авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |

«Международная Школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» организована Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН в рамках Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотруд- ничества в ...»

-- [ Страница 6 ] --

Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119899 Москва, Воробьевы Горы, д.1, стр. oasinitsyna@gmail.com Ключевые слова: фитаза, фитин, Penicillium canescens, кормовые биодобавки 1. Введение Фитаза (мио-инозит-гексакисфосфат-3(6)фосфогидролаза, КФ 3.1.3.8 и 3.1.3.26) ступенчато гидролизует соли мио-инозит-гексакисфосфорной кислоты (фитаты) до мио-инозитола и неорганического фосфата. Фитаты являются запасным соединением фосфора в семенах высших растений. Содержание фитина в зерне колеблется от 0,4 до 3,2% от сухого веса семян, а фосфор фитина составляет 60-88% от общего содержания фосфора зерна [1, 2]. Из-за очень низкой фитазной активности в секретах пищеварительного тракта эта форма фосфора является недоступной для моногастричных животных (таких как свиньи и домашние птицы). В результате основная часть (50-70%) фосфора, входящего в состав кормов растительного происхождения, не усваивается организмом животных. Кроме того, фитиновая кислота связывается с ионами Ca2+, Zn2+, Cu2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+, с белками, крахмалом и липидами, образуя малорастворимые соединения, что значительно снижает питательную ценность кормов [1]. Для правильного формирования скелета животным требуется фосфор, поэтому в рацион животных добавляют неорганический фосфат, что заметно повышает стоимость кормового продукта. Альтернативным способом повышения пищевой ценности кормов является использование в качестве кормовой добавки фитазы [3, 4]. Данная работа посвящена выделению и исследованию свойств, а также возможности практического применения внеклеточной фитазы, секретируемой мицелиальным грибом Penicillium canescens.

2. Материалы и методы В работе использовали ферментный препарат, полученный на основе грибного штамма Р.canescens в ИБФМ РАН (г. Пущино) и сухой фитазный препарат «Natuphos 5000G» фирмы BASF (Германия). Для определения фитазной активности использовали фитат Na из риса (“Sigma”, США).

Выделение фитазы из препарата P.canescens осуществляли в три этапа: предварительная очистка (осаждение 80% от насыщения при 25 сульфатом аммония, обессоливание на колонке с акрилексом П-2), анионообменная хроматография (FPLC на колонке Source 15Q, “Pharmacia”, Швеция) и гидрофобная хроматография (FPLC на колонке Source 15 Isopropyl, “Pharmacia”, Швеция).

В экспериментах по исследованию влияние соков желудочно-кишечного тракта свиней на активность и стабильность фитазы использовали лиофилизованные образцы соков, полученные и сертифицированные по методикам Всероссийского научно-исследовательского института физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных РАСХН, ВНИИФБП, г. Боровск [5].





Методика оценки способности фитазы к увеличению питательной ценности кормов животных и птиц in vitro основывалась на измерении концентрации фосфат-ионов (Рi), образующихся при обработке (инкубация в течении 3 ч при 37, рН 2,5-7,0) ферментом суспензии компонентов кормов. Фермент дозировали по активности (75, 100 и 150 единиц фитазной активности на 1 кг корма).

3. Результаты и обсуждение С помощью хроматографии на различных носителях из культуральной жидкости мицелиального гриба P.canescens была выделена фитаза (мономерный белок, 63 кДа, pI 6,3, рН-оптимум активности 4,5-5,5, температурный оптимум активности 50). Как видно из таблицы 1, фитаза P.сanescens характеризовалась, с одной стороны, высокой удельной активностью по отношению к фитатам, а с другой – обладала весьма широкой субстратной специфичностью. Именно такая совокупность свойств, как было продемонстрировано [6] на примере фитаз из A.fumigatus (фермент с широкой специфичностью) и A.niger (фермент с узкой специфичностью), является наиболее предпочтительной с точки зрения использования фитазы в качестве кормовой добавки.

Известно [7, 8], что практически все грибные фитазы способны последовательно отщеплять от молекулы фитата пять фосфатных групп (расположенных в экваториальной конформации) из шести имеющихся, образуя в качестве конечного продукта мио-инозит-2-монофосфат (с аксиально ориентированной фосфатной группой).

Количественный анализ продуктов гидролиза фитата Na фитазой Р.сanescens показал, что максимальная глубина гидролиза субстрата составляет 83%, что соответствовало отщеплению пяти из шести возможных фосфатных групп. Этот вывод был подтвержден результатами ВЭТСХ продуктов гидролиза.

Таблица 1. Каталитические свойства фитазы А P.canescens: удельная активность (A, ед/мг) и кинетические константы гидролиза (kcat, Km) фосфат-содержащих субстратов (40, рН 5,0) kcat, с-1 kcat/Кm, мМ-1с- Субстрат Кm, мM A, ед/мг 210 ± 5 0,08 ± 0, Фитат Na (рис) 2625 165 ± 5 0,04 ± 0, Фитат Na (кукуруза) 4125 130 ± 4 0,03 ± 0, Фитат K-Mg 4333 120 ± 10 0,06 ± 0, Фитат Са 2000 45 ± 5 15 ± Глицерин-2-фосфат Na 3,0 4, 26 ± 4 17 ± Пиридоксаль-l,5’-фосфат 1,5 2, 230 ± 15 7± D-Глюкозо-6-фосфат Na 33 40 ± 10 0,27 ± 0, D-Фруктозо-6-фосфат Na 148 1, 190 ± 10 3,9 ± 0, D-Фруктозо-1,6-дифосфат Na 49 650 ± 50 20 ± 1-Нафтил-фосфат Na 32 240 ± 40 12 ± 2-Нафтил-фосфат Na 20 260 ± 40 5± п-Нитро-фенил-фосфат 52 Изучение влияния эффекторов (ионов металлов, органических соединений) на каталитическую активность фитазы Р.сanescens показало, что ионы Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Ba2+ и Co2+, а также ЭДТА не оказывали воздействия на каталитические свойства фитазы Р.сanescens, в то время как ионы Zn2+, Cu2+, Fe3+ и лактат- и цитрат-ионы обладали заметным ингибирующим эффектом.

Важной характеристикой фитазы с точки зрения ее практического применения является термостабильность. При 37 (температура тела животных) фитаза P.сanescens сохраняла 90% исходной активности через 3 ч инкубации в Na-ацетатном буфере при pH 3-6, а также в присутствии желудочного сока свиней при рН 3,0 (кислотность в желудке животных).





Способность фитазы P.сanescens гидролизовать фитат, входящий в состав природных субстратов, была исследована на примере кукурузной и соевой муки, являющихся основными компонентами кормовых диет.

Фитазный препарат «Natuphos 5000G» выступал в роли внутреннего стандарта, поскольку уже зарекомендовал себя на рынке ферментных препаратов как эффективная кормовая добавка, способствующая повышению усвояемости фосфора домашними животными за счет отщепления фосфатных групп фитатов зерновых и зернобобовых. Как видно из рисунка 1, фитаза P.сanescens не только не уступает препарату «Natuphos 5000G»

(примененному в тех же дозировках) по способности гидролизовать фитат, входящий в состав кукурузы и сои в широком диапазоне значений рН, но и превосходит его 1,5-6 раз. Таким образом, можно предположить, что фитаза P.сanescens может быть использована в качестве эффективной кормовой добавки.

80 Фитаза P.canescens "Natuphos 5000G" Фитаза P.canescens "Natuphos 5000G" 150 ед.акт./кг Прогидролизованный фитат, % Прогидролизованный фитат, % 100 ед.акт./кг 150 ед.акт./кг 75 ед.акт./кг 100 ед.акт./кг 20 75 ед.акт./кг 40 0 2.5 4 5.5 6 7 2.5 4 5.5 6 7 3.5 4.5 5.5 6.0 7.0 3.5 4.5 5.5 6.0 7. pH pH а) б) Рисунок 1: Результаты прикладных испытаний фитазы P.canescens in vitro: выход Pi при гидролизе соевой (а) и кукурузной муки (б).

Литература (1) Vohra A., Satyanarayana T. (2003) Critical Reviews in Biotechnology, 23, No 1, 29-60.

(2) Egli I. et al. (2002) Journal of Food Science, 67, No 9, 3484-3488.

(3) Zyla K. (2001) Journal of Animal and Feed Science, 10, 247-258.

(4) Wodzinski R.J., Ullah A.H. (1996) In: Advances in Applied Microbiology, v.42, Academic Press, Inc., pp. 263-302.

(5) Engelen A.J. et al. (1994) Journal of AOAC International, 77, No. 3, 760-764.

(6) Wyss, M. et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol., 65, No 2, 367-373.

(7) Greiner R. et al. (2001) J. Agric. Food Chem., 49, 2228-2233.

(8) van Hartingsveldt W. et al. (1993) Gene, 127, 87-94.

НОВЫЕ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ Скомаровский А.А., Синицын А.П.

Кафедра химической энзимологии, Московский государственный университет, Москва 119899, Россия.

askomarovsky@mail.ru Ключевые слова: целлобиогидролаза, -глюкозидаза, гидролитическая способность.

1. Ведение В настоящее время процесс биоконверсии растительной биомассы сконцентрирован на ферментативном гидролизе целлюлозы до глюкозы с последующим сбраживанием до этанола. Природная древесина и отходы ее переработки, представляют потенциальный интерес как дешевый и возобновляемый источник для получения различных продуктов и топлива. Тем не менее, природная древесина и другие целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию. Для повышения реакционной способности древесины на сегодняшний день экономический интерес представляют такие методы предобработки, как паровой взрыв и обработка водно-этанольной смесью в кислой среде (органозольвом).

Стоимость предобработки, а также эффективность гидролитического действия целлюлазных комплексов являются основными факторами, влияющими на экономическую рентабельность процессов биоконверсии лигноцеллюлозной биомассы.

Свойства индивидуальных ферментов, а также их взаимодействие в составе целлюлазного комплекса определяют его эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов.

Целью данной работы являлось: оценка реакционной способности различных сортов древесины и эффективности разных способов ее предобработки;

определение гидролитической способности различных целлюлазных полиферментных систем, изучение роли -глюкозидазы в процессе гидролиза.

