авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

«Международная Школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» организована Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН в рамках Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотруд- ничества в ...»

-- [ Страница 2 ] --

ГБТ – 10,50, ДИА – 16,20, ГА – 17,93, ДЭА – 18,48, сирингалдазин – 22,08, атразин – 24,18, К1 и К2 давали минорные пики при 225 нм. При взаимодействии редокс-медиаторов с лакказой образовывались пики, которые не пересекались с соединениями атразинового ряда. Для определения концентрации атразина была построена калибровочная кривая, которая была линейна в области концентраций от 2 до 110 мкМ.

Экспериментально показано, что лакказа не действует на атразин в отсутствие редокс-медиатора. Из четырех изученных редокс-медиаторов только ГБТ вызывал существенную убыль атразина;

в остальных случаях его концентрация снижалась незначительно – до 4%. Полученные результаты можно объяснить высокой скоростью окисления сирингалдазина и комплексов рутения с образованием необратимых продуктов, тогда как ГБТ является электрохимически обратимым соединением (4).

В системе с ГБТ разложение атразина было изучено при различных концентрациях лакказы и разных соотношениях «атразин/медиатор». В табл.1 показана убыль атразина при малой – 0,02 мкМ – концентрации лакказы. Установлено, что убыль атразина возрастала с увеличением концентрации медиатора.

Таблица 1: Убыль атразина в модельной системе «Атр/ГБТ/лакказа».

Убыль атразина после Атразин, инкубации, % № опыта ГБТ, мкМ Лакказа, мкМ Атр/ГБТ мкМ 4 сут 10 сут 1 104 12 0,02 9:1 4,5 5, 2 99 16 0,02 6:1 5,1 5, 3 86 29 0,02 3:1 4,6 5, 4 58 57 0,02 1:1 20,0 47, 5 29 86 0,02 1:3 33,8 52, 6 16 98 0,02 1:6 40,2 62, 7 12 103 0,02 1:9 57,5 72, Контроль1 58 0 0 - 0 Контроль2 58 0 0,02 - 0 При отношении ГБТ/атразин, равном 9:1, наблюдалось максимальное уменьшение атразина – до 70% за суток. Для высокой концентрации фермента – 0,97 мкМ – эффективность деструкции атразина была существенно ниже, составляя 28% за 10 суток.

В системе «атразин/ГБТ/лакказа» по данным ВЭЖХ наблюдалось слабое накопление рассмотренных в работе метаболитов атразина. При этом формировались также неидентифицируемые продукты, один их которых может быть предварительно отождествлен как комплекс атразин/ГБТ (Рис. 2). Однако для строгой идентификации и количественного анализа продуктов деструкции необходимо привлечение дополнительных методов, например, GC-MS, что и будет составлять тематику последующих работ.

Au 6 Au 0.2 0. 0.1 0. 1 2 3 0.0 0. 0 10 15 20 25 30 мин Рис. 2: Хроматограмма продуктов модельной системы «Атр/ГБТ/лакказа» при 225 нм. 1 – ГБТ, 2 – ДИА, 3 – ДЭА, 4, 5, 7, 8 – неизвестные продукты, 6 – атразин.

4. Заключение Проведено изучение биодеградации атразина в системах, содержащих лакказу и один из медиаторов:

сирингалдазин, ГБТ, К1 или К2. Существенная степень деструкции атразина наблюдалась только для системы «ГБТ/лакказа». При этом для эффективного разложения атразина концентрация медиатора должна в несколько раз превышать концентрацию ксенобиотика.

Областью потенциального применения полученных закономерностей является создание технологий ферментативной детоксификации, прежде всего в водоочистных системах.

Литература (1) Graymore M., Stagnitti F., Allinson G. (2001) Envir. Intern., 26, 7-8, 483–495.

(2) U.S. EPA Office of Pesticide Programs. Health Effect Division. The grouping of a series of triazine pesticides based on a common mechanism of toxicity. (2002). USA, 4–37.

(3) Koroleva-Skorobogat`ko O., Stepanova E., Gavrilova V., Morozova O., Lubimova N., Dzchafarova A., Yaropolov A., Makower A. (1998) J. Biotechnol. Appl. Biochem., 28, 1, 47–54.

(4) Bourbonnais R., Leech D., Paice M.G. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1379, 3, 381-390.

МУТАЦИЯ ЛЕЙДЕНА – ФАКТОР РИСКА РАЗВИТИЯ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ИСХОДА У БОЛЬНЫХ СЕПСИСОМ Городнова Е.А.1, Грачев С.В.1, Малов В.А.1, Белобородов В.Б. Московскаямедицинская академия имени И.М. Сеченова, 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.1, НИЦ, Россия;

Российская медицинская академия последипломного образования, 123836, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1.

gorodnova@mmascience.ru, eagorodnova@mail.ru Ключевые слова: сепсис, ДВС синдром, мутация Лейдена, резистентность к активированному протеину С.

1. Введение Сепсис – актуальная проблема медицинского, демографического и экономического значения. Одним из факторов развития осложнений и неблагоприятного исхода у больных сепсисом является тяжесть нарушений в системе гемостаза. Клинически это проявляется синдромом ДВС, морфологической основой которого является мозаичное повреждение эндотелия с микротромбообразованием и кровоизлияниями вокруг мелких сосудов.

При тяжелом сепсисе синдром ДВС приобретает генерализованный характер с множественным образованием тромбов, отложение сгустков фибрина, выстилающих поверхность эндотелия в виде плёнки, что препятствует массообмену и способствует развитию глубоких дистрофических изменений в тканях и органах. В последние годы появись клинические данные, указывающие на генетическую предрасположенность развития синдрома ДВС. Мутация Лейдена является генетически обусловленным дефектом V фактора свёртывания (ФV), заключается в низкой инактивации ФV его физиологическим ингибитором – активированным протеином С (АПС) (состояние резистентности к АПС) и фактором пожизненного риска возникновения тромбозов.

Носители аллеля болезни могут не иметь никакой клинической симптоматики заболевания до появления внешних факторов: иммобилизации, хирургическое вмешательство, травмы, опухоли, приём гормональных препаратов и т.д. В клинической картине доминируют часто рецидивирующие тромботические нарушения различной локализации и их осложнения. При сепсисе резко возрастает риск развития тромбоза и тяжелых необратимых нарушений коагуляции трудно подающихся медикаментозной коррекции. Следствием этого является развитие синдрома полиорганной недостаточности и неблагоприятный исход заболевания.

Целью настоящего исследования явилось изучение клинико-патогенетического значения определения резистентности к АПС ассоциированной с мутацией Лейдена у больных сепсисом различной этиологии.

2. Материалы и методы Исследование является частью работы по изучению клинико-патогенетического значения ингибиторов свёртывания у 33 больных сепсисом. Дизайн исследования: «Случай-Контроль» = 2(23) : 1(10), «Контроль» группа сравнения, CI=95, power=80. «Случай» или основная группа исследования – 23 пациента с менингококковым сепсисом («идеальная» модель сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями), летальность-22%. «Контроль» - 10 пациентов с сепсисом различной бактериальной этиологии, летальность 50%. Пациенты (мужчины и женщины) в возрасте от 18 до 75 лет включительно, с диагнозом бактериальный сепсис, подтверждённый лабораторными методами исследования. Критерии исключения: беременность, лактация, вирусный гепатит, цирроз печени, новообразования, патология системы крови (гемофилия), ожирение, хронический диализ, недавняя операция или травма (в пределах предыдущих 12 часов), ранний послеоперационный период, портальная гипертония, наличие в анамнезе тромботических заболеваний, приём эстрогенов, назначение гепарина. Все больные (n=33) – пациенты отделения реанимации и интенсивной терапии, относились к группе тяжёлых больных, средняя оценка по шкале APACHE II на момент включения в исследование составила: 21,5+7,3 балла в группе «Случай», и 25,7+4,3 балла в группе «Контроль». В 100% в группе «Случай» и у части пациентов «Контроля» зарегистрированы проявления ДВС синдрома в виде геморрагической сыпи на коже и слизистых оболочках, кровотечений различной локализации. Для выявления резистентности к АПС нами использовался APCr – Quik test bioMerieux (France), основанный на эффекте действия яда гадюки Рассела, представляющий скрининговый тест для детекции мутации Лейдена. В данном тесте не использовались желтушные, липемические и гемолизированные образцы плазмы, т.к. они могли вызвать ложные результаты. Дефициты факторов VII, VIII, IX, XII не оказывают влияния на результаты APCr – Quik test. Тест проводился на коагулометре Stago–4 Roche (USA) по методике определения АЧТВ. При восстановлении реагентов соблюдались все инструкции фирмы производителя. Результат представляют как выражение: APCr – Quik test = время свёртывания с активатором/ время свёртывания солевое (с физиологическим раствором). Отношение, меньшее и равное 1,5 УЕ, предполагает наличие мутации Лейдена.

Результаты обработаны при помощи пакета прикладных программ SPSS PC (Version 9.0) с использованием библиотеки статистических функций, а так же средствами программы Epi Info 6.0.

3. Результаты и обсуждение Так как течение сепсиса у всех больных характеризовалось как тяжёлое, изменения изучаемых лабораторных показателей было принято рассматривать у больных в зависимости от исхода заболевания, т.е. у выживших и больных с летальным исходом. Как видно из таблицы 1, резистентность к АПС, ассоциированная с мутацией Лейдена, выявлена в 30,5% случаев у больных группы «Случай» и в 40% - у больных «Контроля».

Независимо от этиологии, в случае неблагоприятного исхода заболевания, данный генетический дефект выявлялся в 60% случаев, отражая наличие неблагоприятного преморбидного фона, способствующего развитию ДВС - синдрома тяжелого течения и как следствие – неблагоприятного исхода заболевания.

Таблица 1. Мутация Лейдена у больных сепсисом.

Основная группа исследования «Случай» Группа сравнения, «Контроль»

Показатель Всего Выжили Умерли Всего Выжили Умерли n=23 n=18 n=5 n=10 n=5 n= Мутация Лейдена, % встречаемости 30,5 20,2 60 40 20 Все случаи летальных исходов у больных сепсисом с мутацией Лейдена выявлены у пациентов старше (47-74) лет. А в группе «Контроль» мутация Лейдена в 100% случаев была зарегистрирована только у лиц мужского пола. У пациентов группы «Случай» данный генетический дефект был обнаружен почти в равных соотношениях как у мужчин (n=4), так и у женщин (n=3), но лица мужского пола всё-таки преобладали.

