авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
-- [ Страница 1 ] --

Международная Школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» организована

Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН в рамках Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотруд-

ничества в

области биотехнологии в 7-й Рамочной Программе». Школа-конференция проводится

при финансовой поддержке Министерства образования и наук

и РФ, Федерального агенства по

науке и инновациям и INTAS – Международной ассоциации по содействию сотрудничеству с

учеными СНГ.

В сборнике материалов Международной школы-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» представлены работы, посвященные различным аспектам современной биотехнологии.

Вошедшие в сборник работы прошли конкурсный отбор, критериями которого были актуальность, новизна, фундаментальная и практическая значимость исследований.

Работы молодых ученых охватывают различные направления биотехнологии: биотехнология рас тений и животных, получение и характеристика новых штаммов микроорганизмов и ферментных пре паратов, их применение в новых технологических процессах для фармацевтической, пищевой и дру гих отраслей промышленности, а также для целей охраны окружающей среды. Во многих работах рас сматриваются вопросы создания новых биоаналитических методов, получения новых материалов и замены традиционных химических технологических процессов биотехнологическими. Результаты, обобщенные в представленных работах, получены с использованием микробиологических и биохи мических методов, а также новейших подходов генетики и молекулярной биологии.

ISBN 5-900807-44-4 © Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН, УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АЛАНИНА И D-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ Амбарцумян А.А., Алебян М.Г., Дюкова К.Г., Папоян А., Алебян Г.П.

АОЗТ НИИ “Биотехнология” 375056, г. Ереван, ул. Гюрджяна 14, Армения arturhambardzumyan@yahoo.com L-Аланин (L-ала) применяется в медицинской промышленности для производства инфузионных растворов, в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки, в химическом синтезе и др. Анализ патентной литературы последних лет показывает наличие неуклонного интереса к этой аминокислоте. В частности, композиция L-аланина с глицином предлагается для лечения гепатита [Yamauchi M., Sonaka I. Patent EP 1249235, 16.10.2002], L-ала предлагается в производстве сыров [Nasr M. Egypt. Journal of Food Science, 1986, 14(2):385-390] a согласно [Van Der Kaaij H., Zink R., Mollet B. Patent EP 1154698, 18.06.2003] L-аланин дегустаторами признан лучшим подсластителем для молочнокислых продуктов типа ''йогурт''. Основным его производителем является Япония.





D-аспарагиновая кислота (D-асп) является важным предшественником одного из синтетических пенициллинов (Аспоксацилина) [Senuma M, Otsuki O, Sakata N, Furui M, and Tosa T, J Ferment Bioengin, 1989, 67(4): 233-237], используется как исходный материал в синтезе оксазинола и производных D-asp, например N-ацил-D-asp, имеющей антиботулинные свойства [Paquet A and Rayman K Can J Microbiol, 1987, 33: 577-582].

Предлогаемая технология одновременного получения L-аланина и D-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты состоит из следующих этапов:

– Синтез L-асп из фумаровой кислоты с помощью аспартазы (L-aspartate ammonia-lyase, EC 4.3.1.1) Erwinia aroidea;

– Рацемизация L-асп;

– Превращение L-асп рацемической аспарагиновой кислоты в L-ала с помощью аспартат--декарбоксилазы (L-aspartate 4-carboxy-lyase [EC 4.1.1.12]) Pseudomonas sp.;

– Выделение, очистка и кристаллизация D-асп;

– Выделение, очистка и кристаллизация L-ала.

Синтез L-асп из фумарата аммония с помощью иммобилизованных клеток Escherichia coli с аспартазной активностью в индустриальном масштабе в Японии применяется с 1973 г [Sato, T., Y. Nishida, T. Tosa, and I.

Chibata. Biochim. Biophys. Acta, 1979, 570:179-186]. Нами для синтеза L-асп применялись суспензия свободных клеток Erwinia aroidea с активностью 100000 мкмоль/г сырой биомассы/час выращенных на среде с 2 % соевым гидролизатом и 1 % фумаратом аммония, pH 7,0. Клетки выращивались аэробно, при температуре 30 oC, в течении 22 часов. Клетки пермибилизировались 0,03 % тритоном X-100.

В отличие от американских исследователей [David P., Ian G., Jenifer L., Patent US 5834259, 1998] рацемизацию L-асп проводили выдержкой ее водного раствора, находящегося в герметической тефлоновой капсуле, в бытовой микроволновой печи в течении 2 мин и последующим кипячением в 9 % HCl с обратным холодильником в течении 5 час. За ходом рацемизации следили полярометрически по удельному оптическому вращению.

Существуют несколько хорошо известных технологических схем производства D-асп и L-ала методом декарбоксилирования L-асп из рацемата аспартата [Senuma M, Otsuki O, Sakata N, Furui M, and Tosa T, J.

Ferment Bioengin., 1989, 67(4):233-237]. Все они в той или иной мере являются модифицированными аналогами технологий, разработанных для получения L-ala из L-asp [Takamatsu S., Dewey D. Y. Biotech.

Bioeng., 1988, 32:184-191]. Нами для декарбоксилирования L-асп применялись суспензия свободных клеток Pseudomonas sp. с активностью 20000 мкмоль/г сырой биомассы/час выращенных на среде с 2 % соевым гидролизатом и 1 % глутаматом аммония, pH 7,0. Клетки выращивались аэробно, при температуре 30 oC, в течении 22 часов. Клетки пермибилизировались 0,03 % тритоном X-100. В процессе биотрансформации pH реакционной среды поддерживали в пределах 5,5-5,7 подтитровкой кристаллической DL-асп [G.P. Alebyan, K.G. Dyukova, L.A.Gevorgyan, P. Hovhannesyan, A.A. Hambartsumyan Information Technologies and Management (Armenia) 2003, 4:174-181]. По завершению реакции декарбоксилирования (степень конверсии 99 %) реакционная среда содержала 84 г/л L-аланина и 124 г/л D-аспарагиновой кислоты. Фильтрат полученного раствора обесцвечивали активированным углем (1 час, 50 оC).





Полученный обесцвеченный раствор вакуум выпаривали, подкисляли концентрированной серной кислотой до pH-3,0 и охладили до 5 oC. Осадок D-асп отделяли от раствора, промывали холодной водой, высушивали.

Чистота полученного препарата составляла 98 %. Для получения D-асп чистоты более 99 % перед высушиванием проводили ее перекристаллизацию.

После удаления D-асп раствор обогащенный L-ала предварительно обессоливали на катионообменных смолах в H+-форме. Выпаривание, кристаллизацию и высушивание кристаллов L-ала проводили стандартным методом. Чистота полученного препарата составляла 98 %.

Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта ANSEF Project 05-NS-biotech-0831-446 from Armenian National Science & Education Fund.

ЦЕЛЛЮЛАЗНАЯ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗНАЯ АКТИВНОСТИ СОЛЬВЕНТОГЕННЫХ КЛОСТРИДИЙ Березина О.В.

Институт Молекулярной Генетики РАН, 123182, Москва, пл. Курчатова mashchenko@yandex.ru Ключевые слова: Clostridia, сольвентогенные бактерии, гидролиз целлюлозы 1. Введение Политическая нестабильность и рост цен на нефть стимулируют исследования в области развития технологий по производству химических веществ и энергоносителей из возобновляемых природных ресурсов.

Однако, мало кому известно о возможностях, которые открываются при использовании для этих целей микроорганизмов.

Анаэробные бактерии семейства Clostridia производят ценные для химических и энергетических нужд вещества: ацетон, бутанол, этанол и водород [1]. Процесс производства растворителей с помощью клостридий был запатентован Вейцманом в 1916 г. [2]. Вскоре ацетоно-бутиловое производство стало вторым по объему выпускаемой продукции, после процесса получения этанола с помощью дрожжей. Развитие нефтехимической промышленности и повышение цен на субстраты (муку, крахмал) привело к повсеместному сокращению ацетонобутилового производства вплоть до его полного прекращения в 80-х годах прошлого века. В наши дни интерес к сольвентогенным клостридиям вновь возрос благодаря растущей потребности в бутаноле. Бутанол, как жидкий энергоноситель, может частично заменить бензин и дизельное топливо благодаря высокому содержанию энергии, хорошей смешиваемости, высокому октановому числу и низкой летучести [3]. Для того чтобы сделать ацетонобутиловое брожение экономически выгодным в современных экономических условиях, необходимы сольвентогенные штаммы, растущие на доступном и дешевом сырье, таком как растительная биомасса или отходы сельского хозяйства. В связи с этим важно оценить способность сохранившихся индустриальных штаммов гидролизовать целлюлозные/гемицеллюлозные субстраты. Цель данной работы молекулярная идентификация штаммов клостридий, использовавшихся ранее в промышленности, и характеристика их целлюлазной/гемицеллюлазной активности.

2. Материалы и методы Сольвентогенные индустриальные штаммы Clostridium sp. 6 и Clostridium sp. 7 приобретены в коллекции Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова;

штамм Clostridium sp. VKPM B- получен из коллекции Государственного научного центра “Гос НИИ Генетика“. Также в работе использовали штаммы Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, C. saccharoperbutylacetonicum DSM 2152, C. acetobutylicum DSM 1732 (NCIB 2951), C. beijerinckii DSM 791 (ATCC 25752, NCIB 9362) и C acetobutylicum ATCC 824. Для культивирования бактерий использовали среды на основе пшеничной муки/травы: 60 г/л пшеничной муки и травы в разных пропорциях, 0,5 г/л цистеин-HCl, pH 6.5. Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием геномной ДНК клостридий и специфичных бактериальных праймеров [4]. Продукты ПЦP секвенировали, нуклеотидную последовательность анализировали с помощью пакетов программ BLAST и CLUSTALW. Концентрацию ацетона, этанола и бутанола в культуральной жидкости определяли при помощи газовой хроматографии на приборе GC 8000 (Thermofinnigan), оснащенном колонкой Superco SPB 1000 (30 м x 0,53 мм x 0,5 мм). Для анализа целлюлазной/гемицеллюлазной активности были использованы модельные полисахариды: ксилан, карбоксиметилцеллюлоза, аморфная целлюлоза, кристаллическая целлюлоза и бета глюкан. 0,5%-1% (вес/объем) субстраты инкубировали с концентрированной культуральной жидкостью при 37°C от 10 мин до 24 ч. Содержание редуцирующих сахаров измеряли с помощью динитросалицилового реагента [7]. За одну единицу активности принимали количество фермента, освобождающее 1 µмоль D глюкозы в минуту.