2. Материалы и методы В работе были использованы следующие ферментные препараты целлюлаз Trichoderma: Целловиридин Г20х (ПО «Сибфарм», Бердский завод биологических препаратов);

TW-1. (ИБФМ РАН, г. Пущино);

TW- (ИБФМ РАН, г. Пущино);

Celluclast 1.5 L ( Novozymes, Дания);

Fibrilase HDL 160 (Iogen, Канада);

целлюлазы Penicillium – В1 (ИБФМ РАН, г.Пущино);

В40 (ИБФМ РАН, г. Пущино);

В221-151 (ИБФМ РАН, г. Пущино);

В221-6 (ИБФМ РАН, г. Пущино). В качестве источника целоллобиазы (-глюкозидазы) использовали ферментный препарат Novozym 188 (Novozymes, Дания).

В качестве объектов для глубокого осахаривания использовали образцы предобработанной разными способами (паровой взрыв, делигнификация органозольвом) древесины разных пород дерева: (1) Douglas Fir Organosolv (Ethanol) Pulp (пихта, лжетсуга тиссолистная);

(2) steam-exploded Douglas Fir;

(3) steam-exploded Douglas Fir + 10% Bark;

(4) Lodgepole Pine Organosolv (Ethanol) Pulp (сосна);

(5) Poplar Organosolv (Ethanol) Pulp (тополь);

(6) Maple Organosolv (Ethanol) Pulp (клен) 3. Результаты и их обсуждение На рис.1 представлены результаты оценки гидролитической способности ферментных препаратов по различным субстратам.

#1 пихта (органозольв) #2 пихта (паровой взрыв) #3 пихта+10% коры (паровой взрыв) #4 сосна (органозольв) #5 тополь (органозольв) #6 клен (органозольв) 16 14 12 глюкоза г/л 10 вс, г/л 8 6 4 2 0 L L L as # L D # cl D # 0Х. 0Х cl TW 7 #. H H TW t llu 1 TW Г llu 1- Г t se se Ce 2 as ila ila Ce TW TW B TW br br B Fi Fi Рисунок 1. Выход сахаров после 12 часов гидролиза различных образцов предобработанной древесины. Условия:

50оС, рН 5, перемешивание 250 об/мин, [S]= 50 г/л (сухой вес), 10 Ед АФБ/г сухого субстрата.

Как видно, наиболее подвержена ферментному разрушению древесина пихты и тополя (субстраты № 1, 5), обработанная органозольвом (подкисленной этанольно-водной смесью при высокой температуре). Меньшую реакционноспособность проявила древесина, обработанная паровым взрывом (субстраты № 2 и 3.).

Образцы № 2 и 3 показали высокий выход восстанавливающих сахаров (ВС) без ферментативного воздействия – до 3 г/л в условиях гидролиза, видимо, вследствие частичной деполимеризации при предобработке.

Наиболее высокая степень конверсии субстратов была достигнута под действием целлюлазного препарата В221-151 (Penicillium), причем этот препарат приводил к образованию только глюкозы.

Вклад -глюкозидазы в эффективность осахаривания продемонстрирован на гидролизе предобработанного субстрата №1 различными целлюлазными препаратами при в условиях экспериментально подобранной насыщающей концентрации -глюкозидазы (рис.2). Добавление в реакционную смесь избытка -глюкозидазы значительно увеличивает степень конверсии предобработанной древесины и выход глюкозы.

глюкоза, г/л а) 50 б) L L - L 85. D B,2 B 1 D l) Ce W- - t - B H (0 m B m H 1 TW B as se B se T 79 zy B cl ila B ila llu #9 ovo br br Fi Fi N Рисунок 2. Выход глюкозы после 12 ч гидролиза образца предобработанной древесины №1 (50 г/л, сухой вес) а) без -глюкозидазыб) с избытком -глюкозидазы (Novozym 188). Условия: 50оС, рН 5, 250 об/мин. Во всех случаях суммарное содержание белка ферментных препаратов в реакционной смеси составляло 25 мг/г субстрата (сухой вес).

Вклад -глюкозидазы наиболее заметен в случае целлюлазных препаратов Trichoderma, имеющих в отличие от препаратов Penicillium крайне незначительную собственную -глюкозидазную активность (практически в 3 раза увеличивается выход глюкозы).

4. Заключение 1. Предобработка древесины органозольвом и паровым взрывом существенно увеличивает реакционную способность древесины, причем предобработка органозольвом являются более эффективной.

2. Препараты на основе ферментов Penicillium значительно эффективнее гидролизуют различные виды предобработанной древесины, чем препараты на основе ферментов Trichoderma.

3. Эффективность ферментативного гидролиза определяет сбалансированность компонентного состава ферментных препаратов, а также наличие достаточного количества -глюкозидазы.

РЕГИСТРАЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ОСНОВАНИИ ИЗМЕНЕНИЙ АКУСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СРЕДЫ Сотников Д.В.1, Гендриксон О.Д. 1, Приев А.2, Мартьянов А.А. 1, Жердев А.В. 1, Дзантиев Б.Б. Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский проспект 33, Россия Факультет биохимии, Медицинская школа Хадассах, Университет г. Иерусалима, п/я 12272, 91120 Иерусалим, Израиль Sotnikov-d-i@mail.ru Ключевые слова: ультразвук, акустометрия, иммуноферментный анализ, -амилаза, пестициды.

1. Введение Поскольку многие перестройки биомолекул влияют на адиабатическую сжимаемость растворов и гидратацию растворенных веществ, изменения скорости распространения ультразвуковых волн могут рассматриваться как контролируемый параметр для регистрации биохимических процессов (1, 2).

Акустические свойства растворов чувствительны также к различным процессам с корпускулярными компонентами – агрегации, лизису и др. (3, 4). Исходя из этого, в настоящей работе была изучена возможность применения в иммуноанализе регистрации с помощью портативного акустометрического детектора (5).

Работа включала выбор фермента-маркера, синтез реагентов для гомогенного фермент-модулирующего иммуноанализа (EMIT), оптимизацию методики и определение характеристик иммуноанализа.

2. Материалы и методы Акустометрический детектор регистрирует скорость распространения и степень поглощения ультразвуковых волн разной частоты как при фиксированной температуре, так и при ее сканировании в диапазоне 10-90 °C. Измерительная ячейка прибора представляет собой металлическую трубку, генерирующую радиальные осцилляции в столбике заполняющей ее жидкости. Частота резонатора пропорциональна скорости ультразвука, а ширина резонансного пика – изменению скорости ультразвука.

Объем анализируемой пробы – 0,05-0,2 мл.

Разработку EMIT-анализа осуществляли на примере определения гербицида атразина. Сукцинимидно карбодиимидным методом был синтезирован конъюгат -амилазы с карбоксилированным производным атразина. Мольное содержание гаптена в конъюгате определяли методом дифференциальной спектроскопии и титрованием свободных аминогрупп на поверхности белка-носителя. Конъюгат характеризовали по степени сохранения каталитической активности и способности связываться со специфическими антителами в схеме гетерогенного иммуноферментного анализа (ИФА).

При проведении EMIT-анализа объединяли растворы содержащей атразин пробы (в диапазоне концентраций от 50 мкг/мл до 0,1 нг/мл), конъюгата -амилаза-атразин и антител против атразина, затем добавляли 1%-ный раствор крахмала и регистрировали сигнал на акустометре.

3. Результаты и обсуждение Выбор маркера для иммуноферментного акустометрического анализа Принципиальными требованиями к ферменту-маркеру, используемому в акустометрическом иммуноанализе, являются доступность, простота конъюгирования и проведения каталитической реакции, а также высокочувствительная детекция трансформации субстрата по индуцируемым изменениям акустических свойств раствора. Для 14 ферментов, включая -, - и глюкоамилазы из различных источников, галактозидазу, -химотрипсин, щелочную протеазу, пероксидазу, рибонуклеазу, щелочную фосфатазу, уреазу и креатинкиназу, были в оптимальных условиях проведения каталитических реакций получены кинетические и концентрационные зависимости трансформации субстратов.

В качестве оптимального маркера была выбрана бактериальная -амилаза. Высокая чувствительность измерения ее активности обусловлена тем, что -амилаза гидролизует полимерные субстраты, изменяя как гидратацию продукта, так и общую вязкость раствора. Фермент может быть достоверно определен акустометрически для концентраций до 0,1 мкг/мл, что соответствует уровню конъюгированного гаптена 1- нг/мл и обеспечивает возможность выявлять нативный антиген в образцах как минимум в том же концентрационном диапазоне.

Характеристика иммуноферментного акустометрического анализа Реализованный анализ основан на модуляции активности конъюгата амилаза-атразин в составе комплекса с антителами, вызываемой либо конформационными изменениями фермента, либо стерическими препятствиями к взаимодействию с субстратом. Показано, что амилолитическая активность синтезированного конъюгата ингибируется высокими концентрациями антител к атразину (в виде IgG либо антисыворотки). Исходный уровень активности восстанавливается при добавлении содержащей антиген пробы вследствие конкуренции свободных и меченых молекул антигена за связывание с антителами. В соответствии с этим степень восстановления активности конъюгата отражает концентрацию определяемого антигена в пробе. Общий принцип анализа представлен на рис. 1.

Отсутствие антигена в образце Неактивная -амилаза.

Негидролизованный крахмал Аг-Ф Наличие антигена в образце АТ Активная -амилаза.

Гидролизованный крахмал Аг Рисунок 1. Принцип гомогенного иммуноанализа с -амилазой в качестве маркера: АТ – антитела против анализируемого антигена, Аг – определяемые молекулы антигена, Аг-Ф – конъюгат антигена с -амилазой.

Реализованная на примере атразина аналитическая система позволяет детектировать до 0,1 нг/мл гаптена (рис. 2), что соответствует контролируемым уровням его содержания при мониторинге окружающей среды и пищевой продукции. Продолжительность анализа составляет 20 мин. Таким образом, время определения антигена сокращается в 3-4 раза по сравнению с традиционным микропланшетным иммуноферментным анализом (ИФА) (6). Следует отметить, что предлагаемая аналитическая процедура не требует никаких дополнительных стадий, кроме добавления реагентов и регистрации акустического сигнала, т.е. она методически существенно проще традиционного ИФА с поэтапным внесением реагентов и несколькими циклами отмывки микропланшета.

Рисунок 2. Калибровочная кривая определения атразина методом EMIT-анализа с использованием акустометрического детектора.