4. Заключение Настоящее исследование показывает, что в 60% случаев у больных сепсисом с неблагоприятным исходом заболевания, независимо от этиологии, была выявлена Мутация Лейдена. У больных с неблагоприятным исходом данный генетический дефект выявлялся в три раза чаще по сравнению с выжившими больными.

Интересен тот факт, что все случаи летальных исходов у больных сепсисом с мутацией Лейдена выявлены у пациентов старше 40 лет, а носителями данного генетического дефекта чаще были представлены лица мужского пола.

Сепсис являлся фактором, способствующим запуску каскада тяжелых нарушений со стороны системы свёртывания у данных больных, развитию полиорганной недостаточности и летального исхода.

Результаты нашего исследования позволяют полагать, что определение мутации Лейдена у больных сепсисом является дополнительным критерием, объективизирующим оценку степени тяжести одного из компонентов полиорганной недостаточности - ДВС синдрома. Проведённое исследование обосновывает целесообразность определения мутации Лейдена для выбора лечебной тактики коррекции ДВС синдрома у больных тяжелым сепсисом.

Литература (1) Aparicio C., Dahlbck B. (1996) Biochem J.,313, 467-472.

(2) Bajzar L., Kalafatis M., et al. (1996) J Biol Chem., 271, 22949-22952.

(3) Sun X., Evatt B., et al. (1994) Blood, 83, 3120-3125.

(4) Svensson P.J., Dahlback B. (1994) N Engl J Med., 330, 517-522.

(5) Белобородов В.Б.(1997) РМЖ. Том 5. № 24.С.326-338.

(6) Белобородов В.Б., Городнова Е.А. (2006) Клиническая анестезиология и реаниматология. Том 3, №1,С. 45-48.

(7) Городнова Е.А., Пак С.Г. и др. (2004) Вестник РАМН. №6.С.8-13.

(8) Городнова Е.А., Грачев С.В. и др. (2006) Клиническая анестезиология и реаниматология. Том 3, №1, С. 49-55.

ПРОТЕАЛИЗИН – ОТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ К БИОТЕХНОЛОГИИ Громова Т.Ю.1, Костров С.В. Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992, Москва, Проспект Вернадского 86, Россия Институт молекулярной генетики РАН, Москва,123182, Площадь Курчатова 2 Россия tgromova81@mail.ru Ключевые слова: коллагеназы, протеализин, термолизинподобные протеиназы.

1. Введение По данным Министерства здравоохранения РФ, белковый дефицит в рационе питания в настоящее время испытывают до 25 (в некоторых регионах до 60) процентов россиян. Одним из наиболее реальных путей его преодоления является повышение пищевой ценности низкосортного мясного сырья. Сортность мяса и качество вырабатываемой из него продукции в первую очередь определяются содержанием коллагена – основного компонента соединительных тканей животных. Разработка и применение ферментных препаратов, способных эффективно расщеплять соединительную ткань, позволит увеличить пищевую ценность и потребительские качества низкосортного мяса и, таким образом, может дать значительный экономический и социальный эффект. Отметим, что такие препараты должны удовлетворять двум основным требованиям. Во первых, эффективно действовать при температуре 410 градусов, что определяется технологиями приготовления мясопродуктов. Во-вторых, используемые ферменты должны полностью инактивироваться в ходе термообработки.

Ранее сотрудниками Института молекулярной генетики РАН и ГНУ ВНИИ мясной промышленности им В.М. Горбатова Россельхозакадемии (ВНИИМП) обнаружен и запатентован штамм Serratia proteamaculans 94, продуцирующий коллагенолитический фермент активный при пониженной температуре (1). Разработан лабораторный регламент получения коллагенолитического препарата на базе этого штамма, изготовлены опытные партии препарата, продемонстрирована его способность эффективно расщеплять соединительную ткань в составе мясного сырья при низких положительных температурах. Однако себестоимость такого препарата оказалась слишком высокой для применения в промышленном масштабе. Для решения этой проблемы предложен подход, заключающийся в использовании для улучшения качества мясного сырья коллагенолитических ферментов Serratia proteomaculans 94, продуцируемых рекомбинантными штаммами.

С целью клонирования генов протеалитических ферментов создана геномная библиотека Serratia proteomaculans 94, при анализе которой охарактеризлван ген новой металлопротеиназы, названной нами протеализин. На основе клонированного гена и коммерческой экспрессионной системы создан штамм– продуцент фермента.

Задачей данной работы является очистка, характеристика рекомбинантного протеализина и получение коллагенолитического препарата на его основе.

2. Материалы и методы В работе использовали полученный ранее продуцент протеализина Escherichia coli BL21 (DE3) (pSIT20).

Метод очистки протеализина включал анионообменную хроматографию на колонке Econo-Pac High Q Сartridge, 5 ml (Bio-Rad, США), гидрофобную хроматографию на колонке (1,5x3 см) с Phenyl Sepharose CL 4B (Amersham Biosciences), гель-проникающую хроматографию на колонке Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Biosciences).

3. Результаты и обсуждения Анализ выведенной из структуры клонированного гена аминокислотной последовательности протеализина показал, что этот белок относится к группе термолизинподобных протеиназ (ТПП). Как большинство ТПП протеализин синтезируется в виде предшественника, который помимо каталитически активной части, содержит дополнительную N–концевую область. Для многих ТПП показано, что амино-концевой регион предшественника (АКР), удаляемый в ходе созревания, играет роль внутримолекулярного шаперона, необходимого для формирования активного фермента. Однако размер и первичная структура АКР предшественника протеализина не имеют значимого сходства со структурой АКР большинства ТПП (рис. 1).

Рисунок 1: Структурная организация предшественников Рисунок 2: Электрофоретический анализ образцов классических термолизинподобных протеиназ (А) и протеализина. 1. Маркеры молекулярных масс. 2, протеализина (Б). АКР – амино-концевой регион Клеточные лизаты E. coli BL21 (DE3) (pSIT20) сразу предшественника, удаляемый при созревании. после лизиса и через 24 ч инкубации при 4°соответственно. 4. Очищенный протеализин.

Нами было показано, что при экспрессии в E. coli протеализин накапливается в виде предшественника, который после разрушения клеток самопроизвольно процессируется с образованием активной формы (рис. 2).

При этом удаляется 50 аминокислотных остатков N-концевой области.

Активная металлопротеиназа Serratia proteomaculans 94 выделена из клеточного лизата E. coli BL21 (DE3) (pSIT20) в электрофоретически гомогенном виде (рис. 2) в количестве 18,5 мг на литр культуральной суспензии.

Молекулярная масса фермента, определенная при помощи масс-спектрометрического анализа, электрофореза в денатурирующих условиях и гель-проникающей хроматографии, составила 32 кДа.

Совпадение значений молекулярных масс белка, полученных в нативных и денатурирующих условиях, показывает, что активной формой протеализина является мономер. N-концевая аминокислотная последовательность зрелого фермента: AKTSTGGEVI. рН-оптимум активности фермента находится в нейтральной области. Протеализин не обладает высокой термостабильностью, однако устойчив в широком диапазоне рН. Результаты ингибиторного анализа подтвердили принадлежность протеализина к группе металлопротеиназ. Фермент ингибируется групповым ингибитором металлопротеиназ о–фенантролином и устойчив к действию групповых ингибиторов сериновых и цистеиновых протеиназ.

Протеализин гидролизует стандартный субстрат ТПП – 3-(2-фурил)акрилоил-глицил-L-лейцинамид.

Отношение констант kcat/Km при гидролизе этого субстрата ферментом составило (2,52 ± 0,02) 102 M-1 с-1.

Также нами было показано, что протеализин способен гидролизовать нативный коллаген I типа при температуре 4°.

Совместно с сотрудниками ВНИИМП продемонстрировано, что при обработке препаратом рекомбинантного протеализина низкосортного мясного сырья преимущественно гидролизуется соединительная ткань. С использованием данного препарата была выработана опытная партия колбасных изделий и показано, что фермент полностью инактивируется при используемом режиме термической обработки и положительно влияет на органолептические свойства продукта.

4.Заключение Проведенные нами исследования демонстрируют, что на основе протеализина может быть создан препарат для промышленного улучшения качества мясного сырья. Это позволяет перейти к заключительной стадии работы – конструированию продуцента на основе штамма, разрешенного для применения в пищевой промышленности.

Благодарность Авторы благодарят д.х.н. Г.Н. Руденскую (МГУ им. М.В. Ломоносова) за помощь в исследовании субстратной специфичности протеализина.

Литература (1) Костенко Ю.Г., Спицына Д.Н., Батаева Д.С., Костров С.В., Носовская Е.А. Штамм Serratia proteamaculans 94 – продуцент коллагеназы. (2001) Патент Российской Федерации № 2175350.

(2) Demidyuk I.V., Kalashnikov A.E., Gromova T.Yu., Gasanov E.V., Safina D.R., Zabolotskaya M.V., Rudenskaya G.N., Kostrov S.V. (2006) Protein expression and purification, in press.

ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕКТИНОВ С ИЗМЕНЕННОЙ УГЛЕВОДСПЕЦИФИЧНОСТЬЮ Губайдуллин И.И., Баймиев Ал.Х., Баймиев А.Х.

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа, проспект Октября 71, irekgi@rambler.ru Ключевые слова: углеводспецифичность, углеводсвязывающая последовательность, гибридные лектины.

1. Введение Лектины бобовых растений имеют высокий уровень сходства как по первичной (до 85% гомологии), так и по третичной структуре при довольно широком диапазоне их специфичности к углеводам [1]. Более того, различия в специфичности обеспечиваются несколькими конкретными аминокислотными остатками в петлях, составляющих углеводсвязывающий сайт [2-4] и, кроме того, вариациями по длине этих петель, сильно изменяющих структуру связывающего сайта без воздействия на общую трехмерную структуру протомера.

