рамнозы (L-Rha), L-фукозы (L-Fuc), 2-ацетамидо-2 дезокси-D-глюкозы (D-GlcNAc) и 4-ацетамидо-4,6-дидезокси-D-глюкозы (D-QuiNAc). 1H и C ЯМР спектры показали наличие пяти сигналов в аномерной области, четыре сигнала метильных групп 6-дезокси сахаров, один сигнал первично спиртовой группы, два сигнала углеродов, связанных с азотом и сигналы для двух N-ацетатных групп. 1H-ЯМР спектр был расшифрован используя гомоядерные COSY и TOCSY эксперименты. C-ЯМР спектр был расшифрован используя гетероядерный 1H, 13C HSQC эксперимент. Порядок замещения и последовательность H, 1H NOESY и 1 моносахаридных остатков были определены используя H, C HMBC эксперименты. Абсолютная конфигурация моносахаридных остатков была определена на основании специфических углов вращения и подтверждена значениями химических сдвигов и эффектами - и -гликозилирования. Таким образом, на основании всех полученных данных, мы предлагаем следующую структуру повторяющегося звена О-специфического полисахарида С.

tyrosinoxydans:

4)--L-Fucp-(13)--D-GlcpNAc-(13)--L-Rhap-(12)--L-Rhap-( -D-QuiNAc Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований (Грант No. 12-04-00938-a).

1. Perepelov, A. V.;

Shashkov, A. S.;

Tomshich, S. V.;

Komandrova, N. A.;

Nedashkovskaya. Carbohydr. Res. 2013, 372, 69–72.

2. Khang, H.-Y.;

Chung, B.S.;

Lee, D.-H.;

Jung, J. S.;

Park, J.H.;

Jeon, C.O. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009, 59, 654–657.

Пигменты и полисахариды из стерильной и репродуктивной форм красной водоросли Ahnfeltipsis flabelliformis А.О. Кравченко, В.П. Глазунов, С.Д. Анастюк, В.В. Исаков, И.М. Ермак Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия e-mail: kravchenann@ya.ru Красные водоросли являются источником уникальных по структуре и физико-химическим свойствам биологически активных веществ. Внутриклеточными компонентами этих водорослей являются водорастворимые белки-пигменты фикобилипротеины (ФБП) - фикоэритрин (ФЭ), фикоцианин (ФЦ), аллофикоцианин (АФЦ), которые благодаря высокой флюоресценции широко используются в иммунофлуоресцентной диагностике, фармацевтике, биотехнологии, косметической и пищевой промышленности. Основные структурные компоненты клеточной стенки водорослей представлены сульфатированными полисахаридами (ПС) (агаром и каррагинаном), которые обладают уникальными физико-химическими свойствами, что обеспечивает их широкое практическое применение.

Красная водоросль A. flabelliformis, образующая обширные популяции в Дальневосточных морях России, может оказаться новым потенциальным источником сульфатированных полисахаридов и ФБП, поэтому комплексное ее исследование является актуальным. Нами проведен сравнительный анализ ФБП и ПС из стерильной и репродуктивной (цистокарпы) форм водоросли A. flabelliformis, собранной в июле 2012 г. в бухте Троицы. ФБП были экстрагированы 0,1 М фосфатным буфером и 1,5 % раствором NaNO3. После выделения пигментов экстрагировали полисахариды горячей водой трижды.

Согласно результатам анализа, экстракция ФБП NaNO3 увеличивала выход ФЭ вдвое по сравнению с фосфатным буфером. Содержание ФЭ и ФЦ, выделенных из репродуктивной формы водоросли NaNO3, было выше, чем из стерильного растения. Выход полисахаридов после извлечения пигментов был в 1,6 раз выше, чем без предварительной экстракции ФБП. Подобное явление может быть связано с дополнительным разрушением клеточной стенки водоросли в процессе предварительной обработки буферным раствором. Количество ПС из A. flabelliformis с цистокарпами было в 1,5 раза выше, чем из стерильного растения независимо от метода выделения пигментов. Согласно результатам химического анализа, полисахариды из стерильной формы водоросли значительно отличались от ПС из репродуктивной формы более высоким содержанием 3,6-ангидрогалактозы и более низким количеством сульфатных групп.

Фракционирование полисахаридов из стерильной и репродуктивной форм водоросли 4 % позволило разделить их на желирующие и нежелирующие полисахариды, с KCl преимущественным выходом желирующих фракций. Основными моносахаридами полученных полисахаридов являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза. Желирующие полисахариды содержат меньшие количества глюкозы и ксилозы по сравнению с нежелирующими. Согласно ИК-, 1Н и 13С ЯМР спектроскопии, включая двумерную спектроскопию COSY, ROESY и HSQC, и МАЛДИ масс-спектрометрии, желирующий полисахарид из стерильной формы A. flabelliformis имеет гибридную структуру каппа/бета-каррагинана с соотношением каппа- и бета-звеньев в полимерной цепи 3:1 и содержит минорные количества йота- и гамма-каррагинана (предшественник бета-каррагинана). Согласно ИК-спектроскопии, нежелирующий полисахарид содержит 4-связанную -галактозу 6-сульфат.

Согласно предварительным данным, полимерная цепь желирующего полисахарида из репродуктивной формы A. flabelliformis включает звенья каппа- и йота-каррагинана.

Состав и структурные характеристики водорастворимых полисахаридов бурых водорослей Alaria angusta и A. Marginata Р.В. Меньшова1*, К.И. Поршнева2, Н.М. Шевченко1, С.П. Ермакова1, Т.Н. Звягинцева Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия Дальневосточный Федеральный Университет, Владивосток, Россия * Menshova-R@yandex.ru Бурые водоросли широко распространены во всех морях нашей планеты, их запасы исчисляются сотнями миллионов тонн. Одними из наиболее ценных биологически активных веществ бурых водорослей являются полисахариды: альгиновые кислоты, ламинараны и фукоиданы. Эти соединения чрезвычайно перспективны для создания лекарственных препаратов на их основе, так как наряду с широким спектром биологической активности обладают низкой токсичностью для организма.

В настоящее время еще достаточно остро стоят вопросы исследования структурного разнообразия полисахаридов бурых водорослей, в особенности фукоиданов, а также взаимосвязи структуры полисахаридов и их биологического действия. Поэтому большое значение имеют исследования полисахаридной композиции бурых водорослей, выделение индивидуальных полисахаридов и установление характеристик их структуры, а также изучение биологического действия соединений с установленной структурой. Данные направления весьма перспективны и нацелены на широкое использование полисахаридов бурых водорослей и их производных в качестве эффективных лекарственных препаратов.

Цель данной работы – исследование состава и структурных характеристик биологически активных водорастворимых полисахаридов из бурых водорослей A. angusta и A. marginata.

Из свежесобранных образцов водорослей по комплексной схеме выделения были получены высокоочищенные препараты ламинаранов и фукоиданов. Изучены композиции водорастворимых полисахаридов исследуемых водорослей: содержание ламинарана составляет 1.1 и 0.7 % от веса обезжиренной водоросли, фукоидана – 1.4 и 0.9 % у A. angusta и A. marginata соответственно. Показано, что A. angusta и A. marginata продуцируют ламинараны (1,3;

1,6--D глюканы) с типичной для данного класса соединений структурой (соотношение связей 1,3:1,6 = 10:1 и 5:1 соответственно). Фракции фукоиданов из A. angusta и A. marginata представляют собой сульфатированные гетерополисахариды, различающиеся по степени сульфатирования (9.5–28. %), моносахаридному составу и наличию ацетильных групп. Исследование моносахаридного состава фукоиданов показало, что низкосульфатированные фракции содержат гетерогенные полисахариды, состоящие из остатков фукозы, галактозы, маннозы и ксилозы, в то время как высокосульфатированные препараты являются практически чистыми галактофуканами (соотношение Fuc:Gal = 1:0.9 и 1:1 у A. angusta и A. marginata соответственно).

Таким образом, бурые водоросли A. angusta и A. marginata являются источниками получения новых ламинаранов и галактофуканов, структура и биологическая активность которых вызывает безусловный интерес для дальнейшего исследования.

