авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

«Международная Школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» организована Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН в рамках Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотруд- ничества в ...»

-- [ Страница 4 ] --

Ключевые слова: гибридная Mn-пероксидаза, медиаторы, биодеградация Mn-пероксидаза продуцируется во внешнюю среду некоторыми грибами-базидиомицетами и является одним из ключевых ферментов участвующих в разложении полимерного лигнина. Активность Mn пероксидазы полностью зависит от наличия Mn2+, который окисляется ферментом до Mn3+, который, будучи сильным окислителем, далее окисляет различные вещества. Другой лигнинолитический фермент, гибридная Mn-пероксидаза, способна окислять как Mn2+, так и органические вещества в отсутствии Mn2+. Ни Mn пероксидаза, ни гибридная не способны окислять устойчивые нефенольные соединения в Mn2+-зависимой реакции. Для другой оксидоредуктазы – лакказы были найдены особые соединения, - медиаторы, в присутствии которых лакказа приобретала способность окислять устойчивые субстраты. Однако, несмотря на то, что и для Mn-пероксидаз были описаны специальные реакции с участием перокси-радикалов жирных кислот и тиил-радикалов, образуемых из соединений, SH-группы, эффект «лакказных» медиаторов в реакциях пероксидаз не изучался. Целью представленной работы было изучение реакций окисления устойчивых нефенольных соединений в присутствии синтетических «лакказных» медиаторов гибридной (поливалентной) Mn-пероксидазы гриба Panus tigrinus. Для проведения работы был разработан метод получения высокочищенного препарата фермента (Rz=6,0), были получены стабильные интермедиаты и изучены их спектральные свойства. В результате проведенной работы впервые были изучены «медиаторные» реакции гибридной Mn-пероксидазы с устойчивыми соединениями. Для демонстрации большого значения таких реакций в биотехнологии было изучено окисление устойчивого ксенобиотика 2,4,6-трихлорфенола в присутствии медиатора – 1-гидроксибенотриазола.

Mn-пероксидаза, выделенная из культуральной жидкости гриба Panus tigrinus, как и Mn-пероксидазы других грибов, демонстрировала H2O2-зависимое окисление Mn2+ до Mn3+ с образованием комплексов Mn3+ малонат и H2O2- и Mn2+-зависимое окисление фенолов: гидрохинона, гваякола, 2,6-диметоксифенола, 2,4,6 трихлорфенола;

ароматических аминов: p-фенилендиамина, o-дианизидина;

АБТС. Однако, в отсутствие Mn2+ этот фермент катализировал H2O2-зависимое окисление АБТС, p-фенилендиамина, o-дианизидина, гидрохинона и 2,6-диметоксифенола аналогично классической пероксидазе хрена или лигнинпероксидазе, что указывает на принадлежность фермента к гибридным Mn-пероксидазам. В присутствии Mn2+ скорость окисления этих субстратов резко возрастала. Гваякол и 2,4,6-трихлорфенол без марганца не окислялись. Такое нефенольное соединение как вератровый спирт не окислялся гибридной Mn-пероксидазой ни в присутствии марганца, ни в его отсутствии. Для выяснения вопроса, окисляются ли Mn2+ и органический субстрат в одном или нескольких каталитических центрах фермента, был проведён ингибиторный анализ реакции окисления этих субстратов. Ионы Cd2+ являлись конкурентным ингибитором окисления Mn2+, но ингибирования окисления органического субстрата – АБТС, не наблюдалось. Это указывает на возможное окисление Mn2+ и органического субстрата в разных активных центрах фермента.

Поскольку вератровый спирт не являлся субстратом гибридной Mn-пероксидазы и не окислялся Mn3+, это вещество было выбрано в качестве тестового субстрата в реакциях с участием медиаторов. В качестве потенциальных медиаторов для P. tigrinus, использовали соединения, известные в качестве медиаторов лакказ АБТС, ТЕМПО, 4-OH-ТЕМПО, виолуровую кислоту, 1-гидроксибенотриазол, гидроксибензотриазин и гидроксиантраниловую кислоту, пирокатехин, гваякол и 3,4-дигидроксифенилаланин. Mn2+-Зависимая активность гибридной Mn-пероксидазы увеличивалась в присутствии в реакционной смеси некоторых гидрокси- и дикарбоновых кислот. Поэтому, реакции с участием медиаторов проводились в трёх буферных системах: ацетатной, тартратной, малонатной.

Из числа проверенных соединений только 1-гидроксибенотриазол, гидроксибензотриазин и, в небольшой степени, виолуровая кислота проявили свойства медиаторов в реакциях окисления вератрового спирта. За 24 ч реакции гибридной Mn-пероксидазы с вератровым спиртом в присутствии 1-гидроксибенотриазола или гидроксибензотриазина окислялось до 99% целевого субстрата. В отсутствие Mn2+ гибридная Mn-пероксидаза почти не окисляла вератровый спирт – только в ацетатной буферной системе обнаруживали до 6% вератрового альдегида. Поэтому, мы проверили возможность окисления вератрового спирта искусственным Mn3+ в присутствии медиаторов. Оказалось, что Mn3+ацетат был способным замещать систему гибридная Mn пероксидаза /H2O2/Mn2+ в такой реакции. Эти результаты показывают, что эффективное окисление медиатора до реакционноспособного радикала происходило только в присутствии Mn3+.

В условиях избытка концентрации вератрового спирта и Mn3+-ацетата количество образовавшегося вератрового альдегида линейно зависело от количества внесённого 1-гидроксибенотриазола или гидроксибензотриазина. При этом наблюдалось невысокое стехиометрическое соотношение вератровый альдегид : медиатор, составлявшее примерно 1,5 : 1,0 для реакции в малонатном, тартратном буферах и 4,0 :

1,0 – в ацетатном буфере. Низкое стехиометрическое соотношение медиатор/вератровый альдегид указывает на то, что реакция 1-гидроксибенотриазола или гидроксибензотриазина с вератровым спиртом не является циклической. В качестве продуктов трансформации 1-гидроксибенотриазола или гидроксибензотриазина в реакционных смесях обнаруживали их дегидроксилированные производные - бензотриазол и бензотриазин соответственно. Таким образом, медиаторы не являлись в данной реакции катализатором, и радикал медиатора после взаимодействия с вератровым спиртом восстанавливается не обратно в ГБТ или ГБТО, а в бензотриазол и бензотриазин, соответственно.

Была проведена реакция окисления высокотоксичного ксенобиотика 2,4,6-трихлорфенола гибридной Mn пероксидазой в присутствии и без 1- гидроксибенотриазола. В ходе проведения реакции гибридной Mn пероксидазы с 2,4,6-трихлорфенолом в качестве единственного продукта реакции был обнаружен 2,6 дихлорбензохинон. В случае же реакции гибридной Mn-пероксидазы с 2,4,6-трихлорфенолом в присутствии 1 гидроксибенотриазола наравне с 2,6- дихлорбензохиноном образовывалось ещё пять других продуктов, причём концентрация 2,6- дихлорбензохинона изменялась со временем, сначала нарастая, а затем уменьшаясь до минимума. Таким образом, в присутствии 1- гидроксибенотриазола происходила более глубокая трансформация 2,4,6-трихлорфенола, чем без него.

Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫЕ ФОТОПРОТЕИНЫ И ИХ «ЦВЕТНЫЕ» МУТАНТЫ КАК БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ РЕПОРТЕРНЫЕ БЕЛКИ Маликова Н.П., Борисова В.В.

Институт биофизики СО РАН, 660036 Красноярск, Академгородок, Россия npmal@yandex.ru Ключевые слова: биолюминесценция, обелин, внутриклеточный кальций, иммуноферментный анализ 1. Введение Са2+-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных представляют собой устойчивый комплекс, состоящий из односубъединичного полипептида (22.2 кДа) и субстрата 2-гидропероксицелентеразина.

Связывание кальция с молекулой фотопротеина вызывает конформационные изменения, инициирующие окисление субстрата. В результате реакции образуется СО2 и целентерамид, в возбуждённом состоянии, переход которого в основное состояние происходит с излучением кванта света.

Одно из основных применений фотопротеинов обусловлено самой природой реакции – способностью генерировать свет в ответ на появление 2+ 2+. Благодаря этому свойству фотопротеины успешно используются Са для мониторинга внутриклеточного Са более 40 лет. Клонирование кДНК генов фотопротеинов открыло новые возможности их применения. Современные методы позволили получить клетки и организмы способные стабильно экспрессировать фотопротеин, т.е., фактически, индикатор Са2+. Но наиболее значимой оказалась возможность направить фотопротеин в компартменты клетки при помощи специфических сигнальных последовательностей, присоединенных к белку путем генетических манипуляций. Это позволяет селективно следить за изменениями Са2+ в митохондриях, клеточном ядре, аппарате Гольджи и т.д.

Помимо использования фотопротеинов в качестве индикаторов Са2+, показана перспективность их применения в качестве меток в гибридизационном и иммунном анализах, обусловленная рядом факторов. При насыщающей [Са2+] световой поток прямо пропорционален количеству белка, так как он непосредственно уча ствует в реакции. Поэтому линейная зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации фотопротеина ограничена лишь линейным диапазоном регистрирующего устройства. Благодаря высокому квантовому выходу реакции и отсутствию фонового сигнала фотопротеины определяются в аттомолярных количествах, что обеспечивает высокую чувствительность анализа. Белки устойчивы при хранении, а также при проведении химических и генно-инженерных модификаций. Биолюминесцентная реакция фотопротеинов отличается простотой запуска (необходим только Са2+) и высокой скоростью (длительность сигнала несколько секунд). Наличие штаммов-продуцентов рекомбинантных фотопротеинов и технологий их очистки сделали эти белки доступными.

Определение структуры белка [1] позволило выдвинуть гипотезу о механизме формирования эмиттера в биолюминесцентной реакции фотопротеинов [2, 3]. Эта гипотеза послужила основой для получения мутантов фотопротеинов с новыми свойствами полезными при решении различных прикладных задач. В ИБФ СО РАН с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза получены мутанты обелина с измененными спектрами биолюминесценции [4]. В данной работе демонстрируется возможность применения «цветных» мутантов обелина в качестве индикаторов Са2+ и при разработке двухволновых методов иммуноанализа.