Таким образом, заменяя функционально значимые аминокислоты или углеводсвязывающие участки можно создавать лектины с новой и заданной углеводной специфичностью, что может найти применение в биотехнологии и фармакологии. Кроме того, в связи с тем, что многие функции лектинов основаны на их углеводсвязывающих свойствах, возможно, что создание модифицированных или гибридных лектинов заметно облегчит исследования их роли в становлении бобово-ризобиального симбиоза, поскольку в настоящее время сведения о полноразмерных генах бобовых лектинов весьма ограничены.

2. Материалы и методы Для создания гибридных лектинов с новыми и заданными углеводсвязывающими свойствами нами был разработан оригинальный метод сайт направленного мутагенеза. Вектор с полноразмерным геном лектина Pisum sativum амплифицировали праймерами направленными друг от друга, 5’-концы которых приходились точно встык к углеводсвязывающей последовательности (УСП). Таким образом, создавался ампликон-вектор с геном лектина гороха без УСП в котором затем клонировали УСП генов лектинов других растений. Анализ гибридных лектинов на специфичность взаимодействия их с моносахаридами проводился гемагглютинацией эритроцитов. Ингибирование реакции агглютинации сахаридами проводили в пределах от 10 до 100 мМ с двукратным разведением соответствующего сахарида при найденном титре лектина.

3. Результаты и их обсуждение Указанным выше способом сконструированы гибридные гены лектинов P. sativum с УСП Medicago sativa (psl/mal) и Astragalus glycyphyllos (psl/agl), которые были клонировали в экспрессионном векторе pET-15b.

Поиск наиболее оптимального уровня синтеза лектина был проведен среди штаммов клеток рекомбинантов E.coli: BL21(DE3)pLysS, BL21trxB(DE3)pLysS и OrigamiB(DE3)LysS. Довольно высокий уровень наработки целевого белка обнаружен у последнего. В клетках BL21(DE3)pLysS детектировать лектин не удалось, несмотря на разнообразные условия индукции экспрессии гена. У штамма BL21trxB(DE3)pLysS был небольшой уровень синтеза из которого и выделяли лектин аффинной хроматографией. По нашим оценкам, данный штамм продуцирует приблизительно от 2 до 5 мг лектина на литр культуральной среды в поздней логарифмической фазе роста. Вектор pET-15b имеет шесть повторов гистидинового кодона САТ, локализованных между его T7 промотором и полилинкером. Поэтому синтезируемый белок является «fusion»

белком с шестью остатками аминокислоты гистидина. Это позволяет с помощью никелевых колонок элюировать «меченый» таким образом белок и детектировать его как целевой в результате выделения.

По реакции агглютинации, требующей, чтобы лектин был в мультимерной форме, мы заключили, что созданные нами гибридные лектины являются (как и природные) мультивалентными белками. Минимальная концентрация белка, при которой еще наблюдалась агглютинация, составила приблизительно 40 мкг/мл.

При относительно отличающейся первичной структуре УСП лектинов PSL, PSL/MAL и PSL/AGL, они показали некоторое сходство по специфичности к сахаридам, но по силе аффинности к ним заметно различались (табл. 1).

Таблица 1. Специфичность гибридных лектинов PSL/MAL и PSL/AGL к сахаридам и дисахаридам Концентрация сахара (мМ), ингибирующая реакцию агглютинации Сахар гибридный лектин PSL/MAL гибридный лектин PSL/AGL Glc 25 Man 10 Gal 100 GalNAc 100 нет ингиб.

Fru 25 Lac 25 Mal нет ингиб. Cel 50 Замещение УСП лектина PSL таковым A. glycyphyllos привело к значительному (почти на порядок) ослаблению аффинности к Man и приобретению способности связываться с Gal. Подобный случай был описан к литературе. Ямамото с соавторами синтезировали пептид AspThrTrpProAsnThrGluTrpSer, гомологичный углеводсвязывающему участку лектина Bauhinia purpurea, специфичного к Gal и Lac, и обнаружили, что он задерживается на лактозо-агарозной колонке. При замещении его октапептидом Asp(121)ThrPheTyrAsnAlaAlaTrp лектина P. sativum, гибридный лектин B. purpurea, экспрессирующийся в E. coli, проявлял специфичность к Man [5]. Таким образом, можно предположить, что УСП лектина A. glycyphyllos принимает участие в формировании специфичности к Gal, подобно соответствующему участку лектина Bauhinia purpurea или P.

sativum, октапептид которого проявляет специфичность к Man. Напротив, при замещении УСП лектина PSL соответствующим участком M. albus белок сохранил специфичность к Man и Glc и приобрел слабую аффинность к Gal и GalNAc. По всей видимости замена Tyr124His и делеция Ala127 в УСП PSL/MAL привели к приобретению слабой аффинности этого белка к Gal и GalNAc. Кроме того, поскольку в гибридном белке PSL/MAL замещена лишь часть углеводсвязывающего сайта он, по всей видимости, сохраняет свои прежние размеры, что также обуславливает его аффинность к Man как и наличие аминокислотных остатков Phe123 и Ala126. Обнаружено, что при изменении УСП лектина PSL на таковой M. albus и A. glycyphyllos не происходило изменения его сродства к Glc, из чего мы сделали вывод, что данная специфичность PSL видимо формируется преимущественно другими его областями, например такими аминокислотами как: Thr28, Ala30, Glu31, Ala33, Asp81, Gly97, Gly98, Gly99, Tyr100 [6]. Таким образом, это обусловило наличие у гибридного белка PSL/AGL совмещенной специфичности к Gal и Glc, что не характерно для лектинов бобовых. Подобный случай совмещенной специфичности к GlcNAc, Gal и фукозилгалактозе обнаружен у лектина UEA-II бобового растения Ulex europaeus. Причем необычно то, что специфичность к первым двум сахаридам определяется одним и тем же углеводсвязывающим участком этого лектина [7].

Литература (1) Higgins, T.J.V., Chandler, P. M., Zurawski, G., Button, S.C., Spencer, D. (1983) The biosynthesis and primary structure of pea seed lectin. J. Biol. Chem. 258, 9544-9549.

(2) He, X.G. (1990) Signal molecules of plant-induced of gene expression of bacteria. Acta Bot. Sin. 32, 896-900.

(3) Stubbs, M.E., Carver, J.P., Dunn, R.J. (1986) Production of lectin in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 261, 6141-6144.

(4) Longstaff, M., Powell, K.S., Gatehouse, J.A. (1998) Production and purification of active snowdrop lectin in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 252, 59-65.

(5) Yamamoto, K., Konami, Y., Osawa, T. (1992) Alteration of the carbohydrate-binding specificity of the Bauhinia purpurea lectin trough the preparation of a chimeric lectin. J. Biochem. 111, 87-90.

(6) Loris, R., Hamelryck, T., Bouckaert, J., Wyns, L. (1998) Legume lectin structure. Biochim. Biophys Acta. 1383, 9-36.

(7) Loris, R., De Greve, H., Dao-Thi, M.H., Imberty, A. and Wyns, L. (2000) Structural basis of carbohydrate recognition by lectin II from Ulex europaeus, a protein with a promiscuous carbohydrate-binding site. J. Mol Biol. 301, 987-1002.

КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ТРИАЗИНОВЫМИ ГЕРБИЦИДАМИ Думова В.А., Пароменская Л.Н. Санкт-Петербургский Государственный Университет, 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Россия Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, 196608 Санкт Петербург, Пушкин, ш. Подбельского д.3, Россия doumova@mail.ru Ключевые слова: биоремедиация, микробный консорциум, гербициды 1. Введение В настоящее время одной из важнейших экологических проблем является загрязнение окружающей среды, и в первую очередь почвы, различными пестицидами. Поэтому значительное внимание исследователей уделяется поиску безопасных способов очищения почв. Эффективным и экологически оправданным способом биоремедиации загрязненных почв является использование штаммов микроорганизмов способных к деструкции пестицидов, либо их ассоциаций. Широко распространённым способом получения таких ассоциаций является их выделение из многолетне загрязнённых почв. Так были получены консорциумы деструкторов атразина (Alvey S.,Crowley D.E.,1995), линурона ((Dejonghe W. et al, 2003) и 2,4-ДНТ (Snellinx Z.

et al., 2003).

Из торфо-соломистого субстрата, компостируемого в присутствии гербицида прометрина, путём многократных пассажей отобран стабильный консорциум микроорганизмов (БАГС), эффективно разлагающий триазиновые гербициды (Пароменская Л.Н. и др.,2005). Использование таких естественных микробных консорциумов, обладающих способностью разлагать ксенобиотики, имеет несомненные преимущества в связи их легкой приживаемостью в почве.

Целью данной работы являлось изучение состава микробного сообщества БАГС, а также механизм участия отдельных его представителей в разложении гербицида группы s-триазинов - прометрина.

2. Материалы и методы 1.Выделение микроорганизмов из консорциума БАГС Штаммы выделялись из консорциума путем высева водной суспензии 10-4 разведения на агаризованную глюкозо-пептонную среду и отбора доминирующих морфотипов колоний. Выращивание культур проводили в термостате при 25оС.

Для идентификации использовали классические морфолого-культуральные и физиолого-биохимические методы, а также метод 16S-rRNA.

2.Изучение разложения гербицида прометрина Гербицид прометрин относится к группе симм-триазинов (2-метилтио-4,6-бис(изопропиламино)-сим триазин) и широко используется для борьбы с сорняками на посевах широкого круга сельскохозяйственных культур. Изучение разложения гербицида выделенными штаммами микроорганизмов и всем консорциумом проводилось в лабораторных опытах. Оценивалась как способность использовать гербицид в качестве единственного источника углерода и энергии, так и при наличии в среде органических субстратов - глюкозы, арабинозы и целлюлозы. Опыты проводили на стерильном песке в который вносили минеральную питательную среду и прометрин в концентрации 25 мг/кг. Для инокуляции использовали суспензии штаммов микроорганизмов, либо суспензию консорциума. После культивирования при 25оС в течении 10 суток определяли остаточное количество гербицида методом газожидкостной хроматографии.