Два новых ациклических гуанидиновых алкалоида из морской губки Monanchora pulchra E.K. Огурцова1, Т.Н. Макарьева1, Ю.В. Королькова Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, РАН, Москва 117997, ул. Миклухо-Маклая 16/10, Россия e-mail: catrinog.81@mail.ru Гуанидиновые алкалоиды представляют собой хорошо известную группу морских вторичных метаболитов [1-3]. Эти соединения проявляют широкий спектр биологических свойств [1-4].

Ранее в нашей лаборатории из губки Monanchora pulchra был выделен уникальный низкомолекулярный вторичный метаболит, названный пульхранином А (1). Это первое непептидное соединение морского происхождения, ингибирующее TRPV1 канал [5].

Продолжение поиска новых биологически активных природных соединений из морских губок привело к выделению из губки Monanchora pulchra двух новых низкомолекулярных соединений - пульхранинов В и С (2, 3). Их структуры установлены методами масс спектрометрии и ЯМР-спектроскопии, включая двумерные эксперименты (COSY, HMBC).

Проведены исследования ингибирующей активности пульхранинов А (1), В (2) и С (3) в отношении TRPV1, TRPV3 и TRPA1 рецепторов. Установлено, что эта активность пропорциональна длине алкильного радикала и уменьшается в ряду TRPV1 - TRPV3 - TRPA1.

1. Berlinck R.G.S. (2002) Natural guanidine derivatives. Natural Product Reports, 19, 617-649.

2. Berlinck R.G.S, Kossuga M.H.(2005) Natural guanidine derivatives. Natural Product Reports, 22, 516-550.

3. Berlinck R.G.S., Burtoloso A.C.B., Trindade-Silva A.E, Romminger S, Morais R.P., Bandeira K., Mizuno C.

(2010) The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Natural Product Reports, 27, 1871-1907.

4. Blunt J.W., Copp B.R., Keyzers R.A., Munro M.H.G., Prinsep M.R. (2013) Marine natural products. Natural Product Reports, 30, 237-323.

5. Guzii A.G., Makarieva T.N., Korolkova Y.V., Andreev Y.A., Mosharova I.V., Tabakmaher K.M., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Ogurtsova E.K., Antonov A.S., Lee H.S., Grishin E.V. (2013) Pulchranin A, isolated from the Far-Eastern marine sponge, Monanchora pulchra: the first marine non-peptide inhibitor of TRPV-1 channels. Tetrahedron Letters, 54, 1247-1250.

Первичная структура тирозилпротеинсульфотрансферазы из морского моллюска Littorina sitkana М.С. Песенцева1, С.Н. Ковальчук1, Т.Н. Звягинцева1, В.А. Рассказов1, T. Haertle Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия Laboratoire d'Etude des Interactions des Molcules Alimentaires, Institut National de la Recherche Agronomique, B.P. 71627, 44316 Nantes, Cedex 3, France Процессы сульфатирования природных соединений, в особенности морских, а также их роль в природе в настоящее время мало изучены. Однако за последние годы в связи с высокой биологической активностью сульфатированных производных возрос интерес к изучению сульфатирования разных соединений, включая остатки тирозина в белках и пептидах, что является одной из посттрансляционных модификаций у эукариот. Сульфатирование по остаткам тирозина катализируют тирозилпротеинсульфотрансферазы (ТПСТ, КФ 2.8.2.20). Важным аспектом в исследованиях этих ферментов является изучение особенностей путей передачи сигналов у разных групп животных. ТПСТ могут служить важными инструментами в исследованиях роли процесса сульфатирования для белок-белковых взаимодействий [1]. Эти взаимодействия происходят с участием белков системы гемостаза, хемотаксиса, воспаления, а также белков, связанных с вирусными инфекциями, малярией и онкологическими заболеваниями [2, 3]. Несмотря на множество важных биологических процессов, в которых участвуют сульфатированные белки и пептиды, вопрос о роли ТПСТ изучен недостаточно.

Тирозилпротеинсульфотрансферазы обнаружены как среди животных, так и в растениях.

Недавно этот фермент был обнаружен в грамотрицательных бактериях, хотя ранее считалось, что белки простейших организмов не подвергаются сульфатированию. Показано, что все млекопитающие содержат две изоформы ТПСТ: ТПСТ1 и ТПСТ2. Основываясь на гомологии установленных аминокислотных последовательностей ферментов млекопитающих, ТПСТ были найдены в некоторых беспозвоночных. Однако, работы, посвящённые изучению ТПСТ морских моллюсков, отсутствуют.

Используя различные базы генетических данных, были найдены частичные последовательности мРНК и ДНК, кодирующие ТПСТ, в четырёх видах морских моллюсков:

Idiosepius paradoxus, Crepidula fornicate, Lottia gigantean и Crassostrea gigas. Геном последнего недавно был секвенирован и содержал ген, кодирующий ТПСТ, структурно близкий к изоформе ТПСТ2 (GenBank EKC35269). Поиск ТПСТ методом Вестерн-блота в 11 видах беспозвоночных Атлантического побережья Франции показал присутствие этого фермента в экстрактах печени Mytilus edulis и Mercenaria sp. в виде белковых полос в области 50 и 60 кДа соответственно.

С целью установления первичной структуры фермента был проведён поиск гена, кодирующего ТПСТ, в геноме морского моллюска L. sitkana, широко распространенного на побережьях Тихого и Атлантического океанов. Установлена полная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей ТПСТ из L. sitkana. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что кДНК содержит одну протяжённую рамку считывания длиной 1224 п.н., которая кодирует белок, состоящий из 407 а.о. Расчётная молекулярная масса белка без посттрансляционных модификаций составляет 46,63 кДа, изоэлектрическая точка – 8,94.

Сравнение аминокислотной последовательности ТПСТ из L. sitkana с двумя изоформами ТПСТ человека и некоторых видов беспозвоночных выявило высокую степень структурной гомологии 70–85 %. Стоит отметить, что наибольшая степень гомологии ТПСТ из L. sitkana была с белком из С. gigas (85 %), гомология с ТПСТ позвоночных составила 74–81 %. Анализ аминокислотной последовательности ТПСТ из L. sitkana с помощью сервера InterProScan показал, что фермент содержит каталитический домен ТПСТ-2 с 5 по 355 а.о. В аминокислотной последовательности тирозилпротеинсульфотрасферазы из L. sitkana найдены консервативные аминокислотные остатки, которые участвуют в связывании фермента из млекопитающих с субстратами.

1. Seibert C., Sakmar T.P. Toward a framework for sulfoproteomics: Synthesis and characterization of sulfotyrosine-containing peptides // Biopolymers. 2008. – Vol. 90. – P. 459–477.

2. Kehoe J.W. and Bertozzi C.R. Tyrosine sulfation: a modulator of extracellular protein–protein interactions // Chemistry & Biology. – 2000. – Vol. 7. – P. 57–61.

3. Moore K.L. The biology and enzymology of protein tyrosine o-sulfation // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol.

278. – P. 24243–24246.

Иммуномодулирующая, антиоксидантная и антитромботическая активности каррагинанов из красных водорослей дальневосточных морей Е.В. Соколова, В.Н Давыдова, А.О. Барабанова, И.М. Ермак Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия Сульфатированные полисахариды красных водорослей – каррагинаны – относятся к растворимым пищевым волокнам и внесены в список пищевых и медицинских продуктов.

Биологические свойства каррагинанов находятся в тесной связи с их физико-химическими свойствами и структурой, которая отличается большим разнообразием и блочным строением полимерной цепи, что определяется родовой принадлежностью водоросли и условиями ее произрастания. Благодаря полиионной природе каррагинаны способны к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток, что может обеспечивать модуляцию различных звеньев иммунной системы. Каррагинаны широко используются в различных областях пищевой промышленности, в связи с чем особый интерес представляет изучение их антиоксидантного действия.

Изучена иммуномодулирующая активность каррагинанов различных структурных типов, выделенных из красных водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae:

- и –каррагинаны (C. armatus), /- и X-каррагинаны (T. crinitus) и / из C.pinnulatus. Показано, что все типы каррагинанов, индуцируют синтез иммунокомпетентными клетками таких медиаторов иммунной системы как ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО. Наибольшей цитокин-индуцирующей активностью в области высоких концентраций обладает -каррагинан, а наименьшей – X -каррагинан.