4. Заключение Изменение скорости распространения ультразвука в растворе, вызываемое биохимическими процессами, является эффективным параметром для определения содержания биологически активных соединений. На основании данного подхода реализован иммуноанализ с акустометрической регистрацией. Получены реагенты для гомогенного иммуноферментного определения гербицида атразина, установлены оптимальные протоколы их синтеза и проведения конкурентной иммунодетекции. Благодаря исключению диффузионно-зависимых стадий продолжительность анализа сократилась до 20 мин с сохранением чувствительности 0,1 нг/мл.

Предложенный метод обеспечивает повышение экспрессности иммуноанализа и может быть использован для детекции различных практически значимых соединений.

Благодарности Работа выполнена при поддержке гранта INTAS 03-56-150 «Portable ultrasonic sensor for express immunodetection of low and high molecular weight compounds».

Литература (1) Dahint R., Bender F., Morhard F. (1999) Anal. Chem., 71, 3150-3156.

(2) Приев А.И., Сарвазян А.П., Дзантиев Б.Б. и др. (1990) Молек. биол., 24, 629-637.

(3) Coulibaly H., Razavian M., Rameau P. et al. (1994) Transfus. Clin. Biol., 1, 135-140.

(4) Ellis R.W., Sobanski M.A. (2000) J. Med. Microbiol., 49, 853-859.

(5) Жердев А.В., Приев А., Гендриксон О.Д. и др. (2005) Физиология и патология иммунной системы, 8, 31-36.

(6) Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Романенко О.Г. и др. (1995) Прикл. биохим. микробиол., 31, 134-139.

ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК-АПТАМЕРОВ, ПОЛУЧЕННЫХ К ПОЛИМЕРНЫМ ФОРМАМ NM-ФРАГМЕНТА БЕЛКА SUP35P Сурина Е.Р., Митькевич О.В. ФГУП ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1, Россия Российский Кардиологичекий Научно-Производственный Комплекс РосЗдрава, Институт Экспериментальной Кардиологии, 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, дом 15а, Россия lab18@genetika.ru Ключевые слова: прионы, Sup35p, SELEX, аптамеры 1. Введение Прионы - это особый класс белков, вызывающих неизлечимые заболевания центральной нервной системы человека и животных. Главной их особенностью является способность существовать как минимум в двух конформационно различных состояниях: функциональном и прионном. Переход этих белков из функционального в прионное состояние может осуществляться спонтанно или индуцироваться в процессе взаимодействия с предсуществующими прионными формами тех же белков. При этом прионизация белков сопровождается их полимеризацией и образованием амилоидоподобных фибрилл (1).

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae прионные свойства некоторых белков могут обусловливать возникновение нехромосомно-наследуемых генетических детерминант. В частности, детерминант [PSI+] возникает в результате прионизации белка Sup35p. При изучении доменной структуры этого белка выяснилось, что за его прионные свойства отвечает N-концевая область, подразделяемая на собственно N концевой (N) и средний (M) домены. Показано, что очищенный фрагмент NM белка Sup35p обладает прионными свойствами и способен in vitro полимеризоваться с образованием амилоидоподобных фибрилл.

Белок Sup35p не представляет опасности для человека, и поэтому являются удобной моделью для изучения прионного феномена (2).

SELEX представляет собой циклическую процедуру обогащения in vitro исходной смеси рандомизированных олигонуклеотидов молекулами, обладающими за счет их пространственной структуры способностью связывать заданную мишень (3). Результатом осуществления SELEX являются аптамеры – отобранные в ходе нескольких циклов селекции одноцепочечные олигонуклеотиды с установленной первичной структурой, специфически взаимодействующие с избранной мишенью.

Целью данной работы является получение ДНК-аптамеров к прионным формам белка Sup35NMp и исследование их свойств.

2. Материалы и методы Процедуру отбора ДНК-аптамеров проводили в буфере PBS 5mM(pH6.0), NaCl 150mM+2mM MgCl2.

Исходным материалом для SELEX служила смесь 90-членных олигонуклеотидов с известными 25-членными флангами и рандомизированной 40-нуклеотидной серединой. Мишенью для связывания служил полимеризованный in vitro белок Sup35NMp. Отделение связавшихся олигонуклеотидов от оставшихся в растворе проводили, осаждая белок-мишень центрифугированием. Для антиселекции использовали растворимую мономерную форму Sup35NMp. Для амплификации связавшихся олигонуклеотидов испольльзовали «несимметричную» ПЦР. Проведя 9 циклов селекции отобранные ДНК-олигонуклеотиды амплифицировали в виде ds-ДНК, клонировали и секвенировали.

Для исследования свойств выбранные олигонуклеотиды синтезировали в 5’-биотинилированном виде, прегибридизовали их с коньюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена (ИМТЕК) и использовали в ИФА подобной методике и в блоте.

3. Результаты и обсуждение В ходе проведения SELEX были получены ДНК-аптамеры к полимерной форме белка Sup35NMp, 11 из которых были синтезированы. Анализ свойств синтезированных аптамеров с использованием ИФА-подобной методики показал (Рис.1), что все аптамеры связываются как с полимерной формой Sup35NMр, так и с фибриллами Sup35Q70Mр (белок Sup35NMр, содержащий вместо N-домена 70 остатков глутамина).

Возможны два альтернативных объяснения полученных результатов: либо сайты связывания аптамеров располагаются в области М-домена Sup35р, входящего в состав обоих исследованных полимеров, либо эти белки имеют сходную пространственную структуру, не зависящую от аминокислотной последовательности домена, отвечающего за их способность к полимеризациии.

1, 1, 1, 1, фибриллы-Sup35NMp фибриллы-Sup35Q70Mp 0, 0, 0, 0, S6 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S Рисунок 1: Графическое представление эффективности связывания биотинилированных аптамеров с полимерными формами рекомбинантных белков Sup35NMp и Sup35Q70Mp. S8-S18 – исследуемые аптамеры, S6 – отрицательный контроль (биотинилированный аналог sense-праймера, использовавшегося для амплификации олигонуклеотидов при проведении SELEX).

Свойства аптамера S12, показавшего наиболее сильное связывание по данным ИФА, были исследованы при помощи блот-анализа с использованием метода SDS-AGE (4). Для этого в агарозном геле разделили прионные формы Sup35р, очищенные из различных [PSI+] штаммов дрожжей, а также полимеризованный in vitro образец Sup35NMp. После разделения белки перенесли на PVDF-мембрану и обработали либо меченым (см. выше) аптамером, либо поликлональными антителами к Sup35р. Как видно из представленных данных (Рис.2), S12 и антитела к Sup35р обладают сходными свойствами связывания в отношении полимерных форм белков Sup35р и Sup35NMр. При этом S12 не связывается с мономерной формой Sup35NMр, в состав которого входит М-домен – область локализации потенциальных сайтов связывания аптамеров (см. выше). Таким образом, связывание по крайней мере одного из полученных аптамеров с полимерными формами белков Sup35Q70Mр и Sup35NMp не зависит от наличия в их составе указанного домена.

А Б Рисунок 2: Блот-анализ свойств аптамера S12. А – мембрана обработана меченым аптамером S12, Б – мембрана обработана поликлональными антителами к Sup35р. Дорожка 1: полимеризованный in vitro белок Sup35NMp (видна неполная полимеризация);

дорожки 2-4: прионные формы белка Sup35p, очищенные из клеток различных [PSI+] штаммов дрожжей.

4. Заключение В результате проделанной работы были получены и частично охарактеризованы аптамеры к белку Sup35NMр. Показано, что полученные аптамеры проявляют сродство к полимерным формам белков Sup35NMp и Sup35Q70Mр. Аптамер S12 связывается также с прионными формами Sup35p, выделенными из клеток дрожжей.

Литература (1) Тер-Аванесян М.Д, Кушниров В.В. (1999) Биохимия, 1999, 64(12), 1638- (2) Glover J.R., Kowal A.S., Schrimer E.C., Patino M.M., J-J Liu, Lindquist S (1997), Cell, 89, 811- (3) Tuerk C., Gold L. (1990) Science, 249, 505- (4) Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D. (2003) JBC, 278 (49), 49636-49643.

УЧАСТИЕ РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНОЙ АССОЦИАЦИИ НА ОСНОВЕ ЭЛОДЕИ КАНАДСКОЙ В БИОДЕГРАДАЦИИ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ Тумайкина Ю.А., Турковская О.В., Игнатов В.В.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049 Саратов, проспект Энтузиастов 13, Россия biotech@ibppm.sgu.ru Ключевые слова: растительно-микробная ассоциация, биоремедиация, нефтепродукты 1. Введение Нефть, поступая в воду, растекается по поверхности, летучие нефтепродукты испаряются, часть оседает на дно (1). В то же время полярные нефтяные углеводороды растворяются в водной фазе и оказывают прямое токсическое воздействие на водные организмы. Исследования показали, что ароматические углеводороды составляют до 80 % водорастворимой фракции нефти (ВФН) (2, 3).

Устойчивость и деструктивная активность высших водных растений и микроорганизмов к поллютантам составляют основу биотехнологии очистки и восстановления водоемов – фиторемедиации, которая наиболее близка к природным процессам самоочищения. Вместе с тем, неполнота сведений о реальных механизмах самоочищения заставляет продолжать изучение природных ассоциаций с целью увеличения эффективности фиторемедиации.

Цель работы – определение деструктивного потенциала водного растительно-микробного сообщества, образованного элодеей канадской, для выявления его роли в процессах самоочищения водоемов от нефтепродуктов.

2. Материалы и методы Объектами исследований являлись элодея канадская (Elodea canadensis) и 2 штамма бактерий, выделенных с ее поверхности, - Brevundimonas diminuta El-3.1 и Pseudomonas fluorescens El-2.1.

Для стерилизация побеги элодеи предварительно отмывали проточной дистиллированной водой, подвергали УФ-обучению в течение 5 мин и вносили в колбы со 100 мл дистиллированной воды и смесью антибиотиков. Инкубировали 24 ч в затемненных условиях на круговой качалке при 150 об/мин. Затем растения отмывали большим количеством стерильной воды.

Для изучения деструктивной активности выделенных штаммов по отношению к индивидуальным нефтепродуктам использовали минеральную среду М9 (г/л): Na2HPO4 – 6,0;

KH2PO4 – 3,0;

NaCl – 0,5;

NH4Cl – 1,0;

рН 7,2-7,4. Для растений жидкие среды разбавляли в 2 раза. Углеводороды добавляли асептически в концентрациях (г/л): фенол – 0,2;

толуол, бензол, нафталин, фенантрен – 0,1. Суспензию двухсуточной культуры микроорганизмов добавляли до оптической плотности 0,1 по КФК-2. Содержание углеводородов определяли методом УФ-спектрометрии (4).