3. Результаты и обсуждение Определены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК штаммов Clostridium sp. 6 (Acc.

AM231182), Clostridium sp. 7 (Acc. AM231183) и Clostridium sp. VKPM B-4786 (Acc. AM231184).

Сравнительный анализ последовательностей с генами 16S рРНК из базы данных GenBank показал, что гомология 16S рДНК исследуемых штаммов и Clostridium acetobutylicum ATCC 824 составляет 99%.

Уровень производства растворителей индустриальными и типовыми штаммами клостридий был исследован при 37°C. Индустриальные штаммы, выращенные на 6% мучной среде, существенно превосходили типовые по уровню продукции ацетона, бутанола и этанола и производили 12,7-15 г/л растворителей, при этом 51-56 % от общего выхода составлял бутанол (табл.).

Таблица: Конечная концентрация (г/л) растворителей после ферментации 6% мучной среды некоторыми штаммами клостридий.

Штаммы Ацетон Бутанол Этанол C. acetobutylicum 6 5,08 7,18 1, C. acetobutylicum 7 5,80 8,13 0, C. acetobutylicum B-4786 4,92 6,92 0, C. acetobutylicum ATCC 824 0,25 0,35 0, C. beijerinckii NCIMB 8052 0,03 0,09 0, Внеклеточную целлюлазную/гемицеллюлазную активность индустриальных и типовых штаммов исследовали на модельных полисахаридах. Ни один из исследуемых штаммов не обладал истинной целлюлазной активностью, тогда как гемицеллюлазная активность (на бета-глюкане и ксилане) индустриальных штаммов была достаточно высока и возрастала при увеличении доли сухой травы в среде для ферментации (Рис.).

Сухая растительная биомасса содержит 15-40 % гемицеллюлоз [6]. Высокая гемицеллюлазная активность сольвентогенных штаммов открывает возможность частичной замены муки на биомассу в традиционных средах для ферментации. Бутанол-производящие штаммы клостридий C. acetobutylicum 6, C. acetobutylicum 7 и C. acetobutylicum VKPM B-4786 могут быть использованы для экономически выгодного и экологически безопасного производства растворителей в России и странах ЕС.

Активность, Ед/мг белка М 6% ука М 3% + трава 3% ука Трава 6% 1 2 3 4 5 6 Рисунок: Внеклеточная активность на -глюкане. 1 - Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, 2 - C. saccharoper butylacetonicum DSM 2152, 3 - C. beijerinckii NCIB 9362, 4 – C. acetobutylicum ATCC 824, 5 - C. acetobutylicum 6, 6 - C. acetobutylicum 7, 7 - C. acetobutylicum VKPM B-4786.

4. Заключение Исследована продукция ацетона, бутанола и этанола, у трёх штаммов анаэробных бактерий, идентифицированных нами как Clostridium acetobutylicum. Эти штаммы существенно превосходили типовые по уровню продукции растворителей, причем бутанол составлял 51-56% от общего выхода растворителей.

Изучена активность штаммов на целлюлозе и гемицеллюлозе. Высокая гемицеллюлазная активность C. acetobutylicum 6, C. acetobutylicum 7 и C. acetobutylicum VKPM B-4786 открывает возможность использования дешевой растительной биомассы в средах для культивирования.

Благодарности Работа выполнена при поддержке INTAS Fellowship Grant for Young Scientists. Ref. Nr 03-55-2251. Автор благодарит INTAS и Группу Биотехнологии Микроорганизмов Технического Университета г. Мюнхена за предоставленную возможность реализации проекта.

Ссылки (1) Jones D. T., Keis S. (1995) FEMS Microbiol Rev, 17, 233-240.

(2) Weizmann C., (1916) Pat. USA № 1 315 585.

(3) Berezina O., Zverlov V. V., Velikodvorskaya G., Schwarz W. (2006) Appl Microbiol and Biotechnol.

(4) Loy A., Lehner A., Lee N., Adamczyk J., Meier H., Ernst J., Schleifer K.H., Wagner M. (2002) Appl Environ Microbiol, 68, 5064-5081.

(5) Ghose, T. K. (1987) Pure Appl. Chem. 59, 257-268.

(6) Logotkin I. S. (1958) Technology of acetone-butanol production (in Russian). Pisshprom Isdat, Moscow.

ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ СТИМУЛИРУЮЩЕЙ РОСТ РАСТЕНИЯ РИЗОБАКТЕРИЕЙ РОДА AZOSPIRILLUM Бондаренкова А.Д., Муратова А.Ю.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, проспект Энтузиастов, 13, Саратов, 410049, Россия ecbio@ibppm.sgu.ru Ключевые слова: фиторемедиация, Azospirillum, нефтяные углеводороды, биодеградация 1. Введение Одним из путей повышения эффективности фиторемедиации почвы, загрязненной органическими веществами, является инокуляция растений стимулирующими их рост ризобактериями (PGPR) и/или активно разрушающими поллютант микроорганизмами (1,2). Бактерии рода Azospirillum – ассоциативные азотфиксирующие ризобактерии, обладающие фитостимулирующими способностями в отношении широкого круга растений (3), но их деструктивный потенциал по отношению к загрязнителям окружающей среды мало исследован. Мы предполагаем, что природное сочетание фитостимулирующих и деструктивных свойств может служить значительным преимуществом азоспирилл перед другими почвенными микроорганизмами, и позволяет рассматривать их как перспективных интродуцентов для фиторемедиации загрязненной почвы.

Целью нашего исследования было изучение деструктивного потенциала ассоциативных ризобактерий рода Azosporillum по отношению к нефтяным углеводородам как широко распространенным загрязнителям окружающей среды.

2. Материалы и методы Тридцать три штамма рода Azospirillum из Коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (Саратов, Россия) были исследованы на способность использовать сырую нефть в качестве источника углерода и энергии в условиях культивирования на агаризованной и в жидкой среде Nfb (4) с добавлением 1% сырой нефти (5). Деструктивную активность исследовали при культивировании азоспирилл в жидкой среде в условиях аэрации на круговой качалке при 130 об./мин., 29 0С, в течение 14 дней. Остаточное содержание нефтяных углеводородов в среде после культивирования определяли гравиметрическим методом после разделения загрязнителя по фракциям с использованием селективной экстракции и колоночной жидкостной хроматографии (6). Деструктивную активность выражали в процентах деградации от исходной концентрации сырой нефти.

Способность штамма A. brasilense SR80 продуцировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) изучали при культивировании микроорганизма в среде Nfb с 0,2 г/л DL-триптофана в качестве предшественника фитогормона. Влияние сырой нефти на продукцию ИУК исследовали, добавляя в среду 0,1 – 20,0 г/л сырой нефти. После культивирования, как описано выше, из нефтесодержащих образцов оставшуюся нефть экстрагировали хлороформом, бактериальные клетки отделяли центрифугированием, супернатант пропускали через мембранный фильтр. В подготовленных таким образом пробах культуральной жидкости определяли содержание ИУК и триптофана с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (4).

Фитостимулирующую активность штамма A. brasilense SR80 на проростках пшеницы изучали, как описано ранее (5).

Все эксперименты ставили в трех повторностях. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel 2003.

3.Результаты и обсуждение Из 33 штаммов рода Azospirillum, исследованных на способность к деградации сырой нефти, 18 показали отчетливый рост на среде Nfb, содержащей яблочную кислоту и 1% сырой нефти (5). Среди протестированных микроорганизмов штамм A. brasilense SR80 был выбран как наиболее активный деструктор, способный разрушать сырую нефть в концентрации 0,1 – 20 г/л. От исходной концентрации 10 г/л штамм разрушал 57% сырой нефти за 14 сут. Cравнение рассчитанной скорости деградации нефти штаммом SR80 (0,41 г/л в сут.) со скоростью, описанной для штаммов родов Rhodococcus (7), Mycobacterium (8), Pseudomonas (9,10) позволяет нам характеризировать A. brasilense SR80 как эффективного деструктора нефти. Подробные исследования показали, что биодеградации подвергались почти все фракции нефти (Рис.1): парафины и нафтены разрушались на 56 и 44 %, соответственно;

полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) – на 39%, спиртобензольные смолы – на 22%, а степень деструкции моно – и бициклических углеводородов составила только 7%.

абиотический контроль, 0 сут абиотический контроль, 14 сут 7. Azospirillum brasilense SR 80, 14 суток 6. концентрация, г/л 3. 3. 3. 2 1.60 1. 1. 0.78 0.82 0. 0.63 0. 0.73 0. 0.59 0. 0. парафины нафтены моно - ПАУ спирто - сумма фракций бициклические бензольные углеводороды смолы Рисунок 1: Деградация нефтяных фракций штаммом Azospirillum brasilense SR80.

Изучение спектра деструктивной активности штамма показало, что A. brasilense SR80 был способен использовать в качестве источников углерода и энергии и другие углеводородные субстраты, такие как керосин, дизельное топливо, минеральное масло, вазелиновое масло и твердый парафин.

Для выяснения, какие именно компоненты сырой нефти используются азоспириллой в качестве источников углерода и энергии был исследован субстратный спектр штамма SR80 с использованием индивидуальных компонентов представляющих основные классы нефтяных углеводородов. Результаты исследования показали, что углеводороды ряда н-алканов (гексан, гептан, октан, тридекан, гексадекан и гептадекан) являлись наиболее подходящими субстратами для данного штамма. Кроме того, этот микроорганизм был способен разрушать алициклический углеводород декалин, а также моно – и бициклические углеводороды с длиной алифатической цепи более, чем C2.

Будучи деструктором углеводородов, штамм SR80 проявлял способность синтезировать фитогормон ИУК в концентрации 0,024 мг/мл. Установлено, что на продукцию фитогормона не влияло присутствие в среде сырой нефти в концентрации 0,1 – 20,0 г/л. Анализ фитостимулирующей активности штамма показал, что бактеризация 2-сут. проростков пшеницы оказывала положительный эффект на развитие корневой системы растений в присутствии нефти в условиях гидропоники. Полученные данные дают основание полагать, что использование A. brasilense SR80 в качестве инокулянта может стимулировать рост растений, используемых для фиторемедиации нефтезагрязненной почвы. Это предположение в настоящее время проверяется в условиях горшечного эксперимента.