Определена потенциальная антиоксидантная активность каррагинанов, которая проявляется в способности перехватывать оксид азота, гидроксил радикал, супероксид анион.

Антиоксидантная активность каррагинанов уменьшается с ростом зависит от pH, моносахаридного состава количества и местоположения сульфатных групп в полисахаридах и не связана с их восстанавливающей способностью.

Установлено, что каррагинаны обладают антитромботической активностью, замедляя скорость образования фибринового сгустка и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, ингибируя их адгезию к коллагену, опосредованную гликопротеином VI. Наибольшей атикоагулирующей активностью обладают каррагинаны с высокой степенью сульфатирования и большей молекулярной массой. Каппа/бета-каррагинан является наиболее сильным ингибитором агрегации тромбоцитов, и слабым индуктором их адгезии к фибриногену, что позволяет рассматривать этот полисахарид в качестве перспективного антитромботического агента.

Получение новых рекомбинантных полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa В.М. Табакмахер, И.Н. Гладких, Е.А. Зелепуга, М.М. Монастырная, Э.П. Козловская Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия e-mail: tabval@yandex.ru Среди огромного разнообразия ингибиторов сериновых протеиназ полипептиды структурного семейства Кунитц/БПТИ являются наиболее интенсивно исследуемой группой соединений. Эти полипептиды обнаружены практически во всех многоклеточных животных, включая кишечнополостных, паукообразных, рептилий, земноводных, млекопитающих. Более полипептидов Кунитц-типа выделено из морских актиний. Интересно, что многие из них способны одновременно проявлять различную биологическую активность. Так, некоторые соединения этой группы кроме ингибирования сериновых протеиназ способны ингибировать цистеиновые и аспарагиновые протеиназы, модулировать (блокировать или активировать) калиевые каналы Kv1.х и болевой ванниллоидный рецептор TRPV1, проявлять антигистаминную активность и подавлять воспалительный процесс.

Ранее мы показали, что полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa кодируются мультигенным суперсемейством и формируют комбинаторную библиотеку [1]. Однако лишь полипептидов выделено и охарактеризовано к сегодняшнему дню. Два из них (RmIn I и RmIn II) кроме ингибирования сериновых протеиназ проявляют антигистаминную активность [2]. Три других ингибитора Кунитц-типа из H. crispa (APHC1, APHC2, APHC3) способны модулировать болевой ваниллоидный рецептор TRPV1 in vitro и оказывать анальгетический эффект in vivo [3 5]. Тем не менее, молекулярные механизмы взаимодействия этих полипептидов со своими мишенями до сих пор не установлены экспериментально. Получение и исследование новых представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa – чрезвычайно важная задача для установления структурно-функциональных взаимосвязей этих соединений.

С помощью методов компьютерного моделирования и биоинформатики мы провели системный анализ полипептидов Кунитц-типа комбинаторной библиотеки H. crispa. Наиболее интересные с точки зрения прогнозируемой активности молекулы (HCGS 1.10, 1.19, 1.20, 1.36) были отобраны для получения в рекомбинантной форме. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих эти полипептиды, были модифицированы для эффективной экспрессии в прокариотической экспрессионной системе. На основе этих последовательностей были синтезированы олигонуклеотидные праймеры. С использованием техники ПЦР были амплифицированы фрагменты ДНК, которые кодируют целевые полипептиды, фланкированные олигонуклеотидами, содержащими сайты рестрикции эндонуклеаз. Амплифицированные фрагменты были клонированы в вектор pET32b(+) по сайтам рестрикции. Полученными генетическими конструкциями были трансформированы клетки E. coli. Рекомбинантные полипептиды были получены в штамме BL21(DE3) в виде слитных белков с тиоредоксином.

Слитные белки были выделены с использованием металл-аффинной хроматографии и гидролизованы в присутствии BrCN. Зрелые рекомбинантные Кунитц-полипептиды были выделены с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ. Согласно результатам масс спектрометрического анализа, молекулярные массы полипептидов составили 6151, 6088, 6080 и 6176 Да для HCGS 1.10, 1.19, 1.20 и 1.36 соответственно. Величины констант ингибирования трипсина рекомбинантных полипептидов составили 10-7 – 10-8 M. Полученные соединения будут использованы в последующих структурно-функциональных исследованиях.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» № 12-I-П6-10 и гранта РФФИ № 12-08-31567.

1. M.P. Isaeva et al. // Peptides. 2012. V. 34. P. 88–97.

2. I.N. Socotun et al. // Russian J. of Biochemisry. 2007. V. 72. P. 368–374.

3. Y.A. Andreev et al. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 23914 23921.

4. S.A. Kozlov et al. // Russian J. of Bioorganic Chemisry. 2009. V. 35. P. 789–798.

5. Ya.A. Andreev et al. // Doklady Biochemistry and Biophysics (Russia). 2009. V. 424. P. 688–691.

Монанхомикалин C – новый пентациклический гуанидиновый алкалоид из дальневосточной морской губки Monanchora pulchra К.М. Табакмахер*, С.А. Дышловой, Т.Н. Макарьева Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия * dark_xen@mail.ru Гуанидиновые алкалоиды из губок рода Monanchora представляют собой соединения разнообразные по химическому строению и биологическим свойствам [1-6].

В результате поиска биологически активных природных соединений из губки Monanchora pulchra, нами было выделено два пентациклических гуанидиновых алкалоида – монанхомикалин С (1) и птиломикалин А (2). Монанхомикалин С (1) является новым представителем исследуемого класса, содержащим уникальную комбинацию фрагментов, таких как:

семичленный цикл с левой стороны полициклической части и н-пропильная группа в положении [7]. Птиломикалин A (2) ранее был найден в нескольких видах морских губок [8-11] и в двух видах морских звезд [12], однако из губки M. pulchra он выделен впервые.

Структура 1 была установлена с использованием данных 1- и 2D ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Соединения 1 и 2 проявляют цитотоксическую активность против клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 с IC50 8.2 и 4.3 µM соответственно.

Список литературы:

1. Berlinck, R. G. S. Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 617–649.

2. Berlinck, R. G. S., Kossuga, M. H. Nat. Prod. Rep. 2005, 22, 516–550.

3. Berlinck R.G.S, Burtoloso A.C.B, Kossuga M.H. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 919–954.

4. Berlinck R.G.S., Burtoloso A.C.B., Trindade-Silva A.E., Romminger S., Morais R. P.;

Bandeira K., Mizuno C.M.

Nat. Prod. Rep. 2010, 27, 1871–1907.

5. Berlinck R.G.S, Trindade-Silva A.E., Santos M.F.C. Nat. Prod. Rep. 2012, 29, 1382–1406.

6. Abbas S., Kelly M., Bowling J., Sims J., Waters A., Hamann M. Mar. Drugs. 2011, 9, 2423-2437.

7. Tabakmakher K.M., Denisenko V.A., Guzii A.G., Dmitrenok P.S., Dyshlovoy S.A., Lee H.S. and Makarieva T.N.

Nat. Prod. Commun. 2013, 8, 1399-1402.

8. Kashman Y., Hirsh S., McConnell O.J., Ohtani I., Kusumi T., Kakisawa H. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8925 8926.

9. Ohtani I., Kusumi T., Kakisawa H., Kashman Y., Hirsh S. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8472-8479.

10. Laville R., Thomas O.P., Berrue F., Marquez D., Vacelet J., Amade P. J. Nat. Prod. 2009, 72, 1589-1594.

11. Hua H.M., Peng J., Dunbar D.C., Schinazi R.F., De Castro Andrews A.G., Cuevas C., Garcia-Fernandes L.F., Kelly M., Hamann M.T. Tetrahedron. 2007, 63, 11179-11188.

12. Palagiano E., De Marino S., Minale L., Riccio R., Zollo F., Carre J. B., Debitus C., Lucarain L., Provost J.

Tetrahedron. 1995, 51, 3675-3682.

Новая методика тиометилирования гидрокси-1,4-нафтохинонов N-ацетил-L-цистеином.