3. Результаты и обсуждение Сообщество погруженных макрофитов, к которым принадлежит элодея канадская, и их перифитонные микроорганизмы, вероятно, более существенную роль при деградации ВФН. В связи с этим нами была оценена деструктивная активность водных организмов по отношению к отдельным ароматическим соединениям, входящим в состав ВФН: фенол, бензол, толуол, нафталин и фенантрен.

По полученным данным, фенол (0,2 г/л) оказался наиболее доступным субстратом для исследуемых водных организмов, что, вероятно, связано с его относительно высокой растворимостью в воде (0,82 %). Все исследуемые организмы, кроме B. diminuta El-3.1, чья активность составила 81,8 %, полностью разрушили фенол за 10 сут. (рис. 1). При этом отмечено, что за трое суток перифитон снизил содержание фенола до 62- мг/л, стерилизованная элодея – до 70 мг/л, в то время как нативное растение, быстро адаптировавшись к измененным условиям среды, полностью разрушило внесенный ксенобиотик (рис. 2). Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что при деструкции фенола сообществом наблюдался отчетливый эффект синергизма.

При исследовании деструкции толуола (0,1 г/л) нами было установлено, что растение, более активно, чем микроорганизмы.

Деструкция, % 20 фенол нафталин толуол бензол Рисунок 1. Биодеструкция ароматических углеводородов водными организмами за 10 сут. 1 – растительно микробная ассоциация элодеи канадской, 2 – B. diminuta El-3.1, 3 – стерилизованная элодея, 4 – P. fluorescens El-2.1.

1 2 4 Концентрация, мг/л 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Сутки Рисунок 2. Динамика разрушения фенола (0,2 г/л) и нафталина (0,1 г/л) водными организмами. 1 – абиотический контроль, фенол;

2 - абиотический контроль, нафталин;

3 – стерилизованная элодея, фенол;

4 – B. diminuta El-3.1, фенол;

5 – P. fluorescens El-2.1, фенол;

6 - растительно-микробная ассоциация элодеи, фенол;

7 - B. diminuta El-3.1, нафталин;

8 - P. fluorescens El-2.1, нафталин.

Толуол подвергался деструкции всеми исследованными организмами, но наиболее активной оказалась растительно-микробная ассоциация и стерилизованная элодея (83 %) (рис. 1). Для штамма P. fluorescens El-2. толуол являлся более жестким субстратом по сравнению с фенолом. Деструктивная активность штамма составила лишь 40,8 %;

штамм B. diminuta El-3.1 показал промежуточные значения - 69,2 %.

Бензол (0,1 г/л) оказался самым токсичным для водных организмов из всех исследованных субстратов. Его внесение приводило к резкому ухудшению состояния стерилизованной элодеи в течение 5 дней.

Деструктивная активность перифитонных микроорганизмов была невысока: 27,8 - 36,4 %. Растительно микробная ассоциация имела лучший показатель - 77,7 %, хотя в сравнении с другими моноароматическими соединениями он был наименьшим.

В качестве представителей ПАУ исследовали нафталин и фенантрен. Фенантрен (0,1 г/л) не подвергался разрушению изучаемыми организмами. Нафталин (0,1 г/л) окислялся перифитонными штаммами с высокой скоростью: до 3-7 мг/л за трое суток (рис. 2). Наиболее активным оказался штамм B. diminuta El-3.1 (97 %).

Деструктивная активность нативной элодеи, где количество перифитонных микроорганизмов значительно уступает используемой в эксперименте суспензии, тем не менее, высока – 89,9 % (рис. 1). Стерилизованная элодея оказалась наименее активна по отношению к нафталину, концентрация которого снизилась лишь на 27,7 %.

Заключение В деструкции ароматических углеводородов принимали участие все компоненты исследуемой растительно-микробной ассоциации. В деградации нафталина ведущая роль принадлежит перифитонным микроорганизмам. Водное растительно-микробное сообщество на основе элодеи канадской обладает наиболее высоким деструктивным потенциалом в отношении исследованных субстратов. Это позволяет говорить об активном участии этого объекта в процессах самоочищения водоемов и служит основой для разработки экологических биотехнологий очистки и восстановления загрязненных экосистем.

Литература (1) Wang X. et al. (2002) Hydrobiol., 469, 179–191.

(2) Saeed Т., Al-Mutairi M. (2000) Water, Air and Soil Poll., 120, 107-119.

(3) Долгополова А.В. и др. (1991) Химия и технология воды, 10, 909-911.

(4) Чекалов В.П. А.с. СССР №16293183 (1991) Б.И, 7, 63.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИЭПИТОПНЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Ужаченко Р.В., Карпенко Л.И.

ФГУН ГНЦ ВБ “Вектор” uzhachenko@mail.ru Ключевые слова: ВИЧ-1, ДНК-вакцина, ВПЧ 1. Введение По данным ВОЗ, в настоящее время насчитывается более 40 млн. человек, инфицированных ВИЧ-1.

Быстрые темпы распространения, а также высокая летальность детерминируют поиск эффективной вакцины против ВИЧ-инфекции. Одним из наиболее перспективных направлений в этой области является дизайн и исследование иммуногенной активности полиэпитопных вакцин – искусственных белков, содержащих антигенные детерминанты из нескольких вирусных белков.

В ФГУН ГНЦ ВБ “Вектор” (Кольцово, Новосибирская обл.) были получены две полиэпитопные анти-ВИЧ вакцины, направленные на формирование гуморального (TBI – T- and B-cell immunogene) и клеточного (TCI – T-cell immunogene) иммунитета. TBI является четырех-альфа-спиральным белком, в котором В-клеточные и Т хелперные эпитопы из env и gag ВИЧ-1 представлены в нативной конформации. В то же время, TCI (392 а.о.) включает в себя 80 антигенных детерминант из белков env, gag, pol и nef для цитотоксических Т-лимфоцитов.

Цель работы: сравнительный анализ иммуногенной активности полиэпитопных вакцин против ВИЧ-1 на основе белков TBI и TCI.

2. Материалы и методы Для иммунизации были использованы мыши линии Balb/c весом 15 г. Животным вводили в/м одну дозу КомбиВИЧвак двукратно с интервалом через 2 недели.

Для определения титра антител к ВИЧ-1 в сыворотках иммунизированных мышей был использован непрямой ИФА. В качестве антигенов на плашки сорбировали белки recA-TBI, TCI, а 0также ВИЧ-лизат.

Антигены вируса ВИЧ-1 в концентрации 1 мкг/лунку и в объеме 100 мкл адсорбировали при 4 С в течение 15 ч.

Специфичность анти-ВИЧ-IgG, образующихся при вакцинации КомбиВИЧвак, была исследована методом иммуноблотинга с применением тест-системы “Блот-ВИЧ1/2+0” для выявления антител к антигенам ВИЧ-1 и -2.

Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в тесте нейтрализации на модели острой инфекции лимфобластоидных клеток МТ4 ВИЧ-1, при этом использовали референс-штамм ВИЧ-1 IIIB, активно реплицирующийся в Т-лимфобластоидных клеточных линиях. Индекс нейтрализации рассчитывали по количеству вирусспецифического белка р24 в каждой пробе методом ИФА с использованием коммерческой тест-системы “ВектоВИЧ-1-р24-подтверждающий тест” производства “ЗАО Вектор-Бест”.

Специфический цитотоксический ответ оценивали в реакции ELISpot, которую проводили согласно инструкции по применению фирмы “BD”. Для стимуляции лимфоцитов использовали рекомбинантный белок TCI (1 мкг/мл) и два H-2d-специфических пептида (фрагменты белка env), которые содержатся в последовательности белка TCI.

3. Результаты и обсуждение В данной работе были изучены полиэпитопные вакцины на основе белков TBI и TCI, которые были представлены в разных конструкциях.

1) рекомбинантный белок TBI;

2) рекомбинантный белок TBI с адъювантом Al(OH)3;

3) вирусоподобные частицы (ВПЧ), поверхность которых содержала TBI, а коровая часть ВПЧ несла плазмиду pcDNA3.1 (ВПЧ-TBI-pcDNA3.1);

4) ВПЧ-TBI, содержащие плазмиду с геном белка TCI (КомбиВИЧвак).

ДНК-вакцина pcTCI включалась в структуру ВПЧ, коровая часть которых – плазмида с геном иммуногена – была покрыта оболочкой из спермидин-полиглюкина, а также в состав КомбиВИЧвак.

Системный гуморальный иммунитет оценивали по выявлению специфических IgG в сыворотке иммунизированных животных. Так, было показано, что иммунизация TBI сопровождается появлением антител против данного белка, максимальный титр которых регистрируется на 35 сут. (1:300) с последующим снижением величины показателя на 62 сут. (1:80). В то же время, введение TBI с адъювантом Al(OH) приводит к существенному увеличению содержания специфических антител на 35 сут. (1:59.000).

Аналогичное действие оказывает включение TBI в состав ВПЧ (ВПЧ-TBI-pcDNA) (титр антител – 1:53.300).

Наконец, наиболее сильный гуморальный ответ наблюдался в случае КомбиВИЧвак (1:320.000).

При исследовании иммуногенных свойств вакцин, содержащих TCI, в качестве антигена, помимо TBI, использовался TCI. Так, введение мышам ВПЧ-pcTCI вызывало образование антител против TCI с низким значением титра (1:50). В то же время, КомбиВИЧвак индуцирует на 35 сут. более сильный гуморальный ответ (1:800). Между тем, величина этого ответа была такой же, как в случае иммунизации ВПЧ-TBI-pcDNA3.1, вакцины, отличающейся от КомбиВИЧвак тем, что вместо pcTCI коровая часть ВПЧ образована pcDNA3.1.

В настоящей работе в качестве антигена в ИФА также был использован лизат ВИЧ-1 для изучения связывания специфических антител с вирусными белками. При этом было показано, что иммунизация белком TBI вместе с адъювантом Al(OH)3, либо включение TBI в состав ВПЧ (ВПЧ-TBI-pcDNA3.1) сопровождается появлением анти-ВИЧ-IgG на 35 сут. (1:320). В то же время, более высокий титр специфических антител наблюдался в случае КомбиВИЧвак (1:640).