4. Заключение В ходе проведенного исследования были получены приоритетные данные по характеристике деструктивной активности ризобактерий рода Azospirillum по отношению к нефтяным углеводородам.

Результаты показали, что штамм A. brasilense SR80 может быть перспективным инокулянтом растений, используемых для фиторемедиации загрязненных углеводородами почв.

Благодарность Мы выражаем глубокую благодарность к.б.н. Л.И. Поздняковой и к.х.н. О.Е. Макарову (ИБФРМ РАН) за их помощь в выполнении бактериологического и химического анализов. Мы также благодарим Д.Н.Тычинина (ИБФРМ РАН) за его помощь в подготовке английского текста статьи.

Литература (1) Glick B.R. (2003) Biotechnol. Adv., 21, 383–393.

(2) Lucy M., Reed E., Glick B.R. (2004) Antonie van Leeuwenhoek, 86, 1-25.

(3) Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. (2004) Can. J. Microbiol., 50, 521–577.

(4) Dbereiner, J., Baldani, V.L.D. (1979) Can. J. Microbiol., 25, 1264-1269.

(5) Муратова А.Ю. и др. (2005) Микробиология, 74, 2, 248–254.

(6) Рыльков А.В. Методы анализа органического вещества пород, нефти и газа (1977) Ред. Рыльков А.В. Тюмень.:

Западно-Сибирский НИГНИ, 122 с.

(7) Sharma S.L., Pant A. (2000) Biodegradation, 11, 289–294.

(8) Ермоленко З.М. и др. (1997) Микробиология, 66, 5, 650-654.

(9) Wongsa P., Tanaka M., et al. (2004) Cur. Microbiol., 49, 415–422.

(10) Hong J. H. et al. (2005) J. Microbiol. & Biotechnol., 21, 381–384.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТКАНЕВОЙ РЕАКЦИИ НА СИНТЕТИЧЕСКИЕ ЭНДОПРОТЕЗЫ PROLENE И SPMM И ПРОТЕЗЫ PROLENE И SPMM, ПОКРЫТЫЕ ФИБРОБЛАСТАМИ Босхомджиев А.П.

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский проспект 33, Россия arab@bk.ru Ключевые слова: биополимеры, патоморфология, сетчатые эндопротезы, герниопластика 1. Введение На сегодняшний день в мире проводятся более миллиона операций по восстановлению грыж. При этом для закрытия грыжевых ворот, используются полимерные сетчатые имплантанты. Однако в настоящее время остро стоит проблема выбора материала используемого для лечения грыж, это связано с высоким разнообразием имплантантов. Наиболее распространенным материалом является сетка из полипропилена, а наиболее перспективным является материал из полигидроксибутирата, обладающий свойствами биосовместимомсти и биоразложения. Но и сами сетки отличаются друг от друга по толщине, размеру пор, плетению, растяжению и другим характеристикам. Перспективными направлениями являются покрытие сетчатых эндопротезов культурами соединительнотканных клеток и биосовместимыми биоразлагаемыми пластиками. Одним из таких пластиков является полигидроксибутират.

В связи с этим в данной работе было решено исследовать тканевую реакцию на два синтетических эндопротеза SPMM и Prolene, а также SPMM и Prolene покрытые фибробластами. Эти сетки размером имплантируются мышам линии Wistar на мышцы спины, таким образом моделируется операция с расположением эндопротеза на апоневрозе. Для оценки имплантатов изучалась тканевая реакция, каждого имплантата с сравнительной характеристикой реакции. Для определения лучшего эндопротеза, в этой работе были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить тканевую реакцию на Prolene и SPMM.

2. Сравнить тканевую реакцию на Prolene и Prolene с фибробластами, а также SPMM и SPMM с фибробластами.

3. Сравнить тканевую реакцию на Prolene и SPMM, покрытых фибробластами.

2. Материалы и методы Объект исследования.

В качестве объекта исследования использовали мышей линии Wistar (массой 18-20 грамм, одного возраста, все самки). Животным имплантировали полипропиленовые эндопротезы размером 1 см2 на апоневротический слой спины.

Для изучения тканевой реакции использовались следующие виды полипропиленовых сеток:

1. Surgipro mesh Auto Suture (SPMM-149) Lot AOJ194, 35x22 см 2. Prolene Ethicon (PMS3) Lot SG5MJPC, 6x11 см Сравнивались выше приведенные сетки и аналогичные сетки, но покрытые аллогенными фибробластами.

Методика имплантирования сеток.

С целью обезболивания мышей вводили предбрюшинно раствор тиопентала натрия. Введение сеток выполнялось в строго асептических условиях. Фиксация полипропиленовых эндопротезов к тканям не проводилась. В послеоперационном периоде наблюдали за состоянием животных. Ни в одном случае не было отмечено отторжения внедренного полипропиленового эндопротеза. Все раны заживали первичным натяжением. На 3, 7, 14 и 28 сутки животных выводили из эксперимента.

Взятие материала для световой микроскопии.

Животных забивали методом растяжения позвонков. Материал, предназначенный для исследования (кожа сетка - окружающие ткани), бережно иссекали ножницами. Далее полученный материал помещали в фиксатор 4% формалин. Морфологический метод исследования образцов тканей животных был основным и включал в себя световую микроскопию с морфометрическим исследованием.

После взятия материала, его подвергали стандартной процедуре приготовления препаратов для световой микроскопии, окрашивали гематоксилин-эозином.

3. Результаты и обсуждения Производился подсчет макрофагов, лимфоцитов, фибробластов и лейкоцитов под увеличением х630 в нескольких полях зрения. Данные приведены в графиках ниже.

16 Кол-во Кол-во 16 макрофагов 14 макрофагов 12 Кол-во Кол-во Лимфоцитов Лимфоцитов 8 Кол-во Кол-во фибробластов фибробластов 6 4 Кол-во Кол-во нейтрофилов нейтрофилов 2 Prolene+Ф Prolene+Ф Prolene+Ф Prolene+Ф SPMM с Ф 3 SPMM с Ф 7 SPMM с Ф SPMM с Ф 3 сут 7 сут 14 сут 28 сут сут сут 14 сут 28 сут 14 Кол-во Кол-во 20 макрофагов макрофагов Кол-во Кол-во 10 Лимфоцитов Лимфоцитов Кол-во Кол-во 6 фибробластов фибробластов 4 Кол-во Кол-во нейтрофилов 2 нейтрофилов Prolene 3 Prolene 7 Prolene 14 Prolene SPMM 3 SPMM 7 SPMM 14 SPMM сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки Прорастание протезирующего материала схоже с первичным заживлением раны. Пролиферация фибробластов, кровеносных сосудов, синтез коллагена – все это этапы одного процесса. Процессы, происходящие при этом, характерны для реакции воспаления.

Синтетический эндопротез SPMM на сроках с 3 по 28 сутки показал в начале тканевую реакцию, которая охарактеризовывалась серозным отеком, исчезающим полностью на 28 сутки. В течение раннего имплантационного периода макрофаги и лимфоциты являются доминирующими клетками.

Соединительнотканные образования появляются на 7 сутки и постоянно повышают свой уровень до 28 суток.

Формирование хорошо выраженной соединительнотканной капсулы вокруг ячеек отмечено на 28 день.

Аналогичные результаты получаются и с сеткой SPMM с фибробластами, с 3 по 28 сутки серозный отек исчезает, а количество фибробластов неуклонно растет. Но сетка, покрытая фибробластами, SPMM в сравнение с их отсутствием на всех сроках является лучше, но не значительно. Это связанно с тем, что сетка, покрытая фибробластами, вызывает реакцию отторжения в меньшей степени. Тканевая реакция с этой сеткой значительно уменьшена, а регенеративные процессы более ускорены.

В сетках Prolene происходит та же ситуация, что и в сетках SPMM тканевая реакция практически идентична, на всех сроках синтетические протезы ведут себя одинаково.

Это объясняется тем, что Prolene и SPMM по своим физическим характеристикам почти сходны (диаметр нити, толщина сетки, размер пор).

Поэтому сетки Prolene и SPMM можно использовать для закрытия и укрепления травматических и хирургических ран, чтобы обеспечить продолжительную поддержку при заживлении раны. Исследования на животных показывают, что имплантация сеток сопровождается легкой транзиторной воспалительной реакцией, которая обусловлена прорастанием фиброзной ткани через поры сетки, таким образом вовлекая сетка погружается в окружающие ткани. Синтетический эндопротез остается мягким и гибким и нормальное заживление раны не ухудшается. Материал не рассасывается и не теряет свойств за счет действия тканевых ферментов.

4. Заключение Тканевая реакция на синтетические эндопротезы Prolene и SPMM одинакова.

Имплантанты Prolene и SPMM можно использовать для закрытия и укрепления грыжевых ворот.

Синтетические эндопротезы покрытые фибробластами вызывают меньшую воспалительную реакцию, с быстрым течением регенеративных процессов.

В связи с этим, в данное время проводится биохимическое и гистологическое изучение тканевой реакции на имплантацию полипропиленовых сеток покрытых биосовместимым биодеградируемым покрытием на основе полигидроксибутирата.

Благодарности Работа выполнена при поддержке ГК № 02.467.11.3004.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛАМИНАРИНАЗ МОРСКИХ МОЛЛЮСКОВ В НОВЫХ ГИБРИДНЫХ ПОЛИСАХАРИД-СИЛИКАТНЫХ НАНОКОМПОЗИТАХ Бурцева Ю.В.,1 Щипунов Ю.А.,2 Карпенко Т.Ю.,2 Шевченко Н.М.,1 Звягинцева Т.Н. Институт Биоорганической химии и 2 Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, 690022 Владивосток, Россия burtseva@piboc.dvo.ru Ключевые слова: ламинариназы, иммобилизация, гибридные нанокомпозиты 1. Введение К числу наиболее перспективных методов в настоящее время относят иммобилизацию ферментов в процессе золь-гель перехода (1). Достоинством данного метода является то, что включение молекул белка в неорганическую матрицу происходит без образования ковалентных связей между биомолекулами и матрицей.