Первый синтез фибростатинов B, C и D Ю.Е. Сабуцкий, С.Г. Полоник Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия e-mail: alixar2006@yandex.ru 1,4-Нафтохиноны широко распространены в природе [1]. Некоторые из них показывают широкий спектр физиологической активности и используются в медицинской практике в России.

Главной целью нашего исследования был синтез новых N-ацетил-L-цистеинильных производных с целью улучшения растворимости, биодоступности и усиления 1,4-нафтохинонов биологической активности модифицируемых хинонов.

Нами была разработана методика тиометилирования замещенных 2-гидрокси-1,4 нафтохинонов 1a-g с использованием параформальдегида и N-ацетил-L-цистеина (NAC) в качестве тиола.

Серия хиноидных N-ацетил-L-цистеинильных производных 2a-g была получена обработкой гидроксихинонов 1a-g NAC в растворе ацетон-HCOOH при кипячении с обратным холодильником. В этих условиях 2-метокси производные хинонов 1 a-g не давали каких-либо продуктов реакции.

1 a-g 2 a-g R1, R3 =H, OH;

R2= H, OH, Cl, Me, MeO (8 примеров) Конденсация N-ацетил-L-цистеина в данных условиях с 2,7-диметоксипроизводным флавиолина 4 не дала ожидаемого фибростатина C или других изомерных продуктов реакции.

При замене низкокипящего ацетона на высококипящий 1,4-диоксан фибростатин C был получен с выходами 60%. В этих условиях реакция N-ацетил-L-цистеина с метикси-2-метилхинонами 5 и 6, полученными из флавиолина 3, привела к природным фибростатинам B и D. Данные ЯМР, ИК и масс спектров соединений 7-9 были полностью идентичны ранее опубликованным данным для природных биоактивных фибростатинов B, C и D, выделенных из бактерий рода Streptomyces [2,3].

3 R=R1=R2= H (Флавиолин) 7 R=H, R1= Me (Фибростатин C) 4 R=H, R1=R2= Me 8 R= Me, R1= Me (Фибростатин B) 5 R=R1=R2=Me 9 R= Me, R1=OH (Фибростатин D) 6 R=R1= Me, R2= OH 1. Thomson R.H. (1997) Naturally occurring quinones, IV ed, Blackie Academic & Professional, London-Weinheim NY-Tokyo-Melbourne-Madras.

2. T. Ishimary, T. Kanamaru, K. Ohta, H. Okazaki. 1987. J. Antibiotics 40.1231.

3. K. Ohta, F. Kasahara, T. Ishimary, Y. Wada, T. Kanamaru, H. Okazaki. 1987. J. Antibiotics 40.1239.

Некоторые каталитические свойства рекомбинантных фукоиданаз из морской бактерии Formosa algae А.С. Сильченко1,2, А.М. Захаренко1,2, М.И. Кусайкин Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия Дальневосточный Федеральный Университет, Владивосток, Россия Фукоиданы – это сульфатированные гомо- или гетерополисахариды бурых водорослей, построенных из остатков сульфатированной и ацетилированной по различным положениям фукозы связанных между сбой -L-1,3- и/или -L-1,4- гликозидными связями. Кроме остатков фукозы в молекулах фукоиданов встречаются минорные моносахариды: галактоза, манноза, арабиноза и остатки уроновых кислот. Исследования биологической активности фукоиданов намного опережают исследования структуры этих полисахаридов. Химические исследования этих полисахаридов затруднены из-за чрезвычайной нерегулярности их строения в связи с чем, детальный структурный анализ представляет значительные трудности. Поэтому, надежной корреляции между химическим строением и биологическим действием фукоиданов установить до сих пор не удается. Для решения этих задач актуальным является использование ферментов с установленной специфичностью и механизмом действия, способных гидролизовать сложные молекулы фукоиданов. Детальный анализ структуры небольших фрагментов фукоиданов позволит установить химическую структуру этого полисахарида. Использование разнообразных по структуре фрагментов фукоидана поможет определить взаимосвязь между теми или иными структурными элементами и их биологическим действием.

На основании проведенного ранее скрининга, штамм Formosa algae КММ 3553 был выбран в качестве продуцента фукоиданаз. Была установлена последовательность нуклеотидов в геномной ДНК бактерии F. algae при помощи нуклеотидного генетического анализатора HiSeq 2500 («Illumina», США). В базах данных Pfam, GenBank, UniProt и CAZy был проведен поиск гомологов продуктов генов, содержащихся в геноме F. algae. Результаты этого поиска позволили сделать вывод о наличии в геноме F. algae двух генов, кодирующих фукоиданазы (FFA1(внеклеточный) и FFA2 (внутриклеточный)). Расчетные массы продуктов генов FFA1 и FFA2 составили 111 кДа (1008 остатков аминокислот) и 97,8 кДа (890 остатков аминокислот) соответственно. Для подтверждения прогнозируемой функции генов FFA1 и FFA2 морской бактерии F. algae были получены рекомбинантные продукты этих генов и исследована их фукоиданолитическая способность. Было показано, что растворимые фракции экстрактов трансгенного штамма BL21 star (DE3) pLys содержащие полноразмерные рекомбинантные фукоиданазы способны расщеплять фукоидан из F. evanescens. При помощи ПААГ электрофореза были изучены некоторые каталитические свойства рекомбинантных фукоиданаз FFA1 и FFA2. Наиболее эффективными активаторами для обоих ферментов служили ионы Ca2+ и Ba2+, ионы Mg2+ активировали фукоиданазы в меньшей степени. Ионы Co2+ и Mn2+, которые являлись активаторами фукоиданазной активности FFA2, не влияли на активность FFA1. Ионы Zn2+ и Cu2+ не обладали активирующим действием по отношению к обеим фукоиданазам.

Оптимальными для проявления ферментативной активности фукоиданаз были рН 6,5 – 8 для FFA1, 6,5 - 9 для FFA2. Оба фермента с высокой скоростью гидролизовали фукоидан из F.

evanescens, цепь которого построена из -13- и -14-связанных остатков сульфатированной фукозы. Фукоиданы из S. cichorioides и U. pinnatifida, содержащие в своем составе -13 связанные остатки сульфатированной фукозы, ферментативному гидролизу не подвергались. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что фукоиданазы FFA1 и FFA специфичны к гидролизу -14-О-гликозидных связей в молекуле фукоидана из F. evanescens.

Было проведено сравнительное исследование процесса накопления низкомолекулярных продуктов гидролиза фукоидана из F. evanescens рекомбинантными фукоиданазами FFA1 и FFA при помощи гель-проникающей хроматографии методом ВЭЖХ. Обе фукоиданазы FFA1 и FFA проявили свойства эндо-ферментов. Однако основные продукты ферментолиза фукоидана фукоиданазами FFA1 и FFA2 имели различия в молекулярных массах. Так, время удерживания на колонке основного пика низкомолекулярных продуктов реакции FFA1 составило 36,02 мин (молекулярная масса около 5 кДа), а для FFA2 37,25 мин (молекулярная масса меньше 4 кДа).

Полученные данные свидетельствуют о том, что гидролиз фукоидана фукоиданазой FFA проходит с образованием более низкомолекулярных олигосахаридов, по сравнению с FFA1, что вполне согласуется с известными фактами. Считается, что некоторые внеклеточные ферменты проводят «предварительное» расщепление крупных молекул субстрата для проникновения их в клетки, а затем полученные фрагменты расщепляются на более мелкие другими внутриклеточными ферментами, для которых они являются субстратом.

Проведенное предварительное сравнительное исследование фукоиданаз синтезируемых морской бактерией F. algae KMM3553T выявило некоторые различия в их структуре и каталитических свойствах, обусловленное по всей видимости различиями в топологии активных центров. Дальнейшее детальное изучение структуры и каталитических свойств этих ферментов позволит выявить эти различия и поможет установить взаимосвязь между их структурой и функцией.

Биологически активные вещества из факультативных морских грибов дальневосточных морей А.Н. Юрченко, О.Ф. Сметанина, А.И. Калиновский, Н.Н. Киричук, Ш.Ш. Афиятуллов Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, ДBО РАН, 690022, Россия Морские грибы – перспективный источник биоактивных веществ, представляющих различные классы органических соединений [1]. В рамках программы по поиску новых и биологически активных грибных метаболитов мы исследовали 6 изолятов грибов, выделенных из образцов морских донных осадков (Aspergillus versicolor, Curvularia inaequalis, Isaria felina, Myceliophtora lutea, Penicillium citrinum, Wardomyces inflatus), один изолят, выделенный с поверхности коралла (P. citrinum) и два изолята грибов, ассоциированных с морской травой (P.

glabrum, P, implicatum).