Таким образом, вакцины на основе TBI вызывают формирование выраженного гуморального ответа против антигенов ВИЧ-1. При этом самый высокий ответ наблюдался в случае КомбиВИЧвак, что позволяет рассматривать ее в качестве высокоэффективной кандидатной анти-ВИЧ-вакцины. В связи с этим, было проведено более детальное изучение иммуногенных свойств КомбиВИЧвак.

Реакцию вируснейтрализации, оцениваемую по ингибированию вирусной репликации, проводили с сыворотками животных, полученными на 35 сут. (через неделю после бустер-иммунизации). Вирусная репликация регистрировалась по количеству белка р24 ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-1. Было показано, что сыворотки мышей, иммунизированных КомбиВИЧвак, в разведениях 1:50 и 1:100 эффективно подавляют размножение ВИЧ-1 внутри клеток на 60-75%, что сопоставимо с активностью сывороток ВИЧ положительных пациентов.

Специфичность анти-IgG, образующихся при иммунизации, была исследована методом иммуноблотинга с применением рекобинантных вирусоспецифических полипептидов. При этом было показано, что антитела сыворотки иммунизированных мышей эффективно связываются с антигенными детерминантами белков env и gag ВИЧ-1. Таким образом, иммунизация КомбиВИЧвак сопровождается формированием спектра антител широкой специфичности, которые узнают поверхностные белки ВИЧ-1 и обладают вируснейтрализующей активностью.

Формирование клеточного ответа у животных, иммунизированных вакцинами на основе TBI и TCI, оценивали с помощью теста IFN--ELISpot. Введение белка TBI отдельно, либо в комбинации с Al(OH)3 или в составе ВПЧ не сопровождается развитием регистрируемого на 62 день цитотоксического ответа. В то же время, ВПЧ-pcTCI и КомбиВИЧвак индуцируют специфическую цитотоксичность в ответ на стимуляцию TCI (300 и 170 спотов/106 спленоцитов соответственно).

Таким образом, при сравнительном анализе иммуногенных свойств вакцин на основе полиэпитопных белков TCI и TBI было показано, что:

1. Вакцины на основе TBI (TBI с Al(OH)3, ВПЧ-TBI-pcDNA3.1, Комби-ВИЧ-вак) вызывают формирование гуморального ответа против антигенов ВИЧ-1, наибольшая величина которого достигается при совместном введении с адъювантом, либо включении белка в состав ВПЧ.

2. Вакцины на основе TСI (ВПЧ-pcTCI, КомбиВИЧвак) индуцируют формирование специфического клеточного иммунитета, в то время как ни TBI, ни TBI с Al(OH)3, либо ВПЧ-TBI-pcDNA3.1 не оказывают влияния на цитотоксический ответ.

3. Наиболее выраженное влияние на параметры гуморального и клеточного ответа против ВИЧ-1 среди изученных кандидатных вакцин на основе TBI и TCI оказывает Комби-ВИЧ-вак, несущая антигенные детерминанты как для B-клеток, так и для CD8 Т-лимфоцитов. КомбиВИЧвак может быть использована при создании препаратов для профилактической и терапевтической профилактики ВИЧ-1 инфекции.

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ МЕНЕДЖМЕНТА КАЧЕСТВА В ЛАБОРАТОРИЯХ В СООТВЕТСТВИИ С ТРЕБОВАНИЯМИ МЕЖДУНАРОДНОГО СТАНДАРТА ISO/IEC 17025: Фурманов А.А., Гончар Р.С. Украинская лаборатория качества и безопасности продукции АПК, Киев 03041 ул. Полковника Потехина, 16, Украина Национальный аграрный университет Украины, Киев 03041 ул. Героев Обороны, 15, Украина furmanov@twin.nauu.kiev.ua Ключевые слова: система менеджмента качества, аккредитация, компетентность 1. Введение Целью наших исследований является обеспечение организаций разных типов и видов деятельности средствами и методами для создания системы менеджмента качества и для обеспечения гарантий качества, которые будут удовлетворять его внутренние потребности, потребности его клиентов (потребителей), отвечать требованиям любого регуляторного органа, с которым организация сотрудничает. Одним из условий обеспечения конкурентоспособности производителя является внедрение эффективной системы качества продукции и услуг, аккредитация лабораторий и инспекций. Создание систем менеджмента качества (СМК), оценка рисков (в т.ч. производственных), забота о безопасности продукции – будет способствовать лучшему использованию сырья, ресурсов, повышению статуса производителя. Это даст возможность не потерять позиции на внутреннем рынке и расширить экспорт продукции (1). Современный уровень рыночных отношений требует от производителя гарантий не только определенного уровня качества, но и гарантий обеспечения стабильности этого уровня, то есть подтверждение соответствия СМК международным стандартам.

2. Материалы и методы Имея большой опыт работы в сфере агропромышленного комплекса, мы в основном сосредоточили свое внимание на лабораториях первой, второй и третьей сторон, а также лабораториях, где проводятся испытания и калибрования, которые составляют часть института инспекции и сертификации продукции. Развитие производства, его специфика и насыщение рынка обусловили более жесткие требования, чем регламентированные в ISO серии 9000. Например, лидеры автомобильной промышленности требуют от своих поставщиков частей и материалов обязательного соблюдения стандартов QS 9000, на рынке телекоммуникаций действуют аналогичные стандарты на системы качеств TL 9000, в аэрокосмической промышленности – AS 9000 (2).

3. Результаты и обсуждения Универсальные международные стандарты на основе СМК ISO серии 9000 относятся к “добровольной” области сертификации, связанной с доказательством стабильности качества продукции или услуг. Они развивались и конкретизировались в разных направлениях производства, что привело к возникновению целого спектра аналогов, одним из которых для лабораторий является ISO/IEC 17025:2001. Для лабораторий это значит, что перечень технических требований перешел из ЕN 45001 и ISO – Guide 25 в ISO/IEC 17025: (Рис.1). Но в тоже время для успешного функционирования СМК и прохождения аккредитации необходимо глубоко понимать систему качества модели ISO 9001:2000 (3).

EN IS O |I E C IS O 9001 IS O 1990 IS O |I E C - G U ID EN IS O 1982 IS O |I E C -G U ID 1978 IS O -G U ID Рисунок 1. Развитие и взаимосвязь международных требований к компетентности лабораторий Добровольность внедрения СМК постепенно заменяется необходимостью такого внедрения для осуществления основной деятельности организации (4). Для лабораторий внедрение системы качества согласно ISO 9001 – это выполнение важнейшего требования, дающего возможность нормального функционирования и подтверждения компетентности согласно ISO/IEC 17025:2001 (3). Международный опыт по разработке и внедрению СМК в лабораториях показывает, что большинство ведущих лабораторий развитых стран мира уже разработали, внедрили и сертифицировали системы качества на основе стандартов ISO серии 9000, именно поэтому стандарт ISO/IEC 17025:2001, определяющий требования к лабораториям, и был основан на этих стандартах.

Важнейшей проблемой СМК в лаборатории является определение целей и задач. Политика качества, философия качества и цели менеджмента качества должны базироваться на концептуальной модели СМК в соответствии стандарту ISO 9001:2000 (5). В соответствии с требованиями стандарта ISO 9001: построение системы менеджмента качества следует разделить на несколько этапов:

Этап 1. Принятие решения. Этап 2. Подготовка. Этап 3. Анализ фактического состояния. Этап 4.

Назначение владельцев, определения выходов входов и ресурсов. Этап 5. Вживление СМК в структурные подразделения. Этап 6. Составные части Процесса. Этап 7. Внедрение СМК. Этап 8. Внутренние и внешние Аудиты СМК.

Фундаментальным принципом построения системы менеджмента качества в лаборатории по стандарту ISO 9001:2000 является подход с точки зрения процессов. Процессный подход требует определения последовательности процессов, взаимодействия и управления ими (5). Положение по качеству через обобщенную схему и описание взаимодействия процессов СМК устанавливает полную взаимосвязь отдельных элементов, его отображение дополняется соответствующей матрицей или блок-схемой каждого документируемого процесса. Важным этапом в разработанных системах менеджмента качества является документирование процессов, которое должно обеспечивать: достаточную информативность, удобство в пользовании, наглядность отображения и лаконичность изложения, определения методов мониторинга и управления процессом (4).

Результатами нашей работы является внедрение документированной системы менеджмента качества в Украинской лаборатории качества и безопасности продукции АПК. По результатам внутреннего аудита и анализа экономического эффекта мы можем уверенно утверждать, что система полностью отвечает установленным требованиям ISO/IEC 17025:2001 и ISO 9001-2001, политике и целям в сфере качества, установленными нами, требованиям заказчиков. Залогом такого функционирования в будущем, бесспорно, есть последующее совершенствование через проведение предупреждающих и корректирующих действий.

4. Заключение Изложенные принципы следует применять в исследовательских, аналитических и других лабораториях.

Следует отметить, что сертификация системы качества является элементом самой эффективной рекламы для лаборатории, “входным билетом” на рынок услуг по испытанию продукции или калиброванию, одним из наиболее убедительных доказательств надежности результатов работы лаборатории. Отсутствие системы качества в лаборатории – мощная антиреклама, которая крайне затрудняет работу с клиентами, а кое-где делает невозможной работу самой лаборатории.

Литература (1) Карлащук С.В. (2006) Агросектор, №3 (15), стр. (2) Новіков В.М. (2001). Основи метрології та метрологічна діяльність. – К.:Нова-Прінт, 11, 45- (3) ДСТУ ISO/IEC 17025-2001. (2002) Загальні вимоги до компетентності випробувальних та калібрувальних лабораторій. – К.: Держстандарт України (4) Рудзінський В. (2003) Стандарти, сертифікація, якість №1, стр. 17- (5) ДСТУ ISO 9001-2001.(2001) Системи управління якістю. Вимоги. – К.: Держстандарт України ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОРГАНИЗАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ СИМБИОТИЧЕСКИХ КОМПАРТМЕНТОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ СИМБИОНТАМИ, В ХОДЕ РАЗВИТИЯ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ КЛУБЕНЬКОВ ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.) Ходоренко А.В.1, Бревин Н. Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, 196608 Санкт-Петербург, ш. Подбельского, 3, anna_khodorenko@arriam.spb.ru Центр Джона Иннеса, Норвич, Великобритания.