3.Изучение влияния консорциума БАГС на разложение прометрина в почве Исследование проводилось в микрополевом опыте на дерново-подзолистой почве. Гербицид вносили в виде водной суспензии в концентрации 20 мг/кг, препарат БАГС в концентрации 20 г/кг, перемешивая его с верхним слоем почвы глубиной до 10 см. Отборы проб проводили в через 2, 4, 7 недель и 2 месяца. В почве определяли остаточное количество гербицида методом газожидкостной хроматографии.

3. Результаты и обсуждение Из консорциума БАГС было выделено 6 доминирующих штаммов бактерий. По результатам идентификации они были отнесены к родам Bacillus sp.(2, 3, 3/7), Pseudomonas sp.5/7, Acinetobacter sp.8, Cellulomonas sp.4/7.

Результаты исследования разложения прометрина выделенными штаммами на средах с различными источниками углерода представлены в таблице 1.

Таблица 1: Разложение прометрина консорциумом БАГС и его доминантами Разложено прометрина (%) на средах:

Вариант инокуляции Глюкоза Арабиноза Целлюлоза Без углерода Bacillus sp.2 28 25 15 Bacillus sp.3 35 29 2 Bacillus sp.3/7 45 44 35 Pseudomonas sp.5/7 57 36 18 Cellulomonas sp.4/7 46 44 61 Acinetobacter sp.8 65 53 63 консорциум БАГС 65 47 91 * исходная концентрация прометрина 25 мг/кг принята за 100% Из представленных данных следует, что практически все исследуемые штаммы обладают деструктивной активностью в отношении гербицида, однако их активность в немалой степени определяется присутствием в среде того или иного органического субстрата. Можно выделить ряд штаммов, обладающих максимальной активностью в разложении: Acinetobacter sp.8 в присутствии глюкозы и целлюлозы, Cellulomonas sp.4/7 в присутствии целлюлозы и Pseudomonas sp.5/7 в присутствии глюкозы. Большинство штаммов эффективнее используют прометрин в присутствии дополнительных органических субстратов по сравнению с вариантом без углерода. Вероятно, разложение прометрина этими штаммами идёт по типу кометаболизма. В то же время очевидно, что некоторые из присутствующих в консорциуме бактериальных штаммов могут использовать прометрин в качестве единственного источника углерода и энергии (Pseudomonas sp.5/7, Bacillus sp.2 и 3) Активность разложения гербицида целым сообществом значительно увеличивается в присутствии целлюлозы, что может быть связано с процессами комменсализма. В то же время, эффективность консорциума в присутствии глюкозы и арабинозы сопоставима с активностью некоторых штаммов бактерий, выделенных из него.

В микрополевом опыте была установлена эффективность использования консорциума в естественных условиях для биоремедиации почвы, загрязненной прометрином. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2: Влияние консорциума БАГС на разложение прометрина в почве Содержание прометрина мг/кг Вариант 2 недели 4 недели 7 недель 2 месяца Контроль(NPK) 36,0 17,9 7,6 5, +БАГС(20мг/кг) 21,3 2,3 0,5 Уже через 2 недели в варианте с БАГС обнаруживается гораздо меньшее количество гербицида, по сравнению с контролем. Отсутствие гербицида через 2 месяца говорит о его полном разложении под влиянием консорциума.

4.Заключение Таким образом, показана возможность использования данного консорциума для биоремедиации почвы, загрязненной триазиновыми гербицидами. Изучен состав консорциума и выявлены некоторые взаимосвязи в его функционировании. Показано наличие в консорциуме микроорганизмов,обладающих способностью разлагать гербицид прометрин как в условиях кометаболизма, так и при использовании его в качестве единственного источника углерода. Эффективность всего консорциума обеспечивается сопряжённой работой отдельных микробных представителей сообщества.

Список литературы (1) Alvey S.,Crowley D.E. 1995. Influence of organic amendments on biodegradation of atrazine as a nitrogen source. J.

Environ. Qual. 24:1156-1162.

(2) Dejonghe W., Berteloot E., Goris J. et al. 2003. Synergistic degradation of linuron by a bacterial consortium and isolation of a single linuron-degrading Variovorax strain. Applied and environmental microbiology. 69:1532-1541.

(3) Snellinx Z., Taghavi S., Vangronsveld J. et al. 2003. Microbial consortia that degrade 2,4-DNT by interspecies metabolism: isolation and characterization. Biodegradation. 14:19-29.

(4) Пароменская Л.Н., Круглов Ю.В., Гамова М.В. и др. 2005. Деградация s-триазинов консорциумом микроорганизмов, утилизирующим растительные полисахариды. Материалы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» Саратов, 14–16 сентября 2005г. с. ЗАГРЯЗНЕНИЕ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПОЧВ ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМ В ЗОНЕ ВЛИЯНИЯ ГОРНО-МЕТАЛЛУРГИЧЕСКОГО КОМБИНАТА Ермаков И.В., Копцик Г.Н.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, 119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, Россия ierm@mail.ru Ключевые слова: почва, подстилка, тяжелые металлы, медь, никель, металлорганические комплексные соединения 1. Введение Обширная территория центральной части Кольского полуострова находится в зоне влияния горно металлургического комбината (ГМК) «Североникель». Газопылевые выбросы этого предприятия содержат значительное количество тяжелых металлов (в основном никеля и меди), а также диоксида серы, вызывающего подкисление атмосферных осадков. Экосистемы в этом регионе представлены преимущественно хвойными лесами на северном пределе их распространения и поэтому особенно чувствительны к различным формам антропогенного воздействия. Негативное влияние выбросов ГМК «Североникель» на лесные экосистемы прослеживается на площади в несколько тысяч квадратных километров;

территория в радиусе нескольких километров от комбината представляет собой эродированную техногенную пустошь.

Проводившиеся ранее на территории Кольского полуострова исследования позволили оценить масштабы загрязнения лесных экосистем промышленными выбросами горно-металлургических комбинатов и выявить степень воздействия этих предприятий на природу Севера (1, 2). Однако механизмы поглощения почвами тяжелых металлов (ТМ) и факторы, влияющие на миграцию и аккумуляцию ТМ в почвах и других компонентах экосистем, были изучены недостаточно. Задачей настоящего исследования является выявление основных закономерностей поведения ТМ в почвах с целью прогнозирования последствий загрязнения природных экосистем Кольского полуострова и разработки адекватных методов рекультивации почв и защиты сопредельных сред.

2. Материалы и методы Почвенные колонки ненарушенного сложения были отобраны в пределах техногенного елового редколесья, на расстоянии 7 км от комбината. В качестве фоновых образцов были взяты почвенные монолиты на территории ельника кустарничково-зеленомошного, на расстоянии 200 км от комбината. Почвы представлены Al-Fe-гумусовыми подзолами – зональным типом почв лесных экосистем Кольского полуострова. Чтобы оценить роль подстилки в процессах аккумуляции элементов-поллютантов, были отдельно отобраны образцы подстилки ненарушенного сложения. Все образцы были упакованы в пластиковые трубы диаметром 16 см, высота монолитов соответствовала мощности всего почвенного профиля и горизонта подстилки соответственно.

В лабораторных условиях образцы регулярно орошались синтетическими растворами, имитирующими атмосферные выпадения на фоновой территории и в зоне влияния ГМК «Североникель» (последние характеризуются более высокими концентрациями серы и ТМ, прежде всего меди и никеля). Растворы были приготовлены из легкорастворимых солей и не содержали какие-либо органические вещества. Интенсивность орошения соответствовала природной интенсивности дождевых осадков. В течение 170 дней почвенные образцы были подвергнуты воздействию пятилетней нормы осадков. Растворы, фильтрующиеся через почву, регулярно собирали и фильтровали через гидрофильные мембранные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм. В фильтратах определяли pH, концентрации углерода водорастворимых и кислоторастворимых органических соединений (фотоколориметрическим методом), никеля, меди, кальция, магния, калия и натрия (методом пламенной атомно-абсорбционной спектроскопии), сульфатов, нитратов и хлоридов (методом ионной хроматографии).

Поглощение никеля и меди почвами и сорбентами изучали также в статических адсорбционных экспериментах при постоянной ионной силе в диапазоне концентраций ТМ от 0.01 до 8 ммоль/л.

3. Результаты и обсуждение В условиях эксперимента с монолитами загрязненные осадки вызывают подкисление минеральной части почвенного профиля. Естественные значения pH в горизонте подстилки составляют 3.5 единицы, что значительно ниже pH используемых осадков (5.0 – в фоновых осадках и 4.4 – в загрязненных). Подстилка загрязненных почв характеризуется несколько более высокими значениями pH (3.9-4.0 единицы), вероятно, вследствие меньшего содержания органических кислот. Анализ содержания углерода водорастворимых органических соединений в фильтратах выявил значительный вынос органического вещества из подстилок фоновой почвы. Доля углерода кислоторастворимых органических соединений от общего содержания органического углерода составила 60% и 78% в фильтратах из фоновых и загрязненных подстилок соответственно.

Медь и никель интенсивно накапливались в подстилке фоновой почвы, орошаемой загрязненными осадками. В подстилке загрязненной почвы аккумуляция меди заметно не снижалась, а поглощение никеля подстилкой уменьшалось в 2.5 раза. Также был отмечен интенсивный вынос никеля из минеральной части профиля загрязненной почвы. Возможность миграции меди в почвенном профиле в форме металлорганических комплексных соединений подтверждается данными корреляционного анализа (r=0.60 0.83, p=95%). Миграция никеля в пределах профиля фоновых почв также может происходить в составе комплексных соединений с органическим веществом, причем никель образует комплексы преимущественно с кислоторастворимой фракцией органического вещества в почвенном растворе (r=0.80-0.84, p=95%). В условиях загрязнения миграция никеля зависит от pH почвенного раствора (r=-0.85, p=95%).

Таким образом, в условиях опытов с почвенными монолитами никель проявил более высокую миграционную способность по сравнению с медью. Можно прогнозировать высокую степень опасности загрязнения никелем грунтовых вод. Загрязнение грунтовых вод медью будет происходить с меньшей интенсивностью, но в течение значительно более длительного времени.

Результаты статических адсорбционных экспериментов подтвердили высокую способность подстилок к поглощению ТМ. Минеральные горизонты подзолов характеризуются низкой поглотительной способностью по отношению к металлам. Для защиты грунтовых вод от инфильтрации ТМ и очистки загрязненных почв могут применяться различные сорбенты. Наиболее высокую поглотительную способность по отношению к меди проявили активированный уголь, вермикулит и бентонит.