Каждый гриб культивировался в течение 2-3 недель на рисовой среде либо среде «сусло агар», а затем гриб со средой экстрагировался этилацетатом. Каждый этилацетатный экстракт разделялся методом колоночной хроматографии на силикагеле. Дальнейшая очистка методом ВЭЖХ привела к получению индивидуальных соединений.

Шесть новых высокоокисленных хроменов, оксирапентинов B-H (1-7), а также известный оксирапентин A были выделены из экстракта гриба Isaria felina KMM 4639 совместно с новым бензофураном изоакремином D1 и известными циклодепсипептидами исаридином E и изоисариином B. Новый меротерпеноид аспердемин (8), и известные диорцинол и виридикатол были выдедлены из гриба Aspergillus versicolor. Из гриба Myceliophthora lutea выделены новый изоаремин D (9) и известный акремин A. Из гриба Curvularia inaequalis были выделены известные -лактоны курвулапирон, радицинин, а также антрахинон (+)-фомалактон, цинодонтин. Известный изохромен и декалиновое производное эуяваникол A были выделены из Penicillium citrinum и Wardomyces inflatus, соответственно. Четыре известных сесквитерпена были выделены из Penicillium citrinum, ассоциированного с кораллом. Как из гриба P. glabrum, так и из P. implicatum были выделены новый стирилпирон 3-метил-4-метоксигониоталамин (10) и известный фенилкетон сулохрин.

Структуры всех соединений были установлены с помощью спектроскопических методов.

Относительные конфигурации оксирапентинов A и B, акремина A и гониоталамина были подтверждены РСА. Абсолютные конфигурации новых соединений 1, 5 и 8 были определены модифицированным методом Мошера.

Оксирапентин A показал слабую цитотоксичность в отношении нескольких опухолевых клеточных линий, а также подобно оксирапентину D (3), изоакремину D (9) и диорцинолу проявил антимикробную активность в отношении грамположительных мироорганизмов.

Диорцинол и спороген AO-1 подавляли рост дрожжей Candida albicans. Оксирапентин G (6) индуцировал экспрессию белка теплового шока Hsp70.

Литература [1] M.E. Rateb and R. Ebel, Nat. Prod. Rep. 2011, 28, 290-344.

УДК 577.112.5:593. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ МОРСКОЙ БАКТЕРИИ COBETIA MARINA В. А. Голотин, Л. А. Балабанова#, Г. Н. Лихацкая, В. А. Рассказов Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159.

Щелочная фосфатаза (АР) (EC 3.1.3.1) является широко распространенным в природе ферментом, катализирующим неспецифический гидролиз фосфомоноэфиров. Однако было обнаружено, что щелочная фосфатаза морской -протеобактерии Сobetia marina (CmAP) обладает рядом преимуществ, которые можно успешно использовать в молекулярной биотехнологии. Эффективность мономерной рекомбинантной щелочной фосфатазы CmAP в 10 100 раз превышает эффективность известных аналогов, а величина kcat достигает 28300 s-1.

Активность фермента не зависит от присутствия в инкубационной среде ионов двухвалентных металлов и ЭДТА. Период полуинактивации фермента составляет 27 мин при 40 С в присутствии 2 мМ ЭДТА. Фермент устойчив в широком диапазоне рН в различных буферах, оптимальная температура и рН для проведения реакции – 40-50 C и 9.5 – 10.3 соответственно.

Анализ пространственной структуры щелочной фосфатазы CmAP, полученной на основе кристаллической структуры щелочной фосфатазы из морской -протеобактерии Vibrio sp. G15- (код PDB 3E2D), выявил структурно-функциональные особенности фермента. Введение мутаций в предполагаемые сайты связывания ионов Mg2+ приводило к потере активности, что подтверждает наличие эндогенного иона Mg2+ в структуре CmAP. На модели пространственной структуры было показано, что ион Mg2+ принимает участие в формировании сети водородных связей, пронизывающей всю структуру CmAP. Очевидно, что структурно-функциональные особенности щелочной фосфатазы CmAP можно отнести к адаптивным механизмам выживания в симбиотическом сообществе, возникшим в процессе эволюции для функционирования при пониженных температурах в морской среде.

Ключевые слова: морские -протеобактерии;

щелочная фосфатаза;

гетерологическая экспрессия;

рекомбинантный белок;

каталитическая эффективность;

молекулярная структура.

Сокращения: ЩФ – щелочная фосфатаза;

CmAP – щелочная фосфатаза Сobetia marina;

ПЦР – полимеразная цепная реакция, Pi – неорганический фосфор;

ДСН-ПААГ – полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия;

п-НФФ – пара-нитрофенилфосфат, АМФ – аденозинмонофосфат, ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная, ДЭА – диэтаноламин.

# Автор для связи (+7(423)231-07-03;

эл. почта: balaban@piboc.dvo.ru).

ВВЕДЕНИЕ Щелочная фосфатаза (ЩФ) является одним из важнейших ферментов, участвующих в утилизации и модификации фосфатов в клетках морских организмов. Уровень его экспрессии зависит от таких факторов окружающей среды, как концентрация растворенных в морской воде фосфатов, доминирующие виды высших организмов и микробных сообществ, глубина, соленость и температура воды [1]. Интересно, что высокая активность ЩФ наблюдалась как в глубоких слоях воды, так и в эутотрофной зоне в присутствии относительно высокой концентрации фосфатов [2]. Анализ морского сообщества показал, что бактерии, находящиеся в тесном контакте с другими обитателями морской среды, чаще бывают мощными продуцентами щелочных фосфатаз, чем свободноживущие формы бактерий [3]. Отмечено, что конститутивные ЩФ, функционирующие независимо от концентрации в окружающей среде фосфатов, являются результатом симбиотического сосуществования бактерий. Показано также, что они могут играть определенную роль в катаболизме и метаболизме фосфатов в организме-хозяине [4-5]. Так, в морской бактерии Cobetia marina КММ 296 (Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН), выделенной из мидии Crenomytilus grayanus, была обнаружена высокоактивная ЩФ (CmAP) с удельной активностью 15000 ед/мг белка. Авторы предположили, что фермент имеет метаболическую специализацию по снабжению неорганическим фосфором моллюска для регулярного обновления и построения раковины в процессе минерализации [5-6]. Бактерии штамма C. marina КММ 296 не требуют для своего роста ионов Na+ и могут расти при более низких температурах, чем другие морские изоляты этого рода [3]. Было установлено, что CmAP относительно термолабильный фермент и может функционировать независимо от присутствия ионов двухвалентных металлов, ЭДТА и высоких концентраций неорганического фосфора Pi в инкубационной среде [5].

Большинство известных на сегодняшний день ЩФ являются активными гомодимерными металлоферментами, содержащими ионы цинка и магния в активном центре.

Металлосвязывающие сайты в активном центре ЩФ представляют собой консервативные участки полипептидной цепи, за исключением нескольких аминокислотных остатков, непосредственно или косвенно участвующих в связывании иона магния [7]. Однако ЩФ морских бактерий, аналогичные CmAP, имеющие явные признаки холодовой адаптации, такие как пониженная термостабильность и высокая каталитическая эффективность, еще не изучены [5, 8].

В данной работе с использованием методов молекулярного моделирования и мутагенеза были выявлены структурно-функциональные особенности CmAP.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Очевидно, что бактериальные ЩФ обладают уникальными свойствами, которые в значительной степени способствуют выживанию организмов в океанических водах. На сегодняшний день существует несколько экспериментально изученных бактериальных ЩФ, выделенных из антарктических штаммов [9-10], Vibrio Sp. G15 -21 [11], Shewanella sp. [12], Shewanella sp. SIB1 [13], Holomonas sp. 593 [14] и Cobetia marina KMM 296 [5]. Все это протеобактерии, за исключением неопределенной антарктической бактерии TAB5 [10]. Эти ферменты отличаются от своих наземных аналогов металлоспецифичностью, термостабильностью и каталитической эффективностью. Так, например, удельная активность ЩФ из E. coli составляет около 60 ед/мг белка, в то время как удельная активность CmAP, выделенной из природного источника, достигает 15000 ед/мг белка [5, 8]. Самым высокоактивным ферментом среди коммерческих препаратов ЩФ считается рекомбинантная ЩФ из кишечника теленка с удельной активностью 7800 ед/мг (Biozyme Laboratories).