2. Методы Выделение апобелков и определение зависимости интенсивности люминесценции от [Ca2+] проводили, как описано в работе [5]. Моноклональные антитела к -ФСГ (клон ХК96) и к -ФСГ (клон 10F15) были получены от фирмы Хема (Россия);

моноклональные антитела к -ЛГ (MedixMab, Финляндия), стандартные и контрольные образцы сывороток – от НПО «Диас», (Россия). Конъюгаты мутантов с антителами на субъединицы ФСГ и ЛГ получали, как описано ранее [6].

3. Результаты и обсуждение Биолюминесцентные свойства некоторых мутантов обелина с наибольшими изменениями в спектре излучения, показаны на Рис. 1 и в Таблице. Для мутантов H22E&W92F (max = 387 нм) и M25R (max = 520 нм), имеющих минимальное перекрытие спектров, исследована зависимость люминесценции от [Ca2+] (Рис. 2).

Чувствительность мутантов к Ca2+ практически не отличается от таковой для WT обелина. Наблюдается более высокий уровень Са2+-независимой люминесценции, свидетельствующий о меньшей стабильности фотопротеинового комплекса. Однако при использовании этих мутантов как индикаторов потоков кальция в клетках устойчивость фотопротеинового комплекса не играет особой роли.

Для проведения двухволнового иммуноанализа лютеинезирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов в качестве меток были выбраны мутанты H22E&W92F и Y138F (Табл.). Эти мутанты формируют устойчивый комплекс и имеют небольшое перекрытие спектров биолюминесценции (Рис. 1). Соотношение содержания ЛГ и ФСГ яв ляется важным при диагностике нарушения функций генеративных органов. ЛГ и ФСГ – это двухсубъединичные гликопротеины, у которых субъединицы структурно очень схожи, а биологические и иммунологические свойства каждого гормона зависят от его уникальной субъединицы. Для анализа ЛГ и ФСГ в сыворотках Рис.1. Спектры биолюминесценции обелина и его были получены активные конъюгаты мутантов Y138F мутантов. ФС6 и ЖС16 – спектры пропускания и H22E&W92F с антителами на -субъединицы светофильтров.

данных гормонов. При проведении анализа сигналы от «цветных» мутантов регистрировали Таблица. Биолюминесцентные свойства обелина одновременно двумя люминометрами с общим и его мутантов кюветным блоком через светофильтры ФС6 и ЖС16 max, ICafree/ICa актив ность* 10- (Рис. 1) [7]. Сигналы регистрировали двухканальным нм самописцем. Схема проведения и результаты WT 485 100 8. двухволнового анализа ЛГ и ФСГ в стандартных W92F&H22E 387 10 сыворотках показаны на Рис. 3. С помощью полученных калибровочных кривых было определено Y138F 493 67 содержание гормонов в контрольных сыворотках (0,5 M25R 520 30 мМ Е/мл по каждому гормону), которое точно * – активность в % относительно обелина WT соответствовало данным радиоизотопного иммуноанализа.

4. Заключение Представленные результаты показывают, что «цветные» мутанты фотопротеинов могут успешно использоваться как репортерные белки при разработке двухволновых, а в перспективе и мультиволновых методов анализа. Среди потенциальных применений таких методов необходимо отметить синхронный мониторинг по токов Са2+ в различных компартментах клеток, что позволит выявить как локальные изменения [Ca2+] переключают экзогенные и эндогенные стимулы на соответствующий клеточный ответ, а также иммунный и гибридизационный анализы, когда в одном образце одновременно определяется несколько аналитов, необходимых для постановки диагноза. Рис. 2. Зависимость люминесценции WT обелина (), W92F&H22E (), и M25R() от [Ca2+].

Работа поддержана грантом Президента РФ (МК 1963.2005.4) и грантом Лаврентьевского конкурса молодёжных проектов СО РАН (2006 г.).

Литература (1) Liu Z-J., Vysotski E.S., Chen C-J., Rose J.P., Lee J., Wang B-C. Protein Sci., 2000, V. 9, 2085-2093.

(2) Vysotski E.S., Lee J. Acc. Chem. Res., 2004, V. 37, 405 415.

(3) Liu, Z.-J., Stepanyuk, G.A., Vysotski, E.S., Lee, J., Markova, S.V., Malikova, N.P., Wang, B.C. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 2006, V. 103, 2570-2575.

(4) Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Frank L.A., Markova S.V., Vysotski E.S., Lee J. FEBS Lett., 2003, V. 554, 184 – 188.

(5) Vysotski E.S., Liu Z-J., Markova S.V., Blinks J.R., Deng L., Frank L.A., Herko M., Malikova N.P., Rose J.P., Wang B-C., Lee J. Biochemistry, 2003, V. 42, 6013-24.

(6) Frank, L.A., Petunin, A.I., Vysotski, E.S. Anal.

Biochem, 2004, V. 325, 240-246.

(7) Frank, L.A., Borisova, V.V., Vysotski, E.S. In: A. Tsuji, M. Matsumoto, M. Maeda, L.J. Kricka, P.E. Stanley eds. Рис. 3. Схема проведения и результаты Bioluminescence & Chemiluminescence: progress and двухволнового твердофазного иммуноанализа perspectives. Singapore: World Scientific, 2005, 463-466. содержания ЛГ () и ФСГ () в стандартных сыворотках.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИНЦИПА СТАТИСТИЧЕСКОЙ САМОСБОРКИ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ ИЗ ОБЩЕГО ПУЛА БЕЛКА р1 ДЛЯ ОБЪЕДИНЕНИЯ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ АНТИТЕЛА Марченко А.Н.

Федеральное Государственное Унитарное Предприятие Государственный Научно-Исследовательский Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд д.1, Россия Lab_18@genetika.ru Ключевые слова: вирусоподобные частицы, антитела, самосборка 1. Введение TyA-опосредованная система экспрессии основана на использовании способности белка р1, кодируемого открытой рамкой считывания ТуА транспозона Ту1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, к самосборке в вирусоподобные частицы (ВПЧ) (1). Было показано, что присутствие на С-конце белка р1 фрагмента гетерологичного белка не препятствует формированию вирусоподобной частицы (2). Как было продемонстрировано нами ранее, при совместном присутствии в одной клетке двух вариантов гибридных белков р1 происходит самосборка ВПЧ, в которых статистически представлены оба варианта. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела, связанные с белком р1, теоретически могут быть объединены в функциональный антиген-связывающий центр за счет упорядоченной сборки ВПЧ.

2. Материалы и методы Для демонстрации взаимодействия ВПЧ-VLVH с hIFN- использовали ИФА. В качестве подложки на планшеты для ИФА наносили hIFN- в концентрации 10 мкг/мл. Все отмывки проводили в PBS. После блока неспецифического связывания наносили препарат исследуемых ВПЧ-VLVH в концентрации 10 мкг/мл. После отмывки наносили мышиные антисыворотки к p1 в разведении 1:10 000. Далее, после отмывки, наносили коньюгат антител кролика против IgG мыши с пероксидазой хрена.

3. Результаты и обсуждение Для проверки предположения о том, что вариабельные домены антитела могут быть объединены в функциональный антиген-связывающий центр за счет упорядоченной сборки ВПЧ, штамм YBS (ГосНИИгенетика) последовательно трансформировали плазмидами pPDX-TyA-ClinkVH и Yep13-TyA-ClinkVL, кодирующими белок р1, С-конец которого через 13-членный полиглициновый линкер связан с вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей антитела к -интерферону человека (hIFN-, белки р1-VH и р1-VL), соответственно. В результате получен штамм 618/pPDX-TyA-ClinkVH/Yep13-TyA-ClinkVL. Об успешной продукции в нем целевых гибридных ВПЧ (ВПЧ-VLVH) судили по появлению полосы соответствующего молекулярного веса при фракционировании растворимых клеточных белков в полиакриламидном геле.

Взаимодействие ВПЧ-VLVH с hIFN- выявляли с помощью ИФА (см. Материалы и методы). Для этого в качестве подложки использовали hIFN-, что позволяло фиксировать только ВПЧ, содержащие антиген связывающий домен. Затем, с помощью сыворотки, полученной против белка р1, демонстрировали наличие фиксированных частиц. В качестве отрицательного контроля использовали вирусоподобные частицы, образованные белками р1 (ВПЧ), р1-VH (ВПЧ-VH) и р1-VL (ВПЧ-VL) (Рис. 1).

OD, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 2 3 4 Рисунок 1: ИФА-анализ взаимодействия ВПЧ-VLVH с hIFN-.

1) ВПЧ + hIFN-;

2) ВПЧ-VL + hIFN-;

3) ВПЧ-VH + hIFN-;

4) ВПЧ-VLVH + 0;

5) ВПЧ-VLVH + hIFN-.

Сигнал от белка р1 для препарата ВПЧ ВПЧ-VLVH, на порядок превышает сигналы в контрольных опытах.

Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела действительно объединяются в функциональный антиген-связывающий домен за счет самосборки ВПЧ.

Для количественной оценки эффективности образования антиген-связывающих центров из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи антитела к hIFN-, связанных с белком р1, поставили следующий эксперимент: ВПЧ-VLVH инкубировали с hIFN-, образовавшийся комплекс ВПЧ-VLVH+hIFN- удаляли центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы и оценивали количество hIFN- в растворе (Рис 2).

Для обработки экспериментальных данных использовали компьютерную программу ENZFITTER (version 1.05 (CGA)). В результате двухфакторного анализа была определена константа диссоциации (Kd) комплекса ВПЧ-VLVH+hIFN- как 1.22 нМ при количестве сайтов связывания 1.65 на одну частицу, состоящую из молекул гибридного белка р1 (критерий достоверности данного приближения 2=2.56*10–3).

Kd равная 1.22 нМ является типичной для взаимодействия антиген-антитело, и позволяет говорить, что в данном случае идет формирование антигенсвязывающего центра именно за счет объединения вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи.

Эффективность образования антигенсвязывающих центров на ВПЧ не превышает нескольких процентов от теоретически возможной. Низкую эффективность формирования антигенсвязывающих центров можно объяснить тем, что для правильной ассоциации вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела необходимо замыкание дисульфидных связей, чему при самосборке ВПЧ-VLVH мешает восстановительный потенциал цитоплазмы (3).