4. Заключение Настоящие исследования выявили опасность инфильтрации ТМ в грунтовые воды, что неминуемо ведет к снижению качества водных ресурсов Кольского полуострова. В связи с сильным загрязнением почв эта опасность сохраняется даже в случае полного прекращения выбросов горно-металлургического комбината и снижения концентраций поллютантов в атмосферных осадках до фоновых значений. Необходима разработка эффективных методов фиксации ТМ, попавших в почву с атмосферными осадками. Одним из таких методов является использование минеральных сорбентов для поглощения ТМ из почвенного раствора. В зависимости от применяемой технологии, этот метод позволяет также извлекать использованные сорбенты из почвы.

Благодарность Исследования были поддержаны РФФИ (05-04-48460-а), ИНТАС (INTAS 01-2213) и 6-ой Рамочной программой Евросоюза (INCO-CT-2005-013420).

Литература (1) Koptsik, S., Koptsik, G., Livantsova, S., Eruslankina, L., Zhmelkova, T., Vologdina, Zh. Heavy metals in soils near the nickel smelter: chemistry, spatial variation, and impacts on plant diversity (2003) J. Environ. Monit., vol. 5, pp. 441–450.

(2) Копцик Г.Н., Недбаев Н.П., Копцик С.В., Павлюк И.Н. Загрязнение почв лесных экосистем тяжелыми металлами под влиянием атмосферных выбросов комбината «Печенганикель» (1998) Почвоведение, № 8, с. 988-995.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ В БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ Жернаков А.И., Цыганов В.Е.

ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, шоссе Подбельского, 3, Россия alexandr_zhernakov@arriam.spb.ru Ключевые слова: биоремедиация, кадмий, горох (Pisum sativum L.), микоризные грибы (Glomus intraradices Schenck and Smith), клубеньковые бактерии (Rhizobium leguminosarum bv. viciae) 1. Введение В настоящее время загрязнение почв тяжелыми металлами (ТМ) является одной из наиболее серьезных проблем окружающей среды. Через пищевые цепи ТМ из почвы могут поступать в организм человека, приводя к серьезным заболеваниям. К настоящему времени разработан ряд физико-химических технологий, позволяющих производить очистку почвы. Однако многие из них имеют ограниченное применение и высокую стоимость. Наиболее перспективным направлением в данной области признана биоремедиация, основанная на использовании для очистки почв растений и микроорганизмов, характеризующихся повышенными устойчивостью к ТМ и их аккумуляцией. Однако широкое использование биоремедиации также ограничено в настоящее время из-за недостаточности теоретических и практических разработок в данной области.

Новым перспективным направлением в биоремедиации является создание растительно-микробных систем, на основе эндомикоризных грибов и клубеньковых бактерий, которые будут способны не только поглощать ТМ из почвы, но и обогащать ее питательными элементами.

В лаборатории генетики растительно-микробных взаимоотношений ГНУ ВНИИСХМ был получен мутанта гороха SGECdt (1), обладающий повышенной устойчивостью к токсичным концентрациям кадмия и повышенной аккумуляцией кадмия в биомассе. Мутант является перспективной моделью для изучения механизмов устойчивости и механизмов накопления тяжелых металлов растениями, в том числе при становлении и развитии эндомикоризного и азотфиксирующего симбиозов.

2. Материалы и методы Cемена мутанта SGECdt и родительской линии SGE были стерилизованы в концентрированной серной кислоте, промыты стерильной водой и посажены индивидуально (объем сосуда 0,5 дм3) в стерильную песчано почвенную смесь (2:1 объем.) с содержанием кадмия (CdCl2) 20 мкг/кг. Растения мутанта и родительской линий были выращены в 4 вариантах: 1) неинокулированный контроль (cont);

2) инокуляция Rhizobium leguminosarium, штамм CIAM1026 из коллекции ВНИИСХМ (R);

3) инокуляция Glomus intraradices, изолят BEG144 из коллекции ВНИИСХМ (M);

4) совместная инокуляция CIAM1026 и BEG144 (RM).

Растения были выращены в климатической камере HPS2000 (Heraeus Vtch, Германия). В режиме:

день/ночь - 16/8 часов;

относительная влажность 75%;

температура 21оС;

освещенность 490 мкмоль/м2с ( тыс. люкс). Растения были взяты для анализа на 35 день после инокуляции.

3. Результаты и обсуждение Были измерены сухой вес наземной и подземной биомассы растений и количество кадмия в наземной биомассе (таблица 1). Интенсивность бобово-ризобиального симбиоза была охарактеризована по числу клубеньков и их массе на растение. Интенсивность эндомикоризного симбиоза была оценена по интенсивности развития микоризной инфекции корня (M%) и интенсивности развития арбускул (a%) (2) (таблица 2).

Таблица 1: Ростовые параметры мутанта SGECdt и родительской линии SGE содержание кадмия в содержание кадмия в вариант наземная корневая генотип наземной биомассе, наземной биомассе, инокуляции биомасса, мг система, мг мкг/г мкг/растение SGE ± 31 ± 10 ± 2,6 ± 0, 694 153 13,0 6, cont Cdt ± 21 ± 4 ± 1,3 ± 1, 824 178 12,3 10, 2,1b SGE ± 61 ± 11 ± 2,8 ± 685 147 19,8 13, R 19a 0,7a Cdt ± 36 ± ± ± 1, 854 230 16,5 12, b a 0,2a SGE ± 42 ± 12 ± 0,4 ± 747 204 7,0 4, M 11c 0,4b 0,3a Cdt ± 57 ± ± ± 935 277 7,9 7, 49b* 5,3c 1,5c SGE ± ± 6 ± ± 515 129 37,9 19, RM 27a 13a 2,9b 2,6c Cdt ± ± ± ± 925 223 23,3 21, *Средние значения величин в вариантах инокуляции достоверно отличаются от значений величин в варианте неинокулированого контроля с вероятностями P0.05 (a), P0.01 (b), P0.001 (c), соответственно.

Инокуляция клубеньковыми бактериями достоверно увеличила содержание кадмия в растениях (абсолютное значение у родительской линии и концентрацию у мутанта) при этом, фактически не дав прироста в биомассе. Инокуляция эндомикоризным грибом привела к уменьшению аккумуляции кадмия у обеих линий при незначительном приросте наземной биомассы. Наибольший прирост содержания кадмия в растении (более чем в два раза) наблюдался в варианте с двойной инокуляцией. При этом в условиях кадмиевого стресса у родительской линии SGE произошло резкое ингибирование развития наземной части. В то время как у кадмий-устойчивого мутанта масса наземной части достоверно увеличилась.

Таблица 2: Симбиотические параметры мутанта SGECdt и родительской линии SGE число общая масса M, % a, % клубеньков клубеньков SGE ± 1,3 0,291 ± 0, 2, R Cdt ± 5,0 ± 1, 13,3 4, SGE ± - ± - ± 0,40 ± 1, - - 0,40 1, RM Cdt ± 6,2 ± 0,512 ± 4,20 ± 8, 7,4 0,583 22,10 68, SGE ± 3,80 ± 6, 20,20 69, M Cdt ± 4,10 ± 8, 11,40 58, Как и ожидалось, в условиях кадмиевого стресса мутант проявил повышенную устойчивость клубенькообразования, по сравнению с родительской линией. В то же время у мутанта уровень микоризации оказался ниже, чем у родительской линии. Однако мутант и родительская линия дали различный отклик на совместную инокуляцию клубеньковыми бактериями и эндомикоризным грибом. У родительской линии произошло полное ингибирование клубенькообразования и практически полное ингибирование микоризообразования. В то время как у мутанта на фоне небольшого уменьшение количества клубеньков произошло увеличение интенсивности развития микоризной инфекции (M%).

4. Заключение Таким образом, было показано, что совместная инокуляция клубеньковыми бактериями и эндомикоризными грибами приводит к увеличению накопления кадмия в надземной биомассе растений.

Полученные результаты открывают широкие перспективы для проведения дальнейших исследований для создания новых симбиотических систем для биоремедиации почв.

Благодарности Исследование выполнено при финансовой поддержке проектов ИНТАС (01-2170), Администрации Санкт Петербурга (2004, PD04-1/4-230).

Литература (1) Tsyganov et al (2004) Biology of Plant-Microbe Interactions V 4, pp 506-509.

(2) Trouvelot et al (1986) Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizae, pp 217-221.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОУГЛЕРОДА СРЕДИ ОСНОВНЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ У БАКТЕРИЙ RALSTONIA EUTROPHA B5786 ПРИ АККУМУЛЯЦИИ И ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДЕГРАДАЦИИ ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА Жила Н.О.

Институт биофизики СО РАН, 660036, Красноярск, Академгородок, Россия natasha@ibp.ru Ключевые слова: полигидроксибутират, синтез, деградация 1. Введение Синтез полигидроксиалканоатов, среди которых наиболее распространенным является полигидроксибутират (ПГБ), происходит при несбалансированном росте, т.е. при дефиците минеральных элементов, главным образом, азота и фосфора, а также при дефиците кислорода. Интерес к этим полимерам обусловлен биосовместимостью, биоразлагаемостью, термопластичностью, пьезоэлектрическими свойствами.

К настоящему времени установлено, что способностью к синтезу ПГБ обладают многие бактерии, среди которых наиболее хорошо изучен путь биосинтеза ПГБ у Ralstonia eutropha (ранее Alcaligenes eutrophus), начинающийся с конденсации двух молекул ацетил-CoA до ацетоацетил-CoA, который затем восстанавливается до R-3-гидроксибутирил-CoA, далее включающийся в полимерную цепь. Не менее важной, но в меньшей степени изученной, является внутриклеточная деградация ПГБ, происходящая в условиях, противоположных накоплению полимера, а именно при высокой концентрации источника азота и/или отсутствии источника углерода, и заключается в разрушении ПГБ до мономеров D(-)-3-гидроксибутирата, которые далее превращаются в ацетоацетат и далее с образованием ацетил-КоА (1).