По последним данным, каталитическая эффективность CmAP также является самой высокой среди известных ЩФ. Несмотря на высокие значения Км (0,3 – 13.2 мМ), каталитическая эффективность полученного нами рекомбинантного аналога CmAP составила 2,1 х 106 – 8.2 х с-1M-1 при константе kкат от 24 000 до 28 300 с-1 в зависимости от условий проведения реакции (таблица). Для сравнения, Км ЩФ кишечной палочки составляет 0.06 мМ и kкат 62 с-1 при максимальной каталитической эффективности 1.1 х 106, а константы Михаэлиса (Км) бычьей кишечной ЩФ, включая Км каталитически усовершенствованных мутантов, варьировались от 1. до 3.9 мМ и kкат - 1800-6100 с-1 при каталитической эффективности 1.4 – 1.6 х 106 с-1М-1 [11, 15].

Таблица. Кинетические параметры CmAP и константы скорости для п-НФФ в различных буферах при 25 C.

kкат, с-1 kcat/Kм, с-1M- Буфер Kм, мМ 2.1 x ДЭА, pH 10.3 28 300 13. 8.2 x ДЭА, pH 8.0 24 000 0. 1.2 x Трис-HCl, pH 10.3 3 710 2. 3.3 x Трис-HCl, pH 8.0 1 500 0. Оптимизация экспрессии в системе Esherichia coli и схемы очистки привели к получению не менее 2 мг функционально активного гомогенного рекомбинантного белка CmAP с 1 л культуры клеток трансгенного штамма E. coli Rosetta (DE3)/Pho40 [16]. В результате проведения гель фильтрации и электрофореза в нативных условиях при температуре выше 6 С была обнаружена еще одна особенность CmAP. В отличие от классических ЩФ, активная форма CmAP имеет мономерную структуру с молекулярной массой 55 кДа. Однако японским коллегам удалось получить активную CmAP с молекулярной массой 120 кДа, что соответствует массе гомодимерного фермента [8]. Кристаллографический анализ ближайшего гомолога из Vibrio sp.

G15 -21 также выявил димерную организацию ЩФ, в то время как при исследовании его физико химических свойств авторы имели дело с активным мономером [11, 17]. Вероятно, в области димеризации у холодоустойчивых ЩФ имеются более слабые контакты, чем у мезофильных аналогов. Возможно, они участвуют в реорганизации надмолекулярной структуры белка, необходимой для повышения эффективности катализа при очень низких температурах [18].

Однако тот факт, что CmAP может функционировать в виде мономера даже в присутствии ЭДТА, ДСН и некоторых других денатурирующих реагентов, указывает на наличие внутримолекулярных структурных особенностей, не позволяющих такому металлоферменту, как ЩФ, терять существенные для катализа ионы Zn2+ и Mg2+ [7, 19]. Мономерная CmAP устойчива в широком диапазоне рН в различных буферах, а оптимальная температура и рН для проведения реакции – 40 - 50 C и 9.5 - 103 соответственно. Нами также было установлено, что, несмотря на высокую идентичность первичной структуры с ЩФ из Vibrio sp. G15 -21 (69.4% идентичности и 82% гомологии), CmAP термостабильнее своего гомолога и имеет период полуинактивации мин при 40 C, тогда как период полуинактивации ЩФ из Vibrio sp. G15-21 составляет 6 мин при той же температуре инкубации (рис. 1, 2 А). В присутствии ионов Mg2+ термостабильность увеличивалась до 120 мин периода полуинактивации при 45 °С, что указывает на стабилизирующую роль магния [11].

Рис. 1. Температурная стабильность CmAP. Фермент инкубировали в присутствии 2 мМ ЭДТА, остаточную активность измеряли каждые 10 мин стандартным методом при различных температурных режимах: 1 - 20 °C;

2 – 25 °C;

3 – 30 °C;

4 – 37 °C;

5 – 40 °C;

6 – 45 °C.

А Б Рис. 2. A – Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей CmAP (UniProt:

Q1W622) и прототипа из морской бактерии Vibrio sp. G15- (PDB code: 3E2D_A). Рисунок выполнен программой Maestro 9.3. Элементы вторичной структуры показаны для ЩФ Vibrio sp.

G15-21. Идентичные и гомологичные замены аминокислотных остатков выделены. Б - Модель пространственной структуры CmAP, построенной с использованием кристаллической структуры прототипа - ЩФ Vibrio sp. G15-21. Структура белка показана в виде ленточной диаграммы, ионы металлов в активном центре показаны в виде сфер: Zn2+ (1), Zn2+ (2), Mg2+ (3).

Определение специфичности и силы связывания различных ионов в структуре CmAP, полученной на основе единственной существующей на сегодняшний день кристаллической структуры ЩФ из морской -протеобактерии Vibrio sp. G15-21 (код PDB 3E2D), подтвердило наличие двух ионов цинка и один ион магния и позволило идентифицировать их лиганды в активном центре (рис. 2 Б). Как и следовало предполагать, аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с ионами цинка в сайтах связывания M1 и M2, являются консервативными.

Однако в сайте связывания иона Mg2+ (М3) у холодоустойчивых ЩФ морских – протеобактерий произошла замена остатка His116 на остаток Trp274, участие которого в непосредственном связывании этого иона было доказано ранее [19]. Для определения роли других аминокислотных остатков в формировании сайта М3 в структуре CmAP нами были получены мутанты с заменой в местах предсказанных лигандов на нейтральный остаток Gly:

Asp12, Asp273, Asp315, His316, Tre118, Glu268 и Trp274 (рис. 3). Практически все мутантные CmAP, в которых нарушен прямой контакт Mg2+ с лигандом, оказались неактивными, что подтверждает наличие эндогенного иона Mg2+ в структуре CmAP. Мутанты Asp64Gly и Asp443Gly, где нарушение контактов происходит на периферии молекулы, проявляли в семь и полтора раза меньшую активности по сравнению с природным типом CmAP. Структурный анализ мутантов выявил, что нарушение любого внутримолекулярного контакта Mg2+ приводит к нарушению в координации всех ионов металлов в CmAP (рис. 3). На модели пространственной структуры показано, что ион Mg2+ принимает участие в формировании сети водородных связей, пронизывающей всю структуру CmAP.

Как известно, изменение в координации металлов в ЩФ непосредственно связано с изменениями сродства Pi в активном центре фермента [20]. Кроме того, недавно было обнаружено, что между субстрат-связывающим остатком Arg и сайтами связывания Mg2+ в ЩФ практически не существует кооперации вкладов в катализ [7]. Этим можно объяснить столь высокую активность CmAP, которая наблюдается при рН 10.0 [5, 8]. В то время, когда при высоком значении рН стабилизирующий эффект Mg2+ на переносимую фосфорильную группу, как и на биметаллический сайт связывания, остается прежним, субстрат-связывающий остаток Arg129 становится нейтральным, наряду с тем, что выступающий над связанным субстратом остаток Tyr441 становится отрицательно заряженным (рис. 4).

Поскольку высвобождение является самым медленным этапом в механизме Pi ферментативного катализа в ЩФ, ослабление связывания Pi в активном центре за счет дополнительного выталкивания на выходе из ферментативной щели остатком Tyr441 должно способствовать быстрому высвобождению отрицательно заряженного продукта реакции, увеличивая не только Км, но также и число оборота фермента (kкат) во много раз. Тем не менее, более высокую каталитическую эффективность CmAP проявляет при более физиологичном значении рН 8.0 (табл. 1).