Ферменты остаются интактными после иммобилизации, они сохраняют свою структуру и активность, что приводит к сохранению и увеличению времени функционирования белков и их температурной стабильности.

Цель данной работы использовать метод иммобилизации для высоко лабильных ферментов ламинариназ.

В этой работе детально рассмотрены влиянием состава матрицы на свойства и специфичность ферментов в иммобилизованном состоянии. 1,3--D-Глюканазы (К.Ф.3.2.1.6.) из морских моллюсков Spisula sachalinensis (ЛIV) и Chlamys albidus (ЛО) относятся к О-гликозилгидролазам (К.Ф.3.2.1.) представляют значительный интерес для биотехнологического применения (2-4). Эти ферменты катализируют наряду с гидролизом также трансгликозилирование и глюканозилтрансферазную реакцию.Их трансгликозилирующая активность приводит к синтезу 1,3- и 1,3:1,6--D-глюкоолигосахаридов и гликозидов наряду с разветвленными 1,3:1,6--D-глюканами. Один из -D-глюканов, названный трансламом, в отличие от исходного ламинарана, обладает иммуностимулирующей и антиопухолевой активностью (4-6). Транслам, как высокомолекулярный полисахарид, может применяться для биомедицины (7).

2. Материалы и методы Тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликат (ТГЭОС)(8) является прекурсором. Силикатные нанокомпозиты были синтезированы в водных растворах, содержащих ксилан, локус бин гам или катионные производные гидроксиетилцеллюлозы как было описано в (9). Затем в раствор добавляли фермент. Были изучены два разных по типу действия О-гликозилгидролаз. 1,3--D-глюканаза (ламинариназа, КФ 3.2.1.6) из морского моллюска Chlamys albidus осуществляет переход от биологически неактивного ламинарана в транслам.

Иммобилизация фермента проводилась в соответствии с методикой описанной в работе (10).Общие и восстанавливающие сахара определяли фенол-серным методом (11) и методом Нельсона (12). Определение активности ферментов, характеристика продуктов гидролиза, определение константы Михаэлиса-Ментен и синтез транслама проводили по ранее описанным методам (3,4).

3. Результаты и обсуждение Успех в иммобилизации является следствием преимуществ нового прекурсора и синтезированного биокатализатора. 1) необходимые условия определяются ферментом, а не золь-гель процессами;

2) подобраны рН и температура, требуемая для функционирования фермента;

3) органические растворители не используются для растворения прекурсора;

4) катализаторы для образования золь-гель процесса не добавляются из-за каталитического действия полисахаридов внутри матрицы;

5) биокатализатор может быть приготовлен при меньших концентрациях ТГЭОС, которые уменьшают теплообразование в процессе гидролиза прекурсора;

6) пористая структура матрицы обеспечивает свободный доступ для субстрата иммобилизованного фермента и его функционирования, в то время как белковые молекулы не вымываются из матрицы;

7) иммобилизованные ферменты показывают активность при более низкой концентрации по сравнению с их концентрацией в свободном состоянии.

Данная работа представляет собой продолжение исследования свойств ферментов, находящихся в нанокомпозитных гелях. Показано, что свойства ферментов в растворе и ферментов иммобилизованных в геле практически не отличались. Можно отметить лишь расширение интервала области рН и температурного оптимумов для иммобилизованных ферментов. В процессе иммобилизации происходило значительное увеличение температурной стабильности ЛО по сравнению с ферментом в растворе (рис. 1а). Так, при температуре 37°С фермент, иммобилизованный в геле, терял активность полностью только через 6 ч, а ЛО в растворе –в течение 30 мин (рис. 1б).

А 0,8 2б а В р ем я п о л у ж и зн и, ч б 7 б 0, 1б 0, a O t, C 2a 3б 0, 10 15 20 25 30 35 1а 3а 0, 0 2 4 t, ч Рис. 1. Температурная стабильность 1,3--D-глюканазы LO из Ch. albidus.1 -12°C;

2 - 25°C;

3 - 37°C;

a - LO в растворе;

b - LO в иммобилизованном состоянии.

Было показано, что ферменты в растворе и иммобилизованные в гелеимеют схожий состав продуктов гидролиза ламинарана. Константа Михаэлис-Ментен составляет 3 и 4 мг/мл для иммобилизованных глюканаз Лiv и Л0, соответственно, что значительно выше по сравнению с ферментами в растворе (3). Важно выяснить сохраняет ли ламинариназа Л0 способность катализировать глюканозилтрансферазную реакцию после иммобилизации. Для этого мы получили разветвленный 1,3;

1,6--D-глюкан, названный нами трансламом, в условиях которые были описаны в работе (4). Для определения продуктов реакции использовали гель проникающую хроматографию (рис. 2, кривая 1) по сравнению с исходным ламинараном (рис. 2, кривая 2).

T A T T 3, T 2, 2, 1, 1, 0, 0,0 О бъем, м л 0 2 4 6 8 Рис. 2. Гель хроматография ламинарана из L. cichorioides и транслама на колонке (1,5 30 см) с Superdex 75 HR 10/30. 1) транслам;

2) ламинаран.

Показано, что продукты энзиматической реакции содержат высокомолекулярный продукт с Мм ~ 8 кДа, в то время как ламинаран - Мм ~ 5 кДа (табл. 1). Это означает, что иммобилизованная ламинариназа Л катализирует реакцию трансгликозилирования, приводя к увеличению полисахарида. Результаты представлены в таблице, которая содержит данные по исходному ламинарану. Характеристики транслама соответствуют ранее полученным (4).

Таблица 1. Характеристика ламинарана и транслама, полученные при действии иммобилизованной 1,3--D-глюканазы LO на исходный ламинаран.

Связь С-ЯМР-спктры Выход, Мм С Глюкан Содержание, %* (кДа) тип С1 С2 С3 С4 С5 С6 (manni % tol) Ламинаран - 5 90 103,6 74,4 85,8 69,4 76,8 62,0 64, 86, 10 103,9 74,4 76,8 70,8 75,7 70, Транслам 10 8 75 103,4 74,4 85,6 69,4 76,8 62,0 85, 86, 25 103,7 74,4 76,8 70,8 75,7 70,1 76, * Выход количества исходного ламинарана.

4. Заключение Результаты, представленные в работе показывают, что ламинариназы были успешно иммобилизованы в новых гибридных полисахарид-силикатных нанокомпозитных материалов. Они имели максимальную активность в определенных условиях (рН, температуры и ионной силы), что являлось оптимальным для ферментов в растворах до иммобилизации. Кроме того, они обеспечивали аналогичные составные компоненты для синтеза транслама (ламинаран и 1,3--D-глюканазу), в результате получили разветвленный 1,3;

1,6--D глюкан (транслам). В тоже время они сохраняют или увеличивают активность, становятся более термостабильными и показывают увеличение времени жизни. Эти факты дают основание предполагать, что метод иммобилизации идеально подходит для исследованных ферментов и использования биокатализатора для биотехнологических целей.

Благодарности Работа выполнена при поддержке, фонда содействия отечественной науки, грантов президента Российской Федерации и ДВО РАН, РФФИ № 06-04-48540-а и № 05-04-48291-а, Молекулярная клеточная биология.

Литература (1) Gill I., Ballesteros A. (2000) Trends Biothechnol., 18, 282-285.

(2) Solov’eva T.F., et al.: (1996) J. Mar. Technol. Society, 30, 35-39.

(3) Zvyagintseva T.N., Elyakova L.A., (1994) Биоорган. химия, 20, 453-474.

(4) Zvyagintseva T.N., Elyakova L.A., Isakov V.V., (1995) Биоорган. химия, 21, 218-225.

(5) Zvyagintseva et al.: (1997) Acta Phytopathol. Entomol. Hungarica, 32, 59-65.

(6) Ivanushko L.A., et al.: (2001) Antibiot.Chemother., 46, 14-18.

(7) Chihara G., (1984) EOS Rev. Immunol.Immunopharmacol., 4, 85-89.

(8) Meyer, M., Fischer, A., Hoffmann, H. (2002) J. Phys. Chem. B., 106, 1528-1533.

(9) Shchipunov Yu. A. (2003) J. Colloid Interface Sci., 268, 68-75.

(10) Brinker C.J., Scherer G.W., Sol-Gel Science. The Physics and Chemistry of Sol-Gel (1990) Processing, Academic Press, Boston, pp. 180-204.

(11) Dubois M., et al.: (1956) Anal. Chem., 28, 350-356.

(12) Nelson N., (1944) J. Chem., 153, 375-381.

ВОДОРОДНЫЕ ТОПЛИВНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ НА ОСНОВЕ РАЗЛИЧНЫХ ГИДРОГЕНАЗ Воронин О.Г., Морозов С.В., Карякин А.А.

Химический факультет Московского Государственного Университета им. Ломоносова, 19992, Россия, Москва, тел. 7(095)939- voronin@enzyme.chem.msu.ru Ключевые слова: биоэлектрокатализ, гидрогеназа, водородный ферментный электрод.

1. Введение Одной из наиболее важных проблем современного общества является поиск альтернативных источников энергии. Наиболее перспективным вторичным видом топлива считается водород. Для утилизации энергии реакции окисления водорода предпочтительно использовать электрохимические топливные элементы (ТЭ), поскольку в этом случае достигается наибольшая эффективность конверсии энергии. Однако, в современных водородно-кислородных топливных элементах при конструировании топливных электродов используют платиновые катализаторы. Применение платины приводит к ряду значительных проблем, ограничивающих применение таких топливных элементов (высокая цена, требование дорогого высокоочищенного водорода, ограниченность мировых запасов платины).

Эти проблемы могут быть преодолены при использовании биокатализа. Гидрогеназа (фермент, катализирующий в природе реакции окисления/выделения водорода) может быть использована для катализа электродной реакций окисления водорода. Явление биоэлектрокатализа основано на непосредственном переносе электрона между активным центром фермента и электродом и впервые было продемонстрировано советскими учёными [1]. Как было показано ранее, гидрогеназа не отравляется монооксидом углерода и соединениями серы, содержащимися в дешевом неочищенном водороде [2]. Ферменты являются возобновляемым ресурсом, цена которого может быть значительно уменьшена при помощи генно инженерных методов.