Какими путями и на что расходуются продукты эндогенной деградации ПГБ, из анализа новейшей литературы четкого ответа сформулировать не представляется возможным. Публикаций, посвященных анализу метаболических путей цикла ПГБ с применением меченого субстрата, крайне мало. Авторы (2), исследовав включение метки Alcaligenes eutrophus NCIB 11599, показали, что динамика включения метки в полимер аналогична биомассе. При исследовании закономерностей образования сополимеров С4/С метилотрофными бактериями в присутствие меченых по углероду ко-субстратов (пропионата и валерата) показано, что количество радиоуглерода в полимере от общей радиоактивности, найденной в биомассе, может составлять от 16 до 92% (3). Других работ по данному вопросу в доступной литературе не обнаружено.

Поэтому целью данной работы было исследование эндогенной деградации полимера и определения путей миграции и локализации образующихся при этом углеродсодержащих продуктов у бактерии R.eutropha B5786.

2. Материалы и методы Культивирование бактерий R. eutropha B5786 проводили в колбах объемом 1 л на минеральной среде Шлегеля (Schlegel et al., 1961). В качестве углеродного субстрата использовали ацетат натрия (7.5-8.0 г/л). В растущую суточную культуру вносили меченый углеродный субстрат 1,2-14С-ацетат (0.02 мкКи/мл) и сразу отбирали пробы для анализов;

следующие - через 30 мин, 1 час и 2 часа. Далее отбор проб производили через каждые 10-14 ч до конца эксперимента. Проанализирована динамика радиоактивности биомассы, липидов, полимера и остаточной «активной» биомассы (биомасса за исключением липидов и полимера). Содержание полимера в биомассе определяли хроматографией метиловых эфиров жирных кислот после метанолиза проб сухой биомассы на хромато-масс-спектрометре GSD plus (“Hewlett Packard”, США). В качестве внутреннего стандарта использовали бензойную кислоту. Липиды и полимер из биомассы выделяли смесью хлороформа и этанола (2:1, по объему). Полимер отделяли от липидов осаждением двойным объемом гексана. Биомассу, полимер, липиды и «активную» биомассу, предварительно взвешенные, помещали во флаконы с 10 мл сцинтилляционного раствора (10 г 2,5 – дифенилоксазола, 0.25 г 1,3-ди-2,5-фенилоксазолил бензола, 100 г нафталина в 1 л диоксана).

3. Результаты и обсуждение Для анализа динамики эндогенной деградации полимера и определения путей миграции и локализации образующихся при этом углеродсодержащих продуктов бактерии R.eutropha B5786 выращивали в специализированном режиме, позволившем организовать смену направленности синтеза основных (азотсодержащие компоненты) и запасных (липиды, полигидроксибутират) клеточных макромолекул (рис. 1).

I II III +NH4Cl +1,2-1 4 С-ацетат 8 общий азот, % к биомассе полимер, % к биомассе биомасса, г/л;

Рис.1. Динамика содержания биомассы, полимера и 4 азотсодержащих веществ в бактериях Ralstonia eutropha B5786. 1 – биомасса, 2 – полимер, 3 – общий азот;

I – этап накопления полимера, II – этап внутриклеточной деградации 3 полимера, III – этап ресинтеза полимера. Стрелками 0 показано добавление в культуру 1,2-14С-ацетата и хлорида 0 32 64 96 128 160 192 224 аммония.

часы Через 2 ч после добавления в культуру 1,2 14С-ацетата распределение метки среди фракций макромолекул было следующим: около 80 % радиоуглерода от включившегося в биомассу найдено в полимере, чуть менее 20 % - во фракции азотсодержащих компонентов и около 2-4 % - в липидах (рис.2). В течение последующих 112 ч произошло увеличение биомассы примерно в 2,5 раза, отражающее в основном увеличение внутриклеточного пула полимера (с 50 до 88 %) на фоне падения концентрации азотсодержащих веществ (от 5.5 до 1.4-1.6 %). Это сопровождалось перераспределением радиоуглерода: произошло увеличение 14C во фракции «активной биомассы» (от 18 до 80%) на фоне снижения 14C во фракции полимера (до 16%).

Значительное снижение радиоактивности фракции полимера была вызвано, главным образом, тем, что синтез полимера реализовался за счет имеющегося в культуре не меченого ацетата.

После добавления в среду азота (136 ч опыта) начался второй этап эксперимента, в ходе которого были созданы условия для оптимального роста клеток, сопровождающегося деградацией полимера. К концу второго этапа (218 ч эксперимента), когда содержание полимера снизилось до 35 %, доля радиоуглерода в полимере снизилась до 10 % и увеличилась до 87 % в активной биомассе. В липидах доля радиоуглерода от общего количества радиоактивности в биомассе практически не изменялась и сохранялась на уровне 2.5-5.0 %.

На третьем этапе (начиная с 218 ч) после исчерпания минерального азота в культуре снова были созданы условия для накопления в клетках ПГБ, что сопровождалось перераспределением радиоуглерода. На фоне падения содержания общего азота (с 4.5 до 1.0-2.0 %) доля радиоуглерода в этой фракции снизилась с 87 % до 30 %, а в ПГБ, содержание которого выросло с 35 до 65%, напротив, увеличилась от 10 до 65 %. Таким образом, потоки углерода из системы синтеза основных соединений снова перераспределись на образование ПГБ.

100% 80% липиды полимер 60% активная биомасса 40% 20% 0% Рис. 2. Распределение радиоуглерода среди фракций 25 50 98 112 136 170 218 биомассы бактерий Ralstonia eutropha B часы 4. Заключение Таким образом, изменяющиеся ростовые условия существенно влияли на соотношение полимера и общего азота в клетках, не затрагивая при этом содержания липидов и углеводов, уровень которых в течение всего эксперимента составлял 5-7 %. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что при эндогенной деградации ПГБ образуемые при этом углеродсодержащие продукты направляются главным образом на синтез азотсодержащих веществ и в очень незначительной доле – на образование липидов. При последующем культивировании бактерий в режиме ресинтеза ПГБ потоки углерода из системы синтеза основных соединений снова перераспределись на образование полимера.

Благодарности Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования Российской Федерации и Амери канского фонда гражданских исследований и развития для молодых ученых по программе «Фундаментальные исследования и высшее образование» грант № Y1-B-02-08 и гранта Президента Российской Федерации для поддержки молодых ученых – кандидатов наук и их научных руководителей (MK 7999.2006.4).

Литература (1) Anderson A.J., Dawes E.A. (1990) Microbiol. Rev., 54, 450-472.

(2) Haywood G.W., Anderson A.J., Dawes E.A. (1989) FEMS Microbiol. Lett., 57, 1-6.

(3) Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А.(1997) Прикладная биохимия и (4) микробиология, 33, 397-402.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ КЛЮЧЕВОГО СИМБИОТИЧЕСКОГО ГЕНА SYM37 ГОРОХА ПОСЕВНОГО PISUM SATIVUM L.

Жуков В.А.1,2, Тихонович И.А.1, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург - Пушкин, ш. Подбельского, 3, Россия Санкт-Петербургский Государственный Университет, 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Россия zhukoff01@yahoo.com Ключевые слова: симбиоз, микросинтения, бобовые 1. Введение Большинство генов гороха (Pisum sativum L.), контролирующих развитие азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями, были идентифицированы с применением методов химического мутагенеза, поэтому определение их нуклеотидных последовательностей является дополнительной научной задачей.

Одним из возможных путей ее решения является использование синтении геномов модельных и хозяйственно ценных бобовых растений (Kalo et al., 2004;

Zhu et al., 2005).

В последние несколько лет по гомологии с генами модельных бобовых диплоидной люцерны (Medicago truncatula Gaertn.) и лядвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) K. Larsen) (Stougaard, 2001) были клонированы 7 генов гороха, вовлеченных во взаимодействие с клубеньковыми бактериями (Тихонович и др., 2005). Эти факты демонстрируют, что использование синтении геномов бобовых растений действительно является продуктивным подходом для секвенирования симбиотических генов гороха.

Идентификация первичных последовательностей ключевых симбиотических генов позволяет пролить свет на их биохимические и физиологические функции. В то же время выявление комплексов симбиотических генов, влияющих на хозяйственно ценные признаки, позволяет вести научно обоснованную селекцию культурных бобовых растений (Provorov et al., 2002) и, в будущем, переносить наиболее удачные сочетания симбиотических генов в генотипы культурных сортов бобовых растений. В целом понимание механизмов управления развитием симбиотической системы позволит сформулировать принципы создания эффективных растительно-микробных систем.

Таким образом, развитие исследований в данном направлении, несомненно, является перспективным и необходимым как с позиций фундаментальной академической науки, так и с более «популярной» ныне позиции ее прикладных аспектов.

2. Материалы и методы Поиск генов гороха, гомологичных Nfr1 лядвенца японского, был осуществлен на обогащенной кДНКовой библиотеке корневых волосков гороха с использованием 1 экзона Nfr1 в качестве меченой пробы.

В работе были использованы линии гороха RisNod4 (Engvild, 1987) и К24 (Postma et al., 1988), несущие мутацию в гене sym37 (Borisov et al., 2004), а также исходные линии (Finale и Rondo, соответственно).

Тотальная ДНК была выделена из молодых листьев растений согласно стандартному протоколу с использованием CTAB-буфера (Torres et al., 1993), незначительно модифицированному в лаборатории.

Полимеразная цепная реакция проводилась в амплификаторе Peltier Thermal Cycler PTC-200, DNA Engine, на геномной ДНК линий гороха. Последующее прямое секвенирование ПЦР-фрагментов проводилось на аппарате ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Обработка результатов и сборка итоговых последовательностей была осуществлена с использованием пакета программ Sequencher 2.0.6.

Анализ нуклеотидных последовательностей проводился с использованием возможностей серверов NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и EBI (www.ebi.ac.uk).