Ключевые слова: горох (Pisum sativum L.), бобово-ризобиальный симбиоз, гликопротеин, экстензин, липополисахарид Скоординированная экспрессия генов бобового растения и клубеньковых бактерий (ризобий) обеспечивает молекулярный диалог между макро- и микросимбионтом, лежащий в основе формирования симбиотического клубенька. Поверхность симбиотического взаимодействия служит физической точкой контакта между микросимбионтом и хозяином во время совместимой инфекции, а на поздних стадиях используется для обмена питательными веществами и другими молекулами между обоими партнерами (Brewin, 1991, 2004;

VandenBosch et al., 1989). Со стороны бактериальных клеток большую роль в нормальном развитии клубенька играют бактериальные экзо- и липополисахариды (Kannenberg et al., 1994;

Lucas et al., 1996;

Buendia-Claveria et al., 2003). С другой стороны, поверхность взаимодействия хозяина составляет плазматическая мембрана растительной клетки, клеточная стенка и материал внеклеточного матрикса, в который заключены бактериальные клетки. Одним из основных компонентов матрикса инфекционной нити, секретируемым растительными клетками, является экстензиноподобный гликопротеин, называемый экстензином корневых клубеньков - root nodule extensin (RNE), а также другие растительные арабиногалактанпротеины и богатые гидроксипролином белки (Rathbun et al., 2002;

Brewin, 2004).

В настоящем исследовании были использованы следующие Fix- мутанты гороха (Pisum sativum L.), блокированные на различных стадиях развития инфекционной нити, а также их родительские линии: SGE (д.т.), SGEFix--1 (sym40), SGEFix--2 (sym33), RBT3 (sym33, sym40), RBT4 (sym33, sym42), Finale (д.т.), RisFixV (sym42). Во всех экспериментах растения были инокулированы линией 3841 Rhizobium leguminosarum bv.

viciae. Растения выращивались в камерах постоянного климата HeraeusVtch HPS2000 (день:ночь 16:8 ч;

температура 21:19°С;

относительная влажность 75%;

интенсивность света 490 мE/м2·с). В качестве субстрата был использован стерильный вермикулит;

растения выращивались на безазотной среде. В экспериментах были использованы следующие моноклональные антитела и антисыворотки: МАС 57, 265, 204, 236, 206, 207, R82 и JIM 5, 7. Все антитела и антисыворотки были любезно предоставлены проф. Н.Дж. Бревиным (Центр Джона Иннеса, Норвич, Великобритания).

Клубеньки гороха были собраны и исследованы с помощью световой, флуоресцентной, конфокальной и трансмиссионной электронной микроскопии. Срезы клубеньков были проинкубированы с первичными антителами (приведены выше), затем со вторичными антителами: меченными FITS для флуоресцентной микроскопии, и меченными частицами золота для конфокальной (с дополнительным контрастированием серебром) и электронной микроскопии. Срезы были исследованы и сфотографированы: на световом и флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse 800, на конфокальном микроскопе Leica DMR и трансмиссионном электронном микроскопе JEOL JEM-1200.

При исследовании методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии наблюдалось наличие бактериального липополисахарида, меченного антителом МАС 57, у бактерий, находящихся в инфекционных нитях, и у бактероидов в цитоплазме растительных клеток растений родительских линий и мутантных генотипов. Также в этом же исследовании было показано, что антиген МАС 265 (арабиногалактанпротеин экстензин - специфичный для корневых клубеньков экстензин) является главным компонентом матрикса инфекционных нитей у как растений дикого типа, так и у мутантов (рис. 1, 2). Однако метка МАС 265 у мутантных генотипов была обнаружена также в межклеточном пространстве инфицированной ткани клубенька, что было выявлено на световом и на ультраструктурном уровне, а в некоторых инфекционных нитях и инфекционных каплях одиночных и двойных мутантов отсутствовала - феномен, который не наблюдался в клубеньках дикого типа. В таких инфекционных нитях наблюдалась дегенерация бактерий внутри просвета. Антигены для МАС 204 и МАС 236 менее распространены в матриксе инфекционных нитей.

b b b * b b Рисунок 1. Локализация арабиногалактанпротеина – Рисунок 2. Ультраструктурная организация и экстензина (МАС 265) у мутанта SGEFix--1 (sym40) иммунная локализация АГП-экстензина (МАС при исследовании методом конфокальной 265) с помощью мечения золотом клубеньков микроскопии. Стрелки показывают инфекционные гороха у мутанта SGEFix--2 (sym33). b – нити, двойные стрелки – наличие АГП экстензина в бактерии, * - просвет инфекционной нити.

межклеточном пространстве. Масштабная линейка: Масштабная линейка: 500 нм.

20 мкм.

В корневых клубеньках дикого типа и мутантных генотипов как в инфицированных ризобиями клетках, так и в неинфицированных кортикальных клетках корня эпитоп JIM5, распознающий первично деэстерифицированный пектин, локализовался в клеточных стенках, окружающих растительные клетки, а также инфекционные нити в симбиотической ткани клубенька. У двойных мутантов RBT3 (sym33, sym40) и RBT4 (sym33, sym42) инфекционные нити были окружены ненормально утолщенными клеточными стенками.

Иногда метка JIM 5 распознается в фибрилярном материале внутри инфекционных нитей. Внутри ненормально утолщенных клеточных стенок инфекционных нитей одиночного мутанта RisFixV (sym42) метка JIM 5 расположена диффузно, но обычно собрана в локальные карманы внутри утолщенной стенки. Кроме того, подобное утолщение клеточной стенки наблюдается не только у инфекционных нитей, но и у инфицированных клеток хозяина. В стареющих инфицированных клетках у этого мутанта иммуноцитохимическое исследование показало наличие антигена к JIM 5 вокруг деградирующих бактероидов.

Таким образом, в результате проведенных исследований по иммунолокализации арабиногалактанпротеинов (АГП) экстензинов, пектинов первичной клеточной стенки и бактериальных липополисахаридов линии Rhizobium leguminosarum bv. viciae было получено следующее: у мутантных генотипов выявлено увеличение синтеза АГП в межклеточном пространстве, усиление защитных реакций в виде перекисного перекрестного связывания АГП экстензинов, у одиночного мутанта по гену sym 42 выявлено усиление защитных реакций в виде синтеза каллозы и пектиновых веществ вокруг стареющих бактероидов в инфицированных клетках клубеньков.

Благодарности Данная работа была поддержана ИНТАС (YSF 04-83-3196), Федеральным агентством по науке (РИ 19.0/002/140) и РФФИ (05-04-49105-а).

Литература (1) Brewin N.J. (1991) Annu Rev Cell Biol. V. 7. P. 191-226.

(2) Brewin N.J. (2004) Critic. Rev. Plant Sc. V. 23. N. 4 P. 293-316.

(3) Buendia-Claveria A.M. et al. (2003) Microbiology. V. 149. Pt. 7. P. 1807-1818.

(4) Kannenberg E.L. et al. (1994) J Bacteriol. V. 176. N. 7. P. 2021-2032.

(5) Lucas M. et al. (1996) J. Bacteriol. V. 178. P. 2727-2733.

(6) Rathbun E.A. et al. (2002) Mol. Plant Microbe Interact. V. 15. N. 4. P. 350-359.

(7) VandenBosch K.A. et al. (1989) EMBO Journal. V.8. P. 335-342.

МУТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ КАДМИЯ НА ОРГАНИЗАЦИЮ ТУБУЛИНОВЫХ МИКРОТРУБОЧЕК В КОНЧИКАХ КОРНЕЙ У ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PISUM SATIVUM L.) Цыганов В.Е. 1, Балушка Ф. Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, 196608 Санкт-Петербург, ш. Подбельского, 3, viktor_tsyganov@arriam.spb.ru, Боннский университет, Бонн, Германия.

Ключевые слова: горох (Pisum sativum L.), кадмий, цитоскелет, тубулиновые микротрубочки Кадмий (Cd) является одним из наиболее токсичных элементов для всех живых организмов. У растений Cd вызывает ингибирование роста стеблей и корней, вызывает некрозы и хлорозы [1]. Данные эффекты объясняются влиянием Cd на многочисленные биохимические и физиологические процессы [2]. На клеточном уровне Cd вызывает у растений ряд структурных изменений [3,4]. Наблюдаются увеличение размеров и количества вакуолей, конденсация цитоплазмы, вызываемая увеличением плотности матрикса, редукция крист митохондрий, сильный плазмолиз, высокая степень конденсации хроматина [5,6], дезорганизация структуры хлоропластов [7,8], разрывы в ядерной оболочке, плазмалемме и митохондриальных мембранах [8,9]. Также наблюдаются снижение митотической активности в апикальных меристемах [10-13], ингибирование растяжения клеток [14]. Снижение митотической активности сопровождается различными типами митотических аберраций: С-митозом, анафазными мостиками, микроядрышками [10,13]. Единичные исследования показывают влияние Cd на цитоскелет, так у ячменя обработка кадмием вела к модификациям в морфологии организации микротрубочек (МТ) и уменьшала точность воспроизведения аппарата веретена деления [14].

В данном исследовании с использованием уникального мутанта гороха SGECdt, характеризующегося повышенной устойчивостью к Cd, [15], был проведен анализ влияния различных концентраций Cd на организацию МТ в кончиках корней у гороха посевного.

Семена исходной линии гороха SGE и мутантной линии SGECdt, стерилизованные серной кислотой и промытые водопроводной водой, были помещены в увлажненные рулоны фильтровальной бумаги, на которых они прорастали в течение 3 дней в темноте при 200С. Трехдневные проростки были помещены на новые фильтры, увлажненные растворами различных концентраций Cd (0, 1, 10 и 100 мкМ CdCl2), на которых они росли в течение 3 дней. Кончики корней были обработаны по методике Vitha et al. [16]. Изменения в организации МТ были проанализированы на срезах толщиной 14 мкм методами непрямой иммунофлуоресцентной световой и конфокальной микроскопии с использованием первичных моноклональных антител к -тубулину (Sigma-Aldrich, клон DM1A) и вторичных мышиных антител, меченных FITS (Sigma-Aldrich).

Проростки исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt не отличались по длине корней, как в контрольных условиях, так и на концентрациях 1 и 10 мкм CdCl2 (Табл. 1). Обработка 1 мкм CdCl2 не влияла на рост проростков обеих линий, в то же время обработки 10 и 100 мкм CdCl2 приводили к уменьшению длины корней у проростков, особенно обработка 100 мкм CdCl2 (Табл. 1). Следует отметить, что на концентрации мкм CdCl2 длина корней у исходной линии была снижена значительно сильнее, по сравнению с мутантной линией, более того, рост корней у исходной линии к моменту анализа был полностью ингибирован, часть из них имели коричневатую окраску.