Цель данной работы – исследование характеристик топливных электродов с гидрогеназами из различных источников.

2. Материалы и методы Препараты {NiFe} гидрогеназ из Thiocapsa roseopersicina и {NiFeSe} гидрогеназы из Desulfomicrobium baculatum были нам любезно предоставлены к.б.н. Н.А. Зориным из Института фундаментальных проблем биологии РАН (г. Пущино). Образцы графитовой ткани – основы углеродные тканевые ЛШГ-240 любезно предоставили ВНИИ «Графит (Россия). В качестве электрода использовали полосу 0,5х1см, вырезанную из графитовой ткани. N-метил-N`-(12-пиррол-1-илдодецил)-4,4`-бипиридина гексафторфосфат (MPDBP) был любезно предоставлен проф. С. Косньером (Университет им. Ж. Фурье, Гренобль, Франция).

Полимерное покрытие на графитовой ткани получали электрополимеризацией MPDBP. Затем сорбировали фермент из водного раствора (12 часов, +4оС).

Электрохимические измерения проводились с использованием универсального электрохимического прибора Solartron Shlumberger Model 1286 Electrochemical Interface (Великобритания). Поляризационные кривые записывались гальваностатическим и потенциодинамическим методом с подключением по трехэлектродной схеме. Электродом сравнения служил водородный электрод в том же растворе, что и рабочий.

3. Результаты и обсуждение Водородные ферментные электроды При внесении электрода с иммобилизованной гидрогеназой в насыщенный водородом буферный раствор, на электроде устанавливался потенциал, близкий по значению равновесному водородному потенциалу.

Стационарный потенциал составил 0±1 мВ, что соответствует по значению равновесному водородному потенциалу. Поляризационные кривые для ферментных электродов представлены на рис.1. Анодный ток при положительных перенапряжениях обусловлен окислением молекулярного водорода, тогда как в отсутствие гидрогеназы или водорода в этой области потенциалов токи не регистрируются. При отрицательных перенапряжениях наблюдаются катодные токи выделения водорода [2].

D. baculatum 1, T. roseopersicina I, мА/см 0, -150 -100 -50 0 50 100 150 E, мВ -0, Рис. 1. Поляризационные кривые выделения/поглощения водорода на ферментных электродах.

Самой высокой плотности тока удалось достигнуть для гидрогеназы из D. baculatum.

На основании полученных экспериментальных данных были рассчитаны значения токов обмена (табл.1).

Для сравнения приведено значение тока обмена для платины – лучшего неорганического катализатора окисления водорода.

Табл. 1. Электрокаталитические свойства водородных ферментных электродов c иммобилизованными гидрогеназами (0,05 М КН2РО4, 0,1 М NaCl, pH 7, 25oC).

Ток обмена, мкA/cм Источник фермента T. roseopersicina. 40± D. baculatum. 130± Pt (pH 7,0) Для ферментных электродов (табл.1) ток обмена превышает аналогичную величину для платины, которая, как известно, является лучшим катализатором окисления-выделения водорода.

Термостабильность.

Влияние температуры на активность ферментных электродов важна для их биотехнологического применения. Результаты исследования термостабильности представлены на рис. 2. Активность электрода определялась при термостатировании при указанной температуре в течение 3-8 часов.

% of initial activity % of initial activity 10 20 30 40 50 60 70 80 90 20 30 40 50 60 70 80 90 o o temperature, C temperature, C a) b) Рис. 2. Зависимость активности ферментных электродов от темепературы: a) – электрод с гидрогеназой из T. roseopersicina, b) – электрод с гидрогеназой из D. baculatum.

Влияние кислорода на активность ферментных электродов При замене чистого водорода на смесь водород-кислород, потенциал разомкнутой цепи сместился в положительную область, анодный ток понизился. Зависимость тока окисления водорода на ферментном электроде от концентрации водорода в смеси водород-кислород представлена на рис. 3. Эксперимент проводился при перенапряжении 200 мВ.

% of initial activity 100 95 90 85 80 % of hydrogen a) b) Рис. 3. Токи окисления водорода при перенапряжении 200 мВ в присутствии примесей () – кислорода и () – аргона: a) – электрод с гидрогеназой из T. roseopersicina, b) – электрод с гидрогеназой из D. baculatum.

Как видно из представленных результатов, ферментные электроды ингибируются кислородом, однако при удалении кислорода электрод с гидрогеназой T. roseopersicina восстанавливает 100 % активность, что свидетельствует об обратимом ингибировании.

4. Заключение Осуществлен биоэлектрокатализ гидрогеназами из различных источников. Максимальная эффективность окисления водорода достигнута на электродах с иммобилизованной гидрогеназой из Desulfomicrobium baculatum. Изучена электрохимическая кинетика водородных топливных электродов. Показана термостабильность ферментных электродов в интервале температур от 20 до 90оС. Показана толерантность к кислороду электрода с гидрогеназой из Thiocapsa Roseopersicina.

Благодарности Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН №26 «Водородная энергетика», гранта INTAS №03-56-102, федеральной целевой научно-технической программы “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники” на 2002-2006 годы Российского Федерального агентства по науке и инновациям (государственный контракт от № 02.434.11.5003 от 1 июня 2005 г.).

Литература (1) Березин И.В., Варфоломеев С.Д., Ярополов А.И., Богдановская В.А., Тарасевич М.Р. (1975) Докл. АН СССР, т.

225, стр. 105-108.

(2) A.A. Karyakin, S.V. Morozov, E.E. Karyakina, N.A. Zorin, V.V. Perelygin, S. Cosnier.(2005) Biochemical Society Transactions, 33, part 1, 73-75.

АДАПТАЦИЯ МИКРОБНОГО БИОСЕНСОРА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТОВ ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОМАССЫ Воронова Е.А., Решетилов А.Н.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 Пущино Московской области, пр. Науки, 5, Россия anatol@ibpm.pushchino.ru Ключевые слова: микробный биосенсор, метилотрофные дрожжи, селективность 1. Введение Биосенсор - это устройство, включающее биологически чувствительный элемент, связанный с преобразователем или интегрированный с ним. На сегодняшний день в зависимости от биорецептора существуют ферментные, микробные, тканевые, иммуносенсоры и др.

Наиболее часто используемыми сенсорами являются ферментные сенсоры. Однако вместо попытки стабилизировать очищенные ферменты в биосенсорах возможно использование целых клеток. По своим параметрам микробные сенсоры близки к ферментным, однако обладают значительно более низкой селективностью, что обусловлено многообразием ферментативного аппарата клеток. Тем не менее, незначительные затраты на получение биомассы, а также высокая стабильность в ряде случаев делают использование микробных сенсоров более предпочтительным по сравнению с другими типами биосенсорных датчиков.

Различными авторами предложен ряд методических приемов, направленных на повышение селективности анализа с использованием микробных биосенсоров. Один из наиболее часто используемых методов повышения селективности микробных биосенсоров заключается в использовании предполагаемого анализируемого соединения в качестве единственного источника углерода и энергии или косубстрата (1).

Указанный подход позволяет избирательно повысить чувствительность сенсора к данному соединению за счет индукции ферментативных систем, ответственных за его метаболизм, и наработки соответствующих ферментов. Сходный прием связан с метаболическим ингибированием нежелательных путей катаболизма или их стадий в процессе культивирования либо после него (2). В противоположность предыдущему, этот подход не влияет на абсолютную величину чувствительности сенсора к целевому соединению, но позволяет элиминировать или снизить величину сигнала, вызванного содержанием соединений-помех.

К настоящему времени описан ряд микробных биосенсоров на основе иммобилизованных клеток метилотрофных дрожжей. Эти микроорганизмы содержат как минимум два фермента, обеспечивающих метаболизм первичных алифатических спиртов – алкогольоксидазу (АО) и алкогольдегидрогеназу (АДГ).

Данные ферменты обладают различной селективностью и являются индуцибельными, в связи с чем возможно использование описанных подходов для повышения избирательности сенсора по отношению к этанолу, метанолу и другим соединениям.

Целью работы являлось исследование возможности адаптации сенсора для детекции различных субстратов путем индукции и ингибирования внутриклеточных ферментов в процессе культивирования биомассы.

2. Материалы и методы В работе был использован штамм Pichia angusta ВКМ Y-2518, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Культуру поддерживали на сусло-агаре. Для получения биомассы культивирование проводили в 2 этапа:

1) Биомассу выращивали на минеральной среде с добавлением глицерина (1%, об/об.) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл (объем среды – 100 мл) при 28 °С на качалке (220 об/мин).

2) Проводили культивирование на среде того же состава с добавлением метанола, этанола, глюкозы, глицерина (1%, об/об) и смеси 0.5 % метанола и 0.5 % этанола в качестве единственного источника углерода и энергии.

Иммобилизацию клеток проводили адсорбцией на хроматографической бумаге Wathman GF/A (Великобритания) - 5 мкл клеточной суспензии наносили на бумагу, формируя пятно диаметром 3-5 мм, и высушивали на воздухе в течение 5-7 мин. Количество биомассы на рецепторе составляло 0.7 мг сырого веса.

Полученный биорецептор фиксировали на рабочей поверхности электрода.

В качестве преобразователя использовался кислородный электрод Кларка. В качестве измерительного прибора использовали анализатор проточного типа. Измерения проводили в калий-фосфатном буфере (рН=7.5) при скорости протока 0.66 мл/мин, объем пробы составлял 20 мкл, а также измерения проводились в открытой кювете объемом 2 мл. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения сигнала.

4. Результаты и обсуждение Диаграмма субстратной специфичности сенсоров на основе клеток P. angusta, выращенных на различных субстратах, показана на рис. 1. Эксперименты показали, что наиболее высокая селективность характерна для сенсора при выращивании клеток на метаноле. В этом случае сенсор обладает чувствительностью только к метанолу и этанолу, причем соотношение сигналов "метанол/этанол" составляет около 7:1. Это связано с тем, что метанол для использованных клеток является индуктором АО, которая характеризуется повышенной селективностью к метанолу. АДГ при этих условиях, по-видимому, синтезируется в количествах, минимально необходимых для поддержания жизнедеятельности клеток.