3. Результаты и обсуждение На основании анализа фенотипа мутантов и данных генетического картирования было высказано предположение, что ортологом гена sym37 гороха является уже секвенированный ген Nfr1 лядвенца (Radutoiu et al., 2003). Гибридизация меченой пробы с кДНКовой библиотекой выявила 2 гена гороха, гомологичных Nfr1. На основании секвенированных последовательностей этих кДНК были созданы праймеры, позволяющие специфически амплифицировать участки этих генов на геномной ДНК линий гороха. Последующее секвенирование участков генов, сборка их в итоговые последовательности и сравнение генов у мутантных и родительских линий позволили обнаружить однонуклеотидные замены в первичной последовательности одного из генов-кандидатов. На основании нуклеотидных последовательностей обоих генов были созданы молекулярные маркеры, и анализ их наследования показал, что оба они не демонстрируют рекомбинации с мутантным фенотипом в пределах выборки из 52 растений F2. Оба эти факта свидетельствуют, что один из секвенированных гомологов Nfr1 у гороха является ранее идентифицированным геном sym37.

Компьютерный анализ нуклеотидных и соответствующих им белковых последовательностей показал, что предполагаемый продукт гена sym37, как и Nfr1 лядвенца, представляет собой рецептор-подобную Ser/Thr киназу, играющую ключевую роль в специфическом распознавании бактериального Nod-фактора. Эта киназа несет в своем составе 2 LysM-мотива, которые, предположительно, могут связываться с липохитоолигосахаридной молекулой Nod-фактора, и киназный домен, отвечающий за передачу сигнала в ядро клетки, вероятно, через взаимодействие с другими киназами. Однонуклеотидные замены, обнаруженные в первичной последовательности гена sym37, приводят в одном случае к изменению аминокислоты в рецепторном домене белка, а в другом – к появлению преждевременного стоп-кодона в киназном домене. Оба эти изменения лишают белок его функции, что свидетельствует, в частности, о важности структуры рецепторного домена для распознавания Nod-фактора.

4. Заключение Ген sym37 гороха посевного, как и ортологичный ген Nfr1 лядвенца японского, кодирует Ser/Thr рецептор подобную киназу, являющуюся ключевым белком, вовлеченным в сигнальные взаимодействия между бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями. Результат проделанной работы подтверждает возможность использования микросинтении геномов бобовых растений для секвенирования симбиотических генов гороха и является новым шагом в познании становления и функционирования азотфиксирующего бобово-ризобиального симбиоза. Понимание же деталей и механизмов управления развитием симбиотической системы позволит в ближайшем будущем сформулировать принципы создания эффективных растительно микробных систем.

Благодарность Исследование поддержано грантами COB (Travelling Fellowship), РФФИ (04-04-48457-а), НШ-1103.2003.04, CRDF (ST-012-0), ИНТАС (01-2322).

Литература (1) Kalo P., et al. (2004) Mol Gen Genomics, 272, 235-246.

(2) Zhu H., et al (2005) Plant Physiol., 137, 1189–1196.

(3) Stougaard J. (2001) Curr. Opin. Plant Biol., 4, 328-335.

(4) Тихонович И.А., и др. (2005) Успехи современной биологии, 125 (3), 227-238.

(5) Provorov N.A., et al. (2002) J. Theor. Biol., 214, 215-232.

(6) Engvild K.J. (1987) Theor. Appl. Genet., 74, 711-713.

(7) Postma J.G. et al. (1988) J. Plant Physiol., 132, 424-430.

(8) Borisov A.Y., et al. (2004) Biologia, 59 (13), 137-144.

(9) Torres A.M. et al. (1993) Theor. Appl. Genet., 85, 937-945.

(10) Radutoiu S., et al. (2003) Nature, 425, 585-592.

МЕТОД ДЕТЕКЦИИ АКТИВНОСТИ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ FRET МЕЖДУ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ GFP ПОДОБНЫМИ БЕЛКАМИ.

Захарова М.Ю.

Институт Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Российская Федеpация, Москва, 117997, ул. Миклухо-Маклая, 16/ Ключевые слова: сибирская язва, летальный фактор, FRET, флуоресцентные белки.

Летальный фактор (ЛФ) является эффекторной субъединицей токсина сибирской язвы. ЛФ представляет собой цинк-зависимую эндопептидазу. Известно, что она расщепляет митогенактивируемые серин треониновые киназы. Для предотвращения действия ЛФ в процессе инфекции сибирской язвы необходимо создание сильных ингибиторов для этой протеазы. Важно иметь чувствительную аналитическую систему детекции активности ЛФ для оценки действия ингибиторов. Мы разработали дешевую и простую технологию для быстрого определения активности ЛФ с использованием Флуоресцентного Резонансного Переноса Энергии (FRET) между флуоресцентными GFP подобными белками. Была создана генетическая конструкция, содержащая гены цианового и желтого флуоресцентного белка, составляющих эффективную FRET пару.

Нуклеотидные последовательности для нескольких известных пептидных субстратов ЛФ были помещены между FRET партнерами. Разрезание таких химерных белков протеазой приводит к пространственному удалению двух флуорофоров и к исчезновению FRET. Кинетические константы для трех субстратов были посчитаны. Был проведен сравнительный анализ кинетических параметров для разных субстратов. Мы предполагаем, что описанная технология может использоваться для широкомасштабного скрининга ингибиторов и поиска новых потенциальных субстратов для ЛФ 1. Введение Токсин сибирской язвы принадлежит к семейству бинарных токсинов. Он состоит из протективного антигена (ПА), рецептор-связывающей субъединицы, ответственной за интернализацию токсина, и двух взаимозаменящих друг друга энзиматических субъединиц – летального фактора (ЛФ) и отечного фактора (ОФ). Летальный токсин – комплекс ПА и ЛФ – является первичной причиной токсического шока и смерти клеток при сибирской язве.

В последние годы много сил тратится на разработку низкомолекулярных ингибиторов ЛФ, которые могут рассматривать как основа для лекарств при сибирской язве. Для проведения широкомасштабного скринига ингибиторов необходимо наличие чувствительной и дешевой тест-системы. Одной из проблем, возникших при разработке такой системы, явился тот факт, что ЛФ неэффективно разрезает пептидные субстраты, полученные из нативных природных мишеней (МКК киназ).Недавно, оптимизированные флуоресцентные пептидные субстраты были применены для скрининга ингибиторов ЛФ[1],[2].Наилучший из данных субстратов обладал ~ в 100 раз большей скоростью разрезания по сранению с нативным пептидом и был пригодным для широкомасштабного скрининга ингибиторов. Однако, использование больших количеств химически модифицированных пептидов длиной более 10 аминокислот в масштабных скринигах очень дорого. С другой стороны, ЛФ является относительно слабой протеазой, для которой необходимо узнавание окружающих сайт разрезания последовательностей. В этой связи, использование генно-инженерных субстратов может быть более экономичным, так как это предоставляет возможность нарабатывать их в E.coli.

в растворимой форме в больших количествах, а чувствительность таких субстратов вполне сравнима с описанными пептидами. Мы разработали систему детекции ЛФ, основанную на явлении FRET между двумя флуоресцентными белками, связанными друг с другом коротким линкером. Недавно был создан новый циановый белок PS-CFP2 [4]. Максимум его спектра возбуждения был 402 нм. Было показано, что PS-CFP эффективный донор флуоресцентной энергии для желтого белка phiYFP (Евроген, Россия). Максимум спектра флуоресценции phiYFP - 538 нм, спектры возбуждения двух белков практически не перекрываются.

Основываясь на этом мы выбрали PS-CFP2 и phiYFP в качестве FRET пары для детекции активности ЛФ.

2. Материалы и методы Последовательность, кодирующая домены ЛФ 2-4, была амплифицирована с ДНК Bacillus anthracis Sterne при помощи ПЦР и клонирована в вектор на основе pET22B после гена глутатион-С-трансферазы (ГСТ).

Химерный белок ГСТ-ЛФ был экспрессирован в штамме E.coli Bl21DE3 и очищен с помощью хроматографии на глутатион-сефарозе.

Вектор для клонирования PS-CFP2 - phi-YFP FRETбыл был сконструирован на основе pQE30(QIAgen).Между генами белков были вставлены нуклеотидные последовательности (48 нп, 16 аа) для разных пептидных субстратов ЛФ. Химерные белки были наработаны в штамме Bl21. После того, как клеточная культура, росшая на 37 градусах, достигала OD (600)=0,6, клетки инкубировались 24 часа на комнатной температуре для созревания хромофоров у флуоресцентных белков. Очистка химерных белков в одну стадию проводилась с помощью металл-хелатной хроматографии.

Измерение активности ЛФ проводилось в черных 96-луночных плашках с помощью плашечного флуориметра TECAN Genious. Концентрация субстратов изменялась от 1 до 50 мкМ, концентрация ЛФ была 1 нМ 3. Результаты и обсуждения Три пептидных субстрата, представленных в работе [5] были выбраны в качестве модели для оценки применимости системы из флуоресцентных белков для детекции активности ЛФ (см таблицу 1). Были подобраны оптимальные условия для анализа активности ЛФ в данной системе. С одной стороны известно, что активность ЛФ понижается при увеличении ионной силы раствора [3], с другой, в низкосолевых условиях флуоресцентные химерные белки могут агрегировать из-за склонности к димеризации phiYFP. С учетом этого, оптимальным был выбран реакционный буфер, содержащий: 30mM Tris-HСl (pH 7,5), 100mM NaCl & 0,1 mM CaCl2. Было исследовано ингибирование активности ЛФ с помощью EGTA. Результаты приведены на Рис. 1.

Контрольный интактный субстрат №3 (Таб. I) имеет наибольшее значение флуоресценции при 538 нм (желтая линия). Субстрат, обработанный ЛФ, практически полностью протеолизован и дает минимальное значение флуоресценции при 538 нм (LF, зеленая линия). Ингибирование активности ЛФ агентом, связывающим двухвалентные металлы, ведет к практически полному восстановлению флуоресценции. Три субстрата для ЛФ (Table I, Turk) с известными параметрами были использованы для кинетических экспериментов в составе химерных флуоресцентных конструктов. В качестве контроля использовались интактный и полностью протеолизованный белковые конструкты (см рис 2). Кинетические параметры для трех субстратов были определены: построены кривые Михаэлиса (рис 3) и определены кинетические константы протеолиза (Tаб I).