Инф,нМ 0 1 2 3 4 5 Ty,нМ Рисунок 2: Графическое описание взаимодействия ВПЧ-VLVH с -интерфероном.

• - ВПЧ-VLVH + -интерферон;

- ВПЧ + -интерферон.

Следует отметить, что даже при данной эффективности образования антигенсвязывающих центров более 94% ВПЧ-VLVH имеют в своем составе хотя бы один такой центр, что делает возможным практическое использование описанной системы как одной из систем гетерологичной продукции антительных фрагментов.

4. Заключение Нами продемонстрирована новая возможность использования самосборки вирусоподобных частиц для объединения вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела в функциональный антигенсвязывающий центр. В этой системе белок р1 выступает в роли аналога константных доменов антитела, осуществляя пространственное сближение вариабельных доменов.

Литература (1) Dobson M.J., Mellor J., Fulton A.M., Roberts N.A., Bowen B.A., Kingsman S.M., Kingsman A.J. (1984) EMBO J., 3, 1115-1119.

(2) Adams S.E., Dawson K.M., Gull K., Kingsman S.M., Kingsman A.J. (1987) Nature., 329, 68-70.

(3) Schouten A, Roosien J, Bakker J, Schots A. (2002) J. Biol. Chem., 277, 19339-19345.

ПОДАВЛЕНИЕ АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ ПРИРОДНЫМИ И ИСКУССТВЕННЫМИ ШАПЕРОНАМИ Меремьянин А.В., Курганов Б.И.

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2, Россия mer-av@inbi.ras.ru Ключевые слова: глигогенфосфорилаза b, -кристаллин, агрегация, денатурация, аналитическое ультрацентрифугирование, динамическое светорассеяние, дифференциальная сканирующая калориметрия.

1. Введение Известно, что целый ряд заболеваний (таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Мачадо–Джозефа, прионные энцефалопатии, болезнь Шарко, системный амилоидоз, фиброзно-кистозная дегенерация) связаны с образованием функционально-неактивных белковых агрегатов (1).

Понимание механизма этих процессов позволит разработать медицинские препараты, стабилизирующие нативные белки, агрегация которых является причиной возникновения заболевания. Приемы стабилизации белков, основанные на использовании шаперонов, могут быть использованы при решении биотехнологических задач и при разработке методов хранения белковых препаратов медицинского назначения.

2. Материалы и методы В работе были использованы -кристаллин, Hepes фирмы «Sigma» (США), пролин фирмы «ICN» (США).

Гликогенфосфорилазу b (Phb) выделяли из скелетных мышц кролика по методу Фишера и Кребса (2), используя дитиотреитол вместо цистеина;

фермент был трехкратно перекристаллизован. Концентрацию Phb определяли спектрофотометрически с использованием коэффициента поглощения 13,2 для 1%-ного раствора белка при 280 нм (3).

Тепловая денатурация ферментов была изучена методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), динамического светорассеяния и аналитического ультрацентрифугирования. Эксперименты ДСК были проведены с использованием дифференциального сканирующего микрокалориметра DASM-4M (СКБ научного приборостроения, Пущино, Россия). Растворы ферментов (1,0–1,5 мг/мл) подвергали прогреву с постоянной скоростью 1 °С/мин от 5 до 90 °С при постоянном давлении 2,2 атм. Дальнейший анализ и построение графиков зависимости максимальной теплоемкости от температуры был осуществлен с использованием програмного обеспечения Origin software (MicroCal Inc., США). Измерения методом динамического светорассеяния проводили с использованием фотон-корреляционного спектрометра (PhotoCor Instruments Inc., США). Автокорреляционные функции анализировали, используя программное обеспечение DynaLS (Alango, Израиль). Эксперименты по аналитическому ультрацентрифугированию проводили на компьютеризированной аналитической ультрацентрифуге, Модель Е (Beckman), оборудованной фотоэлектрическим сканером и монохроматором;

были использованы двухсекторные 12 мм ячейки. Профили седиментации были получены путем измерения поглощения при длине волны 280 нм. Время сканирования – мин. Для расчета коэффициента седиментации использовали программу SEDFIT (4). Все растворы, для экспериментов были приготовлены с использованием деионизированной воды, полученной с помощью системы Easy-Pure II RF (Barnstead, США).

3. Результаты и обсуждение Согласно данным ДСК максимальное значение величины теплоемкости Cp,max наблюдается при температуре 59 °С. В присутствии -кристаллина выявлен сдвиг кривой денатурации в область более высоких температур. При изучении взаимодействия -кристаллина с Phb методом аналитического ультрацентрифугирования было обнаружено увеличение коэффициента седиментации основного пика при °С, что свидетельствует о возможности взаимодействия -кристаллина с конформационно измененной димерной молекулой. При 20 °С Phb и -кристаллин седиментируют независимо друг от друга.

Для характеристики размеров агрегатов при 48 °С был использован метод динамического светорассеяния.

График зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса свидетельствует о том, что начальной стадией агрегации является образование стартовых агрегатов. Гидродинамический радиус стартовых агрегатов (Rh,0) рассчитывается из отрезка, отсекаемого линейной зависимостью на оси абсцисс.

Величина Rh,0 найдена равной 76 нм. Исходя из величины гидродинамического радиуса стартового агрегата с использованием уравнения Крейтона Mr = (1,68Rh)2,3398 (Mr – молекулярная масса в кДа и Rh – гидродинамический радиус в нм) проведена приблизительная оценка числа денатурированных молекул Phb, входящих в состав стартового агрегата. Эта величина составляет 870 денатурированных мономеров.

Зависимость гидродинамического радиуса от времени может быть описана степенной функцией. Это свидетельствует о том, что процесс агрегации протекает в кинетическом режиме, при котором скорость агрегации лимитируется стадией диффузии (diffusion-limited cluster-cluster aggregation). При данном режиме агрегации вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице. В присутствии -кристаллина наблюдается изменение характера функции Rh(t) на экспоненциальный, что свидетельствует о переходе процесса агрегации в режим, при котором вероятность слипания частиц при столкновении становится меньше единицы (reaction-limited cluster-cluster aggregation). При этом наблюдается уменьшение размера стартовых агрегатов до 55 нм и появление лаг-периода на кинетических кривых агрегации. При изучении процесса агрегации Phb в условиях повышения температуры с постоянной скоростью, равной 1 °С/мин, отмечен сдвиг протекания агрегации в область более высоких температур в присутствии -кристаллина, что коррелирует с данными ДСК и аналитического ультрацентрифугирования.

Используя вышеперечисленные методы, были получены предварительные данные по защитному действию пролина.

4. Заключение Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что -кристаллин оказывает положительный эффект на стабилизацию Phb, взаимодействуя с частично развернутыми интермедиатами фермента.

На основании кинетики тепловой денатурации Phb и ряда других белков (5) предложен новый механизм агрегации белка (рис. 1). Данный механизм включает стадию образования стартовых агрегатов (первичных кластеров) и следующую за ней стадию слипания стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка.

Защитный эффект шаперонов (на примере -кристаллина) обусловлен уменьшением размера стартовых агрегатов, увеличением длительности латентной фазы, приводящей к образованию стартовых агрегатов, и уменьшением вероятности слипания частиц при их столкновении.

Рисунок 1: Схема тепловой агрегации белков Литература (1) Маркосян К.А., Курганов Б.И. Биохимия, 2004, т. 69, в. 9, с. 1196 – 1212.

(2) Fisher, E.H., and Krebs, E.G. (1962) Meth. Enzymol., 5, 368-373.

(3) Kastenschmidt, L.L. et al. (1968) Biochemistry, 7, 3590-3607.

(4) P. Schuk, Biophys. J. 2000, v. 78, 1606-1619.

(5) K.A. Markossian, B.I. Kurganov, D.I. Levitsky, H.A. Khanova, N.A. Chebotareva, A.M. Samoilov, T.B. Eronina, N.V.

Fedurkina, L.G. Mitskevich, A.V. Merem’yanin, S.Yu. Kleymenov, V.F. Makeeva, V.I. Muronetz, I.N. Naletova, I.N.

Shalova, R.A. Asryants, E.V. Schmalhausen, L. Saso, Yu.V. Panyukov, E.N. Dobrov, I.K. Yudin, A.C. Timofeeva, K.O.

Muranov and M.A. Ostrovsky. Mechanism of the chaperone-like activity. Nova Science Publishing Inc., New York, 2006, p. 90-173.

дНМФ-КИНАЗА БАКТЕРИОФАГА Т5 –ЭФФЕКТИВНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ дНТФ Микулинская Г.В., Зимин А.А., Феофанов С.А.

Филиал Института биоорганической химии РАН им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, 142292 Московская обл., г. Пущино проспект Науки, 6, Россия grromozeka@rambler.ru Ключевые слова: дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназа, субстратная специфичность, дНТФ 1. Введение Лимитирующей стадией в технологии энзиматического получения дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), широко применяемых как в фундаментальных исследованиях, так и в медицине и фармацевтике, является фосфорилирование дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ), осуществляемое дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназами (дНМФ-киназами).

дНМФ + (д)АТФ дНДФ + (д)AДФ Лимитирующей эта стадия является прежде всего потому, что большинство известных НМФ-киназ, в отличие от НДФ-киназ, специфичны к азотистому основанию субстрата. Однако, уникальная дНМФ-киназа бактериофага Т5 (КФ 2.7.4.13) обладает широкой субстратной специфичностью, и использование ее в технологии может существенно упростить процесс и снизить его стоимость. В данной работе описано обеспечение сверхпродукции этого фермента на основе геномных исследований, а также предложен метод последующей очистки белка из клеток суперпродуцента с высоким выходом.