Сравнительный иммуноцитохимический анализ кончиков корня, выращенных без Cd, у исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt показал типичную организацию митотических МТ в делящихся клетках (препрофазные пояски, митотические веретена, цитокинетические фрагмопласты) (Рис. 1А), а также в кортикальных клетках, для которых характерна поперечная (относительно оси растяжения клетки) ориентация кортикальных МТ (Рис. 1B). Данная организация сохранялась при обработках кончиков корней 1 и 10 мкм CdCl2. На концентрации 100 мкм CdCl2 у растений исходной линии не наблюдалось митотических МТ, в большинстве кортикальных клеток кортикальные МТ отсутствовали, в редких клетках сохранившиеся кортикальные МТ имели неупорядоченную организацию (Рис. 1C), в дистальной зоне кончика корня кортикальные МТ имели диагональную ориентацию (Рис. 1D). В то же время у растений мутантной линии наблюдались митотические МТ, хотя число митозов было сильно снижено, по сравнению с другими вариантами. Кортикальные МТ в кортикальных клетках были представлены как поперечными, так и диагональными МТ.

Таблица 1. Влияние различных концентраций Cd на длину проростков исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt. Даны средние значения со ст. ошибками.

Вариант опыта длина корней, см Вариант опыта длина корней, см SGEa,b* SGECdt c,d 11,17±0,25 11,12±0, SGECdt + 1 мкм CdCl SGE + 1 мкм CdCl2 10,59±0,60 10,56±0, SGE + 10 мкм CdCl2a SGECdt + 10 мкм CdCl2c 9,89±0,52 10,48±0, b,f SGECdt + 100 мкм CdCl2d,f SGE + 100 мкм CdCl2 6,59±0,53 8,09±0, *Средние значения, отмеченные одинаковыми буквами статистически достоверно различаются (Р0,999) Рис 1. Организация МТ в кончиках корней у исходной линии SGE и мутантной линии SGECdt при обработках различными концентрациями Cd. A - митотические МТ (острия стрелок указыват фрагмопласт, двойное острие стрелки указывает митотическое веретено), B - поперечные кортикальные МТ (обозначены стрелками) C отсутствие кортикальных МТ, стрелка- неупорядоченные МТ, D - диагональные МТ (обозначены стрелками).

Масштабная линейка = 10 мкМ.

Таким образом, было показано, что мутант SGECdt характеризуется способностью поддерживать организацию митотических и кортикальных МТ на концентрациях Cd, вызывающих серьезные нарушения в их организации у растений исходной линии SGE.

Данная работа была финансово поддержана ИНТАС (YSF 04-83-3143).

Литература (1) Sanita di Toppi L., Gabrielli R. Environ. Exp. Bot. 1999. V. 41 P. 105-130.

(2) Benavides M.P., et al. Braz. J. Plant Physiol. 2005. V 17(1). P. 21-34.

(3) Kupper H., et al. Planta. 2000. V. 212. P. 75-84.

(4) Vitria A.P., et al. Biol. Plant. 2004. V. 47. P. 561-568.

(5) Liu D., Kottke I. J. Biosci. 2004. V. 29. P. 329-335.

(6) Maruthi Sridar B.B., et al. Environ. Exp. Bot. 2005. V. 54. P. 131-141.

(7) Aravind P., Prasad M.N.V. Braz. J. Plant Physiol. 2005.V. 17. P. 3-20.

(8) Vitria A.P., et al. Environ. Exp. Bot. 2006. in press.

(9) Stoyanova D., Chakalova E. Plant Physiol. 1990. V. 16. 18-26.

(10) Zhang Y., Yang X. Mutat. Res. 1994. V. 312 P. 121-126.

(11) Zhang Y., Xiao M. Mutat. Res. 1998.V. 420 P. 1-6.

(12) Liu D., et al. Biol. Plant. 2003/4. V. 47. P. 79–83.

(13) Fusconi A., et al. Environ. Exp. Bot. 2006. in press.

(14) Voustinas G., et al. Cell Biol. Int. 1997. V. 21 P. 411-418.

(15) Tsyganov et al. 2004. Biology of Plant-Microbe Interactions V 4, pp 506- (16) Vitha S., et al. 2000. In Actin: a Dynamic Framework for Multiple Plant Cell Functions, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 619-636.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОСНОВАННЫХ НА FRET-ЭФФЕКТЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ, ЛИГАЗНОЙ И ГИБРИДИЗАЦИОННОЙ ЦЕПНЫХ РЕАКЦИЙ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ ДНК ИЛИ РНК Чемерис Д.А., Романенкова М.Л., Матниязов Р.Т.

Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, 450054 Уфа, пр. Октября, 71, Россия chemeris_da@anrb.ru Ключевые слова: ПЦР, ЛЦР, ГЦР, FRET 1. Введение ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) широко используется как в фундаментальных исследованиях, так и для целей диагностики, тогда как ЛЦР в реальном времени (ЛЦР-РВ) пока остается невостребованной, хотя имеет перед ПЦР некоторые преимущества. Новая цепная реакция - гибридизационная (1) недавно переведена нами в режим реального времени (ГЦР-РВ). Протекающая изотермически без участия ферментов ГЦР-РВ является по существу нанобиотехнологией и возможно одним из основных методов ДНК/РНК диагностики будущего.

2. Материалы и методы ПЦР-РВ, ЛЦР-РВ и ГЦР-РВ проводили в ДНК амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ (Bio-Rad, США) в реакционных смесях объемом 30 мкл в стандартных буферах, содержащих Taq ДНК полимеразу, праймера, меченных донорным (FAM) и акцепторным (ROX) флуорохромами, 4 дНТФ (для ПЦР);

Tth ДНК лигазу и 4 олигонуклеотида, два из которых несли те же донорный и акцепторный флуорохромы (для ЛЦР);

олигонуклеотидные шпильки, несущие аналогичные донорный и акцепторный флуорохромы (для ГЦР).

Другими ингредиентами реакций служили искомые последовательности ДНК или РНК, а также для отрицательного контроля - неспецифические молекулы нуклеиновых кислот. Температурные колебания во времени зависели от конкретных реакций и последовательностей используемых праймеров и олигонуклеотидов.

3. Результаты и обсуждение Размер ампликонов в ПЦР-РВ не должен быть большим. Здесь мы пошли дальше всех и в нашем скоростном варианте ПЦР-РВ, где стандартные 25 циклов завершаются менее чем за 15 минут, праймеры отжигаются встык, приводя к наработке целевого продукта размером всего около 40 пн. Такое расположение праймеров обеспечивает флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET), поскольку его эффективность обратно пропорциональна расстоянию между красителем-донором и красителем-акцептором в шестой степени и не может происходить при привычном расположении праймеров. При этом обеспечивается амплификация довольно коротких фрагментов или, точнее, обломков молекул ДНК или РНК, которые с большей вероятностью могут сохраняться в старых или подвергнувшихся сильному разрушительному воздействию образцах (при детекции ГМИ в продуктах питания, например). До минимума сокращается время, требуемое для построения комплементарных цепей, и этап элонгации становится не нужным. Благодаря тому, что целевой продукт ПЦР имеет небольшой размер, существенно снижается температура денатурации, при которой цепи ампликона должны разойтись и стать новыми матрицами для отжига праймеров. С одной стороны, это экономия времени вообще, так как переходы от одной температуры к другой не мгновенны, а с другой - сокращение времени пребывания ДНК полимеразы при высоких температурах продлевает срок жизни фермента, обеспечивая в целом более надежную амплификацию.

Рисунок 1: Схема расположения прямых (1 и 3) и обратного (2) праймеров и протекания ПЦР-РВ на платформе "УФА" с FRET-эффектом между донорным (F) и акцепторным (R) красителями. Волнистой стрелкой показан перенос энергии, а радиальные лучи символизируют свечение.

Расположение праймеров встык гарантирует высокую специфичность предложенного варианта ПЦР-РВ, поскольку случаи фальш-праймирования, вызванные отжигом на других местах расположенных вплотную сразу двух праймеров, "связанных" между собой FRET-эффектом, практически невозможны. Из приведенной схемы протекания варианта ПЦР-РВ с FRET-эффектом, названного нами "УФА" (Универсальная Флуоресцентная Амплификация) видно, что в качестве положительно-отрицательного контроля была проведена амплификация с третьим удаленным праймером, обеспечившим по данным гель-электрофореза наработку продукта, но не перенос энергии, что также подтверждает высокую специфичность ПЦР-РВ "УФА".

Изучение транскрипционной активности генов представляет собой важную задачу, часто решаемую с помощью ПЦР-РВ. Использование для этой цели ПЦР-РВ "УФА" в случае генов, содержащих интроны, позволяет уверенно детектировать количество транскрибируемой РНК и без ДНКазной обработки полностью исключить вклад самого гена. Определение произошедшего трансгеноза при анализе трансгенных растений с помощью ПЦР из-за сверхвысокой чувствительности этой реакции и остающихся агробактерий часто не представляется возможным. Однако расположение прямого и обратного праймеров на границах искусственных экзонов и интрона в маркерном гене uid (gus), содержащемся в бинарном векторе pCambia позволило нам с помощью ПЦР-РВ "УФА" не только доказать произошедшую трансформацию, но и оценить уровень транскрипции маркерного трансгена.

Рисунок 2: Схема расположения прямого (F) и обратного (R) праймеров в ПЦР-РВ "УФА" с FRET-эффектом между донорным (F) и акцепторным (R) красителями для определения уровня экспрессии генов, содержащих интроны.

Нами разработан способ детекции ампликонов в ЛЦР-РВ, основанный на FRET-эффекте между присоединенным к одному олигонуклеотиду красителем-акцептором и возбуждаемым красителем-донором, входящим в состав соседнего олигонуклеотида, которые в ходе ЛЦР в результате лигирования становятся единой молекулой. Важными чертами ЛЦР является возможность детекции коротких фрагментов ДНК или РНК, причем последние без этапа обратной транскрипции могут служить матрицами для лигирования олигонуклеотидов.