Эффективность разрезания субстратов в составе флуоресцентного белка несколько ниже, чем свободных пептидов в работе [5].Это может быть связано с разными способами выделения и очистки ЛФ, оказывающими влияние на удельную активность протеазы., а также с возможными стерическими затруднениями связывания ЛФ и субстрата в составе химерного конструкта. В то же время, кинетические параметры разрезания субстратов в составе химерных белков сравнимы с полученными для субстрата, использованного для скрининга ингибиторов ЛФ (субстраты №4 и №5 [6]).Следовательно, может быть сделан вывод о том, что данная методика пригодна для исследования ингибиторов ЛФ.

Рис. 1:Детекция активности ЛФ с использованием Рис. 2: Исследование кинетики действия ЛФ на fret системы из двух белков. мкМ fret субстрата №2 (таб1).

d 100 control Fluorescence, AU Fluorescence, AU LF 80 LF LF+EGTA 60 40 500 intact 0 0 2000 4000 cleaved 450 500 550 600 Time, sec Wavelength, nm Рис. 3: Кривая Михаэлиса-Ментен для разрезания ЛФ субстрата № 2 (таб1) 3 e - Rate (M/s) 3 e - 2 e - 2 e - 1 e - 5 e -1 0 1 e -6 2 e -6 3 e -6 4 e -6 5 e - [S u b s tra te ] (M ) Высокая растворимость химерных флуоресцентных белков, их спектральные характеристики, эффективность FRET между белками позволяет проводить измерение активности ЛФ и тестирование различных субстратов. В отличие от большинства пептидных субстратов, которые не проходят через клеточную мембрану или быстро деградируют в эукариотической клетке, генетически кодируемые флуоресцентные химерные белки, содержащие субстраты для ЛФ, могут быть перенесены в систему, пригодную для экспрессии в клетках млекопитающих. Таким образом, разработанный субстрат может быть использован для для анализа действия ингибиторов ЛФ в эукариотической клеточной культуре.

Таблица 1: Кинетические характеристики субстратов для ЛФ Kcat/Km, M-1s- Аминокслотная последовательность Km, mkM Kcat/Km, # M-1s-1, #1-3 [5]и #4-5[6] субстратов (данное иследование) (данное иследование) 1 -KKVYPYPME- 16.5 2.54e4 6e 2 -KKVAPYPME- 4.87 9.5e4 1,3e 3 -RRKKVYPYPME- 0.157 1.99e5 4e 4 ACM-LARRRPVLP-PNA - - 1e 5 ACG-YBARRRRRRRRVLR-PNA - - 6,5e Литература (1) Cummings, R.T., et al., A peptide-based fluorescence resonance energy transfer assay for Bacillus anthracis lethal factor protease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(10): p. 6603-6.

(2) Mock, M. and B.P. Roques, Progress in rapid screening of Bacillus anthracis lethal factor activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(10): p. 6527-9.

(3) Tonello, F., P. Ascenzi, and C. Montecucco, The metalloproteolytic activity of the anthrax lethal factor is substrate inhibited. J Biol Chem, 2003. 278(41): p. 40075-8.

(4) Chudakov, D.M., et al., Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol, 2004. 22(11): p.

1435-9.

(5) Turk, B.E., et al., The structural basis for substrate and inhibitor selectivity of the anthrax lethal factor. Nat Struct Mol Biol, 2004. 11(1): p. 60-6.

(6) Tonello, F., et al., Screening inhibitors of anthrax lethal factor. Nature, 2002. 418(6896): p. 386.

КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И РЕФОЛДИНГ РЕКОМБИНАНТНЫХ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА Иванов А.В.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева 8, Россия ai2003@front.ru Ключевые слова: рекомбинантные рибосомные белки человека, биореактор “БИОК” 1. Введение Рибосомные белки (р-белки) являются структурными компонентами рибосомы – уникального рибонуклеопротеидного комплекса, осуществляющего синтез белков в клетке. Кроме этого, многие рибосомные белки выполняют внерибосомные функции, т.е. функции, несвязанные с синтезом белков на рибосоме. К настоящему времени получены данные об участии р-белков в клеточном ответе на вирусные инфекции и в понижении чувствительности злокачественных опухолей к химиотерапии. Например, р-белок L22 может связывать РНК EBER-1 вируса Эпстейна-Барр, а р-белки SA, S3, S5, S7 и S18 – РНК вируса гепатита С;

сверхэкспрессия генов р-белков S13, L23 и L6 в раковых клетках желудка человека понижает чувствительность этих клеток к противораковым препаратам. Приведенные примеры свидетельствуют о том, что данные, полученные при изучении структуры и функции р-белков человека, могут быть использованы в разработке противовирусных и противоопухолевых препаратов. Такие исследования требуют больших количеств охарактеризованных индивидуальных р-белков, в свете чего разработка метода препаративного получения рекомбинантных р-белков является принципиально важной. В представленной работе, выполненной в Лаборатории структуры и функции рибосом Института химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) СО РАН, выполнено клонирование, экспрессия и рефолдинг р-белков человека и изучена их структурная стабильность.

2. Материалы и методы Штаммы-суперпродуценты р-белков S3, S5, S10, S13, S16, S17 и S26 получены, как описано в (1).

Нуклеотидные последовательности ДНК р-белков в соответствующих экспрессионных векторах проверены секвенированием на ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) в Межинститутском центре секвенирования (СО РАН, Новосибирск). Культивирование клеток проводили в вихревом биореакторе “BIOK” (ЗАО “Саяны”, Новосибирск, Рассия) в Лаборатории генной терапии Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (2). Очистка, рефолдинг и анализ рекомбинантных р-белков выполнены, как описано в (1, 3).

3. Результаты и обсуждение кДНК р-белков S3, S5, S10, S13, S16, S17 и S26 человека клонировали в экспрессирующий вектор pET-15b с помощью стандартных молекулярно-биологических процедур. В случае кДНК белка S26 аргининовый кодон AGA в тандеме двух редких аргининовых кодонов 13-AGGAGA-18 заменяли аргининовым кодоном CGC, который чаще встречается в геноме E.coli.

Полученные плазмиды экспрессировали в клетках E.coli BL21(DE3). Клетки наращивали в 7 л среды LB, содержащей ампицилин (100 мг/л), с помощью вихревого биореактора “BIOK” (Рис. 1), для которого характерны высокая эффективность и низкая стоимость производства и пониженный риск разрушения продукта. Наращивание клеток проводили при 37оС до достижения поглощения А600=0.6, после чего индуцировали синтез рекомбинантного белка, добавляя в среду изопропил--D-тиогалактопиранозид до 1мМ концентрации. Затем клетки наращивали еще в течение 3 ч и осаждали с помощью центрифугирования. Во всех случаях получали около 15 г биомассы. Результаты анализа суммарного клеточного белка показаны на Рис. 2 (дорожка 1). Количество рекомбинантного Рис. 1. Принципиальная белка, синтезированного в каждом случае, составляло около 10-20% от общего схема биореактора количества клеточных белков. Все рекомбинантные белки образовывали тельца “BIOK”. включения (Рис. 2, дорожка 2). Белки выделяли с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе (Рис. 2, дорожка 3). Р-белок S3 дополнительно очищали от соэкспрессирующегося низкомолекулярного полипептида с помощью гель-фильтрациии на колонке “Superdex-75”. Для рефолдинга р-белков (кроме S5) использовали ступенчатый диализ против буферов, содержащих понижающуюся концентрацию гуанидин гидрохлорида. Рефолдинг S5 проводили с помощью быстрого разбавления раствора белка буфером, не содержащим гуанидин гидрохлорида. Конечная концентрация белков варьировала от 9 до 28 мг на литр клеточной культуры. Полученные рекомбинантные белки характеризовали с помощью двумерного (2D) гель-электрофореза (Рис. 3) в системе, которая обычно используется для разделения р-белков. Рекомбинантный белок S26 дополнительно анализировали иммуноблотингом, используя антисыворотку против S26, выделенного из 40S субчастицы рибосомы человека (Рис. 4). Для анализа эффективности рефолдинга вторичные структуры р-белков S13 и S16 анализировали с помощью КД-спектроскопии и гель-электрофореза в градиентном ПААГ. Показано, что в случае р-белка S 43±5% первичной структуры белка образуют -спирали, а 11± 3% - -структуры, а в случае р-белка S16 - 21± и 24.3±3%, соответственно.

Рис. 2. Анализ экспрессии и очистки рекомбинантных белков электрофорезом в 14%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS. Дорожка 1 – суммарный клеточный белок, дорожка 2 - белки из телец включения, дорожка 3 –белки, выделенные с помощью хроматографии на Ni-NTA агарозе. TP40 – суммарный 40S р-белок.

Рис. 3. Анализ рекомбинантных р-белков с помощью 2D гель-электрофореза (1-ое направление – шелочные условия, 2-ое направление – в присутствии SDS). Панель A: рекомбинантные р-белки, панель В – те же белки в присутствии суммарного 40S р-белка.

Рис. 4. Анализ рекомбинантного S26 с помощью специфичной антисыворотки.

Дорожки 1 и 2 - суммарный 40S р-белок. Дорожки 3 и 4 – рекомбинантный S26.

Дорожки 1 и 3 окрашены Ponceau S, дорожки 2 и 4 – обработаны специфичной антисывороткой.

4. Заключение Разработан простой протокол для препаративного получения рекомбинантных рибосомных белков человека в клетках E.coli. Эти белки могут быть использованы в исследованиях, касающихся разработки противовирусных и противоопухолевых препаратов нового поколения.

Благодарность Автор выражает благодарность Г.Г. Карповой за научное руководство и А.А. Малыгину за помощь в проведении настоящей работы, а также Н.П.Мертвецову и Ю.А. Рамазанову за предоставление биореактора “BIOK”. Выполнение работы поддержано грантами СО РАН для молодых ученых № 92 (А.В. Иванов) и РФФИ № 05-04-48393 (А.А. Малыгин).

Литература (1) Malygin A.A. et al. (2003) Protein Express. Purif., 28, 57-62.

(2) Кислых В.И. и др. (2001) Биотехнология, № 3, 72-79.

(3) Malygin A.A., Parakhnevitch N.M., Karpova G.G. (2005) Biochim. Biophys. Acta, 1747, 93-97.

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И СЕНСОРЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Иванова А.В.

Уральский государственный экономический университет, 620219, г. Екатеринбург, ул.8 Марта, 62,Россия.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |
 



 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.