рост на 1% метаноле рост на 1% глюкозе 0. рост на 1% глицерине 0. рост на 1% этаноле 0. Ответ, нА/с рост на 0.5% метаноле + 0.5% этаноле 0. 0. 0. 0. уксусная кислота пируват сукцинат бутанол изобутанол сахароза ксилит бензиловый спирт изоцитрат сорбит метанол этанол пропанол арабитол изопропанол глюкоза галактоза арабиноза мальтоза ксилоза лактоза аскорбиновая кислота целлобиоза глицерин Субстраты, 10 мМ Рисунок 1: Субстратная специфичность биосенсора на основе P. angusta ВКМ Y-2518 при культивировании на различных субстратах.

При росте на этаноле наблюдается противоположная картина. Ответы сенсора на этанол возрастают при резком снижении чувствительности к метанолу. В то же время, сенсор начинает проявлять чувствительность к ряду других спиртов, а также некоторым углеводам и сукцинату. Подобный характер специфичности сенсора сохраняется при росте клеток на смеси равных концентраций этанола и метанола. Причиной наблюдаемых изменений является тот факт, что этанол является репрессором АО и, возможно, индуктором АДГ в данных клетках.

Рост на глицерине приводит к снижению сигналов на метанол при повышении сигналов на этанол;

фактически, чувствительность сенсора к этанолу и метанолу становится сопоставимой. Для данного варианта клеток также характерно расширение специфичности, сходное с таковым при росте на этаноле. Видимо, глицерин не является избирательным индуктором или репрессором ни для АО, ни для АДГ, что приводит к синтезу обоих ферментов, хотя и в меньших (судя по величине отклика на метанол) количествах, чем при росте на специфических субстратах.

Биорецептор, сформированный из клеток, выращенных на глюкозе, оказался малоэффективным с точки зрения функционирования сенсора. Сенсор на его основе характеризовался низкой величиной ответов на все протестированные субстраты. Это позволяет сделать вывод о том, что в присутствии глюкозы синтез обоих ферментов метаболизма спиртов находится на фоновом уровне.

4. Заключение Исследована субстратная специфичность сенсоров на основе клеток метилотрофных дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2518 при росте на различных субстратах.

Наибольшей селективностью обладает сенсор, выращенный на метаноле, данный сенсор дает высокий ответ на метанол, в связи с этим он может быть использован для детекции метанола Сенсоры, для которых были использованы биорецепторы на основе клеток, выращенных на этаноле, глицерине и смеси этанол-метанол, характеризуются более широким диапазоном окисляемых субстратов.

Данные сенсоры могут быть использованы, например, для определения биологического потребления кислорода.

Сенсор, для формирования которого были использованы клетки, выращенные на глюкозе, не имеют практического применения, т.к. сенсор давал низкие ответы практически на все используемые в работе субстраты.

Литература (1) Simonian, A.L. et al. (1992) Appl. Biochem. Biotechnol., 36(3), 199-210.

(2) Riedel, K., Scheller, F. (1987) Analyst, 112(3), 341-342.

ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОКСИГЕННЫХ ВИДОВ ГРИБОВ РОДА ALTERNARIA В ЗЕРНЕ МОЛЕКУЛЯРНЫМИ МЕТОДАМИ Ганнибал Ф.Б., Ули-Маттила Т. Всероссийский НИИ защиты растений, шоссе Подбельскгог 3, 196608 С.-Петербург, Россия.

Университет Турку, лаборатория физиологии растений и молекулярной биологии, FIN-20014, Турку, Финляндия phbgannibal@yandex.ru Ключевые слова: Alternaria, грибы, идентификация, ПЦР, зерно 1. Введение Контаминация растений, продуктов питания и кормов токсигенными грибами и микотоксинами является общемировой проблемой. Метаболиты, способные причинить вред здоровью растений, животных и человека, характерны для очень многих видов грибов. Актуальной задачей является изучение распространения токсигенных грибов и мониторинг их массового появления.

Род Alternaria включает в себя целый ряд видов, продуцирующих токсины и приносящих вред сельскому хозяйству. Эти виды очень часто обнаруживаются в зерне и других продуктах растительного происхождения.

Наиболее распространены на зерновых культурах вид A. tenuissima и виды комплекса A. infectoria. Выявление и определение видов Alternaria, равно как и многих других видов грибов, с помощью традиционных методов часто требует специальных навыков и занимает много времени. Более простым и быстрым способом обнаружения грибов являются методы, основанные на ПЦР.

Целью нашей работы было улучшение существующих методов ПЦР-диагностики видов Alternaria и конструирование новых видоспецифичных праймеров.

2. Материалы и методы Изоляты грибов и образцы заражённого зерна были собраны в 2003-2005 преимущественно на территории России и Финляндии. Экстракцию ДНК из чистых культур грибов и зерна проводили методами, описанными С.А.Булатом (Bulat et al., 1998) и Тейлором (Taylor et al., 2001), соответственно. В последнем случае использовался набор реактивов GenElute Plant Genomic DNA Kit (Sigma, США).

Была протестирована комбинация праймеров (AAF2/AAR3;

Konstantinova et al., 2002), ранее опубликованных, как специфичная для вида A. alternata. Конструирование SCAR-праймеров, селективных для комплекса видов A. infectoria включало следующие этапы: УП-ПЦР (Булат и др., 1992) с изолятами разных видов Alternaria;

выявление фрагмента ДНК, специфичного для комплекса видов A. infectoria;

изоляция обнаруженного фрагмента;

его клонирование при помощи TOPO TA Cloning kit (Invitrogen, США);

очистка плазмидной ДНК (Sambrook, Russell, 2001);

секвенирование (ABI Prism 373 3130XL Genetic Analyser;

Perkin Elmer, USA);

конструирование праймеров с использованием online программы Primer3 (Rozen, Skaletsky, 1998).

3. Результаты и обсуждение Амплификация ДНК нескольких мелкоспоровых видов Alternaria с праймерами AAF2/AAR3 выявила, что данная комбинация праймеров не является узко специфичной для A. alternata. Также эти праймеры амплифицируют ДНК других, родственных A. alternata токсигенных видов, таких как A. arborescens и A.

tenuissima. Последний вид – наиболее распространённый представитель микобиоты зерна (Andersen et al., 1996;

Gannibal, 2004).

После выявления специфичного для A. infectoria продукта УП-ПЦР и его секвенирования была сконструирована пара селективных праймеров Ain3F/Ain4R. Данные праймеры были протестированы на ДНК разных видов Alternaria, что подтвердило их специфичность. Впоследствии праймеры были опробованы на образцах ДНК, выделенной из семян зерновых культур, инфицированных видами комплекса A. infectoria.

Заражённость зерна при этом колебалась от 1 до 63%. Мажорный ПЦР-продукт, ожидаемого размера был получен при амплификации образцов, у которых заражённость A. infectoria составляла 4% и более. У некоторых образцов, заражённость которых видами упомянутого комплекса была ниже 4%, также в небольших количествах иногда образовывались продукты ПЦР.

Результаты оценки праймеров AAF2/AAR3 показали стабильную детекцию A. tenuissima в образцах семян с уровнем заражённость 8% и более. При более низкой заражённости, результаты были ненадёжными, что может быть объяснено отсутствием прямой связи между долей заражённых семян и количеством грибной ДНК в образце.

Таким образом, ПЦР со специфичными праймерами – это относительно простой и надёжный метод с достаточно высокой разрешающей способностью. При наличии соответствующих методик экстракции ДНК, возможно применение ПЦР для обнаружения видов Alternaria и других грибов в любых видах пищи и кормов.

Анализ 43 образцов зерна пшеницы и ячменя с использованием двух упомянутых выше наборов праймеров выявил присутствие представителей вида A. tenuissima и комплекса A. infectoria в подавляющем большинстве проб. ДНК видов комплекса A. infectoria была обнаружена в 98% партий зерна. ДНК A. tenuissima (и, вероятно, других родственных видов) была выявлена в 91% образцов.

4. Заключение Установлено, что праймеры для ПЦР AAF2/AAR3 (Konstantinova et al., 2002) амплифицируют ДНК группы родственных токсигенных видов: A. alternata, A. tenuissima и A. arborescens. Сконструированные нами праймеры Ain3F/Ain4R, специфичны для комплекса видов A. infectoria. Обе пары праймеров могут быть использованы для выявления и идентификации соответствующих групп видов рода Alternaria в чистой культуре, в зерне и других видах сельскохозяйственной продукции.

Благодарности Работа была поддержана грантами CIMO (грант № TM-04-2097) и NordForsk (NordForsk’s networks for research and research training;

грант № 040291).

Литература (1) Булат С. А. и др. (1992) Генетика, 28 (5), 19-28.

(2) Ганнибал Ф. Б. (2004) Mikologiya i Fitopatologiya, 38 (3), 19-28.

(3) Andersen B. et al. (1996) Canadian Journal of Botany, 74 (6), 854-858.

(4) Bulat S. A. et al. (1998) Mycological Research, 102 (8), 933-943.

(5) Konstantinova P. et al. (2002) Mycological Research, 106 (1), 23-33.

(6) Rozen S., Skaletsky H. J. (1998) http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html.

(7) Sambrook J., Russell D. W. (2001) Molecular cloning. A laboratory manual. 3rd edition.

РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ГЕЛЕВЫХ БИОЧИПОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЧЕЛОВЕКА Глотов А.С., Иващенко Т.И., Наседкина Т.В.1, Баранов В.С.

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии имени Д.О.Отта Российской академии медицинских наук, 199034 Санкт-Петербург, Менделеевская 3, Россия Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, 119991 Москва Вавилова 32, Россия anglotov@mail.ru Ключевые слова: биочипы, генетический полиморфизм, наследственная предрасположенность 1. Введение Анализ генетического полиморфизма имеет большое научное и практическое значение. Однако проведение широкомасштабных популяционных исследований, диагностика генетической предрасположенности к целому комплексу мультифакториальных заболеваний, скрининг полиморфных локусов, ассоциированных с индивидуальной чувствительностью к фармацевтическим препаратам, требуют в настоящее время создания эффективных, точных и быстрых методов детекции множества мутаций. Наиболее перспективным, с нашей точки зрения, для решения таких задач является метод гибридизации на олигонуклеотидной матрице (1).