2. Материалы и методы Для секвенирования фрагмента генома бактериофага Т5, содержащего ген, был предложен специальный подход (1). Получение геномной ДНК бактериофага, секвенирование, клонирование гена dnk, индукция синтеза белка осуществлялись с использованием стандартных методов молекулярной биологии (2). Белок определяли методом Брэдфорд (3). Активность фермента измеряли спектрофотометрическим методом (4) с дГМФ в качестве субстрата. Электрофорез в 12,5% ПААГ вели по методу Лэммли (5). Клетки E.coli BL21(DE3) (5 г), содержащиe плазмиду pDNKT5, суспендировали в буфере А, содержащем 40 мМ трис-НСl (pH=8,0), 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ -меркаптоэтанола. Суспензию клеток разрушали ультразвуком, затем центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Супернатант (18 мл) избавляли от нуклеиновых кислот пропусканием через колонку с DEAE-Toyopearl 650 М, уравновешенную буфером А. Белок из фракций, содержащих целевую активность, высаливали сульфатом аммония до 60% насыщения. Ионообменную хроматографию вели на колонке Mono Q объемом 1 мл (Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden), белки элюировали 30-мл линейным градиентом NaCl (0,20,6 M) в буфере А. Аффинную хроматографию вели на 1,5-мл колонке Toyopearl AF-Red 650M (TosoHaas, Stuttgart, Germany), фермент элюировали буфером А, содержащим 5 мМ АТФ.

3. Результаты и обсуждение В целях идентификации гена dnk был секвенирован фрагмент ранней области генома бактериофага Т длиной около 7 т.п.н., в которой был найден ген дНМФ-киназы, кодирующий белок с молекулярной массой 28,668 кДа.

Ген дезоксирибонуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5 был клонирован под контролем промотора гена 10 бактериофага Т7 в плазмиду pET3a. Ген dnk был экспрессирован в клетках E.coli BL21(DE3) посредством индукции ИПТГ. При этом было показано, что варьирование концентрации ИПТГ от 0,1 до мМ не сказывается существенно на уровне экспрессии, что немаловажно экономически при масштабировании процесса. Весь фермент находился в клетке в растворимом состоянии, его содержание составляло 18% от тотального белка. Рекомбинантная дНМФ-киназа бактериофага Т5 была очищена до гомогенного состояния из клеток E.coli BL21(DE3), содержащих плазмиду pdnkT5, двумя способами (рис.1). Первый способ в качестве основного этапа включал ионообменную, второй – аффинную хроматографию. Оба способа дали хороший результат и высокий выход (63-66%).

1 2 3 4 5 6 Рис.1. Денатурирующий электрофорез фракций на различных стадиях очистки.

1, маркеры молекулярной массы (94,0, 66,0, 45,0, 29,0 20,1 и 14,1 кДа);

2, грубый экстракт клеток E.coli, инфицированных фагом T5;

3, грубый экстракт клеток E. coli BL21(DE3), содержащих плазмиду pdnkT5;

4, экстракт после пропускания через Toyopearl 650M;

5, осаждение сульфатом аммония;

6, ионообменная хроматография;

7, аффинная хроматография.

Итоги очистки сведены в таблицу 1.

Таблица 1. Очистка дНМФ-киназы бактериофага Т5. Стадии, отмеченные звездочкой, представляют собой два альтернативных подхода.

удельная количество общая степень выход, активность, белка, мг активность, Е очистки % E/мг грубый экстракт 67,5 1957,5 29 1,00 100, пропускание через Toyopearl 650M 54,0 1944,0 36 1,24 99, осаждение сульфатом аммония 48,0 1920,0 40 1,38 98, а) ионообменная хроматография* 4,2 651,0 155 5,35 66, б) аффинная хроматография* 4,0 620,0 155 5,35 63, 4. Заключение В результате клонирования гена были получены клетки E.coli, активность дНМФ-киназы в которых превышала активность фермента в инфицированных бактериофагом клетках в 200 раз. Рекомбинантный фермент легко очистить до гомогенности любым из двух способов. При этом выход активного фермента составляет более 60%. Полученный препарат был успешно использован в технологии получения дНТФ.

Благодарность Авторы выражают благодарность Каюшину А.Л. за синтез олигонуклеотидов.

Литература (1) Galina V. Mikoulinskaia, Andrei A. Zimin, Sergei A. Feofanov, and Anatolii I. Miroshnikov. Identification, cloning and expression of bacteriophage T5 dnk gene encoding a broad specificity deoxyribonucleoside monophosphate kinase (EC 2.7.4.13). (2004) Protein Expression and purification, 33, 166-175.

(2) Maniatis T., Fritch E.E., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratore manual. (1982) Cold Spring Harbor Laboratory.

(3) Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. (1976) Anal. Biochem. 72, 248254.

(4) Bessman, M.J. Deoxynucleoside monophosphate kinases, in “Methods in Enzymology,” (1963), vol.VI, pp. 166177, Academic Press, New York and London.

(5) Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. (1968) Nature 170, 52595268.

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ АДД РАСЩЕПЛЕНИЕМ БОКОВОЙ ЦЕПИ СТЕРИНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ MYCOBACTERIUM NEOAURUM Молчанова М.А.

Центр «Биоинженерия» РАН, 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, к.1.

averakot@bk.ru Ключевые слова: стероиды, андростадиендион, микобактерии, фитостерины.

1. Введение 17-Кетостероиды– АДД (андроста-1,4-диен-3,17-дион), АД (андрост-4-ен-3,17-дион) и 9-гидрокси-АД в настоящее время являются основными интермедиатами в синтезе медицинских препаратов стероидной природы (1). Необходимость в указанных соединениях возникла во 2-ой половине 20-го столетия в связи с истощением запасов стероидного растительного сырья - диосгенина и соласодина, выделяемых соответственно из Dioscorea и Solanum spp. (2), и переходом на более дешевый и доступный вид сырья – стерины растительного и животного происхождения (фитостерины - ФС, холестерин). 17-Кетостероиды могут быть получены из стеринов селективным расщеплением их боковой цепи мутантными штаммами микобактерий с блокированным синтезом ферментов, катализирующих расщепление стероидных колец.

Целью нашей работы является изучение реакции микробиологической трансформации стеринов до АДД ключевого промежуточного продукта в синтезе эстрогенов, гестагенов и анаболиков 19-норстероидного ряда, для разработки его промышленного метода синтеза. Сложностью указанного процесса является, во-первых, чрезвычайно низкая растворимость субстрата в водных средах и, во-вторых, ингибирование процесса продуктом реакции, что требует специальных решений для успешного завершения поставленной цели.

2. Материалы и методы Работа проводилась с мутантным штаммом Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ас-1656, способным расщеплять стерины с образованием АДД (3). Субстратами для трансформации служили холестерин (98%) и соевые ФС, содержащие 97% смеси -ситостерина, стигмастерина и кампестерина. Стерины измельчали в воде с 0,03 % твина-80 до частиц не более 15 мкм. Сорбенты добавляли в питательную среду до стерилизации в отношении стерин/сорбент 1/10. Содержание продуктов трансформации определяли с помощью ТСХ и ВЭЖХ, оценивали, учитывая истинное содержание стеринов в трансформируемом субстрате, в г/л и в % от теоретически возможного результата.

3. Результаты и обсуждение В связи с высокой токсичностью АДД для микроорганизмов (4,5) необходимо исключить его контакт с клетками микроорганизма-трансформатора. Одним из решений избежать такого контакта является проведение трансформации в присутствии сорбента, избирательно поглощающего 4-3-кетостероиды (6). Для сорбции АДД, образующегося в процессе отщепления боковой цепи стеринов, нами были выбраны сорбенты, хорошо зарекомендовавшие себя ранее в процессах сорбции кортикостероидов (7). Это высокопористые неионогенные полимеры-сорбенты «поролас», представляющие собой полистирол, полученный сополимеризацией дивинилбензола и этилстирола в присутствии различных модифицирующих добавок. Эти сорбенты характеризуются большой удельной поверхностью 500-1000 м2/г со значительным объемом пор более 1 см3/г и неполярными или слабополярными свойствами. Они отличаются высокой механической прочностью и стабильностью в работе в циклах сорбции-десорбции. Большим достоинством пороласов является возможность их многократного использования.

Нами изучена возможность проведения трансформации стеринов (при нагрузке 10 г/л) c помощью M.neoaurum в присутствии различных сортов пороласов, а также сверхсшитых полистирольных сорбентов MN-200, MN-202.

Проблема низкой растворимости исходного стерина была решена нами специальным методом внесения субстрата, предварительно измельченного методом мокрого помола в присутствии подобранного ПАВ. Это позволило поднять концентрацию ФС до 10-20 г/л.

Установлено, что в процессе трансформации холестерина в присутствии сорбента АДД численность M.

neoaurum возрастает от начального значения 3107 КОЕ/мл до 4,5109 КОЕ/мл, при этом достигается полная конверсия субстрата с накоплением до 5 г/л АДД (Рис. 1,2). В отсутствие сорбента рост микобактерии замедляется, ее численность в конце ферментации составляет 5107 КОЕ/мл, а содержание АДД не превышает 1,5 г/л. На (Рис. 1) видно, что в отсутствие сорбента с накоплением 15-20% АДД до наступления стационарной фазы начинается отмирание клеток.

9, АДД, % от теор.

9 с сорбентом с 8,5 сорбентом lgN 8 без сорбента 7,5 без сорбента 6,5 18 23 29 42 45 50 53 56 68 75 18 23 29 42 60 66 70 72 75 79 время, час время, час N=КОЕ в 1 мл культуральной жидкости Рисунок 1: Рост M.neoaurum в процессе трансформа- Рисунок 2: Динамика накопления АДД.

ции холестерина.

В экспериментах с сорбентами с различными физическими характеристиками установлено, что все марки пороласов обладают избирательной сорбцией АДД, однако лучшими для нашей цели являются материалы с механической прочностью не ниже 80%, с удельной поверхностью более 800 м2/г. Трансформация 10 г/л холестерина в присутствии указанных сорбентов при соотношении сорбент/стерин – 10/1 заканчивалась через 3 сут. с образованием 70% АДД (Рис. 2). Однако для конверсии ФС при той же нагрузке потребовалось не менее 4 сут. инкубации. Для ускорения процесса превращения ФС в АДД мы использовали ранее примененный для трансформации ФС в АД (8) метод насыщения культуральной жидкости ионом НСО3-, который необходим, в отличие от холестерина, для расщепления разветвленной боковой цепи ФС. Благодаря этому полная конверсия ФС завершалась за 55-60 ч с сохранением баланса по сумме образующихся продуктов и содержанием АДД до 75%.