A D B E C F Рис. 3. Детализированная атомарная структура активного центра CmAP и металсвязывающих сайтов in silico (A), и мутантов Asp12Gly (B), Asp64Gly (C), Asp443Gly (D), Thr118Gly (E), Glu268Gly (F). Координаты ионов металлов и иона сульфата рассчитаны по суперпозиции модели CmAP и кристаллической структуры ЩФ Vibrio sp. G15-21 с использованием программы MOE 2012.10. Вода и ионы металлов Zn2+ (1), Zn2+ (2), Mg2+ (3) показаны в виде сфер.

Рис. 4. Схематическое изображение контактов взаимодействия субстрата АМФ и аминокислотных остатков активного центра CmAP.

Узкая ферментативная щель и особенность окружения ферментативного входа в активный центр CmAP объясняет также более узкую субстратную специфичность фермента, что отличает его от других бактериальных ЩФ и делает больше похожим на ЩФ млекопитающих (рис. 4).

Гидролиз п-НФФ и 5’-АМФ в присутствии ЩФ кишечника теленка и CmAP проходит с одинаково высокой скоростью, тогда как другие субстраты расщепляются гораздо медленнее [5, 8, 21]. На рис. 4 видно, что остаток Trp274 в CmAP, который был обнаружен лишь в ЩФ морских бактерий, образует стэкинг-взаимодействие с кольцом субстрата АМФ. Однако было обнаружено, что люминесцентные субстраты, которые используются в большинстве методов идентификации активности ЩФ, а также концевые фосфатные группы в молекуле ДНК с одноцепочечными разрывами достаточно эффективно гидролизуются в присутствии CmAP [5, 8].

Очевидно, что структурно-функциональные особенности щелочной фосфатазы CmAP можно отнести к адаптивным механизмам выживания в симбиотическом сообществе, возникшим в процессе эволюции для функционирования при пониженных температурах в морской среде. Эти особенности могут быть использованы в ряде биотехнологических подходов. Так, относительно низкая термостабильность позволяет использовать в ДНК-технологиях без CmAP дополнительного этапа удаления фермента из реакционной смеси [5]. Высокая каталитическая эффективность и легкий метод анализа активности CmAP вне зависимости от внешних кофакторов и денатурирующих реагентов, а также мономерная структура могут в перспективе быть использованы для быстрого мониторинга и оптимизации различных аспектов получения рекомбинантных белков с помощью их генно-инженерного слияния с CmAP в качестве маркера для визуализации целевого продукта. Кроме того, это дает возможность использования CmAP в составе бифункциональных полипептидов в методах ИФА для усовершенствования методов обнаружения интересующих лигандов в клинической диагностике. Понимание взаимосвязи структуры ферментов с их функцией дает возможность создания более эффективных ферментов или ферментов с новыми функциональными возможностями.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Получение рекомбинантного белка и мутантов CmAP. Клонирование и гетерологическую экспрессию рекомбинантиного белка и его очистку проводили, как описано ранее [16]. Для получения мутантов мутации вводили в последовательности синтетических олигонуклеотидов отдельно для первой и второй цепи ДНК. Получали один ПЦР-фрагмент с использованием прямого праймера на N-конец гена природного типа CmAP и обратного праймера, включающего в свой состав мутацию. Другой ПЦР-фрагмент получали с использованием прямого праймера, включающего в свой состав ту же самую мутацию, и обратного праймера на С-конец гена природного типа CmAP. Два ПЦР-фрагмента соединялись между собой в местах мутации по принципу комплементарности цепей ДНК методом ПЦР. Полученный продукт реакции использовали как матрицу для получения полноразмерного мутантного гена CmAP, как описано выше [16]. При любых манипуляциях с мутантами в качестве контроля использовали природный тип CmAP.

Определение кинетических характеристик и физико-химических свойств CmAP проводили на очищенном препарате белка согласно данным электрофореза в ДСН-ПААГ. В работе использовали реагенты фирмы «Sigma». Активность ЩФ определяли по методу, описанному ранее [5, 16]. Кинетические исследования проводили в буферах 1 M ДЭА, содержащем от 0.15 до 15 мМ п-НФФ, и 0.1 M Трис-HCl, 0.2 М KCl, содержащем от 0,13 до 2,0 мМ п-НФФ, при pH 8,0 и 10,3. Скорость гидролиза субстрата регистрировали при 25 С каждую минуту в течение 10 мин после 30-секундного лаг-периода. Значения констант Kм, Vмакс и kкат были определены графически с помощью программы Origin 8.1. Для определения рН-стабильности и рН-оптимума CmAP использовали буферы: 0.03 M NaHCO3 (4.0 - 6.0), 0.05 M Tris-HCl (7.0 - 9.0);

0.1 M NaHCO3 (9.0 11.0);

0.1 M глицин (9.0 - 11.0). Температурный оптимум и температурную стабильность CmAP определяли в буфере 0.1 M Трис-HCl, 0.2 М KCl, в течение 30 мин в интервале температур от до 65 С. Фермент инкубировали при определенной температуре, охлаждали в ледяной бане и остаточную активность измеряли стандартным методом каждые 10 минут [16]. За время полуинактивации фермента принимали то время и температуру, при которой сохранялось 50% активности. Действие ионов Mg2+ на температурную стабильность CmAP определяли добавлением от 2 до 10 мМ MgCl2 в инкубационную смесь или прединкубировали с ферментом в 50 мМ Трис-HCl, pH = 8.6, при каждом значении температуры в течение 5 часов. Действие ЭДТА, SDS определяли добавлением реагентов в различных концентрациях (0-100мМ) в инкубационную смесь или прединкубировали с ферментом в 50 мМ Трис-HCl, pH = 8.6 в течение разного количества времени.

Компьютерное моделирование пространственной структуры CmAP (UniProt Q1W622), молекулярный докинг с субстратами и анализ аминокислотной последовательности проводили с помощью программы МОЕ 2012.10 (MOE;

Chemical 220 Computing Group, Canada;

Значения определяли с помощью сервера www.chemcomp.com). pKa PROPKA Построение статистических потенциалов межатомных (http://propka.ki.ku.dk) [22].

взаимодействий для всех негидратированных атомов в CmAP с ионами двухвалентных металлов проводили путём статистического анализа относительного расположения атомов в трёхмерных структурах белков, принадлежащих к так называемой обучающей выборке, построенных методом стохастического моделирования [23].

БЛАГОДАРНОСТИ Работа выполнена при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» № 12-I-П6-10 и гранта РФФИ 12-04-00825-а.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Hoppe H-G. // Hydrobiologia. 2003. V. 493. P. 187–200.

2. Dell’Anno A., Danavaro R. // Science. 2005. V. 309. P. 2179.

3. Ivanova E.P., Christen R., Sawabe T., Alexeeva Y.V., Lysenko A.M., Chelomin V.P., Mikhailov V.V.

// Environ. Microbiol. 2005. V. 20. P. 200–207.

4. Aono T., Maldonado-Mendoza I.E., Dewbre G.R., Harrison M.J., Saito M. // New Phytol. 2004. V.

162. P. 525–534.

5. Plisova E.Y., Balabanova L.A., Ivanova E.P., Kozhemyako V.B., Mikhailov V.V., Agafonova E.V., Rasskazov V.A. // Mar. Biotechnol. 2005. V. 7. P. 173–178.

6. Leveque I., Cusack M., Davis S.A., Mann S. // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. V. 43. P. 885–888.

7. Zalatan J.G., Fenn T.D., Herschlag D. // J. Mol. Biol. 2008. V. 384. P. 1174–1189.

8. Nasu E., Ichiyanagi A., Gomi K. // Biotechnol. Lett. 2012. V. 34. P. 321–328.

9. Kobori H., Sullivan C.W., Shizya H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 6691–6695.

10. Rina M., Pozidis C., Mavromatis K., Tzanodaskalaki M., Kokkinidis M., Bouriotis V. // Eur. J.

Biochem. 2000. V. 267. P. 1230–1238.

11. Hauksson B.J., Andresson O.S., Asgeirsson B. // Enzyme Microb. Tech. 2000. V. 27. P. 66–73.

12. Murakawa T., Yamagata H., Tsuruta H., Aizono Y. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. P.

754–761.

13. Suzuki Y., Mizutani Y., Tsuji T., Ohtani N., Takano K., Haruki M., Morikawa M., Kanaya S. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005. V. 69. P. 364–373.

14. Ishibashi M., Yamashita S., Tokunaga M. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005. V. 69. P. 1213– 1216.