2. Материалы и методы Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе DNA/RNA Synthesizer (“Applied Biosystems”, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Микроматрица была приготовлена путем фотополимеризации пористого полиакриламидного геля.

Объем каждой капли был равен примерно 0,2 нл.

Выделение ДНК проводили в соответствии с методикой приведенной в руководстве Маниатиса (2), с некоторыми модификациями.

Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов выбирали из интернет-базы “Nucleotide” (“NCBI”, США). Праймеры, необходимые для проведения ПЦР этих фрагментов, подбирали с использованием программы “Oligo 6” (США). Специфичность праймеров проверяли в программе “Nucleotide-nucleotide BLAST” (“NCBI”, США). При проведении ПЦР фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе гены системы биотрансформации и метаболизма лекарств («фармакогенетического биочипа») объединяли в группы, соответствующие блокам олигонуклеотидных проб на биочипе (3). Продукт первого этапа ПЦР (1 мкл) использовали в качестве матрицы на втором этапе ПЦР.

Аналогичным образом амплифицировали фрагменты генов сердечно-сосудистой системы («кардиочипа»).

Гибридизацию на микрочипах проводили с использованием флуоресцентно меченых образцов, полученных на второй стадии мультиплексной ПЦР. Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов «Чипдетектор-01-«БЧ-ИМБ».

3. Результаты и обсуждение Создание “фармакогенетического биочипа”. На основе анализа данных зарубежной и отечественной литературы (4-7), были выбраны аллельные варианты следующих генов, представляющих наибольший интерес для определения индивидуальной чувствительности к фармацевтическим препаратам и изучения генетической предрасположенности к некоторым мультифакториальным заболеваниям, в том числе и онкологическим: CYP1A1 (4887СА, 4889AG и 6235TC), CYP2D6 (1934GA и 2637delA), GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481TC, 590AG и 857AG), MTHFR (677CT), CYP2C9 (430СT и 1075CT) и CYP2C19 (681GA).

Конструирование биочипа. Блочный подход. Схема биочипа представлена на рис. 1.

Олигонуклеотидные зонды обозначены цифрами, каждой из них соответствует определенная аллель или гаплотип конкретного гена.

1- Гаплотип 4887CYP1A1*С+4889CYP1A1*A 2- Гаплотип 4887CYP1A1*С+4889CYP1A1*G 3- Гаплотип 4887CYP1A1*A+4889CYP1A1*C 1 3 5 7 9 11 4- Гаплотип 4887CYP1A1*A+4889CYP1A1*G 5- Аллель 6235CYP1A1*T 6- Аллель 6235CYP1A1*С 1 3 5 7 9 11 7- Аллель 1934CYP2D6*G 8- Аллель 1934CYP2D6*A 9- Аллель 2637CYP2D6*A 10- Аллель 2637CYP2D6delA S 2 4 6 8 10 12 11- Наличие гена GSTT S 12- Отсутствие гена GSTT 13- Наличие гена GSTM S 2 4 6 8 10 12 14- Отсутствие гена GSTM 15- Аллель 481NAT2*T S 16- Аллель 481NAT2*С 17- Аллель 590NAT2*A 15 17 21 23 25 18- Аллель 590NAT2*G 19- Аллель 857NAT2*A 20- Аллель 857NAT2*G 15 17 19 21 23 25 21- Аллель 667MTHFR*C 22- Аллель 667MTHFR*T 23- Аллель 430CYP2C9*С 24- 16 18 20 22 24 26 Аллель 430CYP2C9*T 25- Аллель 1075CYP2C9*A 26- Аллель 1075CYP2C9*C Аллель 681CYP2C19*G 27 16 18 20 22 24 26 Аллель 681CYP2C19*A 28 Рисунок 1: Схема “фармакогенетического биочипа”. Ячейки серого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям “дикого типа”, ячейки черного цвета – последовательностям “мутантного типа”. Ячейки светло-серого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям гена CYP1A1 с одной мутацией, а белого цвета – с двумя мутациями. Каждый олигонуклеотид на биочипе продублирован.

Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода.

Микрочип протестирован на 30-ти контрольных и более 100 диагностических образцах. При тестировании контрольных образцов результаты анализа методом ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами. При анализе диагностических образцов (тестирование на биочипах и методом ПДРФ проводили параллельно), несовпадение результатов обнаружено только в двух случаях из 715-ти проанализированных полиморфных вариантов. Таким образом, специфичность метода гибридизации на биочипах составила 99.7%. Чувствительность биочипа оценивали, проанализировав 40 контрольных образцов с разным количеством исходной геномной ДНК (от 0,1нг до 10мкг). Было показано, что минимальным количеством ДНК, необходимым для однозначной идентификации мутаций, было 10нг.

Разработанный биочип позволяет анализировать 14 мутаций в восьми различных генах. На рис. 2 приведен пример гибридизационной картины, включающей все блоки биочипа.

Создание “кардиочипа”. При создании “кардиочипа” был использован разработанный нами алгоритм создания биочипов. Для выявления генетической предрасположенности к артериальной гипертензии были выбраны полиморфные варианты следующих генов: REN (I9-83GA), AGT (M235T), AGTR1 (1166AC), Генотип 1 CYP1A1 (*2B/*1), CYP2D6 (*4/*4), GSTT1 (+/+), GSTM1 (+/+), NAT2 (S2/N), MTHFR (C/C), 3 4 CYP2C9 (*1/*1), CYP2C19 (*2/*1) Рисунок 2: Пример гибридизационной картины, полученной на биочипе для анализа полиморфизма по генам CYP1A1, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2, MTHFR, CYP2C9 и CYP2C19. Стрелками указаны обнаруженные “мутантные” варианты.

AGTR2 (3123CA), BKR2 (-58TC), MTHFR (677CT), ADRB2 (48AG и 81CG). Белковые продукты генов ренин-ангиотензиновой системы (REN, AGT, AGTR1, AGTR2) являются одними из самых важных регуляторов кровяного давления, обеспечивая поддержание жизненно необходимых процессов в организме (8 9). Таким образом, данный биочип позволяет анализировать 8 полиморфных вариантов в семи различных генах (рис. 3).

Генотип:

REN (G/G) AGT (M/T) AGTR1 (A/A) AGTR2 (C/C) BKR2 (T/C) MTHFR (C/T) ABRB2 (48A/A и 81С/C) Рисунок 3: Пример гибридизационной картины, полученной на биочипе для анализа полиморфизма по генам REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2, MTHFR, ADRB2. Стрелками указаны обнаруженные “мутантные” варианты (овалом выделены такие ячейки).

4. Заключение 1. Предложен алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма человека.

2. Разработаны “фармакогенетический биочип” и «кардиочип».

3. Метод гибридизации на биочипах обладает высокой специфичностью (99%) и может быть предложен для использования при массовом скрининге образцов ДНК.

Благодарность Авторы выражают благодарность Д.В. Прокопенко и Р.А. Юрасову за помощь в обработке результатов, а также С.А. Суржикову, А.В. Чудинову и С.В. Панькову – за синтез олигонуклеотидов, флуоресцентных красителей и изготовление микрочипов.

Литература (1) Kolchinsky A., Mirzabekov A. (2002) Hum. Mutat., 19, 343-360.

(2) Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование. М.: Мир, 480с.

(3) Глотов А.С. и др. (2005) Молекуляр. Биология, 39, 403-412.

(4) Baranov V.S., Ivashchenko T.E., Baranova E.V. (2004) Current pediatrics, 3, 57–61.

(5) Krajinovic M. et al. (2002). Clin. Cancer. Res., 8, 802-810.

(6) Landi S. et al. (2003) Biotechniques, 35, 816-820, 822, 824-827.

(7) Labuda D. et al. (1999) Anal. Biochem., 275, 84-92.

(8) Нефедова Ю.Б., Шварц Е. (1998) Артериальная гипертензия, 4, 63-71.

(9) Naber C.K., Siffert W. (2004) Minerva. Med., 95, 347-356.

ФИТОСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ SINORHIZOBIUM MELILOTI – ПРОДУЦЕНТА ИУК И ДЕСТРУКТОРА ПАУ – В ЧИСТОМ И ЗАГРЯЗНЕННОМ ГРУНТЕ Голубев С.Н.

Институт биохимии и физиологии растений и организмов РАН, 410049, Саратов, проспект Энтузиастов 13, Россия biotech@ibppm.sgu.ru Ключевые слова: фиторемедиация, ПАУ, ризобастерии, ИУК, корневая экссудация 1. Введение Среди биотехнологий, предлагаемых для очистки почв от таких опасных и широко распространенных поллютантов как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), перспективна фиторемедиация, основанная на использовании растений и ассоциированных с ними ризосферных микроорганизмов. Серьезным фактором, ограничивающим эффективность этой технологии, является токсичность поллютантов для растений. Замедление ростовых процессов растений приводит к ослаблению не только их собственного детоксикационного потенциала по отношению к загрязнителю, но и такового у ассоциированной с ними микрофлоры. Совместное использование в качестве инокулянтов растений бактерий-деструкторов и бактерий фитостимуляторов, как показано (1), позволило успешно преодолеть эту проблему. В связи с этим ожидается, что ризобактерии-деструкторы, обладающие стимулирующей рост растений активностью, могут быть более эффективными инокулянтами.

Эта работа сфокусирована на том, чтобы выяснить как проявляется фитостимулирующая активность штамма Sinorhizobium meliloti, являющегося продуцентом индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и деструктором ПАУ, в чистом и загрязненном грунте.

2. Материалы и методы Модельное растение (сорго, Sorghum bicolor L. Moench) культивировали в течение 4 недель в фитотроне:

день/ночь – 14/10 часов;

интенсивность света – 450 mol m-2 s-1, температура – 24/20 0С, грунт – кварцевый песок, относительная влажность – 70 %, загрязнитель – фенантрен (10 и 100 ppm). Для бактеризации растений (106 КОЕ/кг грунта) использовали штамм S. meliloti P221, охарактеризованный в работе (2). Контроль за штаммом в грунте осуществляли с помощью иммунодиффузионного анализа и штамм-специфичных антител.

Выживаемость растений в грунте рассчитывали как отношение числа выживших особей к числу исходно засеянных.