Особенностями ГЦР является то, что в ней не происходит амплификации детектируемых фрагментов ДНК или РНК, а имеет место изотермическая (в широком диапазоне температур) самосборка наноконструкций, инициируемая только полностью комплементарными искомыми последовательностями и свидетельствующая о присутствии таковых. Движущей силой ГЦР является временно скрытая энергия, заключенная в специальным образом сконструированных олигонуклеотидных наноструктурах, представляющих собой шпильки с верхушечной петлей, двуцепочечным стержнем и одноцепочечным участком. В отсутствии инициаторной молекулы эти олигонуклеотидные конструкции стабильны и не вступают в реакцию гибридизации. Однако стоит только появиться в реакционной смеси искомой (инициаторной) последовательности ДНК или РНК, как шпильки начинают поочередно раскрываться, и происходит пошаговое удлинение цепей ДНК, детекция чего велась нами по увеличивающейся флуоресценции красителя-акцептора, при этом рост свечения характеризовался стандартной кривой, быстро выходящей на плато.

4. Заключение Предложен новый вариант ПЦР-РВ, по всем параметрам превосходящий ныне существующие. Показана возможность проведения ЛЦР на матрице РНК без этапа обратной транскрипции. Несмотря на то, что ГЦР-РВ с FRET-эффектом пока уступает по чувствительности и ЛЦР-РВ и ПЦР-РВ, нам представляется, что у этой реакции, тем не менее, есть хорошие перспективы.

Благодарность Данная работа выполнена в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4 и Государственного контракта ФЦНТП № 02.445.11.7018.

Литература (1) Dirks R.M., Pierce N.A. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 15275-15278.

РОЛЬ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРОЦЕССАХ ДЕСТРУКЦИИ ПРИРОДНЫХ ФОСФОРИТОВ Чубик М.В., Чубик М.П., Булатова Н.Ш.

Томский Политехнический Университет 634050, г. Томск, пр. Ленина, д. mchubik@mail.ru Ключевые слова: биогеотехнология, фосфоритовые руды, микроорганизмы 1. Введение Бактериальное обогащение руды является наиболее приемлемым, так как не требует создания сложных горнодобывающих комплексов, позволяет увеличить объем сырьевых ресурсов, обеспечить комплексность извлечения металлов. Биотехнологические методы более выгодны экономически и экологически безопасны, по сравнению с химическими методами переработки руд.

Обогащение руды микроорганизмами происходит вследствие разрушения ими кристаллической решетки минералов слагающих породу. Так микроорганизмы извлекают из решетки элементы необходимые им для питания и построения клетки. Тем самым они способствуют расшатыванию и деструкции кристаллической решетки и разрушению самого минерала.

Однако попытка вызвать деструкцию фосфоритов с помощью микроорганизмов для увеличения растворимой фракции Р2О5 и сокращения дорогостоящих способов обогащения фосфоритов является новым, мало изученным направлением по переработке фосфатного сырья.

Целью данной работы являлось исследование изменений, происходящих в фосфоритовой руде Джерой Сардарьинского месторождения под воздействием микроорганизмов.

2. Материалы и методы Основным объектом исследования явились руды и вода дренирующих водотоков Джерой-Сардарьинского месторождения фосфоритов, Узбекистан. В ходе работы мы применяли следующий комплекс исследований:

общий, химический, рентгенофазовый, дифференциально-термический, аналитический и микробиологический анализы руды и проб воды. В ходе микробиологического анализа были выделены три группы микроорганизмов: смешанная культура аутомикрофлоры;

Thiobacillus thioparus и недифференцированная культура, растущая на среде Белкановой. Дальнейшие эксперименты были проведены с использованием этих групп микроорганизмов.

В нашей работе мы поставили три серии опытов для определения влияния микроорганизмов на фосфоритовую руду.

Серия 1. Эксперимент по воздействию автохтонной микрофлоры фосфоритовой руды к ее разрушению.

Навеску руды (1,6 г) заливали питательной средой Н.Н.Ляликовой (1). В данной серии выщелачивающий раствор являлся стерильным, а руда не стерильна. В качестве контроля использовали навеску стерильной фосфоритовой руды на среде Ляликовой.

Серия 2. Эксперимент по воздействию бактерий Thiobacillus thioparus, полученных из пробы воды, на фосфоритовую руду.

Навеску руды (1,6 г) заливали питательной средой Бейеринка. Контроль: 1,6 г стерильной фосфоритовой руды + 5 мл дистиллированной воды. В опытных и в контрольных вариантах данной серии выщелачивающий раствор и руда являлись стерильными.

Серия 3. Эксперимент по воздействию штамма недифференцированных бактерий, растущих на среде Белкановой.

Навеску руды (1,6г) заливают питательной средой для Вacillus mucilaginosus в модификации Белкановой (2). Контроль: 1,6 г стерильной фосфоритовой руды + 5 мл дистиллированной воды. В опытных и в контрольных вариантах данной серии выщелачивающий раствор и руда были стерильными.

В течение эксперимента изучали жидкую и твердую фазы поставленных опытов. Во всех сериях эксперимента соотношение твердой фазы к жидкой составляло 1:3. Жидкая фаза представляла собой водный фильтрат, содержащий растворенные компоненты руды. Твердая фаза - высушенную и измельченную руду после воздействия микроорганизмов.

В выщелачивающие растворы (питательные среды) не добавляли растворимые фосфаты, т.к.

предполагалось, что фосфорное питание будет осуществляться за счет фосфатов, выщелачиваемых из породы.

Сроки эксперимента 7, 14, 30, 60 суток.

3. Результаты и обсуждение По данным рентгенофазового анализа фосфоритовая руда Джерой- Сардарьинского месторождения имела сложный минералогический состав. Основным минералом являлся франколит. Кроме того, фосфорсодержащими минералами являлись фторкарбонатапатит и фторкарбонатгидроксиапатит.

Все серии эксперимента (естественный микробоценоз, Th. thioparus, культура со среды Белкановой) показали положительные результаты по воздействию на структуру минералов фосфоритовой руды.

Микроорганизмы серии «Естественный микробоценоз» наиболее активно выщелачивали фосфор и кремний на 14 сутки эксперимента. Th. thioparus на начальной стадии способствовали выщелачиванию кремния и переходу кальция в растворимое состояние, равномерное выщелачивание фосфора происходило на протяжении 14-30 суток. Культура со среды Белкановой наиболее активно выщелачивала кремний и фосфор в жидкую фазу на начальной стадии (Рис.1).

концентрация фосфора в жидкой фазе, мг/мл 0, 1, 0, 7 14 30 сутки естественный микробоценоз Th.thioparus среда Белканов Рисунок 1: Содержание фосфора в жидкой фазе.

В ходе опыта мы наблюдали выщелачивание кальция в раствор. Это явление способствует снижению карбонатного модуля и улучшению характеристик руды. Из руды в результате деятельности бактерий выщелачивались глауконит, гидрослюды, кварц, дернит, некоторое количество карбонатов. В целом, действие микробных культур на фосфоритовую руду было схоже между собой, но отличалось выраженностью эффекта на минералы.

4. Заключение В дальнейшем нами запланирована идентификация микроорганизмов, выделенных со среды Белкановой.

Кроме того, необходимо детально изучить механизмы воздействия выделенных микроорганизмов на основные минералы, составляющие руды. Мы предполагаем, что для внедрения в производство больше всего подходят именно эти микроорганизмы, так как они показывают наиболее стабильные результаты выщелачивания, не требуют дополнительных затрат на собственное содержание, а также на очистку руды. Культура со среды Белкановой может, вероятно, применяться в качестве отдельного биоудобрения для перевода трудно усваиваемого фосфора в доступную для растений форму.

В качестве объектов исследования мы планируем выбрать руды других месторождений, в том числе Западно-Сибирского региона. При этом особое внимание необходимо обратить на рудные «хвосты» и хвостохранилища, поскольку бактериальное обогащение отходов добычи и переработки руды очевидно имеет экономическую выгоду. Кроме того, такой подход будет способствовать более быстрому и эффективному включению в естественный геохимический круговорот бросовых продуктов обогащения руды.

Литература (1) Лебедева Е.В., Ляликова Н.Н., Бугельский Ю.Ю. (1978) Микробиология, XLVII, 6, 1101 – 1115.

(2) Белканова Н.П., Каравайко Г.И., Авакян З.А. (1985) Микробиология, 54, 1, 27 – 30.

ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS - ПРОДУЦЕНТ СЕКРЕТИРУЕМОЙ ЭНДО-(1-4)-БЕТА-КСИЛАНАЗЫ С ПОНИЖЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЭНДОГЛЮКАНАЗ Чулкин А.М., Беневоленский С.В.

ФГУП ГосНИИГенетика, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд 1, Россия lab26@genetika.ru Ключевые слова: ксиланаза, эндоксиланаза, целлюлаза, эндоглюканаза 1. Ведение Общественное беспокойство на воздействие загрязняющих веществ, используемых в целлюлозно бумажной промышленности, которая применяет хлор как отбеливающий реагент, заставляет развивать биотехнологические методы для отбеливания целлюлозы, то есть, биоотбеливание с использованием эндоксиланаз.

Эндоксиланазы деполимеризуют ксилан, и преобразуют его из полимерного вещества в ксилоолигосахариды и ксилозу. Гидролиз ксилана, в свою очередь, облегчает удаление лигнина из бумажной пульпы.

Загрязнение целлюлазами, имеющее место в большинстве микробиологических препаратов эндоксиланаз представляет большую проблему в применении эндоксиланаз для отбеливания. Целлюлазы приводят к повреждению целлюлозы, которая является главным продуктом целлюлозно-бумажной промышленности.

Применение мутантных по эндоглюканазам штаммов-продуцентов эндоксиланазы позволяет уменьшить целлюлазную активность в препаратах эндоксиланазы и, тем самым, увеличить прочность бумажного полотна.

2. Материалы и методы.

Определение активности эндоксиланазы. Активность эндоксиланазы определяли по количеству восстанавливающих сахаров, выделяемых при гидролизе ксилана из лиственницы. Восстанавливающие сахара определяли методом Шомоди-Нельсона (1).

Определение активности целлюлаз. Активность целлюлаз определялась по отношению к растворимому окрашенному субстрату (2).

3. Результаты и обсуждение Клонирование гена egl2 1-4--эндоглюканазы семейства A целлюлаз (семейства 5 гликозил гидролаз) P. canescens. Для клонирования внутреннего фрагмента гена egl2 1-4--эндоглюканазы P.canescens были использованы праймеры на консервативные участки генов 1-4--эндоглюканаз семейства A целлюлаз (семейства 5 гликозил гидролаз). Амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 900 п.н. был клонирован плазмидном векторе и секвенирован.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.