4. Заключение В результате проведенных экспериментальных исследований найдены оптимальные условия получения АДД путем ферментативного окисления стеринов в присутствии синтетических полимеров, которые будут положены в основу промышленного регламента на его производство. На основе полученных данных оформлена и подана в ФИПС заявка на патент РФ.

Литература (1) Fernandes P., Cruz A., Angelova B. et al. (2003) Enzyme and Microbial Technol. V.32, Pp. 688-705.

(2) Ахрем А.А., Титов Ю.А. (1970) Стероиды и Микроорганизмы. М. Наука. С.256.

(3) Молчанова М.А. (2005) Материалы международной школы-конференции молодых ученых. М.: МАКС Пресс, С.

196.

(4) Horhold С., Gottschaldt В., Grosse Н.Н. (1989)Fifth Int. Conf. on Chemistry & Biotechnol. Varna, Bulg. V.4, Pp.

92-110.

(5) Srivastava S.K, Srivastava R.A.K., Mathur S.N. (1985) J.Appl. Bacteriol. V.59, N.5, Pp. 399-402.

(6) Gottschaldt B., Hoehold C., Wetzker M. et al. (1993) DD Patent 301740.

(7) Андрюшина В.А., Стыценко Т.С., Кощеенко К.А. и др. (1997) Патент РФ 2093518, Бюлл. Изобр..№29.

(8) Родина Н.В., Молчанова М.А., Андрюшина В.А. и др. (2005) Тезисы доклада на 3 международном конгрессе «Биотехнология: состояние перспективы развития». Т.1, С. 84-85.

НОВЫЕ ФЕРМЕНТЫ ЭКСТРЕМОФИЛОВ И ИХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ Морозкина Е.В.

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр. 33, Россия Chicelena@yandex.ru Ключевые слова: экстремофилы, адаптация, нитратредуктаза.

1. Введение Изучение механизмов адаптации микроорганизмов к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды при постоянно увеличивающихся техногенных нагрузках, является одной из важнейших научных задач, имеющих: теоретический аспект – изучение механизмов адаптации к воздействию условий стресса и прикладное значение – биотехнологический потенциал для создания систем детоксикации и биоремедиации (1). Ферменты, выделенные из экстремофилов, как правило, обладают повышенной активностью, стабильностью и могут функционировать при высоких концентрациях соли (галоферменты), в условиях высокой щелочности (алкалоферменты) и других экстремальных условиях (температура, давление, кислотность и т.д.), что определяет их биотехнологический потенциал (2). Нитратредуктаза, ключевой фермент азотного обмена, является прекрасным индикатором ответа организма на стресс, поскольку его структура и свойства хорошо изучены для микроорганизмов, растущих в “нормальных” условиях. Данный фермент имеет важное прикладное значение в качестве одного из биологичеких компонентов для очистки различных техногенных объектов, в частности, алкалофильные микроорганизмы могут использоваться для удаления избыточных количеств нитратов из щелочных промышленных стоков.

Целью настоящей работы явилось исследование нитратредуктазы галоалкалофильной бактерии Halomonas sp. штамм AGJ 1-3, растущей при щелочных значениях рН (10,5) и высоких концентрациях солей (35 г/л).

2. Материалы и методы Культивирование галоалкалофильной бактерии Halomonas sp. и получение гомогенного препарата нитратредуктазы проводили, как описано ранее (3).

Активность нитратредуктазы определяли, как указано в работе (4).

За единицу активности нитратредуктазы принимали количество фермента, катализирующего образование нмоль NO2– за 1 мин при оптимальной температуре.

Определение молибденового кофактора, основанное на использовании дефектной по нему нитратредуктазы мутанта nit-1 Neurospora crassa, проводили согласно описанному ранее методу (5).

Физико-химические свойства фермента определяли, как описано ранее (3).

Содержание металлов в гомогенных препаратах НР-аз определяли методами плазменной атомно эмиссионной спектрометрии и плазменной масс-спектрометрии на приборах Optima 2000 DV и ELAN (PerkinElmer, США).

MALDI масс-спектрометрия. Масс-спектры гомогенного препарата НР-азы получали на MALDI-TOF масс-спектрометре Reflex III (“Bruker”, США) с УФ-лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да. Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot, Peptide Fingerprint (“Matrix Science”, США), с точностью определения массы МН+, равной 0,01%, и по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).

3. Результаты и обсуждение В результате разработанной нами схемы очистки (3) был получен гомогенный препарат нитратредуктазы, представляющий собой мономер с молекулярной массой 130 кДа (Рис. 1). Выделенный фермент обладал высокой удельной активностью (рис.1), сравнимой с активностью нитратредуктазы архебактерии Pyrobaculum aerophilum (Afshar et al., 2001). Несмотря на высокую щелочность среды роста клеток (рН 10,5), фермент имел четко выраженный оптимум при рН 7,0. Нитратредуктаза характеризовалась высоким температурным оптимумом (70 – 80оС), высокой термостабильностью и восстанавливал не только нитрат, но и нитрит и хлорат.

В активном центре фермента не обнаружено ионов молибдена (данные металлоанализа). Тест с апоНР-азой мутанта nit-1 так же подтвердил отсутствие молибденового кофактора в составе фермента. Дальнейшие исследования (спектрофотометрия и металлоанализ) показали содержание ионов железа в составе нитратредуктазы.

Рисунок 1: SDS-электрофорез и физико-химические свойства гомогенного препарата нитратредуктазы бактерии Holomonas sp. штамм AGJ 1-3.

Свойства фермента Значение Удельная активность, мкмоль NO2-/мин*мг Субъединичный состав Мономер Молекулярная масса, кДа Металл в активном центре Fe Наличие Мосо отсутствует Температурный оптимум, оС 70- Термостабильность (I0,5 при 70 оС), мин рН оптимум 7, NO3–, ClO3–, NO2– Субстратная специфичность:

Выделенный фермент так же отличался от описанных ранее нитратредуктаз, в частности Desulfovibrio desulfuricans, достаточно высоким содержанием “cтрессорных” аминокислот - глицина (15%) и аланина (13,6%), характерных для участков - спирали полипептидной цепи. Методом MALDI-спектроскопии подтверждено, что выделенная нитратредуктаза - неизвестный ранее фермент, полная аминокислотная последовательность которого не имеет гомологии с первичной структурой известных редуктаз. Анализ гомологии по отдельным пептидам (170 пептидов по 10 аминокислот) с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) показал, что степень гомологии достаточно низкая. Наибольшая степень гомологии (26, – 29,5) наблюдалась с оксидоредуктазами различного типа. Для последовательности CGDVNRNCGN было отмечено сходство (26,5) с консервативным фрагментом ряда сульфитредуктаз, содержащих в активном центре сирогем, ковалентно связанный с железо-серными кластерами (табл 1).

Полученные данные указывают на то, что НР-аза бактерий Halomonas sp. штамма AGJ 1-3 является новой безмолибденовой альтернативной нитратредуктазой, характеризующейся высокой активностью, высоким температурным оптимумом, стабильностью, а так же повышенным содержанием “стрессорных” аминокислот, и принадлежит к классу оксидоредуктаз, содержащих в активном центре ионы железа.

Таблица 1. Анализ гомологии НР-азы бактерий Halomonas sp. штамма AGJ 1-3 по отдельным пептидам при помощи Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Степень Фрагмент Фермент, организм гомологии RKYWNERKQA Predicted oxidoreductases [Cytophaga hutchinsonii] 29, PIGAIFDPES Aldehyde reductase II [Sporidiobolus salmonicolor]. 26, QCECKEVKKC Probable Fe-S oxidoreductase [Desulfotalea psychrophila LSv54] 26, CKCEKEMPTG Thiol-disulfide oxidoreductase [Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus E33L] 28, Семейство Sulfite reductase (более 20 родов) 26, CGDVNRNCGN KNMEKPADNC Nitroreductase [Crocosphaera watsonii] 26, NRYWDKEDCA Peptide methionine sulfoxide reductase [Streptococcus pneumoniae] 26, 4. Заключение Показано, что адаптационный ответ галоалкалофильной бактерии Halomonas sp. штамма AGJ 1-3, растущей на среде с нитратом в условиях щелочных значений рН (10,5) и высоких концентраций солей (35 г/л) происходит не на уровне изменения функциональных характеристик, а включет структурную модификацию активного центра нитратредуктазы и его первичной последовательности. Фермент, синтезировавшийся в этих условиях, обладал нитратредуктазной активностью, но характеризовался уникальными свойствами (высокая активность, термостабильность, температурный оптимум, широкая субстратная специфичность) и на структурном уровне имел низкую степень гомологии с ранее выделенными нитратредуктазами.

Литература (1) Rothschild, L.J. and Mancinelli, R.L. (2001) Nature, 490, 1092-1101.

(2) Vieille, C. and Zeikus, G.J. (2001) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 1- (3) Антипов А.Н. и др. (2005) Биохимия, 70(7), 968- (4) Носиков А.Н. и др. (2000) Биохимия, 65(2), 245- (5) Hawkes, T.R. and Bray, R.C. (1984). Biochem. J., 219, 481- (6) Afshar, S. et al. (2001) J. Bacteriol., 183, 5491- ИЕРАРХИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗ С TIM-ТИПОМ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ Наумов Д.Г.

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, I-ый Дорожный проезд, д.1, Москва, Ключевые слова: иерархическая классификация, (/)8-barrel fold, классификация ферментов, семейство белков, филогения белков, гликозил-гидролаза, CAZy, клан, суперсемейство, TIM, программа blast Введение Гликозил-гидролазы или гликозидазы [К.Ф. 3.2.1.-] являются широко распространённой группой ферментов, имеющих большое биохимическое, медицинское и промышленное значение. Они гидролизуют гликозидные связи между двумя углеводными остатками или между углеводным и неуглеводным остатком.

Огромное разнообразие этих ферментов является следствием высокого разнообразия их природных субстратов: ди-, олиго- и полисахаридов. Традиционная номенклатура гликозидаз (IUBMB) основана только на их субстратной специфичности и лишь иногда учитывает молекулярный механизм их действия. Эта классификация не отражает структурных особенностей и эволюционного родства гликозидаз, она не подходит для ферментов, действующих на несколько субстратов.