15. Kozlenkov A., Manes T., Hoylaerts M.F., Millan J.L. // J. Chem. Biol. 2002. V. 277. P. 22992– 22999.

16. Балабанова Л.А., Рассказов В.А. // Патент № 2447151. опубл. 10.04.2012. Бюл. № 10.

17. Helland R., Larsen R.L., Asgeirsson B. // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1794. P. 297–308.

18. Asgeirsson B., Nielsen B.N., Hojrup P. // Comp. Biochem. Physiol. B. 2003. V. 136. P. 45–60.

19. Gudjnsdttir K., Asgeirsson B. // FEBS J. 2008. V. 275. P. 117–127.

20. Wang E., Koutsioulis D., Leiros H.K., Andersen O.A., Bouriotis V., Hough E., Heikinheimo P. // J.

Mol. Biol. 2007. V. 366. P. 1318–1331.

21. McComb R.B., Bowers G.N., Posen S. // Alkaline Phosphatase / New York: Plenum Press, 1979. P.

701.

22. Olsson M.M, Sndergard S.R., Rostkowski M., Jensen J.H. J // Chem. Theory Comp. 2011. V. 7. P.

525 – 537.

23. Рахманов С.В., Макеев В.Ю. // Биофизика. 2008. Т. 53.С. 389 – 396.

STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF THE COBETIA MARINA ALKALINE PHOSPHATASE V. A.Golotin, L. A. Balabanova#, G. N. Likhatskaya, V. A. Rasskazov # Phone: +7(423)231-07-03;

e-mail: balaban@piboc.dvo.ru G. B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, 690022, prosp. 100 let Vladivostoku 159, Russia Alkaline phosphatase (AP) (EC 3.1.3.1) is a widely distributed enzyme that catalyzes the non-specific hydrolysis of phosphomonoesters. However, marine -Proteobacteria Cobetia marina alkaline phosphatase (CmAP) has been found to be more efficient enzymes than its terrestrial counterparts and display 10- to 100-fold higher kcat values than all other known eukaryotic and bacterial APs. The enzyme functioned independent of extraneous bivalent metal ions and the dimer formation. CmAP is stable up to 45 C with a half-life of 27 min at 40 C in the presence of 2 mM EDTA. The enzyme is stable in a wide range of pH (6.0 - 11.0) in different buffers. CmAP has reaction temperature optimums at 40 C and C and optimum pH diapason 9.5 - 10.3. The CmAP model building process completed on the base of the high-quality experimental structure of Vibrio sp. G15-21 alkaline phosphatase at 1.4 resolution (PDB code: 3E2D_A) revealed some structural and functional different of CmAP. The substitution of Gly for the residues of the putative Mg2+-binding sites carried out for signification of their role in the binding of the endogenous Mg2+. Each intramolecular Mg2+ contact is directly or indirectly implicated in all metal ions coordination as well as included in the unified hydrogen bond network penetrated through the entire molecular structure. It is evident that the structural and functional features of the alkaline phosphatase CmAP can be attributed to the adaptive mechanisms of survival in a symbiotic community as a result of evolution for functionating at low temperatures in the marine environment.

Keywords: marine -Proteobacteria, alkaline phosphatase, heterologous expression, recombinant protein, catalytic efficiency, molecular structure.

УДК 577.115:528. СТРОЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ФАКУЛЬТАТИВНЫХ МОРСКИХ ГРИБОВ РОДА ASPERGILLUS О. И. Журавлева, А. Н. Юрченко, О. Ф. Сметанина, Ш. Ш. Афиятуллов Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, Из четырех изолятов факультативных морских грибов Aspergillus carneus KMM 4638, A.

fumigatus KMM 4631, A. sulphureus KMM 4640 и A. versicolor выделены 13 новых вторичных метаболитов различной химической природы. Структуры соединений установлены на основании данных спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии высокого разрешения. Абсолютная стереохимия 11 выделенных метаболитов была определена с помощью модифицированных методов Мерфи, Мошера и данных КД спектров. Исследована антимикробная и цитотоксическая активности ряда выделенных метаболитов.

ВВЕДЕНИЕ Исследование вторичных метаболитов морских грибов является относительно молодой, но быстро развивающейся областью биоорганической химии. Начиная с открытия цефалоспорина С, выделенного из культуры Cephalosporium sp. в 1949 г., и до 1992 г. было описано только метаболитов из морских грибов. Интенсивное изучение грибов микромицетов как источников биологически активных соединений было начато в начале двухтысячных годов. К настоящему времени описано более 1000 новых метаболитов из грибов, выделенных из морских объектов.

Морские грибы принято разделять на две группы: облигатные морские грибы – те, что растут и размножаются исключительно в морских и эстуарных местах обитания, и факультативные морские грибы – те, что обитают в пресной воде или на суше, но могут расти (и, возможно, размножаться) в морской среде. Было установлено, что физиологические и биохимические свойства морских грибов обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, гидростатическое давление, низкие температуры, неравномерное распределение питательных веществ и специфические, истинно морские источники питания. Это предполагает наличие у морских грибов некоторых биохимических особенностей, обуславливающих биосинтез необычных по структуре и биологическому действию соединений. В настоящее время из морских грибов выделены мощные антивирусные соединения, антибиотики, эффективно подавляющие развитие возбудителей туберкулеза и метициллин- и ванкомицин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus, вещества, обладающие цитотоксической активностью в отношении различных типов опухолевых клеток.

С каждым годом растет число новых структур вторичных метаболитов, выделенных из грибов микромицетов [1]. При этом лидирующие позиции занимают метаболиты грибов рода Aspergillus, о чем свидетельствует тот факт, что из 230 соединений, выделенных из морских грибов в 2011 г., 72 продуцируются грибами данного рода [2].

Проведенный в лаборатории химии микробных метаболитов скрининг экстрактов изолятов морских грибов рода Aspergillus, выделенных из донных осадков, водорослей и макроорганизмов Охотского моря, позволил отобрать наиболее перспективные штаммы микроорганизмов для дальнейших химических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В качестве объектов исследования нами были отобраны четыре штамма факультативных морских грибов: Aspergillus carneus KMM 4638, выделенный с поверхности морской бурой водоросли Laminaria sachalinensis (Miyabe), Aspergillus fumigatus KMM 4631, ассоциированный с мягким кораллом Sinularia sp., Aspergillus sulphureus KMM 4640 и Aspergillus versicolor, выделенные из донных осадков.

Ферментацию всех штаммов проводили на модифицированной рисовой среде [3]. По окончании инкубационного периода мицелий гриба вместе со средой измельчали и трижды экстрагировали этилацетатом. Экстракт концентрировали в вакууме, полученный сухой остаток растворяли в системе метанол-вода и последовательно экстрагировали гексаном и этилацетатом.

Этилацетатные экстракты упаривали досуха, остатки хроматографировали на колонках с силикагелем в системе гексанэтилацетат (ступенчатый градиент с увеличением полярности элюента). Полученные фракции делили методом обращенно-фазной и нормально-фазной ВЭЖХ для получения индивидуальных соединений.

Из этилацетатного экстракта культуры гриба методами колоночной A. carneus хроматографии и ВЭЖХ были выделены новые алкалоиды: карнеамиды А–С (1–3), карнехиназолины A–D (4–7) и дигидроцинереаин (8) (рис. 1) [4,5].

Рис. 1. Структуры алкалоидов из A. carneus.

Для установления строения выделенных соединений использовались спектроскопия ЯМР на различных ядрах, масс-спектрометрия высокого разрешения с различными типами ионизации, а также ИК– и УФ–спектроскопии. Для установления абсолютной конфигурации асимметрических центров использовали методы Мерфи и данные КД спектров.

Корреляции в COSY и HMBC спектрах а также данные масс-спектров карнеамида А (1) показали, что оно является алкалоидом, содержащим в своей структуре четырехзамещенный индольный кор, дигидропирановый фрагмент, обращенную пренильную группу в пираноиндольном фрагменте и дикетопиперазиновую систему с ненасыщенным пролином. Связь пренилированного пираноиндольного кора с дикетопиперазиновой частью молекулы через метиленовый мостик была установлена на основании HMBC корреляций.



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.