Вес побегов и корней определяли после высушивания при 70 0С, а площадь поверхности корней – с помощью красителя метеленового синего. Сбор корневых экссудатов проводили согласно (3). Содержание ИУК и аминокислот в ризосферном растворе определяли с использованием ВЭЖХ. Статистический анализ данных проводили с помощью ANOVA 3. Результаты и обсуждение В чистом грунте, обедненном органическими веществами, стимулирующая рост растений способность S. meliloti P221 не проявлялась. На это могло повлиять усиление интенсивности корневой экссудации сорго (на 23 %), связанное с привлечением инокулянта в ризосферу и поддержание там его существования. При этом потери растением органических веществ могли быть очень велики (4). Однако факт снижения сухого веса корней сорго (на 7 %) при поддержании величины площади их поверхности на прежнем уровне в случае интродукции микроорганизма свидетельствовал об изменении морфологии корней. Это коррелировало с увеличением содержания ИУК в ризосфере благодаря фитогормональной активности инокулянта (Рис. 1). Как известно, этот ауксин при концентрации 10-4 – 10-8 М способствуют формированию у растений латеральных корней и корневых волосков, но ингибируют элонгацию корней (5, 6).

12 0, Б А Корневая поверхность, 0, 0, дм2 / горшок ИУК, мкМ 0, 6 0, 0, 0, 0, 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 ИУК, пкМ / горшок Триптофан, мкМ Пустые метки – небактеризованные растения, заштрихованные – бактеризованные Круг – растения в чистом грунте Ромб – растения в грунте с 10 ppm фенантрена Треугольник – растения в грунте со 100 ppm фенантрена Рисунок 1: Зависимость площади корневой поверхности от концентрации ИУК (А) и концентрации фитогормона от содержания триптофана (Б) в ризосфере сорго.

Инокуляция сорго исследуемым микроорганизмом в условиях загрязнения грунта ПАУ способствовала преодолению растениями поллютантного стресса: на 23 % повышалась их выживаемость, на 42 и 20 % соответственно увеличивался прирост наземной и корневой биомассы, на 86 % возрастала площадь корневой поверхности. Изменение последнего параметра являлось, вероятнее всего, следствием фитогормональной активности интродуцента. Подтверждение этому – увеличение содержания ИУК в ризосфере в присутствии S.

meliloti P221, которое линейно зависело от концентрации предшественника фитогормона – триптофана (Рис.

1). Отмеченное при этом снижение содержания в прикорневой зоне сорго данной аминокислоты могло быть связано с утилизацией триптофана микроорганизмом, в том числе и на синтез ИУК (5). В условиях ПАУ загрязнения ключевым моментом фитогормональной регуляции взаимодействий между сорго и S. meliloti P221, возможно, являлся факт значительного снижения количества ризосферной ИУК под влиянием поллютантного давления. По аналогии с моделью стимуляции роста растений при взаимодействии последних с бактериями рода Azospirillum (7), мы предположили, что отмеченное нами изменение могло быть сигналом для усиления бактериального синтеза ИУК, которое впоследствии вызвало увеличение площади корневой поверхности сорго.

Наконец, следует обратить внимание на сокращение интенсивности корневой экссудации у сорго (на 22 %) при его инокуляции штаммом S. meliloti P221 в условиях ПАУ-загрязнения. Это могло благоприятствовать созданию в ризосфере условий для эффективной детоксикации ксенобиотика и стимуляции роста растений за счет снижения концентрации альтернативных источников углерода.

4. Заключение В отсутствие загрязнителя “платой” за долгосрочную продуктивность ассоциации растение-ризобактерии в изменяющихся условиях окружающей среды могло быть некоторое замедление аккумуляции биомассы сорго по сравнению с небактеризованным контролем. В ответ на воздействие загрязнителя растение, сокращая интенсивность корневой экссудации, было способно стимулировать активность S. meliloti P221, результатом которой являлось значительное улучшение выживаемости и ростовых параметров сорго по сравнению с небактеризованным контролем. Следовательно, S. meliloti P221 может стать перспективным инокулянтом растений при фиторемедиации ПАУ-загрязненных почв.

Благодарности За всестороннюю помощь при проведении этого исследования выражаю искреннюю признательность А.

Муратовой, О. Турковской, А. Бондаренковой, Т. Дмитриевой (Институт биохимии и физиологии растений и организмов РАН, Саратов, Россия), Л. Виттенмайеру и В. Мербаху (Институт почвоведения и питания растений, Университет Мартина Лютера, Галле/Заале, Германия).

Литература (1) Huang X.-D. et al. (2004) Environmental Pollution, 130, 465-476.

(2) Голубев С.Н. и др. Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой. (2005) Ред. О.В.

Турковская, Саратов, Научная книга, 112-123.

(3) Egle K., Rmer W., Keller H. (2003) Agronomie, 23, 511-518.

(4) Walker T.S. et al. (2003) Plant Physiology, 132, 44-51.

(5) Dobbelaere S. et al. (1999) Plant and Soil, 212, 155-164.

(6) van Loon L.C. and Bakker P.A.H.M.: Signalling in Rhizobacteria-Plant Interactions. (2003) In: de Kroon H., Visser E.J.W. (Eds.): Ecological Studies. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 168, 297-330.

(7) Lambrecht M. et al. (2000) Trends in Microbiology, 8, 298-300.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ RED-ЗАВИСИМОЙ СИСТЕМЫ РЕКОМБИНАЦИИ ФАГА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК ПРОМОТОРОВ В ENTEROBACTERIACEAE Голубева Л.И., Куваева Т.М., Каташкина Ж.И.

ЗАО «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика (АГРИ)», Москва 117545, 1-ый Дорожный проезд, д. lesgol@mail.ru Ключевые слова: promoters library, bacteriophage lambda recombination, chromosome engineering, bacteria В настоящее время система Red-зависимой рекомбинации фага (Gene, vol. 246(1-2), pp. 321-30) широко используется для интеграции в хромосому Escherichia coli K12 и Salmonella typhimurium ПЦР амплифицированных фрагментов ДНК. Данная система также применяется для интеграции ПЦР амплифицированных фрагментов ДНК в хромосому таких организмов, как Salmonella enterica Serovar enteritidis (Infect. Immun. Vol.70, p.451-461), Shigella flexneri (Infect. Immun. Vol.69, p. 7471-7480) и Yersinia pseudotuberculosis (FEMS Immun. and Med. Microbiol. Vol. 38, p. 113-116).

Нами был разработан метод, позволяющий за один акт Red-зависимой интеграции получить представительную выборку колоний, имеющих различные уровни экспрессии интересующего гена или оперона. Для демонстрации возможностей метода был проведен эксперимент по рандомизации промоторной области гена lacZ в штамме дикого типа E.coli MG1655. В результате была получена библиотека колоний, несущих перед структурной частью гена lacZ Ptac –подобные промоторы, отличающиеся по четырем внутренним нуклеотидам области «-35» исходного промотора Ptac. Для колоний, отобранных по результатам предварительного скрининга на среде с красителем X-gal, была определена активность -галактозидазы. Было показано, что полученный набор промоторов обеспечивает плавное изменения уровня активности -галактозидазы более чем на два порядка величины. Нуклеотидные последовательности отобранных промоторов были определены по методу Сенгера (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467).

Полученная библиотека промоторов может быть применена как в прикладных, так и в фундаментальных исследованиях для обеспечения изменения уровня экспрессии генов или оперонов в заданное число раз.

Обсуждается возможность использования такого подхода и в других видах Enterobacteriaceae.

РОЛЬ РЕДОКС-МЕДИАТОРОВ В БИОДЕГРАДАЦИИ ГЕРБИЦИДА АТРАЗИНА ГРИБНОЙ ЛАККАЗОЙ Горбатова О.Н., Королева О.В.

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский проспект, д.33, стр.2, Россия olia77@yandex.ru Ключевые слова: атразин, биодеструкция, редокс-медиатор, лакказа.

1. Введение Постоянно увеличивающиеся объемы отходов производств и жизнедеятельности человека делают актуальными вопросы создания технологий для ремедиации экосистем. Одной из основных групп токсичных загрязнителей окружающей среды являются пестициды, из которых к наиболее широко используемым относятся сим-триазины – атразин и его структурные аналоги (Рис.1), оказывающие негативное воздействие на различные растительные и животные организмы (1, 2). Оптимальным подходом к биотрансформации ксенобиотиков на сегодняшний день представляется использование культур микроорганизмов или ферментных систем совместно с медиаторами, увеличивающими скорость и эффективность деструкции загрязнителя. Целью настоящей работы являлось изучение деструкции атразина системами, содержащими лакказу (грибную оксидоредуктазу) и различные редокс-медиаторы.

Cl N N NH N NH C 2H CH(CH 3) 2 Cl OH Атразин N N N N NH 2 N NH C 2H Cl NH N NH C 2H Деизопропилатразин CH(CH 3) 2 N N 2-гидроксиатразин NH N NH CH(CH 3) Деэтилатразин Рисунок 1: Атразин и его производные.

2. Материалы и методы Атразин (Атр) и его производные: деэтилатразин (ДЭА), деизопропилатразин (ДИА) и гидроксиатразин (ГА), – производства «Dr. Ehrenstorfer” (Германия, Аугсбург). Комплексы рутения [Ru(phpy)(phen)2]PF6 (К1) и [Ru(bpy)2Cl2]·2H2O (К2) были синтезированы на кафедре химической энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова (Россия, Москва). Сирингалдазин – стандарт «Sigma» (США), 1-гидроксибензотриазол (ГБТ) – стандарт «Fluka» (Швейцария). Лакказу получали при глубинном культивировании базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea (3).

Воздействие медиаторов – ГБТ, сирингалдазина, К1 и К2 – изучали в водных растворах «атразин/редокс медиатор/лакказа» в течение 10 суток при комнатной температуре (25±2°C), варьируя мольное соотношение «атразин/медиатор» от 9:1 до 1:9. Деструкцию атразина лакказой в присутствии медиаторов характеризовали методом ВЭЖХ по убыли атразина и накоплению продуктов с использованием хроматографической системы “Beckman Coulter” (США).

3. Результаты и обсуждение Стандартные растворы характеризовались следующими временами удерживания в методе ВЭЖХ, мин:



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.