Накопление данных о первичных структурах гликозидаз позволило предложить новую классификацию, основанную на гомологии (Henrissat, 1991). Эта классификация регулярно обновляется и в настоящее время доступна на сайте CAZy (http://www.cazy.org/CAZY/fam/acc_GH.html). Она охватывает около 30. последовательностей гликозидаз и их гомологов, которые объединяются в более чем 100 семейств.

Молекулярный механизм (с сохранением или обращением оптической конфигурации) действия ферментов консервативен в пределах каждого семейства. Тщательный анализ первичных и третичных структур белков позволяет обнаружить эволюционные связи между представителями разных семейств. Родственные семейства, если они характеризуются общим механизмом, предложено объединять в кланы (Henrissat & Bairoch, 1996). К настоящему времени описано 14 кланов (GH-A – GH-N), объединяющих 46 семейств. Крупнейший из них (клан GH-A) содержит 17 семейств, а остальные – по 2-3.

В CAZy классификации никогда два клана не были объединены в один даже после обнаружения их существенного сходства. Однако стало известно, что эволюционно родственными могут быть даже гликозидазы, обладающие разным механизмом гидролиза. Например, нами было предложено выделить фуранозидазное (или -фруктозидазное) суперсемейство, объединяющее кланы GH-F (меняют конфигурацию гликозидной связи) и GH-J (сохраняют конфигурацию), а также семейство GHLP (COG2152 или DUF377) энзиматически неохарактеризованных белков (Naumoff, 2001).

Некоторые семейства гликозидаз являются очень многочисленными (число известных представителей достигает 4.000 в случае семейства GH13) и содержат ферменты с различными ферментативными активностями. В таких случаях представляется целесообразным выделять в пределах них подсемейства, которые помогут лучше учитывать уровень сходства белков и точнее предсказывать их субстратную специфичность.

Нами было выделено несколько подсемейств в фуранозидазном суперсемействе (Naumoff, 2001).

TIM-barrel (бочонок триозофосфат изомеразного типа), состоящий из восьми / мотивов сложенных в цилиндрическую структуру, является одной из наиболее распространённых трёхмерных структур белков (Nagano et al., 2001). Предполагается, что все (/)8-домены белков имеют общее эволюционное происхождение.

Согласно этой гипотезе, они произошли от предкового (/)4-домена путём тандемной дупликации гена с дальнейшим объединением двух копий в один ген и последующей дивергенции (Lang et al., 2000). Около 50% всех гликозидаз имеют каталитические домены (/)8-типа (Rigden et al., 2003). Они относятся к 4 кланам (GH A, GH-D, GH-H и GH-K) и целому ряду других семейств, не включённых в состав кланов.

GH1 GH2 GH5 GH10 GH17 GH26 GH30 GH35 GH GH42 GH50 GH51 GH53 GH59 GH72 GH79 GH clan GH-A GH14 GH29 GH44 GH71 GH67 GH type I type IV GH36A GH36B GH36C GH36D GH27 GH36 GH31 GH13 GH70 GH clan GH-D clan GH-H COG GH66 GH -galactosidase superfamily type II GH18 GH20 GH3 GH GH25 GH84 GH clan GH-K type III GH6 GH38 GH (/)7-barrel fold (/)8-barrel fold TIM-barrel fold type Рисунок. Иерархическая классификация гликозидаз с TIM-типом трёхмерной структуры, предложенная в настоящей работе. Разбиение семейств на подсемейства не указано. Закрашенные прямоугольники соответствуют иерархическим группам, содержащим хотя бы одного представителя с известной трёхмерной структурой.

В данной работе мы суммировали имеющиеся данные об эволюционных взаимосвязях различных гликозидаз с каталитическими доменами TIM-типа и предложили для них иерархическую классификацию.

Результаты и обсуждение Мелибиазы или -галактозидазы [К.Ф. 3.2.1.22] – это гликозидазы, способные отщеплять с сохранением их оптической конфигурации терминальные нередуцирующие остатки -D-галактозы от -D-галактозидов, в том числе от галактоолигосахаридов, галактоманнанов и галактолипидов. Большинство известных -галактозидаз имеют (/)8-тип каталитического домена и относятся к семействам GH27 и GH36 гликозидаз, которые образуют клан GH-D. Мы проанализировали аминокислотные последовательности всех белков этого клана.

Для выделения среди них подсемейств нами были использованы: попарное сравнение последовательностей (30% идентичности), анализ порядка появления белков при скрининге с помощью программы blast и анализ топологии филогенетических деревьев (монофилетический статус). Было обнаружено 3 и 4 основных подсемейств в семействах GH27 и GH36 соответственно.

Анализ с помощью программы PSI-BLAST показал примерно одинаковые эволюционные расстояния между семействами GH27 и GH36, а также между ними и семейством GH31. Это позволило нам объединить эти три семейства в -галактозидазное суперсемейство. Согласно данным филогенетического анализа, семейства GH27 и GH31 вероятно являются монофилетическими группами, а GH36 – имеет полифилетическое происхождение. Мы предлагаем рассматривать четыре подсемейства этого семейства как четыре различных семейства гликозидаз (GH36A-GH36D) в пределах -галактозидазного суперсемейства.

Итеративный скрининг базы данных аминокислотных последовательностей позволил выявить отдалённое родство белков -галактозидазного суперсемейства с представителями нескольких других семейств, в том числе GH13, GH97 и COG1649. GH13 является наиболее многочисленным семейством гликозидаз, содержащим ферменты с почти 30 различными энзиматическими активностями, включая гидролазы, трансгликозидазы и изомеразы. Семейство GH13 вместе с GH70 и GH77 образует клан GH-H ( глюкозидазное суперсемейство).

COG1649 (или DUF187) – семейство энзиматически неохарактеризованных белков. В пределах него нам удалось обнаружить 4 основных подсемейства. Итеративный скрининг базы данных выявил родство белков этого семейства с представителями семейств GH13, GH20, GH31 и GH36. Семейство GH20 относится к клану GH-K.

GH97 – недавно обнаруженное семейство гликозидаз, содержащее только 2 белка с известными энзиматическими активностями. В пределах него мы выделили 5 основных подсемейств. С помощью программы PSI-BLAST удалось показать, что белки семейства GH97 имеют наибольшее сходство с представителями -галактозидазного суперсемейства. Более отдалённое родство обнаружено с гликозидазами семейств GH13 и GH20, а также с некоторыми членами семейства COG0535. COG0535 – группа энзиматически неохарактеризованных белков. Они аннотируется, как семейство предполагаемых Fe-S оксидоредуктаз, подобно ближайшему COG0641 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/). Итеративный скрининг базы данных показал, что оба COG-семейства родственны суперсемейству Fe-S белков (the radical SAM superfamily), имеющему (/)8-структуру.

Скрининг базы данных PDB с помощью программы 3D-PSSM показал, что белки семейства GH97 имеют наибольшее сходство своих предсказанных трёхмерных структур с представителями -галактозидазного суперсемейства. Среди других наиболее похожих белков оказались гликозидазы, относящиеся к семействам:

GH2 (клан GH-A), GH5 (GH-A), GH13 (GH-H), GH17 (GH-A), GH18 (GH-K) и GH20 (GH-K), а также ряд других белков, имеющих структуру TIM-бочёнка.

Взятые вместе эти данные указывают на общность эволюционного происхождения каталитических доменов гликозидаз, относящихся к кланам GH-A, GH-D, GH-H и GH-K. Комплиментарные результаты были опубликованы рядом других авторов. Henrissat (1998) и Janeek (1998) обнаружили отдалённое сходство последовательностей семейства GH13 с GH31 и GH57 соответственно. Imamura et al. (2001) предположили о наличии общего предшественника у гликозидаз семейств GH38 и GH57. Nagano et al. (2001) пришли к выводу об общности эволюционного происхождения белков клана GH-A и семейств GH13 и GH14. Rigden (2002) предположил об общности происхождения семейств GH13, GH27, GH31, GH36 и GH66. Трёхмерная структура (/)8-типа была предсказана для каталитических доменов семейств GH29, GH44, GH50, GH71, GH84, GH85 и GH89 (Rigden et al., 2003). Более того, семейство GH50 предложено рассматривать как эволюционный предшественник семейств GH14 и GH42.

Используя за основу двухуровневую классификацию CAZy и приняв во внимание все указанные выше данные, а также белковые классификации на сайтах SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/) и Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/), мы предложили новую иерархическую классификацию для гликозидаз с TIM-типом трёхмерной структуры (Рисунок).

Работа финансировалась грантами президента РФ для молодых учёных (MK-118.2003.04 и MK 1461.2005.4) и грантом РФФИ (06-04-49079-а).

БЕЛОК ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОЛОКА, ИНДУЦИРУЮЩИЙ АПОПТОЗ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ MCF- Некипелая В.В., Семенов Д.В.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, г. Новосибирск, ул. Лаврентьева, 8, Россия lana_nekipelaya@mail.ru Ключевые слова: апоптоз, рак молочной железы человека, MCF- 1. Введение Апоптоз – механизм, ответственный за поддержание постоянства численности клеток, формообразование и выбраковку дефектных клеток многоклеточных организмов. Актуальность исследований апоптоза определяется тем, что нарушения регуляции этого процесса связано с развитием различных заболеваний, в том числе онкологических [1,2].

Одним из наиболее важных направлений изучения апоптотической гибели является поиск и исследование физиологических индукторов апоптоза как потенциальных средств терапии раковых заболеваний. Ранее в работе Hakanson и соав. было показано, что человеческое молоко обладает способностью индуцировать апоптоз раковых клеток млекопитающих в культуре, при этом не оказывая апоптотического действия на немалигнизированные клетки [3,4]. Кроме того известно, что окончание лактации сопровождается инволюцей молочной железы, во время которой происходит апоптотическая гибель клеток, секретирующих молоко.

Апоптоз секреторных эпителиоцитов происходит при локальном накоплении и стазисе молока в железе на фоне падения системного уровня лактогенных гормонов [5]. При этом уровень лактогенных гормонов оказывает лишь модулирующее влияние на процесс инволюции молочной железы, в то время как необратимая индукция апоптоза секреторных клеток происходит исключительно благодаря локальным для молочной железы стимулам [6]. Данные А. Марти позволяют предположить, что в процессе лактации в молоке накапливаются или активируются факторы, способные подавлять секрецию и индуцировать апоптоз клеток молочной железы [7].

Целью данной работы являлось выделение и идентификация белков молока человека, способных индуцировать апоптоз клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 в культуре.

2. Материалы и методы Материалы: клеточная линия MCF-7 (ATCC, США);

сорбенты Fractogel DEAE-650 ("Sigma"), Fractogel СM 650 (М) ("Sigma"), Sepharose Blue ("Sigma"), трис, акриламид, SDS, N,N'- метиленбисакриламид ("Sigma").

Методы: ионообменной хроматографии на сорбентах Fractogel DEAE-650 и Fractogel СM 650 (М) [8];

аффинной хроматографии на цибакрон-сефарозе (Sepharose Blue) [8];

ВЭЖХ на Protein C4 [8];

SDS электрофореза в ПААГ [9], MTT-теста [10], MALDI-TOF, MALDI MS/MS.

Детали:

3. Результаты и обсуждение Разделение белков плазмы человеческого молока проводили по схеме, включающей ряд последовательных хроматографических стадий: ионообменные хроматографии на сорбентах DEAE-650 (S) (рис.1) и Fractogel СM 650 (М) (рис.2) и аффинной хроматографии на цибакрон-сефарозе (рис.3). Такая стратегия выделения позволила получить белковые фракции, инкубация которых с клетками аденокарциномы MCF-7 приводила к апоптотическим признакам признаки свойственные апоптозу: конденсация цитоплазмы и ядер, образование апоптотических телец, сморщивание клетки, а также уменьшение числа и снижением интенсивности окраски митохондрий, окрашиваемых родаминовыми красителями [11].

Анализ цитотоксических фракций, полученных серией хроматографий, методом SDS электрофореза в ПААГ показал, что они содержат один полипептид (P1), подвижность которого в геле соответствует подвижности полипептида с молекулярной массой ~ 12 кДа (рис. 4, дор. 4).

Влияние компонентов молока на жизнеспособность клеток MCF-7 на каждой стадии разделения оценивали методами МТТ-теста и окраски трипановым синим. Морфологические изменения клеток MCF-7, индуцируемые соединениями человеческого молока, оценивали методом световой микроскопии.

Для того чтобы идентифицировать и определить аминокислотную последовательность P1 методом масс спектрометрии, проводили его дополнительную очистку высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращенно-фазовом сорбенте Protein C4 (данные не иллюстрированы).

Согласно данным MALDI-TOF спектрометрии P1 представлен одним пиком, соответствующим молекулярной массе 8606.5 ± 0.5 Да. Несовпадение молекулярных масс P1, определенных методом гель электрофореза и методом масс-спектрометрии, обусловлено, по-видимому, аномальной подвижностью коротких полипептидов (10 кДа) в ПААГ [9].

Молекулярные массы продуктов трипсинолиза P1, определенные методом масс-спектрометрии, совпадают с молекулярными массами продуктов трипсинолиза: фрагмент 66 - 123 -казеина человека [NCBI accession NP_005203, "Mascot"] [12]. Значение молекулярной массы P1, определенное методом MALDI-TOF спектрометрии, было подтвержено анализом MALDI MS/MS спектрометрии.

4. Заключение Таким образом, мы выделили белок человеческого молока, индуцирующий апоптоз клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Этот белок является фрагментом -казеина человека и имеет молекулярную массу 8.6 кДа.

В настоящее время мы планируем определить механизм взаимодействия белкового индуктора апоптоза P с клетками MCF-7, а также путь развития апоптотичсеской гибели клеток аденокарциномы молочной железы человека под действием выделенного апоптотического фактора.

Литература.

(1) Владимирская Е.Б. Биологические основы противоопухолевой терапиию. М.: Агат-Мед, 2001. 110 стр.

(2) Buchner T. // Acute Leukemia IV. Prognosis factores and Treatment Stieattlies. Berlin. 1993. p. (3) Hakansson A., Zhivotovsky B., Orrenius S., Sabharwal H., Svanborg C.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. Р.

8064-8068.

(4) Svensson M., Sabharwal H., Hakansson A., Mossberg A., Lipniunas P., Lefflert H., Svanborg C., // Journal of Biological Chemistry. 1999. V. 274. Р. 6388-6396.

(5) Wilde C.J., et al. // Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 1999. V. 4. № 2. P. 129-136.

(6) Li M., et al. // PNAS. 1997. V. 94. № 7. P. 3425-3430.

(7) Marti A., et al. // Eur. J. Cell. Biol. 1997. V. 73. № 2. P. 158-165.

(8) Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Москва: Наука. 1985. 535 стр.

(9) Дарбре А. Практическая химия белка. Аналитические методы. Москва: Мир. 1989. 621 стр.

(10) Bank U, Reinhold D, Ansorg S. // Allergy and Immunology, 1991, V.37. № 3-4. P.119-123.

(11) Cohen G. M. // Biochemistry. 1997. V. 326. Р.1- (12) Perkins, DN, Pappin, DJ, Creasy, DM and Cottrell, JS. // Electrophoresis. 1999. V. 20. № 18. P. 3551-3567.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАНИЛАМИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ОБРАЗЦАХ МЕДА МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА Нестеренко И.С., Нокель М.А.

Кафедра Химической энзимологии, Химический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова, 119992 Москва, Ленинские Горы, 1, Россия iranes2607@gmail.com Ключевые слова: сульфаниламиды, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, мед 1. Введение Сульфаниламидные препараты в настоящее время являются широко применяемыми антибактериальными средствами. Эти соединения также используются в ветеринарии в целях профилактики и лечения различных заболеваний у животных. Однако, попадая опосредованно в продукты питания (молоко, мясо, мед) остаточные количества сульфаниламидов при определенных концентрациях могут вызывать у людей дерматиты, нарушения обмена веществ, деятельности центральной нервной системы и другие заболевания. Для предупреждения возможных осложнений необходим контроль за содержанием сульфаниламидов в различных пищевых объектах. Поэтому разрабатываются высокочувствительные методе, способные выявить достаточно низкие концентрации этих веществ. В последнее время возрастающее значение приобретают иммунохимические метода анализа, характеризующиеся высокой чувствительностью и специфичностью и возможностью одновременного анализа большого количества образцов [1]. Среди этих методов следует выделить метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА), характеризующийся не только высокой чувствительностью, но и быстротой проведения определений [2].

Целью настоящей работы являлось получение иммунореагентов и разработка методики экспрессного определения сульфаниламидов с помощью поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, а также применение данной методики для определения сульфамидных препаратов в образцах меда.

2. Материалы и методы В работе были использованы следующие реагенты: метанольные растворы с концентрацией 1мг/мл следующих препаратов: сульфаметазин, сульфатиазол, сульфапиридин, сульфахиноксалин;

флуоресцентные метки: флуоресцеинизотиоционат(ФИТЦ), этилендиаминтиокарбамилфлуоресцеин (ЭДФ) и другие реагенты необходимые для синтеза сульфаниламидов, меченных флуоресцентной меткой.

Все измерение проводили в 2,5 мМ боратном буфере pH 8,5, содержащем 0,1 % азида натрия.

Для выполнения поставленной задачи были получены конъюгаты сульфаметазина с ЭДФ и сульфапиридина, сульфатиазола и сульфахиноксалина с ФИТЦ (рис.1) Выделение и очистка трейсеров (сульфаниламидов, меченных флуоресцентной меткой) проводились методом тонкослойной хроматографии в системе хлороформ : метанол 4:1.

Полученные трейсеры были протестированы иммунохимическим способом на предмет связывания с специфическими антителами. Для тестирования были использованы поликлональные овечьи антитела к определяемым сульфаниламидам, предоставленные нам профессором Роем Джакманом, Центральная Ветеринарная лаборатория, Великобритания.

Стандартные растворы сульфаниламидов готовили методом последовательного разведения в дистиллированной воде исходного метанольного раствора с концентрацией 1 мг/мл.

Для измерения поляризации флуоресценции использовали поляризационный флуориметр «Beacon 2000»

фирмы «Panevra», США.

3. Результаты и обсуждение Конъюгаты сульфаниламидов с флуоресцентными метками были охарактеризованы по способности связываться с антителами. Получены кривые связывания, на основании которых выбраны рабочие концентрации антител, и построены градуировочные графики ПФИА для каждого из определяемых сульфаниламидов (рис.2), а также рассчитаны аналитические характеристики методики для четырех разработанных методик: пределы обнаружения, линейный диапазон определяемых концентраций и концентрация аналита при 50%-ном изменении аналитического сигнала (параметр Ic50) (таблица 1).

(а) (б) O HO O HO OH OH O S O CH NH NH NH NH O O O N O O O NH NH S S NH H3C N NH O S O N (в) (г) O O HO HO OH OH O O O O O NH S NH NH O NH NH S NH N O S S O N N S Рисунок 1: Структура трейсеров сульфаметазин-ЭДФ- (а), сульфапиридин-ФИТЦ-(б), сульфатиазол-ФИТЦ (в), сульфахиноксалин-ФИТЦ-(г).

(a) (б) mP mP 120 60 0 1E-3, 0 1 10 100 1000 10000 1E-3 1 10 100 1000 Сульфатиазол, нг/мл Сульфаметазин, нг/мл mP (г) (в) mP 100 1E-3 1 10 100 1000 1E-3, 0 1 10 100 1000 Сульфакуиноксалин, нг/мл Сульфапиридин, нг/мл Рисунок 2: Градуировочные графики для определения: (а)-сульфаметазина;

(б)-сульфатиазола, (в)-сульфапиридина, (г)- сульфахиноксалина.

Таблица 1: Аналитические характеристики ПФИА сульфаниламидов Название Предел обнаружения Линейный диапазон определяемых IС50, нг/мл соединения сульфаниламидов в воде, нг/мл концентраций в воде, нг/мл сульфатиазол 3 5- 293 сульфапиридин 7 10-261 сульфаметазин 8 19-790 сульфахиноксалин 3 10-700 Данные таблицы 1 показывают, что с помощью разработанных методик ПФИА можно определять достаточно низкие концентрации сульфаметзина, сульфатиазола, сульфапиридина и сульфахиноксалина, используя специфические антитела к каждому из соединений.

Для оценки специфичности анализа были определены коэффициенты перекрестного реагирования с близкородственными соединениями для четырех разработанных методик ПФИА (Табл. 2).

Таблица 2: Специфичность анализа сульфаниламидов Коэффициент перекрестного реагирования, % Название соединения антитела к антитела к антитела к антитела к сульфаметазину сульфатиазолу сульфапиридину сульфахиноксалину сульфаметазин 0,5 1,5 0, сульфадиазин 5,0 0,2 0,6 0, сульфамеразин 7,0 0,1 1,5 0, сульфатиазол 0,1 7 0, сульфаметоксазол 0,1 1,6 0,1 0, сульфахиноксалин 1,3 0,1 0,2 сульфадиметоксин 0,9 0,1 0,1 0, сульфапиридин 3,7 2,9 0, сульфаниламид 0,1 0,1 0,1 0, сульфахлорпиридазин 0,1 0,7 0,2 0, сульфаметоксипиридазин 0,2 0,1 0,2 0, Из таблицы 2 видно, что данные антитела обладают высокой специфичностью к определяемому сульфаниламиду. Коэффициенты перекрестного реагирования не превышают 10%. Возможно, в дальнейшем следует рассмотреть целесообразность объединения антител для групп-специфического анализа. Но, согласно полученным данным, разработанные методики уже можно применять для отдельного определения каждого из рассматриваемых веществ в смеси с их аналогами.

Представляло интерес на практике испытать разработанные нами методики определения сульфаниламидов. Поэтому нами предпринята попытка использования полученных результатов для определения сульфаниламидных препаратов в различных образцах меда.

Известно, что мед представляет собой сложную смесь, состоящую практически на 90% из углеводов, включая также ферменты, остатки пыльцы и воду. Эффект матрицы часто затрудняет прямой анализ образцов меда, разбавление их снижает чувствительность метода. Для снижения предела обнаружения, в отличие от ранее применяемой методики прямого разбавления пищевых проб [3-4], нами предложен метод экстракции сульфаниниламидов из образцов меда смесью дихлорметана и ацетонитрила.

Нами изучено 30 образцов меда из различных регионов России, а также из Германии и Бельгии. Построены градуировочные графики с использованием стандартных растворов сульфаниламидов, приготовленных в ацетонитриле и в воде, линейный диапазон которых практически совпадал. Предел обнаружения в меде составил 6, 14 и 20 нг/мл для сульфатиазола, сульфапиридина и сульфаметазина соответственно. Время пробоподготовки образцов занимает около часа. Время анализа 10 образцов на приборе Beacon составляет около двух минут.

4. Заключение Разработанный нами метод определения сульфаниламидов в меде, благодаря относительно простому способу подготовки проб, высокой скорости анализа, его чувствительности и специфичности представляет интерес и может быть рекомендован для применения на практике.

Благодарность Мы выражаем благодарность научному руководителю, д.х.н., профессору Еремину С.А за оказанное содействие при выполнении данной работы, ценные советы и консультации.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-03-33015а.

Мы выражаем благодарность всем, предоставившим нам образцы меда для анализа.

Литература (1) Haasnoot W., Bienenmann-Ploum M., Lamminmki U., Swanenburg M., Rhijn H. Application of a multi-sulfonamide biosensor immunoassay for the detection of sulfadiazine and sulmethoxazole residues in broiler serum and its use as a predictor of the levels in edible tissue. Analytica Chimica Acta. 2005, 552, 87-95.

(2) Eremin S.A., Smith D.S. Fluorescence polarization immunoassay for pesticides. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 2003, 6, 79-99.

(3) Pastor-Navarro N., Garcia-Bover C., Maquieira A., Puchades R. Specific polyclonal-based immunoassay for sulfathiazole. Anal. Bioanal. Chem. 2004, 379, 1088-1099.

(4) Legg D.R., Baumgartner A., Salter R., Wheeler A. ROSA(Rapid one step assay) for antibiotics in honey. Apiacta, 2003, 38, 207-217.

ЦИАНИД УСТОЙЧИВЫЕ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ КАТАЛИЗАТОРЫ ГИДРОЛИЗА ЦИАНГИДРИНОВ Новиков А.Д., Яненко А.С.

ФГУПГосНИИгенетика, 117545, 1-й Дорожный пр., 1, Москва, Россия;

yanenko@genetika.ru Ключевые слова: нитрилгидратаза, устойчивость к цианидам, циангидрины.

Нитрилгидратазы (НГ) являются одними из ключевых ферментов биодеградации нитрилов, катализируя превращение нитрилов в соответствующие амиды, которые далее, под действием амидаз, гидролизуются до соответствующих кислот и аммония.

O O Н итрил ги д р ат а за A м и д а за + NH R C N C C R NH R OH НГ, в настоящее время, являются наиболее широко используемыми ферментами в химической промышленности. Конверсия акрилонитрила в акриламид является наиболее успешным примером промышленного биокатализа в химии.

Новой областью применения НГ является гидратация -оксинитрилов (циангидринов) до -оксиамидов, которые широко используют в фармацевтической и полимерной промышленностях. Например, ацетон циангидрин может быть гидролизован до -гидроксиизобутироамида, который является предшественником метакриламида - мономера, промышленное производство которого, на сегодняшний день, составляет ~ тон в год. Главным препятствием использования НГ для гидролиза циангидринов является их высокая чувствительность к цианидам, которые всегда присутствуют в водных растворах циангидринов из-за их не стабильности (особенно не стабильны растворы кетон циангидринов). Как результат выше перечисленных трудностей, на сегодняшний день, отсутствуют промышленные процессы гидролиза циангидринов с использованием биокатализаторов.

Целями данной работы являлись поиск штаммов, содержащих НГ устойчивые к цианидам, характеристика ферментов и кодирующих их генов, а так же использование НГ для гидролиза циангидринов.

Из образцов почвы, с использованием накопительных культур, в присутствии KCN, были изолированы два бактериальных штамма, содержащие НГ с высокой устойчивостью к цианидам (1). На основании сиквенирования фрагментов генов 16S РНК и биохимических тестов, штаммы были отнесены к роду Pseudomonas - Pseudomonas marginales MA32 и Pseudomonas putida MA113. В отличие от известных НГ, которые быстро теряют активность при низких и средних концентрациях цианида (3), выделенные из этих штаммов ферменты сохраняли устойчивость к 100мМ цианида(2). Т.о., обнаруженные ферменты обладают наиболее высоким уровнем устойчивости к цианидам из всех известных на сегодняшний день (Рис. 1).

Обнаруженные нами НГ относятся к Fe-типу НГ, но отличаются по субстратной специфичности. Вместе с тем, оба фермента обладают широкой субстратной специфичностью, включая не только короткоцепочечные (акрилонитрил), но и длинноцепочечные нитрилы, в том числе нитрилы с четвертичными альфа-углеродными атомами (Рис. 2).

Константа ингибирования, мМ 0, R. opacus P.putida R. equi MA 32 MA Рис.1: Ингибирование цианидом НГ из различных микроорганизмов.

100 MA 90 MA Относительная активность, % AN MAN MetN ACH FVN Рис.2: Субстратная специфичность НГ исследуемых микроорганизмов.

AN-акрилонитрил, MAN-метакрилонитрил, MetN-метиониннитрил, ACH –асетонциангидрин, FVN – формилвалиннитрил;

MA32-Pseudomonas marginales MA32;

MA113- Pseudomonas putida MA Штамм Pseudomonas marginales MA32 был использован как биокатализатор для трансформации ацетонциангидрина в -оксиизобутироамид, являющийся предшественником промышленно значимого мономера-метакриламида.

O O O Нитрил CH H 3C HO C C H 3C HO C N Na 0.5 Mg 0.25 H 2 PO NH гидратаза NH + H 3C CH CH H 3C CH 300°C H C N Новый биокатализатор позволяет получать 1,6 М растворы -оксиизобутироамида за 5ч при концентрации биокатализатора 5г/л по сухому весу (2).

Для выяснения причин высокой цианид устойчивости и получения высокоактивных промышленных штаммов нами, с помощью ПЦР с вырожденными праймерами, были клонированы кластеры НГ обоих штаммов. Гены НГ из штаммов P. marginales MA32 и P. putida MA113 обладали высоким уровнем гомологии (~89%) и проявляли родство с генами и субъединиц цианид чувствительной НГ из Pseudomonas chlororaphis B23 (~90 и ~84%, соответственно). Сходным с Ps.chlororaphis B23, было и общее строение НГ кластеров (Рис.3).

NH N H A m id P47K O rf E O xdA P s.c h lo r o r.B 2 N H NH A m id P47K O rf E M A NH N H A m id P47K M A Рис.3: Структура НГ кластеров исследуемых штаммов.

Ps.chloror.B23-Pseudomonas chlororaphis В23;

MA32-Pseudomonas marginales MA32;

MA113- Pseudomonas putida MA113;

OxdA-ольдоксим дегидратаза;

Amid-амидаза;

NH- субъединица НГ;

NH- субъединица НГ;

P47K- ORF, необходимая для экспрессии генов НГ;

OrfE- не идентифицированная ORF.

Вместе с тем, в пептидах, кодируемых генами НГ P. marginales MA32 и P. putida MA113, имеется ряд аминокислотных замен и делеций общих для обоих цианид устойчивых штаммов (Рис. 4).

B23-Pseudomonas chlororaphis В23;

MA32-Pseudomonas marginales MA32;

MA113- Pseudomonas marginales MA32. Аминокислоты идентичные у всех штаммов выделены черным цветом;

аминокислоты и делеции, идентичные у цианид устойчивых штаммов, выделены серым цветом.

Мы полагаем, что признак высокой устойчивости к цианидам, обусловлен особенностями структуры генов НГ из штаммов МА32 и МА113. Дальнейшее изучение этих особенностей поможет пониманию причин цианид устойчивости этого класса ферментов и созданию на их основе новых более продуктивных биокатализаторов для нужд химической промышленности.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |
 



 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.